枇杷抗寒基因EjGLK1及其编码的蛋白与应用

枇杷抗寒基因ejglk1及其编码的蛋白与应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及枇杷抗寒基因ejglk1及其编码的蛋白和应用。


背景技术：

2.枇杷是原产于中国的蔷薇科枇杷属果树，其果实成熟于春夏之际的水果淡季且具有独特风味，因此受到消费者喜爱。枇杷夏秋花芽分化，秋冬开花坐果，因此极易受到低温甚至冻害影响从而影响枇杷产量(蒋际谋，陈秀萍，邓朝军，许奇志，郑少泉.(2018).我国枇杷产业优劣势分析与发展对策.中国园艺文摘，34(4)，4)。中国的主要产区如浙江、福建、重庆等，均有报道表明低温甚至冻害严重影响枇杷产量甚至使枇杷死亡(蔡礼鸿，(2012).枇杷学)。
3.较常规杂交育种，枇杷倍性育种快速高效，如三倍体枇杷相比二倍体枇杷具有果实无核，营养生长旺盛的特点(彭思维，王永清，严娟，陶炼.(2011).三倍体枇杷育种的研究进展.全国枇杷学术研讨会)。由于培育得到的多倍体具有较强抗逆性，因此高产的优质枇杷品种逐渐成为解决枇杷低温冻害的有效措施之一。对于枇杷抗寒研究结果表明，三倍体枇杷相比二、四倍体枇杷具有显著的抗冷冻胁迫，同时其光合效率等都得到显著提高(刘明秀，2021)。
4.枇杷易受到低温冰冻灾害从而使光合作用受到严重影响，最终影响枇杷产量甚至存活率。而通过对枇杷ejglk1基因调控解析，有利于对其功能的进一步解析，对于枇杷的抗冷冻胁迫有重要作用，同时为分子标记等奠定理论基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供枇杷ejglk1(golden2-like 1)及其编码的蛋白和应用。
6.本发明提供一种维持枇杷抗寒性相关的基因ejglk1，所述ejglk1的cdna核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明提供了上述维持枇杷ejglk1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明提供了上述维持枇杷基因ejglk1的扩增引物对，其中，上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
9.本发明提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
10.本发明还提供所述基因在调控枇杷抗寒中的用途。
11.本发明提供了一种转化体，所述转化体由上述表达载体转化宿主获得。
12.本发明提供了枇杷ejglk1及其蛋白质、表达载体或转化体在提高枇杷抗寒性育种中的应用。
13.本发明从具有抗寒的三倍体品种中克隆得到1个相关的基因ejglk1，发现其定位于细胞核。通过实时荧光定量pcr证实了ejglk1基因在枇杷低温处理后表达量显著升高，且
在抗寒的三倍体中表达最高，也表明了ejglk1基因具有提高枇杷低温抗逆性的作用。利用基因工程手段构建了ejglk1基因的植物过表达载体，将其在glk1双突的拟南芥glk1glk2中超量表达，结果影响叶绿体发育相关基因的表达及叶绿素的含量，并使glk1glk2双突变型由黄白色恢复为正常绿色。同时，也显著影响了低温胁迫途径关键调控通路ice-cbf-cors中相关基因的变化，以及ros相关酶的表达，最终提高拟南芥的抗寒性。本发明为被子植物的低温胁迫调控提供了良好的应用前景。
附图说明
14.图1所示是枇杷ejglk1基因的克隆电泳照片。其中，m为dl2000 dna marker，1为ejglk1基因orf的pcr产物，长度为1620bp。
15.图2所示是枇杷ejglk1编码蛋白质的氨基酸序列与苹果、梨、拟南芥、桃、杨树、茶、蓖麻、葡萄、香蕉、黄麻、烟草、小米、荷花的序列对比，均具有高度保守的tea domain及gct-box跨膜结构域。
16.图3所示是枇杷ejglk1基因在烟草叶片中瞬时表达的亚细胞定位，表明ejglk1蛋白定位于细胞核。gfp：绿色荧光蛋白；dapi：细胞核染料染色荧光信号；bright field：明场成像；merged：gfp，dapi和bright fild的合并后的图像。
17.图4所示是ejglk1转基因拟南芥阳性鉴定。(a)pcr扩增鉴定；(b)rt-qpcr鉴定。m:dl2000 dna marker；+:阳性对照；-:阴性对照；glk1glk2:拟南芥双突变体。
18.图5所示是glk1基因缺失的拟南芥双突变体glk1glk2与野生型表型及表达量鉴定。
19.图6所示是ejglk1转基因拟南芥与突变体及野生型冷冻胁迫处理前后差异表型及相关基因的表达量测定。(a)ejglk1转基因拟南芥与突变体及野生型常温及冷冻胁迫处理前后差异表型；(b)ejglk1转基因拟南芥与突变体及野生型的叶绿素含量；(c)ejglk1转基因拟南芥与突变体及野生型常温及冷冻胁迫处理前后存活率统计；(d)电导率测定；(e-h)叶绿体合成相关基因的表达量测定。
20.图7所示是ejglk1转基因拟南芥与突变体及野生型低温通路ice-cbf-cors相关基因表达量测定。
21.图8所示是ejglk1转基因拟南芥与突变体及野生型ros相关酶活的测定。
具体实施方式
22.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。
23.实施例1枇杷ejglk1基因序列的分子克隆
24.三倍体枇杷叶片总rna的提取
25.使用多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取抗寒三倍体枇杷叶片rna，后使用逆转录试剂盒得到相应的cdna，并对相应的rna在-80℃超低温冰箱中保存。
26.根据本团队前期枇杷重测序数据，在枇杷ejglk1基因编码的全长序列两端设计同源重组引物，其正向引物序列为:ejglk-f:aattaccatggggcgcgccatgcttcttttatcacctttgagg；其反向引物序列为:ejglk-r:tagactcacctaggatcctcaagcacaggagggtggaaattt。
27.使用反转录所得的cdna为模板，使用引物ejglk-f和ejglk-r，对枇杷ejglk1基因进行pcr扩增。pcr扩增体系及反应条件如下：扩增总体积为20μl，高保真酶primerstar10μl，ddh2o为7μl，模板(叶片的总cdna)为1μl，上游引物ejglk-f为1μl，下游引物ejglk-r为1μl。反应条件依次为：95℃-5min；95℃-30s，57℃-30s，72℃-30s，循环35次；72℃-5min。待反应结束后，取出扩增产物加入10
×
loadingbuffer2μl并混匀后，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到的正确的特异条带如图1，使用胶回收试剂盒进行胶回收得到纯化的产物，对得到的产物进行浓度鉴定并保存在-20℃冰箱中。
28.使用dnaman软件，得到ejglk1基因的cds为1620bp(seqidno.1)，进行蛋白质翻译，去除终止密码子后，得到539个氨基酸序列(seqidno.2)。对得到的序列和苹果、梨、拟南芥、桃、杨树、茶、蓖麻、葡萄、香蕉、黄麻、烟草、小米、荷花的glk蛋白进行氨基酸序列特异性比对，发现这些序列均具有保守的tea结构域及gct-box结构域(图2)。
29.实施例2枇杷ejglk1基因的植物表达载体pfgc5941-35s::ejglk1-egfp的构建
30.用限制性内切酶smai对植物表达载体pfgc5941-35s::egfp进行酶切，酶切体系如下：酶切的总体积为20μl，其中smai为1μl，10
×
colorbuffer为10μl，植物表达载体pfgc5941-35s::egfp质粒为9μl，37℃-30min。待反应结束后，取出产物并使用1％琼脂糖凝胶电泳得到的正确的特异条带，通过胶回收试剂盒进行胶回收，将得到的产物测定浓度并保存在-20℃冰箱中。使用同源重组酶将纯化得到的ejglk1目的基因片段和酶切回收后的植物表达载体，通过连接酶cloningmix进行连接并进行大肠杆菌的转化。将得到的菌液通过使用ejglk1上下游引物扩增验证，并通过测序比对得到有ejglk1基因的植物表达载体。将得到的正确菌液使用质粒提取试剂盒提取质粒，后测定浓度并保存在-20℃冰箱中，活化好的大肠杆菌菌液保存在-80℃超低温冰箱中。
31.实施例3枇杷ejglk1基因的亚细胞定位分析
32.将10ml的含有pfgc5941-35s::ejglk1-egfp质粒的阳性农杆菌于28℃摇床至od值在0.8-1.2之间。6000rpm离心20min，弃上清留沉淀，用10ml的重悬液(10mmmgcl2、10mmmes，150μm乙酰丁香酮)进行重悬。将重悬液进行烟草叶片转化，暗培养48h后进行gfp的荧光观察，观察到gfp信号后，加入dapi染色10min后进行观察，结果如图3所示。结果表明ejglk1定位于细胞核。
33.实施例4将转基因表达载体pfgc5941-35s::ejglk1-egfp转入拟南芥
34.首先对获得的拟南芥突变体材料glk1glk2进行鉴定，通过表型观察及对拟南芥atglk1及atglk2基因通过分别使用表达引物atglk1-f:ttgggtctccgattctccct，atglk1-r:ggcggtgctctaaatctcgt；以及atglk2-f:ttctccggctccagtactca，atglk2-r:aatccccgaccgtcgtaaag，进行表达量验证(图4)，结果表明获得了突变体拟南芥glk1glk2，其颜色较野生型col-0比为黄白色。
35.得到的载体质粒pfgc5941-35s::ejglk1-egfp取1μg在冰上预冷后，将30μl冻融的农杆菌感受态gv3101混合均匀，冰上放置5min后转入液氮中冻存5min，后37℃水浴5min，加入700μl的yeb培养基，置于28℃摇床(220rpm)2h，将菌液涂布于带有利福平和卡那霉素抗性的yrk培养基，后放于28℃培养箱中倒置培养48h。使用ejglk1基因的扩增引物进行pcr验证，pcr扩增体系及反应条件如下：扩增总体积为20μl，低保真酶2
×
taq为10μl，ddh2o为7μl，模板(待验证的农杆菌)为1μl，上游引物ejglk-f为1μl，下游引物ejglk-r为1μl。反应条
件依次为：95℃-5min；95℃-30s，57℃-30s，72℃-30s，循环30次；72℃-5min，最终得到有目的片段的农杆菌。
36.将含有pfgc5941-35s::ejglk1-egfp质粒的阳性农杆菌，在2ml的yrk培养基中活化，放于28℃摇床至od值在0.8-1.2之间，后转入100ml的yrk培养基中至od值在0.8-1.2。6000rpm离心20min后弃去上清得到沉淀，用重悬液(100ml体系含蔗糖:5g，表面活性剂silwetl-77:50μl)重悬备用。
37.将突变体拟南芥播种至腐殖土：蛭石：珍珠岩为3:1:1的营养土中，后放入4℃暗培养2天，转入23℃光照培养箱(湿度80％，16h光照)，培养至待侵染时，减去果荚和花并留下花芽，使用配制好的重悬液侵染10-30s，后保持湿润暗培养24h，移至23℃光照培养箱。该方法一周间隔7天重复2次后，培养至收种。
38.实施例5枇杷ejglk1基因的转基因拟南芥筛选
39.将收取得到的待筛选的拟南芥种子，后点种于营养土上，4℃暗培养2天后于光照培养箱正常培养。待长出叶片后取用除草剂草铵膦进行喷施，将正常生长的幼苗放入23℃光照培养箱验证得到阳性苗，并转入拟南芥营养土中培养。
40.实施例6枇杷ejglk1基因的转基因拟南芥阳性鉴定(dna扩增鉴定、实时荧光定量pcr)
41.扩增(dna)鉴定步骤如下：用植物dna提取试剂盒按步骤提取分别得到待测株系的dna，以含有ejglk1基因的农杆菌作阳性模板，以突变体拟南芥glk1glk2的dna作阴性模板，加入taq酶及引物ejglk-f和ejglk-r进行pcr扩增鉴定。
42.利用dnaman设计ejglk1基因的特异性表达引物，得到上游引物eejglk-f:ctacacctcctcccatgcac，下游引物eejglk-r:cagtacgaagcgtctggagg；并合成拟南芥内参基因上游引物:actin-f:ctcaagaggttctcagcagta，下游引物:actin-r:tcaccttcttcatccgcagtt，进行实时荧光定量pcr。pcr反应程序为:95℃，5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，40个循环，采集溶解曲线：60℃，90s，预溶解；后以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃，每个反应进行3个生物学重复。结果如图5所示，选取转基因拟南芥l3、l4作为阳性植株进行后续观测。
43.实施例7枇杷ejglk1基因的转基因拟南芥的表型鉴定
44.为进一步分析异源过表达ejglk1基因在拟南芥中的功能，将转基因拟南芥l3、l4的t3代两个株系及突变体拟南芥glk1glk2进行处理观察及表型分析。将野生型拟南芥，突变体和转基因株系t3代种子在超净台上，通过灭菌后放于1/2ms培养板上，在23℃光照培养箱中垂直培养10天，后进行冷冻胁迫处理(-4℃)6小时(图6)。
45.结果表明：常温下，突变体glk1glk2较col-0及转基因株系l3、l4颜色为黄白色，叶绿素含量及叶绿素合成相关基因的表达量(表达引物分别使用hema1-f:tgctttgaacagaatgtacggt；hema1-r:atatgtaacgatactgggacc；gun4-f:gacgtgactcttctctctcttcc；gun4-r:ggtggtggaggaggaggtgg；chlh-f:cgattcatctcttctcctatc；chlh-r:tggttgatctgtgtttcttc；cao-f:cacatcttcatcaactccatg；cao-r:ttgttgtcctaaaactagcc；)也显著低于突变体及转基因株系(图6e-h)。在冷冻处理6小时后，统计存活率的结果表明，转基因株系的存活率显著高于突变体株系。结果表明，转基因株系回复了突变体株系的叶绿素含量及相关基因的合成，并
使转基因株系获得更好的抗性。
46.实施例8转基因拟南芥株系中低温胁迫相关基因的表达水平
47.利用ncbi网站设计低温胁迫相关基因的特异性表达引物，atcbf1上游引物atcbf1-f:aatgtttggctccgattacg，下游引物atcbf1-r:cccacttaccggagtttctt；atcbf2上游表达引物atcbf2-f:gaccttggtggaggctattt，下游引物atcbf2-r:atcccttcggccatgttatc；atcbf3上游引物atcbf3-f:ttatatgcacgatgaggcga，下游引物atcbf3-r:atgattccactgtacggacg；atice1上游表达引物atice1-f:gttcgggaatgaggaggttt，下游引物atice1-r:aacactctcagccgctttac；atrd29a上游表达引物atrd29a-f:cttgtcgacgagaagcaaagaa，下游引物atrd29a-r:tcttgatggagaattcgtgtcc；atcor47上游引物atcor47-f:tgtcatcgaaaagcttcaccga；atcor47下游引物atcor47-r:accgggatggtagtggaaactg；atcor15a上游引物atcor15a-f:gtcgtcgtttctcaacgcaaga，下游引物atcor15a-r:gctttctcagcttctttaccca。通过荧光定量pcr，结果显示(图7)：冷冻胁迫处理后转基因株系中各个低温胁迫相关基因的表达水平较突变体显著增加。结果表明，异源表达ejglk1基因显著影响了低温迫途径关键调控通路ice-cbf-cors中相关基因的变化。
48.实施例9转基因拟南芥株系中ros相关酶活测定
49.为了分析ejglk1基因对拟南芥耐寒性的影响，对突变体拟南芥glk1glk2、野生型和转基因株系l3、l4叶片-4℃冷冻胁迫前后超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)、抗坏血酸过氧化物酶(apx)活性使用试剂盒进行了测定，，如图8。在正常条件下，sod、pod、cat、apx酶活性在各个株系中无显著差异；-4℃冷冻胁迫后，sod、pod、cat、apx酶活性在各个株系中均有所升高，但突变体株系的上升趋势低于野生型株系和转基因株系。结果表明，突变体glk1glk2在冷冻胁迫下与活性氧清除相关酶活性受到抑制，ejglk1异源转化glk1glk2突变体拟南芥能够进一步提高glk1glk2突变体在冷冻胁迫下这些酶的活性，从活性氧清除的生理指标上说明ejglk1的异源转化提高了glk1glk2拟南芥突变体的耐寒性。
50.突变体拟南芥glk1的缺失严重影响植物的抗寒性甚至存活率，枇杷ejglk1基因能够恢复其抗寒性及存活率，结果表明了该基因具有增加抗寒性的作用。
51.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.枇杷ejglk1蛋白，其为：1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述的枇杷ejglk1蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如seq id no.1所示。4.含有权利要求2或3所述基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。7.权利要求2或3所述基因在低温胁迫下影响低温调控通路ice-cbf-cors相关基因的表达，从而增加植物抗寒性的用途。8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入植物基因组中，并在拟南芥双突变体glk1gkl2中异源表达该基因，使突变体叶片由黄色恢复为绿色，增加了叶绿素的含量，增强了植物光合作用。9.权利要求2或3所述基因在低温下通过增加叶绿体发育相关基因的表达从而影响光合作用及低温相关通路ice-cbf-cors相关基因的表达，同时抗胁迫相关酶活性显著提高，从而增强植物抗寒性的用途。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，在低温下通过增加低温调控通路相关基因的表达以及提高抗胁迫相关酶活，从而增强植物抗寒性。

技术总结
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷叶抗寒相关基因EjGLK1及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述的EjGLK1基因通过影响叶绿体相关基因合成及影响低温胁迫通路ICE-CBF-COR中相关基因的表达增加植物抗寒性。使用浸花法将含有目的基因的植物表达载体pFGC5941-35S::EjGLK1通过根癌农杆菌介导转入野生型拟南芥中。结果表明，EjGKL1超表达增强了拟南芥的抗寒性。本发明利用枇杷EjGLK1基因获得的转基因拟南芥植株材料，相比拟南芥缺失GLK基因材料，叶绿素含量及叶绿体发育合成相关基因的表达量显著提高，并影响低温通路相关基因的表达及抗胁迫相关酶的含量，进而增加植物的抗寒性，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。


技术研发人员：郭启高 锁晓栋 杨灏 徐勋 刘明秀 梁国鲁 景丹龙
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/8/28