一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mRNA加帽率的方法

一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mrna加帽率的方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mrna加帽率的方法。


背景技术：

2.mrna作为遗传信息的瞬时载体，可以利用细胞机器合成蛋白质。因其具有安全、强大、快速、灵活、可程序化生产的特性，在药物研发中具有非常优秀的潜力。因此，mrna药物作为一种新型核酸药物非常具有吸引力，相关需求也日益增加。
3.mrna药物制备最关键的步骤是生产结构完整并具有生物学活性的mrna原液。体外合成的mrna需要具有完整的结构才能发挥正常的生物学功能。最小的mrna结构通常包含5’帽子，5’/3’非翻译区(untranslated region，utr)，编码蛋白的开放阅读框(open reading frame，orf)和3’poly a尾。真核rna聚合酶ii转录的mrna在其5’端进行共转录修饰的结构称为帽子。帽子结构对于mrna至关重要：
①
mrna帽子通过募集翻译起始因子促进mrna的有效翻译；
②
帽子结构可保护mrna免受核酸外切酶的快速降解，从而有效维持mrna的相对稳定性；
③
对于药物研发，缺乏帽子结构的mrna在机体内将会被先天性免疫传感器模式识别受体(pattern recognition receptor，prr)识别为“异己”，从而引发先天免疫反应的过度激活和mrna的降解。
4.近年来，基于物种多样性，随着基础研究的深入，更多帽子结构被发现，除了真核生物最常见的m7gpppn帽子结构外，2,2,7-m3gpppn、5
’‑
γ-mpppn、mgpppn、gpppn、gpppmnm、m7g(5’)ppp(5’)m62ampampcmpm3um(cap4)等以及最初在细菌和酵母中发现的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)帽子也在哺乳动物细胞中被鉴定出来。此外，市面上针对mrna的共转录加帽，已开发出加帽类似物如m7g(5’)ppp(5’)(2’omea)pg、m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)pg、m7g(5’)ppp(5’)(2’ome,m6a)pg等以及基于正义链rna病毒的mrna共转录帽子类似物
5.m7g(5’)ppp(5’)(2’omea)pu。由于现有帽子结构种类的增加以及mrna加帽率批量检测需求的增加，因此亟需开发批量检测mrna加帽率的技术方法。目前测定mrna帽子种类和加帽效率的方法主要包括：elisa法(例如中国专利申请cn105209633a利用抗m7g特异性抗体与帽子结构结合，通过二抗结合一抗，利用elisa定量检测rna加帽效率。该方法需要特定试剂做标准曲线，适用的帽子结构有限，因样品的不同，批间精确度容易存在差异)、hplc色谱法(例如中国专利申请cn105051213a，该方法需要使用适当的色谱柱，对加帽与未加帽样品的要求高，帽子结构需要有较大的分别才易于从色谱图中将加帽与未加帽样品峰分开)、imagej软件分析法(例如中国专利申请cn112626177a通过imagej软件分析跑胶图快速定量检测rna加帽效率，该方法仅可定量分析mrna加帽与未加帽样品量差异明显的样品，对于体外转录获得较高加帽率的mrna样品的检测效果有限)、hplc串联质谱法(例如中国专利申请cn112111558a利用hplc-ms测定牛痘病毒加帽酶活性的方法。该方法借助质谱可精确的分析样品的加帽率，但设备要求高，且该方法限定于酶法加帽的加帽率分析)、飞行时间质谱技术(例如中国专利申请cn114250268a利用飞行时间质谱技术快速检测mrna加帽效
率。该方法设备要求高，且使用的加帽与未加帽序列已限定，仅用于固定序列mrna的加帽率检测，适用范围有限)、rt-qpcr法(例如专利cn114395613b提供了一种利用rt-qpcr体外检测牛痘病毒加帽酶活性的方法，通过检测ct值差异，从而判定牛痘病毒加帽酶的活性。但是该方法仅适用于酶法加帽检测)等等。此外，现有的检测方法多为人工操作，并没有mrna样品的自动化处理以及批处理的方法，人工操作的批间样品可能存在较大差异，难以实现批间样品质量可控性的标准要求。
6.毛细管电泳(capillary electrophoresis，ce)技术是一种基于电荷和分子量大小差异分离分析生物分子(核酸、蛋白质、多肽、糖等)的方法。它利用电场将带电生物分子在带电毛细管中移动，分离不同大小、电荷和形状的分子。mrna是由核苷酸组成的单链生物大分子，带负电荷的性质。由于核酸mrna具有负电荷，因此在电场作用下，基于mrna的大小、形态和电荷密度的不同可在毛细管中移动并差异分离。mrna分离的具体过程涉及到许多因素，包括缓冲液的ph值、离子浓度和类型、毛细管材料的类型和尺寸等等。在实际应用中，需要根据不同的样品和实验目的进行调整和优化。通过优化实验条件，可以实现高效、高分辨率核酸样品的分离和定量。总之，毛细管电泳技术在生物医学、分子生物学、食品科学等领域中应用广泛。
7.中国专利申请cn115678968a公开了一种利用毛细管电泳检测mrna加帽效率的方法。该专利采用人工操作的方法，主要用于检测m7gpppn帽子结构，检测对象相对单一；该专利设计探针所选位点为5’utr的5’端第10～85位区域内核苷酸，探针设计并非从头设计，因此探针可选的序列区间受限；由于从头设计的探针还会出现在毛细管电泳中未加帽序列与加帽序列电泳峰更难区分的情况，因此需要具有更好分辨率的检测方法技术，然而，该专利基于其方法所获得的结果峰图并不独立反而黏连在一起，会影响加帽率检测结果计算的准确性；该专利设计的dna探针与供试mrna结合后，需要进行两次酶解，即在rnase酶解后还需dnase酶解。
8.因此，开发一整套简单、经济、高效、批量、分辨率高的自动化处理检测mrna加帽效率的方法，是mrna药物研究和药物生产质检亟需解决的问题之一。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mrna加帽率的方法。
10.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
11.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mrna加帽率的方法，包括如下步骤：
12.(1)根据待测mrna的5’utr区序列设计杂交探针；
13.(2)将所述杂交探针与待测mrna变性、退火，得到杂合序列；
14.(3)利用rna水解酶定向切割所述杂合序列，纯化后再经高温变性解离，得到含有探针、加帽mrna和未加帽mrna的混合物；
15.(4)将步骤(3)提取到的混合物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果计算得到待测mrna的加帽率。
16.优选的，所述杂交探针与待测mrna反向互补。
17.优选的，所述杂交探针根据待测mrna的5’utr区序列自5’端第1～100个区域内碱基序列设计得到。
18.优选的，所述杂交探针的长度≥15nt。
19.优选的，所述待测mrna的帽子结构包括：天然的mrna 5’端的帽子结构、人工合成的具有修饰或未修饰的mrna 5’端的帽子结构类似物。
20.优选的，步骤(2)所述待测mrna与杂交探针的添加比例为1:1～1:5。
21.优选的，步骤(2)所述变性的条件为：90～100℃变性1～10分钟，所述退火为：70℃退火，-10℃/2分钟循环降至室温。
22.优选的，步骤(3)所述rna水解酶为rnase h、rnase hⅰ和rnase hⅱ中的一种。
23.优选的，步骤(3)所述高温变性解离的温度为70～100℃，时间为2～10分钟。
24.优选的，步骤(4)所述毛细管的长度为10～60cm。
25.优选的，步骤(4)所述毛细管电泳还包括反向电泳程序，反向电泳时间为10～60分钟，电泳时凝胶保存的温度为2～8℃。
26.本发明根据待测mrna的5’utr区序列设计杂交探针，再将杂交探针与待测mrna杂交得到杂合序列，对杂合序列进行酶解、纯化和高温变性解离，得到探针、加帽和未加帽mrna序列。利用自动化核酸样品处理系统以及灵敏度好、分辨率高、精确度准的毛细管电泳设备分析mrna加帽率，通过设置反向电泳程序，以及特定的灌制凝胶和保存凝胶的程序，可实现mrna加帽率的自动化批量定量检测，且一旦设定好程序，便无需复杂的操作即可稳定运行。并且将毛细管凝胶保存于2～8℃，可在24小时内维持凝胶性质的稳定性，编辑程序间隔重复平衡、灌胶，可获得稳定的mrna加帽率批量检测结果。
27.本发明的方法得到的毛细管电泳图谱特征峰基线平滑，信噪比高，加帽与未加帽样品的分子量虽然相近，但两者信号峰之间的分离度高。针对多个mrna加帽样品，通过单次灌胶，添加反向电泳程序，可多次进样电泳，从而获得多个样品的加帽率检测结果，实现批量检测。本发明操作简单，耗材成本低廉，实验结果精准、可重复，非常适用于mrna药物产业化中的质量检定。
附图说明
28.图1为实施例3中酶切加帽(g)探针的毛细管电泳图；
29.图2为实施例3中加帽(g)样品的毛细管电泳图；
30.图3为实施例3中未加帽(g)样品的毛细管电泳图；
31.图4为实施例3中加帽(g)与未加帽(g)混合样品的毛细管电泳图；
32.图5为实施例3中加帽(u)样品的毛细管电泳图；
33.图6为实施例3中内参marker(20nt、50nt、70nt和100nt)的毛细管电泳图。
具体实施方式
34.本发明提供了一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mrna加帽率的方法，包括如下步骤：
35.(1)根据待测mrna的5’utr区序列设计杂交探针；
36.(2)将所述杂交探针与待测mrna变性、退火，得到杂合序列；
37.(3)利用rna水解酶定向切割所述杂合序列，纯化后再经高温变性解离，得到含有探针、加帽mrna和未加帽mrna的混合物；
38.(4)将步骤(3)得到的混合物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果计算得到待测mrna的加帽率。
39.在本发明中，所述杂交探针与待测mrna反向互补。
40.在本发明中，所述杂交探针根据待测mrna的5’utr区序列自5’端第1～100个区域内碱基序列设计得到，杂交探针的长度≥15nt。
41.在本发明中，所述杂交探针还优选偶联有生物素，用于与链霉亲和素磁珠偶联进行纯化。
42.在本发明中，所述待测mrna的帽子结构包括：天然的mrna 5’端的帽子结构、人工合成的具有修饰或未修饰的mrna 5’端的帽子结构类似物，优选为，g、u、a、c帽子及其n核苷酸类似物(n≥1)。
43.在本发明中，步骤(2)所述待测mrna与杂交探针的添加比例为1:1～1:5。
44.在本发明中，步骤(2)所述变性的条件为：90～100℃变性1～10分钟，优选为95℃，5分钟。
45.在本发明中，步骤(2)所述退火为：70℃退火，-10℃/2分钟循环降至室温。
46.在本发明中，步骤(3)所述rna水解酶为rnase h、rnase hⅰ和rnase hⅱ中的一种，优选为rnase h。
47.在本发明中，rna水解酶酶切反应的温度为35～40℃，时间为1～4小时，优选为，37℃，3小时。
48.在本发明中，步骤(3)所述高温变性解离的温度为70～100℃，时间为2～10分钟，优选为80℃，3分钟。
49.在本发明中，步骤(2)、(3)所述过程在自动核酸提取仪上进行，所述自动核酸提取仪为：thermo scientific kingfisherapex核酸纯化系统或者roche magnapure lc全自动核酸纯化与加样系统，优选为thermo scientific kingfisherapex核酸纯化系统。
50.在本发明中，步骤(4)所述毛细管的长度为10～60cm。
51.在本发明中，步骤(4)所述毛细管电泳的时间为50～70分钟，优选为60分钟。
52.在本发明中，步骤(4)所述毛细管电泳还包括在每一针样品电泳完成后增加反向电泳10～60分钟的步骤，优选为20分钟。
53.在本发明中，进行步骤(4)所述毛细管电泳时还需要添加核酸内标电泳。
54.在本发明中，步骤(4)所述过程在毛细管电泳设备上进行，所述毛细管电泳设备为：beckman pa800或者sciex pa800plus。
55.在本发明中，步骤(4)所述毛细管电泳还包括酶切探针电泳的步骤，可用于检测设计探针是否存在自切割，因探针自切割影响结果的准确性。
56.在本发明中，步骤(4)所述毛细管电泳所用凝胶的储存温度为2～8℃，可在24小时内维持凝胶性质的稳定性，编辑程序间隔重复平衡、灌胶，可获得稳定的mrna加帽率批量检测结果。
57.在本发明中，所述mrna加帽率的检测方法可以广泛应用于基础生物学研究、临床诊断、药物开发及药物生产中mrna的质量控制应用。
58.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
59.实施例1
60.本实施例以未加帽的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，fluc)mrna和加帽的fluc mrna为检测对象。利用共转录法体外转录制备未加帽的和加帽的fluc mrna样品。
61.体外转录反应及mrna加帽检测样品的制备必须在完全无dnase/rnase的环境下进行，并且除非指定，所涉及的耗材、试剂、缓冲液等都要求无核酸酶。
62.(1)体外转录制备常规密码子优化的未加帽fluc mrna样品
63.利用含有fluc基因序列的线性化dna质粒，经过除酶纯化后作为转录模板，使用市售商用的t7体外转录试剂盒进行转录合成。反应体系参照表1所示。
64.表1未加帽的mrna体外转录体系
65.组分20μl的反应体系(μl)dnase/rnase-free water6gtp(100mm)2atp(100mm)2utp1(100mm)2ctp1(100mm)210x transcription buffer2dna template(2μg)1000ng/μl2t7rna polymerase mix2总体积20
66.按照上述体系将各组分添加到无酶的200μl pcr管中，混匀离心后置于pcr仪上37℃反应2小时。转录反应结束后，每个体系加入2u dnaseⅰ继续37℃反应15分钟以去除模板dna。使用变性琼脂糖凝胶电泳检测合成mrna的完整性，检测合格后，纯化获得未加帽的mrna样品，使用微量紫外分光光度计检测mrna的浓度。常规密码子优化的萤火虫荧光素酶未加帽的fluc mrna序列如seq id no.1所示。
67.(2)体外转录制备常规和复制型密码子优化加帽的fluc mrna样品
68.利用含有fluc基因序列的线性化dna质粒，经过除酶纯化后作为转录模板，使用市售商用的t7体外转录试剂盒进行转录合成，反应体系参照表2所示，帽子类似物依据常规与复制型的模板分别使用商售m7(3’omeg)(5’)ppp(5’)(2’omea)pg(g帽子，之后以g代称)或m7g(5’)ppp(5’)(2’omea)pu(u帽子，之后以u代称)制备常规密码子优化的fluc加帽样品和复制型密码子优化的fluc加帽样品。复制型密码子优化的未加帽fluc mrna序列如seq id no.2所示。
69.表2加帽的mrna体外转录体系
70.组分20μl的反应体系(μl)dnase/rnase-free water4.4gtp(100mm)2atp(100mm)2utp1(100mm)2
ctp1(100mm)2g帽子/u帽子(100mm)1.610x transcription buffer2dna template(2μg)1000ng/μl2t7rna polymerase mix2总体积20
71.按照上述体系将各组分添加到无酶的200μl pcr管中，混匀离心后置于pcr仪上37℃反应2小时。转录反应结束后，每个体系加入2u dnaseⅰ继续37℃反应15分钟以去除模板dna。使用变性琼脂糖凝胶电泳检测合成mrna的完整性，检测合格后，纯化后获得加帽的mrna样品，使用微量紫外分光光度计检测mrna的浓度。
72.实施例2
73.制备mrna加帽率检测的上机样品。
74.毛细管电泳上机样品制备所用的mrna使用实施例1制备的未加帽的mrna样品以及两种加帽的mrna样品。委托上海生工有限公司合成两种杂交探针并偶联生物素：
75.probe g(seq id no：3)：aatactaguuuauucucccu/3bioteg/
76.probe u(seq id no：4)：aaaatcuuuuggcgucgugu/3bioteg/
77.将实施例1合成的mrna与各自的探针按照表3的体系进行变性退火。自动化样品处理的反应程序见表4。
78.表3mrna与探针变性退火
[0079][0080]
上述组分添加完成后，混匀离心。
[0081]
将表3混合后的样品移取至96孔深孔板中，置于thermo scientific kingfisherapex核酸纯化系统的操作盘，按照表4设置自动化mrna样品处理程序(处理过程中加入磁珠用于纯化探针与mrna的杂合片段)。
[0082]
表4自动化mrna样品处理程序
[0083][0084][0085]
通过上述程序，完成mrna加帽率检测样品的纯化，样品降至室温后即可使用毛细管电泳上机检测。
[0086]
实施例3
[0087]
本实施例使用毛细管电泳设备检测mrna的加帽率。使用的上机样品为实施例2中处理获得的上机样品：未加帽(g)上机样品、加帽(g)上机样品、未加帽(g)与加帽(g)等质量混合的上机样品、加帽(u)上机样品。用无酶水调整至20μl的检测上样体积，即可上机检测。
[0088]
毛细管电泳使用的条件为：毛细管长度使用60cm，毛细管电泳的温度为30℃，电泳电压为30kv，紫外光采集波长为254nm，进样时间为15秒。凝胶的保存温度为8℃。设定程序顺序如表5。
[0089]
表5自动化mrna(g)加帽率检测程序
[0090][0091][0092]
为了检测探针中是否存在自切割位点，影响探针的反应效率，在首次测试时，需要增加单独酶切探针并跑毛细管电泳这一步。本实施例以酶切探针g毛细管电泳作为演示(表5，编号1)，结果见图1。如图1所示为酶切探针g毛细管电泳图，探针为单一峰，说明利用计算机辅助筛选的探针无自切割位点，在理论上具有良好的杂交性能，适用于mrna加帽率的检测。
[0093]
体外共转录加帽反应中，由于帽子结构和核苷酸g存在竞争关系以及加帽效率的差异，反应体系中会存在加帽的mrna和未成功加帽的mrna。当用rnase h定向酶切后，可利用磁珠通过探针上的生物素标签特异性捕获与探针杂交区域互补的mrna片段，经过高温变性后，与探针互补区域的mrna片段(含加帽和未成功加帽的mrna片段)、探针就解离在溶液中，经过毛细管电泳会产生各个片段电泳快慢的差异，从而将各个片段在毛细管电泳图上区分开，通过加帽mrna与总mrna(含加帽mrna和未加帽mrna)的峰面积比可计算出加帽率。
[0094]
通过软件计算获得各个峰的峰面积比例(图2，表7)，依据表7的数值可得mrna加帽(g)样品的加帽率为4.71/(0.93+4.71)*100％＝83.51％。
[0095]
表7mrna加帽(g)、未加帽样品各个峰的峰面积比例
[0096]
pk#nametimecorrected areacorrected area percent1探针42.485432.7894.362样品中的未加帽峰44.6553.730.933样品中的加帽峰44.92271.104.71
[0097]
图3为利用毛细管电泳未加帽(g)样品，该样品仅含有探针峰和未加帽(g)样品峰。
[0098]
图4为加帽(g)与未加帽(g)混合样品的毛细管电泳图，图中标注了探针、未加帽(g)和加帽(g)的出峰位置，图4混合样品中探针、未加帽(g)和加帽(g)的峰型与图2单独跑加帽(g)样品的峰型一致。
[0099]
图5为加帽(u)样品的毛细管电泳图，通过软件计算获得各个峰的峰面积比例(表8)，可得u帽子(图5)的加帽率为27.46/(7.49+27.46)*100％＝78.57％。
[0100]
表8 mrna加帽(u)、未加帽样品各个峰的峰面积比例
[0101]
pk#nametimecorrected areacorrected area percent1探针41.883311.4665.052样品中的未加帽峰44.55381.277.493样品中的加帽峰44.701398.1527.46
[0102]
此外，通过添加内参marker(20nt、50nt、70nt和100nt)(图6)可以监测仪器、配件和程序的稳定状态，同时利用内标和软件自带的功能可精确分析样品的分子量。因而，本发明是一种非常适用于mrna加帽率批量检测的方法。
[0103]
实施例3中各个图谱特征峰基线平滑，信噪比高，加帽与未加帽样品的分子量虽然相近，但两者信号峰之间的分离度高，因此，本发明可根据待测mrna的序列设计合成探针，通过待测mrna与探针的杂交保护mrna免受rna水解酶的降解，经过纯化、高温变性后获得mrna 5’端含帽子结构区域的序列。利用自动化核酸样品处理系统以及灵敏度好、分辨率高、精确度准的毛细管电泳设备分析mrna加帽率，通过设置反向电泳程序，以及特定的灌制凝胶和保存凝胶的程序，可实现mrna加帽率的自动化批量定量检测，且一旦设定好程序，便无需复杂的操作即可稳定运行。本发明的方法操作简单，耗材成本低廉，实验结果精准、可重复，非常适用于mrna药物的产业化中的质量检定。
[0104]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mrna加帽率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据待测mrna的5’utr区序列设计杂交探针；(2)将所述杂交探针与待测mrna变性、退火，得到杂合序列；(3)利用rna水解酶定向切割所述杂合序列，纯化后再经高温变性解离，得到含有探针、加帽mrna和未加帽mrna的混合物；(4)将步骤(3)提取到的混合物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳结果计算得到待测mrna的加帽率。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交探针与待测mrna反向互补；所述杂交探针根据待测mrna的5’utr区序列自5’端第1～100个区域内碱基序列设计得到；所述杂交探针的长度≥15nt。3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测mrna的帽子结构包括：天然的mrna5’端的帽子结构、人工合成的具有修饰或未修饰的mrna5’端的帽子结构类似物。4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述待测mrna与杂交探针的添加比例为1:1～1:5。5.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述变性的条件为：90～100℃变性1～10分钟，所述退火为：70℃退火，-10℃/2分钟循环降至室温。6.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述rna水解酶为rnaseh、rnasehⅰ和rnasehⅱ中的一种。7.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述高温变性解离的温度为70～100℃，时间为2～10分钟。8.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述毛细管的长度为10～60cm。9.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(4)所述毛细管电泳还包括反向电泳程序，反向电泳时间为10～60分钟，电泳时凝胶保存的温度为2～8℃。

技术总结
本发明提供了一种利用毛细管电泳技术自动化批量检测mRNA加帽率的方法，属于生物检测技术领域。将根据待测mRNA的5’UTR区序列设计的杂交探针与待测mRNA杂交得到杂合序列，对杂合序列进行酶解、纯化和高温变性解离，得到探针、加帽和未加帽mRNA序列。用毛细管电泳设备分析mRNA加帽率，通过设置反向电泳程序，以及特定的灌制凝胶和保存凝胶的程序，可实现mRNA加帽率的自动化批量定量检测。本发明得到的毛细管电泳图谱特征峰基线平滑，信噪比高，加帽与未加帽样品的分子量虽然相近，但两者信号峰之间的分离度高。本发明操作简单，耗材成本低廉，实验结果精准、可重复，非常适用于mRNA药物产业化中的质量检定。产业化中的质量检定。产业化中的质量检定。


技术研发人员：向虹 洪超 陈昶旭 田原 谢忠平 廖国阳 谢天宏 高羽 岳磊 李华 戴永娟 余娜
受保护的技术使用者：中国医学科学院医学生物学研究所
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/28