一种提高花生固氮和产量的小分子蛋白及其应用

1.本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提高花生固氮和产量的小分子蛋白及其应用。


背景技术：

2.花生是我国重要的油料作物，提高产量对保障我国油料供给具有重大意义。豆科植物大多能与固氮根瘤菌建立共生关系，形成高效的“固氮工厂”——根瘤。花生是豆科植物，其根系也能形成根瘤，进行固氮，促进花生生长。花生的根瘤形成始于5-6片叶，主要集中于上胚轴形成的主根和侧根上，根瘤形成受不同品种特性等内在因素和土壤养分、土壤ph值和土壤透气性等外在环境的影响。因此，充分利用空气中氮气，提高花生根系固氮能力，提高花生地上部氮素含量，是减少花生氮肥施用量、降低环境污染，提高花生产量的重要措施。
3.目前主要通过选择不同花生品种或者调节花生根系养分、水分等微环境来提高花生根系固氮能力。但是，随着施肥量的增加，根系氮素含量逐渐增加，花生根系固氮能力逐渐降低，导致肥料利用率下降和环境污染。
4.小分子多肽在植物生长发育、耐逆和养分吸收中发挥着重要的调控作用。最近研究发现许多小分子多肽具有类似激素的功能。目前，在植物中研究发现小分子多肽在调控根瘤形成中也具有重要的作用。因此，在充分研究小分子多肽功能的基础上，开发高效的调控花生根瘤形成和固氮能力的小分子蛋白(enfp，enhance nitrogen fixation of peanut)，建立适宜的体外施用方法，提高花生根系固氮能力，增强叶片氮素含量，降低花生氮肥施用量，增加花生产量，可以为保障我国油料安全提供技术支撑。


技术实现要素：

5.本发明利用生物信息学手段深入分析了花生基因组信息，对花生和其他植物中小分子多肽进行了充分对比和实验筛选，最终找到了10个可显著提高花生固氮能力和产量的小分子多肽enfp-1～enfp-10。在花生盛花期通过喷施enfp溶液，可以增加花生体内enfp含量，进而提高花生根系固氮能力及地上部氮素含量，进而提高花生产量。
6.本发明的技术方案为：一种提高花生固氮和产量的小分子蛋白，其特征是，其为enfp-1～enfp-10中任一种或者两种以上的混合物，所述enfp-1～enfp-10的氨基酸序列如下：
7.enfp-1：afrptapshspgsmr
8.enfp-2：dfrptapshspgsmr
9.enfp-3：nfrptapshspgsmr
10.enfp-4：afrptapghspgsmr
11.enfp-5：dfrptapghspgsmr
12.enfp-6：nfrptapghspgsmr
13.enfp-7：afrptapgnspgsmr
14.enfp-8：dfrptapgnspgsmr
15.enfp-9：nfrptapgnspgsmr
16.enfp-10：dfrptapggspgsmr。
17.上述小分子蛋白enfp-1至enfp-10可以提高花生根系固氮能力，提高地上部氮素含量，进而提高花生产量。
18.采用上述enfp-1至enfp-10提高花生根系固氮能力的方法，具体为：在花生盛花期叶面喷施enfp溶液；所述enfp溶液为含有silwet系列有机硅表面活性剂和enfp的水溶液，大田使用时，每亩喷施20-30l。enfp溶液中添加silwet系列有机硅表面活性剂可促进小分子蛋白进入花生叶片，促进enfp诱导花生产生活性物质，提高花生根系固氮能力。
19.上述enfp溶液的工作浓度为：enfp-1至enfp-10中任一种或者两种以上的混合物的终浓度为0.02
±
0.005g/l(优选0.02g/l)，silwet系列有机硅表面活性剂的浓度为0.01-0.02％。
20.本发明的技术效果为：
21.1、本发明克服了现有技术存在的问题，在花生盛花期，采用叶片喷施小分子蛋白enfp溶液，提高根系固氮能力，并能提高花生产量。因此，使用该产品，可在降低化肥用量前提下，提高花生产量，不仅可以防止大量施肥导致的环境污染，又可以提高花生产量，具有广阔的应用前景。
22.2、大田实验表明，花生叶面喷施enfp溶液后，可提高花生根系根瘤数量，提高花生固氮能力和叶片氮素含量，从而提高花生产量。因此，本发明方法不仅具有提高花生根系固氮的作用，还具有提高产量的功能，为花生生产的高效可持续发展提供了现实有效的产品和方法。
附图说明
23.图1为试验例一分别用enfp-1至enfp-10的溶液处理温室种植花生，对花生叶片氮素含量的影响图；从图中看出：enfp-1至enfp-10溶液均能显著提高花生叶片氮素含量；
24.图2为试验例二分别用enfp-1和enfp-10的溶液处理大田生长的花生，对花生根系根瘤的影响图；从图中看出：enfp-1和enfp-10溶液均能显著提高花生根系根瘤菌数量；
25.图3为试验例三分别用enfp-1和enfp-10的溶液处理大田生长的花生，对花生产量的影响图；从图中看出：enfp-1和enfp-10溶液均能显著提高花生产量；
26.其中，enfp溶液：含silwet l-77表面活性剂和enfp的水溶液；ck：含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水对照。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。
28.实施例1：小分子蛋白氨基酸序列的确定
29.(1)确定小分子蛋白氨基酸序列
30.本技术发明人根据豆科植物花生、苜蓿等植物中的相关蛋白序列并结合花生中该蛋白基因的表达丰度，通过生物信息学分析，对个别关键氨基酸进行了替换，建立了具有150条小分子蛋白序列的小分子蛋白库，利用这150条小分子蛋白分别进行叶片喷施花生叶片，最终发现了10个可显著提高花生根系根瘤数量的小分子蛋白。该10种小分子蛋白的c端6个氨基酸是保守的，为：spgsmr。将上述10种小分子蛋白序列分别命名为：enfp-1至enfp-10。
31.(2)小分子蛋白合成及保存
32.利用fmoc固相多肽合成方法合成小分子蛋白。合成步骤如下：
33.①
取fmoc-c端第一位氨基酸-王树脂0.3g，放入离心管，用dcm溶胀20分钟，抽滤掉dcm；加3倍树脂体积的20％哌啶/dmf溶液溶解，利用氮吹仪，吹氮气30分钟，使其干燥；添加2倍树脂体积的dmf，洗涤5次，离心倒掉液体。
34.②
取0.27mmol fmoc-c端第二位氨基酸-oh，0.54mmol dipea，0.26mmol hbtu，加入上述离心管，加入适量溶剂dmf反应30分钟，得到fmoc-c端第二位氨基酸-c端第一位氨基酸-王树脂。氨基酸：dipea:hbtu：树脂＝3：6：2.85：1(摩尔比)；然后用2倍树脂体积的dmf洗涤3次上一步骤的树脂；然后加3倍树脂体积的20％pip/dmf溶液，鼓氮气30分钟，抽干，脱除fmoc基团，得到h2n-第二位氨基酸-第一位氨基酸-王树脂；最后，用2倍树脂体积的dmf洗涤5次上一步骤的树脂。
35.③
重复步骤2，每重复一次步骤2可增加1个氨基酸，根据小分子蛋白序列要求进行重复，得到最终目标小分子多肽。
36.④
甲醇洗涤树脂3次，然后加6倍树脂体积的切割液(体积比；三氟乙酸：茴香硫醚：1,2-乙二硫醇：苯酚：水＝87.5％：5％：2.5％：2.5％：2.5％)，摇床摇晃2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小时，得到小分子蛋白粗品100mg。
37.⑤
通过hplc仪器纯化得到95％以上纯度的小分子蛋白：
38.首先用c18分析柱快梯度分析小分子蛋白粗品。流动相为：水相a：0.1％tfa/水；有机相b：0.1％tfa/乙腈；梯度：5％-70％，20分钟，粗品主峰在7min分钟左右。
39.其次，使用c18制备柱进行小分子蛋白分离，收集目标峰。测质谱，发现收集的目标峰的分子量和目标小分子蛋白分子量吻合，纯度在95％以上为初步合格。然后，将收集到的目标峰溶液先用液氮速冻，再放冻干机上真空干燥成粉末状，取冻干后的粉末状小分子蛋白1mg，用水溶解，进行hplc和ms复测，纯度在95％以上，分子量没有变化为最终合格。
40.该类小分子蛋白可放置在-80℃保存2年左右，在-20℃保存半年左右。
41.实施例2：叶面肥epw配制及施用
42.分别取enfp-1至enfp-10以及上述10种小分子蛋白的等质量混合物2g，用1l去离子水溶解，制成100x母液，母液可在-20℃以下放置1-2周，如在室温需要现配现用。
43.在大田应用时，取enfp母液100ml，用自来水进行稀释，最终稀释定容至10l，然后加入2ml silwet l-77表面活性剂，混合均匀，使其终浓度达到0.02g/l，enfp工作液中含有2/10000的silwet l-77表面活性剂，将溶液用于下述的试验例。
44.在花生盛花期进行叶面喷施，喷施量为20-30l/亩；选择上午10点以前或下午4点
以后，并且1天内无雨时喷施。喷施时尽量让花生叶片正反面都能均匀喷施上enfp溶液。
45.试验例一、叶面喷施enfp溶液对对花生叶片氮素含量的影响
46.选取饱满的鲁花23号花生种子，在实验室内播种于含有育苗基质的小盒子(10
×
10
×
10cm)中，放置温室发芽生长，室温28℃，12小时光照、12小时黑暗。花生发芽后，继续在温室生长20天，然后进行叶片喷施enfp溶液处理，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，实验重复3次。喷施10天后测定花生叶片氮素含量。本试验中enfp溶液为分别含enfp-1至enfp-10的10种小分子蛋白溶液(制备方法如实施例2所示)。
47.试验结果：测定花生叶片氮素含量，发现与对照相比，喷施enfp显著提高花生叶片氮素含量(图1)。证实叶面喷施enfp溶液可以显著提高花生叶片氮素含量，且enfp-1至enfp-10溶液在提高花生叶片氮素含量方面效果相差不大。
48.试验例二、叶面喷施epw溶液对花生根系根瘤的影响
49.选取饱满的鲁花23号花生种子，于2021年5月25日在山东金乡播种于大田，花生进行单粒精播，花生播种密度为9000株/亩，等行距种植，行距40cm。设置喷施enfp-1和enfp-10溶液的处理，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，随机区组排列，重复3次。小区面积32m2，采用8行区。在花生盛花期，选取无雨天气于下午4点后，每亩叶面喷施0.02g/l的enfp溶液30l。9月17日收获花生，收获时统计根瘤数目。本试验中enfp溶液为分别含enfp-1和enfp-10的小分子蛋白溶液(制备方法如实施例2所示)，喷施时尽量让花生叶片正反面都能均匀喷施上enfp溶液。
50.试验结果：花生收获时，挖取花生根系，统计单株根瘤数目，发现与对照相比，喷施enfp-1和enfp-10溶液都能显著提高花生单株根系根瘤数(图2)。
51.试验例三叶面喷施enfp溶液对花生产量的影响
52.选取饱满的鲁花23号花生种子，于2021年5月25日在山东金乡播种于大田，花生进行单粒精播，花生播种密度为9000株/亩，等行距种植，行距40cm。设置喷施enfp-1和enfp-10溶液的处理，以喷施含有相同浓度的silwet l-77表面活性剂的清水为对照，随机区组排列，重复3次。小区面积32m2，采用8行区。在花生盛花期，选取无雨天气于下午4点后，每亩叶面喷施0.02g/l的enfp溶液30l。9月17日收获花生，统计花生产量。本试验中enfp溶液为分别含enfp-1和enfp-10的小分子蛋白溶液(制备方法如实施例2所示)，喷施时尽量让花生叶片正反面都能均匀喷施上enfp溶液。
53.试验结果：花生收获后，测定花生产量，发现与对照相比，喷施enfp-1和enfp-10溶液都能显著提高花生产量(图3)。

技术特征：
1.一种提高花生固氮和产量的小分子蛋白，其特征是，其为enfp-1～enfp-10中任一种或者两种以上的混合物，所述enfp-1～enfp-10的氨基酸序列如下：enfp-1：afrptapshspgsmrenfp-2：dfrptapshspgsmrenfp-3：nfrptapshspgsmrenfp-4：afrptapghspgsmrenfp-5：dfrptapghspgsmrenfp-6：nfrptapghspgsmrenfp-7：afrptapgnspgsmrenfp-8：dfrptapgnspgsmrenfp-9：nfrptapgnspgsmrenfp-10：dfrptapggspgsmr。2.一种含有权利要求1所述的小分子蛋白的enfp溶液，其特征是，所述enfp溶液为含有silwet系列有机硅表面活性剂和enfp-1～enfp-10中任一种或者两种以上的混合物的水溶液。3.如权利要求2所述的enfp溶液，其特征是，所述enfp-1至enfp-10中任一种或者两种以上的混合物的终浓度为0.02
±
0.005g/l。4.如权利要求3所述的enfp溶液，其特征是，所述silwet系列有机硅表面活性剂的浓度为0.01-0.02％。5.权利要求1所述的小分子蛋白或者权利要求2-4中任一项所述的enfp溶液在同时提高花生根系根瘤数量和叶片氮素含量方面的应用。6.权利要求1所述的小分子蛋白或者权利要求2-4中任一项所述的enfp溶液在提高花生产量方面的应用。7.一种提高花生固氮和产量的方法，其特征是，在花生盛花期叶面喷施权利要求4所述的enfp溶液。8.如权利要求7所述的提高花生固氮和产量的方法，其特征是，大田使用时，每亩喷施20-30l。

技术总结
针对现有技术中提高花生根系固氮能力的方法，存在的“随着施肥量的增加，根系氮素含量逐渐增加，花生根系固氮能力逐渐降低，导致肥料利用率下降和环境污染”的问题，本发明根据花生能产生根瘤进行固氮的生物学特性，提供了一种提高花生固氮和产量的小分子蛋白及其应用，小分子蛋白为10种小分子蛋白(ENFP-1至ENFP-10)中的任一种或者两种以上的组合，使用时配制成含有Silwet系列有机硅表面活性剂的ENFP水溶液。本发明通过实验证明：叶面喷施ENFP溶液能显著提高花生根系根瘤数量，提高花生固氮能力，提高花生叶片氮素含量，并能提高花生产量，具有显著的增产效果。具有显著的增产效果。具有显著的增产效果。


技术研发人员：孔祥强 卢合全 罗振 唐薇 王小文 尹静 秦澜
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/28