关键基因在体外调控卵母细胞GVBD的用途及干扰片段

关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途及干扰片段
技术领域
1.本发明属于基因学技术领域，尤其涉及一种关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途及干扰片段。


背景技术：

2.卵母细胞的成熟是动物胚胎体外生产的关键组成，随着辅助生殖技术和克隆技术发明的不断深入以及新兴生物技术的飞速发展，动物生殖发育、动物遗传育种和动物种质创新等生物发明对体外获得高质量卵母细胞的需求愈发浓烈。近年来，随着卵母细胞体外成熟发明的日趋深入，卵母细胞成熟机理的发明已有大量报道，在一定程度上提高了卵母细胞体外成熟质量，但与体内成熟的卵母细胞相比，不论是成熟率还是成熟质量方面依然存在较大差异。
3.与其他细胞相比，卵母细胞具有分化独特且复杂的特征，哺乳动物卵母细胞的生长和发育与围绕卵母细胞的颗粒细胞以及包裹卵丘卵母细胞复合体的体细胞都具有密切和相互依赖的关系(gilchristetal.,2008)，从有腔卵泡中取出时，卵母细胞仍在完成最后的生长和分化步骤，这是提供卵母细胞后续体外发育能力的基础，即能够维持卵母细胞受精和后续胚胎发育所需能力。从胚胎的角度看，目前人们对于卵母细胞成熟的发明主要体现在维持卵母细胞质量这一方面，尤其是利用相关成熟培养因子，减少细胞机能的退化和抑制细胞体外损伤，并通过多种激素及促生长因子提高卵母细胞成熟率和可利用率。，目前也有大量的包括模拟哺乳动物体内生存环境，或构建胚胎样结构和子宫内膜组织，以及使用生物工程来延长卵母细胞寿命等方面的发明。
4.生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown，gvbd)，作为卵母细胞成熟起始的标志，对于校正卵母细胞成熟进程和维持卵母细胞胞质成熟与核成熟的一致性起到至关重要作用，gvbd的发生决定了卵母细胞成熟。目前，虽然有大量卵母细胞成熟机制的发明，但是对于gvbd发生的分子机制和其受到的具体调控因素的发明缺少，因此，需要加深对调控卵母细胞gvbd发生的分子机制进行细致发明，进而改善卵母细胞胞质成熟和核成熟质量，为获得体外高质量成熟的卵母细胞奠定基础，对动物生殖与发育进程的发明提供重要理论参考。
5.猪不仅是畜牧产业重要的农场动物，更作为生物医学试验的模型动物。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中，不能明确猪卵母细胞gvbd发生的时间点，没有通过不同发育时间段gv期和gvbd期卵母细胞高通量组测序，分析猪卵母细胞gvbd前后rna转录的差异表达、p38mapk磷酸化及相关分子指标变化，不能明确卵母细胞gvbd发生的分子调控机制，不能为明确卵母细胞成熟分子机制提供了重要理论参考，使得获得高质量动物卵母细胞及推动动物胚胎工程发展和动物生产实用性受限。


技术实现要素：

7.为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种关键基因在体外调
控卵母细胞gvbd的用途及干扰片段。本发明以猪卵母细胞为实验材料，对卵母细胞gvbd进行了大量摸索，并最终明确了猪卵母细胞gvbd发生的时间点，同时完成了不同发育时间段gv期和gvbd期卵母细胞高通量组测序，并且探究了猪卵母细胞gvbd前后rna转录的差异表达、p38mapk磷酸化及相关分子指标变化，最终揭示了卵母细胞gvbd发生的分子调控机制，为明确卵母细胞成熟分子机制提供了重要理论参考，为进一步获得高质量动物卵母细胞及推动动物胚胎工程发展和动物生产的进步奠定了坚实基础。
8.所述技术方案如下：一种关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途，所述关键基因为rap1b。dna如seq id no：9，并从卵母细胞中克隆合成。
9.在一个实施例中，关键基因rap1b在体外通过介导mekk6/p38mapk联络信号通路调控卵母细胞的gvbd应用。
10.在一个实施例中，所述关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途中关键基因的筛选方法包括：
11.通过对不同发育时间段gv期和gvbd期卵母细胞进行转录组测序分析，确定卵母细胞gvbd前后转录差异，筛选出差异表达的基因，构建分子调控网络和信号通路网络，筛选出调控卵母细胞gvbd的关键因子rap1b；
12.在一个实施例中，筛选出差异表达的基因包括mapkapk3、ccsap、baz2a、kdm6b、rap1b、ak6、cdt1、klf2、adgra3、cep57、ccsap20、wrnip1，根据ncbi网站查询基因序列，使用primer5引物设计软件设计引物，设置gv期卵母细胞为对照组，gvbd期卵母细胞为实验组，对两组卵母细胞分别进行qrt-pcr检测，然后对rap1b基因在卵母细胞发育过程中不同时间点mrna水平的表达进行检测、rap1b在不同时期卵母细胞中的定位、高通量测序预测rap1b信号转导途径模式，通过高通量测序结果的预测，确定rap1b在gvbd过程中，作为mek6/p38mapk联络上游信号分子起转导信号的作用。
13.在一个实施例中，利用所述用途中的关键基因构建的体外过表达载体，dna如seq id no：10。
14.在一个实施例中，所述的过表达载体的构建方法包括：
15.步骤1，rap1b引物设计及扩增，根据ncbi网站提供的猪rap1b的基因序列以及p-easy-t3中spei酶切位点两侧序列，设计克隆引物序列，克隆引物序列包括seq id no：1、seq id no：2；
16.步骤2，琼脂糖凝胶电泳和胶回收；
17.步骤3，peasy-t3载体与rap1b的连接和转化；peasy-t3载体的dna序列为seq id no：11；
18.步骤4，菌液pcr检测及测序；
19.步骤5，线性化rap1b，分别使用质粒提取试剂盒，胶回收的试剂盒得到插入rap1b的peasy-t3载体质粒，使用限制性内切酶spei-hf，在冰上建立反应体系；
20.peasy-t3载体质粒的dna序列为seq id no：12：
21.步骤6，过表达rap1bmrna的获取，使用mmessaget7ultra转录试剂盒，对插入rap1b的peasy-t3载体质粒dna进行反转录，并进行poly(a)尾修饰，获得过表达rap1bmrna。
22.在一个实施例中，在步骤1中，克隆反应条件为：95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s；40个循环，4℃保存；反应体系包括：taqdna聚合酶(2
×
)10μl，primerf/r(10μm)1.6μl，cdna2μ
l，ddh2o6.4μl。
23.在一个实施例中，在步骤3中，连接：将胶回收的pcr扩增产物，与peasy-t3cloningvector混合，室温下反应10min。反应结束后将离心管置于冰上，反应体系包括：pcrproduct0.5-4μl，peasy-t3cloningvector1μl；
24.转化包括：加连接产物于50μltrans1-t1感受态细胞中，混匀，冰浴30min，放入42℃热水中，热激30sec，置于冰上2min；随后将感受态细胞加入250μllb培养基中，200rpm、37℃培养1h，使菌体复苏；将菌液进行离心，弃上清后取浓缩的100ul菌液，并涂在含有50ug/ml氨苄的lb固体培养平板中，37℃倒置，避光培养16-20h。
25.步骤4中，pcr检测：将获得的菌落加入含amp的lb液体培养基中，在37℃，180rpm振荡培养12-16h；以获得的菌液为模板，进行引物pcr扩增，鉴定插入片段；反应体系包括：taqdna聚合酶(2
×
)10μl，primerf/r(10μm)2μl；
26.反应条件：95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s；40个循环，4℃保存；然后进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，检测阳性克隆；
27.步骤5中，在冰上建立反应体系包括：
28.反应组分：peasy-t3载体质粒dna1μg，10xnebbuffer5μl，restrictionenzyme，1μl，nuclease-freewater50μ；反应条件为：37℃，15min；80℃，20min；然后进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。
29.本发明的另一目的在于提供一种利用所述用途中的关键基因构建的体外干扰片段。
30.在一个实施例中，根据rap1b基因，设计三种不同干扰片段，分别对应起始点15、100、383位点，分别为rap1b-15、rap1b-100、rap1b-383；rap1b-15的扰低序列为seq id no：5、seq id no：6，rap1b-100的扰低序列为seq id no：7、seq id no：8，rap1b-383的扰低序列为seq id no：3、seq id no：4。
31.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：生猪产业是我国畜牧业的支出产业，卵母细胞有效成熟是生猪繁殖的保障。卵母细胞成熟是动物胚胎工程发展的基础，卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown，gvbd)是卵母细胞核成熟的启动标志。但目前，卵母细胞gvbd是如何启动的，涉及到哪些分子变化，这些分子又是如何调控卵母细胞核成熟启动的，这些还都没有明确答案。为明确卵母细胞成熟起始的分子机制，本发明以猪卵母细胞为对象，检测了不同成熟时间点的卵母细胞核状态，明确卵母细胞gvbd发生的时间点；设置培养0h、19h以及添加信号通路抑制剂至19h三种不同方式，以体外培养0h为对照，分析不同培养方式下卵母细胞gvbd发生率、纺锤体形态、核纤层蛋白磷酸化、p38mapkmrna及蛋白表达水平，分析响应卵母细胞gvbd的调控分子；以gv和gvbd期卵母细胞为材料进行高通量测序分析，筛选出调控gvbd发生的关键基因rap1b；通过构建rap1b体外转录载体和合成干扰sirna，以显微注射方式分别进行过表达和扰低和，分析mkk6、p38及其磷酸化蛋白的表达模式，揭示rap1b调控卵母细胞gvbd的分子机制，结果如下：
32.1.卵母细胞体外成熟培养0-16h，83.33％处于gv期，纺锤体未见明显组装，hochest33342染色结果显示染色质呈现圆环状或弥散状分布；16.66％发生染色体凝集；培养至19h时，卵母细胞核发生凝集，免疫荧光染色结果显示纺锤体明显组装，呈现丝状错落分布在细胞核处，gvbd发生率达到63.46％，提示卵母细胞进入gvbd期；qrt-pcr、蛋白免疫
印迹分析以及免疫荧光染色结果显示，p38mapk信号通路在gvbd过程中p38发生磷酸化活化，磷酸化的p38mapk在gvbd之前定位在胞质中，在gvbd过程中向细胞核周围迁移；加入p38mapk特异性抑制剂sb203580后，p38mapk磷酸化受到抑制，p38mapkmrna表达水平显著下调(p＜0.05)，gvbd率显著下降(p＜0.05)，gvbd受到抑制。这些结果表明，p38mapk磷酸化调控卵母细胞gvbd发生。
33.2.为揭示卵母细胞gvbd分子机制，对gv和gvbd期卵母细胞进行单细胞高通量测序，结果显示，样品组内重复性好，相关系数最低为0.995；组间存在不同层次聚类，显著上调基因30个，显著下调基因52个；筛选显著上调或下调各6个基因进行qrt-pcr分析发现，mapkapk5、baz2a、kdm6b、rap1b、wrnip1表达水平随卵母细胞gvbd发生而上调，casp、ak6、klf2、adgra3、cep57随着卵母细胞发育到gvbd期而显著降低，其中，rap1b基因表达量呈现最显著上调(p＜0.05)；免疫荧光染色结果显示，rap1b在卵母细胞gv期时散乱分布在细胞质中，随着卵母细胞进入gvbd期，rap1b向细胞核凝集；上述结果表明，rap1b是调控gvbd发生的潜在关键基因。
34.3.通过反转录pcr获得卵母细胞cdna，进行扩增获得rap1b序列，插入到线性化载体peasy-t3中，构建rap1b体外转录质粒，利用mmessagemmachine
tm
t7ultra转录试剂盒获得rap1brna，进行poly(a)加尾，纯化，获得rap1bmrna；根据ncbi提供的rap1b基因序列，设计并筛选rap1bsirna干扰序列；明确卵母细胞成熟培养6h时进行显微注射，不影响gvbd发生率(61％)；显微注射rap1b的sirna干扰片段和mrna，基因水平检测显示19h卵母细胞中rap1b基因表达分别显著扰低和过表达，wb结果显示，19h过表达组rap1b蛋白表达显著上调；进一步分析结果显示，过表达组mekk6磷酸化显著上调，p38磷酸化显著升高，核纤层蛋白lamina/c磷酸化水平升高，gvbd明显促进，上调至71.7％；扰低组结果显示，mekk6磷酸化水平下降，p38磷酸化受到抑制，核纤层蛋白lamina/c活化不明显，染色质呈现环状或弥散分布在细胞质中，gvbd发生受到抑制，下调至26.6％。
35.本发明阐明了rap1b可通过介导p38mapk信号通路调控猪卵母细胞gvbd发生，对丰富和完善卵母细胞成熟机理提供了重要理论参考，对提高卵母细胞成熟质量和促进动物胚胎工程乃至生猪产业的发展将起到积极推动作用。
附图说明
36.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
37.图1是本发明实施例提供的关键基因的筛选方法流程图；
38.图2是本发明实施例提供的如样品间相关性分析热图；
39.图3是本发明实施例提供的样品间层次聚类分析图；
40.图4是本发明实施例提供的样品间及组间维恩图分析图；
41.图5是本发明实施例提供的明显差异表达基因(dge)图；
42.图6是本发明实施例提供的对每组deg作表达量热图；
43.图7是本发明实施例提供的不同发育时期猪卵母细胞差异基因表达模式图；
44.图8是本发明实施例提供的不同发育时期rap1bmrna表达模式图；
45.图9是本发明实施例提供的不同发育时期rap1b免疫荧光染色图；
46.图10是本发明实施例提供的rap1b信号转导途径模式图；
47.图11是本发明实施例提供的过表达载体的构建与体外转录中琼脂糖凝胶电泳结果显示其条带大小与目的条带大小一致图；
48.图12是本发明实施例提供的过表达载体的构建与体外转录中将目的条带进行胶回收并纯化，通过凝胶电泳结果显示纯化效果满足实验要求图；
49.图13是本发明实施例提供的过表达载体的构建与体外转录中将条带大小同rap1b片段一致的菌液进行测序。对测序正确的菌液提取质粒，并进行验证图；
50.图14是本发明实施例提供的过表达载体的构建与体外转录中使用限制性内切酶对环状质粒进行切割并验证图；
51.图15是本发明实施例提供的过表达载体的构建与体外转录中rap1b-peasy-t3电泳图；
52.图16是本发明实施例提供的显微注射后的荧光效果图；
53.图17是本发明实施例提供的注射不同sirna片段对rap1b基因表达的影响图；
54.图18是本发明实施例提供的扰低和过表达后卵母细胞中rap1bmrna表达模式图；
55.图19是本发明实施例提供的干扰和过表达后rap1b蛋白表达效果图；
56.图20是本发明实施例提供的干扰和过表达后rap1b蛋白表达柱状图；
57.图21是本发明实施例提供的扰低和过表达后卵母细胞中纺锤体形态及定位图；
58.图22是本发明实施例提供的扰低和过表达后卵母细胞中p-lamina/c免疫荧光染色图；
59.图23是本发明实施例提供的扰低和过表达后卵母细胞中p-p38免疫荧光染色图；
60.图24是本发明实施例提供的扰低和过表达后卵母细胞中相关蛋白westernblot检测图；
61.图25是本发明实施例提供的p-p38mapk蛋白图；
62.图26是本发明实施例提供的p-mekk6蛋白图；
63.图27是本发明实施例提供的p38mapk蛋白图；
64.图28是本发明实施例提供的mekk6蛋白图。
具体实施方式
65.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
66.gvbd，作为卵母细胞成熟起始的标志，决定了卵母细胞成熟。目前，对于卵母细胞gvbd发生的分子机制和其受到的具体调控因素的发明较少，因此，需要加深对调控卵母细胞gvbd发生的分子机制进行细致发明，进而改善卵母细胞胞质成熟和核成熟。发明gvbd调控机制可为获得体外高质量成熟的卵母细胞奠定基础，也可对动物生殖与发育进程的发明提供重要理论参考。
67.猪不仅是畜牧产业重要的经济动物，更作为生物医学试验的模型动物，本发明以猪卵母细胞为实验材料，对猪卵母细胞gvbd进行大量摸索，并最终明确猪卵母细胞gvbd发
生的时间点，同时完成不同发育时间点gv期和gvbd期卵母细胞高通量组测序，并且探究了猪卵母细胞gvbd前后p38mapk信号通路磷酸化及相关分子指标变化，最终揭示卵母细胞gvbd发生的分子调控机制，为明确卵母细胞成熟发育提供重要理论参考，为进一步获得高质量动物卵母细胞及动物胚胎奠定基础，为推动动物胚胎工程发展和动物生产的进步奠定坚实基础。
68.本发明实施例提供一种关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途，所述关键基因为rap1b。从卵母细胞中克隆合成。dna序列为seq id no：9atgcgtgagtataagctagtcgttcttggctcaggaggcgttggaaaatctgctctgaccgtacaatttgttcaaggaattttt gttgaaaaatatgatcctacgatagaagattcttatagaaagcaagttgaagtagatgcgcaacagtgtatgcttgaaatcttggatactgcaggaacggaacaatttacagcaatgagggacttgtacatgaaaaatggacaaggctttgcattagtttattccatcacagcacagtccacatttaatgatttacaagatctgagagaacagattcttcgagttaaagacactgatgatgttccaatgatcctggttggtaataagtgtgacttggaagatgaaagagttgtaggaaaggaacaaggtcaaaatctagcaagacaatggaacaactgtgcattcttagaatcctctgcaaaatcaaaaataaatgttaatgagatcttttatgacttagtgcgacaaattaacagaaaaactccagtgcctgggaaggcccgcaaaaagtcatcatgtcaactgctttaa。
69.在一优选实施例中，关键基因rap1b在体外通过介导mekk6/p38mapk联络信号通路调控卵母细胞的gvbd应用。
70.如图1所示，提供一种所述关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途中关键基因的筛选方法包括：
71.s1，通过对不同发育时间段gv期和gvbd期卵母细胞进行转录组测序分析，确定卵母细胞gvbd前后转录差异，筛选出差异表达的基因；
72.s2，构建分子调控网络和信号通路网络；
73.s3，筛选出调控卵母细胞gvbd的关键因子rap1b；
74.本发明实施例提供一种利用所述用途中的关键基因构建的体外过表达载体。dna如seq id no：10：
75.gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattggatcgcccttatgcgtgagtataagctagtcgttcttggctcaggaggcgttggaaaatctgctctgaccgtacaatttgttcaaggaatttttgttgaaaaatatgatcctacgatagaagattcttatagaaagcaagttgaagtagatgcgcaacagtgtatgcttgaaatcttggatactgcaggaacggaacaatttacagcaatgagggacttgtacatgaaaaatggacaaggctttgcattagtttattccatcacagcacagtccacatttaatgatttacaagatctgagagaacagattcttcgagttaaagacactgatgatgttccaatgatcctggttggtaataagtgtgacttggaagatgaaagagttgtaggaaaggaacaaggtcaaaatctagcaagacaatggaacaactgtgcattcttagaatcctctgcaaaatcaaaaataaatgttaatgagatcttttatgacttagtgcgacaaattaacagaaaaactccagtgcctgggaaggcccgcaaaaagtcatcatgtcaactgctttaaagggcgatcccaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccg
id no：11：
80.gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattggatcgcccttagggcgatcccaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccattcgccattcaggctgcg
caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactata；
81.步骤4，菌液pcr检测及测序；
82.步骤5，线性化rap1b，分别使用质粒提取试剂盒，胶回收的试剂盒得到插入rap1b的peasy-t3载体质粒，使用限制性内切酶spei-hf，在冰上建立反应体系；
83.peasy-t3载体质粒的dna序列为seq id no：12：
84.gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattggatcgcccttatgcgtgagtataagctagtcgttcttggctcaggaggcgttggaaaatctgctctgaccgtacaatttgttcaaggaatttttgttgaaaaatatgatcctacgatagaagattcttatagaaagcaagttgaagtagatgcgcaacagtgtatgcttgaaatcttggatactgcaggaacggaacaatttacagcaatgagggacttgtacatgaaaaatggacaaggctttgcattagtttattccatcacagcacagtccacatttaatgatttacaagatctgagagaacagattcttcgagttaaagacactgatgatgttccaatgatcctggttggtaataagtgtgacttggaagatgaaagagttgtaggaaaggaacaaggtcaaaatctagcaagacaatggaacaactgtgcattcttagaatcctctgcaaaatcaaaaataaatgttaatgagatcttttatgacttagtgcgacaaattaacagaaaaactccagtgcctgggaaggcccgcaaaaagtcatcatgtcaactgctttaaagggcgatcccaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctc
ttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattgtaatacgactcactata；
85.步骤6，过表达rap1bmrna的获取，使用mmessaget7ultra转录试剂盒，对插入rap1b的peasy-t3载体质粒dna进行反转录，并进行poly(a)尾修饰，获得过表达rap1bmrna。
86.本发明实施例提供一种利用所述用途中的关键基因构建的体外干扰片段。
87.在一优选实施例中，根据rap1b基因，设计三种不同干扰片段，分别对应起始点15、100、383位点，分别为rap1b-15、rap1b-100、rap1b-383；rap1b-15的扰低序列为seq id no：5、seq id no：6，rap1b-100的扰低序列为seq id no：7、seq id no：8，rap1b-383的扰低序列为seq id no：3、seq id no：4。
88.实施例1，p38磷酸化调控卵母细胞gvbd发生机理的分析。
89.1.随着辅助生殖技术和克隆技术发明的不断深入和新兴生物技术的发展，动物生殖与发育发明领域对体外卵母细胞成熟质量的要求日益增加(zhangetal.,2022)，而卵母细胞与其他细胞相比，具有分化独特且复杂的特点，发明猪卵母细胞体外成熟成为体外生产猪胚胎及利用猪体细胞核移植技术进行克隆猪生产的关键环节(chenetal.,2021)。一般认为，gvbd，作为卵母细胞成熟启动的标志，调控卵母细胞后续成熟。目前卵母细胞体外成熟技术的发明取得了巨大进展，但仍缺乏对gvbd过程中分子事件的了解，导致提高体外成熟卵母细胞质量的努力收效甚微(tiwarietal.,2018)，因此，需要对卵母细胞gvbd发生分子机制进行深入探究，改善卵母细胞成熟质量。
90.gvbd的主要特征是染色质高度凝集、核仁消失及核膜破裂等；这表明卵母细胞在染色体凝聚之前必须积累适当信息，以便进行减数分裂恢复、受精和胚胎发育。在胚胎发育早期，原始生殖细胞通过有丝分裂增殖到一定数目后停止增殖(whelanetal.,2012)，在视黄酸的作用下进入减数第一次分裂前期成为初级卵母细胞，随后经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期，该时期染色质处于高度去凝集状态，外包重新形成核膜，此时期的卵母细胞称为gv期卵母细胞(endoetal.,2019)。有现有技术表明，mapk在gv期后，终止颗粒细胞和卵母细胞之间的间隙连接，并在磷酸化蛋白信号激活状态下，使卵母细胞发生gvbd。现有技术
证实，磷酸化的p38mapk信号转导，一定程度上改变了卵母细胞成熟和卵丘扩散相关的基因转录(yoonetal.,2017)，进而导致卵母细胞从gv期进入gvbd期。
91.由于缺乏对卵母细胞gvbd分子事件的了解，卵母细胞成熟时间的调控无法合理掌控，导致进一步提高卵母细胞成熟质量的效果较差。因此，通过明确卵母细胞gvbd的调控机制，可以施行有效阻断gvbd发生的方法，为卵母细胞的胞质成熟提供更为充足的发育时间，保障卵母细胞成熟。
92.2试验试剂耗材：2.2主要试剂，见表1。
93.表1主要试剂
[0094][0095][0096]
2.3主要仪器设备：2.4主要溶液配制，洗卵液配置：每1000ml蒸馏水添加药品质量如表2，最后使用ph仪调节ph为7.0-7.2。
[0097]
表2洗卵液
[0098][0099][0100]
成熟液配制：tcm199为成熟液母液，添加双抗和丙酮酸钠后，按照10ml体系配制，添加0.5ug/mllh、0.5ug/mlfsh和10ug/mlegf。
[0101]
操作液配制：1ltcm-199中加入0.1001gsodiumpyruvate、0.050gpg、0.060gsm，按照每50ml操作液添加0.1500gbsa。
[0102]
免疫荧光染色相关试剂：
[0103]
dpvbs-pva：将0.1000gpva溶于90ml去离子水中，再添加10mldpbs(10x)；
[0104]
清洗液：将1ul10％tritenx-100和1ultween添加到1mldpbs-pva中；
[0105]
1％封闭液：取9mlpbs，添加1ml0.1％tritionx-100，添加0.1000gbsa；
[0106]
透膜液：将1ml10％tritionx-100添加到9mldpbs-pva中；
[0107]
固定液：1g多聚甲醛加到22.5ml去离子水中，65℃水浴40min，搅拌10min，加入一滴1mol/lnaoh，继续搅拌直到底部粉末全部溶解，冷却至室温，加一滴1mol/l的hcl，加入2.5ml10倍dpbs，调节ph到7.2，过滤备用。
[0108]
westernbolt相关试剂配制：
[0109]
10x电泳缓冲液：甘氨酸144g，tris30.3g，溶于800ml超纯水，定容至1000ml；
[0110]
1x电泳缓冲液：100ml10x电泳缓冲液，900ml超纯水，10ml10％sds；
[0111]
1x转膜缓冲液：100ml10x电泳缓冲液，700ml超纯水，200ml甲醇；
[0112]
10xtbst：80gnacl，24.2gtris溶于800ml超纯水，调ph：7.6，定容至1000ml；
[0113]
1xtbst：100ml10xtbst，900ml超纯水，1mltween20；
[0114]
一抗、二抗的稀释：使用1xtbst浓度按照1：2000稀释后使用。
[0115]
3试验方法：
[0116]
3.1猪卵母细胞的获取及处理，卵母细胞获取方法如下：到当地屠宰场收集离体时间短未发生冷却的猪卵巢，收集后迅速放入添加双抗的36-39℃的生理盐水保温杯中，带回实验室；
[0117]
抽卵：使用10ml注射器，与卵巢呈30
°
斜面扎入3-8mm卵泡，轻吸卵泡液，将卵泡液
轻轻注入50ml37℃温热的离心管中备用；
[0118]
洗卵：将收集的卵泡液放入37℃恒温箱沉降5-10min，使用20ml注射器去掉上清液，用配置好的hepes缓冲液35ml倒入卵母细胞内容物，再沉降5-10min，反复三次，第三次不弃上清倒入细胞培养皿；
[0119]
捡卵：在体视显微镜下选取胞质均匀，含有三层以上颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体(cocs)，使用事先配置好的成熟培养液洗涤清洗四次；
[0120]
养卵：从洗涤中吸取卵母细胞放入事先配置好的卵母细胞成熟培养液，50枚卵母细胞每孔，38.5℃，5％二氧化碳浓度下培养。
[0121]
3.2猪卵母细胞去卵丘处理，使用200ml移液枪吸取成熟培养液中的猪卵母细胞，加入到1mg/ml事先配置的37℃透明质酸酶中，移液枪轻吹或者使用旋涡振荡仪震荡3min，使用1000ml移液枪将卵母细胞透明质酸酶混合液吸取到5ml细胞培养皿中，置于体视显微镜下并捡取去卵丘处理的卵母细胞，将卵母细胞放入事先准备好的操作液中，终止消化。捡取为卵母细胞质膜完整，透明带外围不存在颗粒细胞的卵母细胞。
[0122]
3.3免疫荧光染色，对去除颗粒细胞的卵母细胞进行固定，pbs清洗卵母细胞30s，将卵母细胞加入4％多聚甲醛4℃过夜或室温固定30min；用清洗液洗去多聚甲醛，将卵母细胞加入透膜液，在摇床上透膜30min；用清洗液清洗3次，每次5min洗去透膜液，加入封闭液摇床封闭60min；用清洗液清洗3次，每次5min，再加入α-微管蛋白-fitc荧光抗体或p-p38mapk抗体4℃过夜孵育；用清洗液清洗3次，每次5min，按照合适浓度加入hoechst33342染料；用dpbs-pva清洗3次，每次5min；在载玻片滴加10μl防荧光淬灭剂，将卵母细胞放到防荧光淬灭剂中盖片封存，荧光显微镜下观察。
[0123]
3.4qrt-pcr荧光定量分析：3.4.1猪卵母细胞rna提取与反转录，使用rneasyminikit(qiagen)rna提取试剂盒提取猪卵母细胞的总rna，具体的rna提取步骤如下：将50枚卵母细胞转移到1.5ml离心管中，加入350μlrlt，吹打混匀；加入3.5μlβ-巯基乙醇，抗氧化保护dna；加入350μl70％无水乙醇，吹打混匀；使用移液枪将液体转移至1.5ml吸附柱，12000r离心1min；倒掉下层液体，加入700μlbufferrw，12000r离心1min；倒掉下层液体，加入500μlbufferrpe，12000r，离心1min；倒掉下层液体，重复加入500μlbufferrpe，12000r，离心1min；更换底座，加入50μl无rna酶的水，12000r离心1min；转移到100μl的离心管中得到rna洗脱液。使用primescriptrt试剂盒(takara)进行反转录，具体转录步骤如下：取出-20℃的试剂盒，添加20μlmix，30μl无rna酶水，50μlrna洗脱液，放入pcr仪，反转录条件为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，将得到的cdna储存在-20℃。
[0124]
3.4.2荧光定量反应体系及步骤，使用dnaman引物设计软件和ncbi网站查询的rap1b，设计并由ncbi-blast网站筛选引物，由上海生工公司合成引物，引物序列如表1.5。使用sybrpremixextaqii(takara)和480实时pcr系统(罗氏系统)在96孔光学反应板中进行反应，反应体系：2
×
sybrgreenpcrmastermix10μl，pcr引物混合物(10μm)2μl，模板cdna2μl，ddh2o6μl；qrt-pcr反应条件如下：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s的40个两步循环，最后由95℃，15s组成的解离阶段，60℃，1min和95℃，15s。对于每个样品，通过三次重复获得ct值，使用2-δδct法分析mrna表达模式。
[0125]
3.5westernbolt蛋白印迹分析，将不同发育时期的猪卵母细胞进行脱卵丘处理，分别获得不同时期猪卵母细胞各120枚，使用pbs清洗卵母细胞后，尽量少吸液体吸入
rnase-freeep管中，加入20μlrapi细胞裂解液以及1％pmsf，液氮快速冷冻，反复冻融三次提取蛋白或待后续使用，-80℃保存；将ep管中的卵母细胞加入5μlloadingdye5xbuffer并混匀，置于95℃恒温加热台7-8min，得到变性后的蛋白裂解液；聚丙烯酰胺凝胶制备：清洗梳子和玻璃板，蒸馏水润洗，放在一起晾干(1mm玻璃板)，配制10％分离胶并加入蒸馏水压平静止凝固，倒出上层液体，吸干水分；配制5％浓缩胶，插上梳齿，静置使完全凝固；小心上样后，先以80v，40min进胶；再以120v，100min跑完；转膜：预先将pvdf膜裁剪好，泡于甲醇中数分钟后浸泡于transbuffers中，厚滤纸打开泡于transbuffers中；将凝胶从胶版剥离，marker处标记，放到负电极板上，盖上pvdf膜，300ma冰浴，转膜60-90min；封闭：配制5％脱脂奶粉封闭液，将胶室温封闭1-2h，50-60rpm；一抗结合：用tbst稀释一抗(1：1000)，一抗4℃过夜孵育；二抗结合：配制二抗(1：5000)，tbst稀释，1h室温孵育，40-50rpm，用tbst洗膜，分别洗5、10、15min；显影：配置发光液(a：b＝1：1)，用显影仪按照合适的曝光时间检测目的条带。
[0126]
4结果：4.1不同时间段卵母细胞核状态，猪卵母细胞在体外成熟培养的过程中，经历gv到gvbd期，后续完成减数分裂进程。结果显示，刚开始培养的卵母细胞绝大部分处于gv期，其主要特征是染色质散乱分布，免疫荧光染色后可见明显核膜。当卵母细胞进入gvbd期，核膜破裂，染色质凝集。
[0127]
本发明检测了卵母细胞gv-gvbd-mi期细胞核的状态图，0h时卵母细胞有核膜包被，处于gv期，细胞核呈现圆环的状态；随着卵母细胞发育，核膜逐渐破裂，破裂后染色质散乱分布在细胞质中；当进入gvbd期时，卵母细胞染色质凝集，呈花簇状。猪卵母细胞体外培养发育到不同时间点，各阶段所占比例如：在19h时卵母细胞发生gvbd，发生率为63.46％，而在16h时卵母细胞gvbd发生率为16.66％，可见猪卵母细胞在体外培养下，19h发生gvbd。
[0128]
4.2猪卵母细胞gvbd过程中纺锤体形态变化，猪卵母细胞纺锤体形态结构随卵母细胞成熟呈现出不同状态，gv期卵母细胞纺锤体定位在卵母细胞质中，染色质散乱分布，纺锤体未出现；gvbd期染色质高度凝集为染色体，出现明显的纺锤丝，其定位由细胞核周围逐渐向内靠拢。
[0129]
4.3gvbd发生过程中p38mrna水平和蛋白水平：4.3.1猪卵母细胞rna检验，本实验需用发育到不同时间段的卵母细胞提取rna，分别取5μl，采用琼脂糖凝胶电泳检测条带，使用标准对比18s和28s，条带清晰，说明实验用到的rna符合试验标准。
[0130]
4.3.2不同时期卵母细胞p38(mapk14)基因qrt-pcr分析，实时荧光定量pcr检测0h和19h猪卵母细胞中p38mrna的表达，相比0h时，19h猪卵母细胞中p38的mrna表达量显著上调(p＜0.05)。
[0131]
4.3.3p-p38蛋白的细胞定位，gv和gvbd期卵母细胞免疫荧光染色及分析后发现，gvbd时卵母细胞p-p38主要集中在卵母细胞凝集染色质周围，并且荧光强度较gv期呈现显著上调趋势(p＜0.05)说明p-p38参与卵母细胞gvbd调控。
[0132]
4.3.4p38、p-p38蛋白水平表达变化，采用westernblot检测并分析0h和19h卵母细胞p38及p-p38变化，检测灰度值并分析进行均一化处理，结果显示，19h时，p38蛋白表达量显著上调(p＝0.0012＜0.05)，磷酸化的p38蛋白表达量升高更为显著显著(p＝0.0002＜0.05)。
[0133]
4.4加入p38mapk信号通路抑制剂对猪卵母细胞gvbd进程的影响，为了进一步明确
p38mapk信号通路对猪卵母细胞gvbd的调控，加入p38mapk信号通路抑制剂sb203580后进一步检测各项指标，进一步明确p-p38调控卵母细胞gvbd的机制。
[0134]
4.4.1抑制剂sb203580对卵母细胞gvbd发生影响情况，在成熟培养液中添加p38mapk信号通路抑制剂sb203580观察染色质形态，结果显示，抑制剂sb20358显著下调猪卵母细胞gvbd发生率。
[0135]
4.4.2加入抑制剂sb203580培养猪卵母细胞到19h时，染色质仍处于弥散状态，未达到明显的gvbd状态。
[0136]
4.4.3不同培养体系下p38mapk基因的相对表达含量，分别对正常体系下培养的gv期卵母细胞，正常体系下gvbd期卵母细胞以及加入抑制剂培养至gvbd期的卵母细胞，提取rna，进行qrt-pcr检测，结果显示，抑制剂组卵母细胞中p38mapk表达量降低，显著低于gv期和gvbd期卵母细胞含量(p＜0.001)。
[0137]
4.4.4抑制剂培养后p38mapk信号通路蛋白表达及细胞中的定位，对不同培养体系卵母细胞进行免疫荧光染色处理，结果显示，正常培养至0h卵母细胞染色质呈絮状聚集在细胞核周围，p38的活化不明显；对正常培养至19h卵母细胞免疫荧光，结果显示，卵母细胞染色质凝集，磷酸化的p38活化明显增多，且主要集中在卵母细胞核周围；抑制剂培养至19h，结果显示磷酸化p38的活化受到明显抑制，染色质呈现凝集趋势，但未凝集。westernbolt检测结果显示，正常培养至19h，磷酸化的p38蛋白显著上调(p＜0.05)，且总的p38呈上升趋势；抑制剂组磷酸化p38蛋白的表达呈现低表达的趋势。
[0138]
4.4.5抑制剂培养后核纤层蛋白定位情况，核纤层蛋白免疫荧光结果，正常培养0h，核纤层蛋白集中在细胞核部位；在19h发生gvbd，核膜破裂，核纤层蛋白分散到细胞质中；抑制剂组中，未见明显gvbd，仍可见明显的核纤层蛋白，且集中在细胞核处。通过上述试验结果表明，p38mapk信号通路调控猪卵母细胞gvbd发生，是通过影响核纤层蛋白磷酸化使核膜发生裂解来实现的。
[0139]
5.猪卵母细胞成熟受到广泛关注，gvbd决定卵母细胞成熟。现有技术表明，卵母细胞gvbd的发生主要集中在体外培养18-20h之间。本发明的发明结果发现，猪卵母细胞在0-16h绝大部分处于gv期，从16h开始卵母细胞染色质状态及核膜形态发生改变，在19h时gvbd所占比重最大。当然对猪卵母细胞的发明众多，有的实验结果也说明猪卵母细胞完成gvbd的时间多数位于22h前。由于发明的侧重点方向不同，对gvbd界定时间点也并未明确，本发明通过多次体外成熟培养，最终证实了gvbd发生的时间点，在成熟培养的19h，在一定程度上加深了对卵母细胞gvbd这一事件的了解。
[0140]
在确定gvbd这一时间点后，本发明检测了卵母细胞中p38mapk的mrna和蛋白质的表达，结果显示在gvbd过程中，p38的基因表达量显著上调，p38蛋白的磷酸化与基因表达也呈现正相关的趋势，同时出现显著上调的情况。这一结果符合gvbd与p38mapk信号通路的激活相关这一假设，并且有众多证据表明，活化的mapk信号通路伴随整个卵母细胞的发育进程，这在一定程度上补充了猪卵母细胞中调控gvbd发生的有关机制。为了进一步验证卵母细胞gvbd与p38mapk信号通路有关，本发明使用了sb203580药物，这是一种p38mapk信号通路抑制剂，有效减弱了p38mapk信号通路的激活，抑制p38发生磷酸化。本试验将正常培养的卵母细胞设置为对照组，使用抑制剂添加培养的设置为实验组，通过一系列检测，19h卵母细胞gvbd发生受到显著抑制，gvbd率小于15％，并且p38mapkmrna表达水平显著下调，
westernblot结果显示磷酸化的p38受到明显抑制，卵母细胞核膜组成相关蛋白核纤层蛋白lamina/c的活化受到显著抑制，而核纤层蛋白与纺锤体的形成和微丝微管的组装有关，因此本发明不仅明确了卵母细胞gvbd与p38mapk信号通路有关，并且根据核纤层蛋白a/c磷酸化程度，得到卵母细胞gvbd的发生与p38mapk信号通路的激活有关，并且磷酸化的p38通过激活lamina/c调控核膜的破裂。
[0141]
最近表明，磷酸化的p38mapk在早期卵母细胞成熟和有丝分裂期间起着重要作用，通过注射p38的同一亚型的蛋白激酶到未成熟卵母细胞中，可以诱导卵母细胞gvbd的发生)，结合本发明对磷酸化p38蛋白的测定结果，在gvbd时磷酸化p38蛋白显著上调，这表明存在一种特殊机制，通过诱导p38的磷酸化，进一步调控卵母细胞的gvbd。有证据表明，较低水平活化的p38mapk可以诱导卵丘细胞和卵母细胞之间的缝隙连接的阻断，从而抑制卵母细胞的减数分裂恢复。本发明预测活化的p38mapk对卵母细胞gvbd的影响呈现尖顶趋势，即过低或过高的表达都对gvbd的发生产生负调控，但p38mapk是如何被控制在合理的范围之内的机制尚不清楚，最近表明，mekk6的去磷酸化可以有效减少p38mapk磷酸化的活性，相关表明，mekk6作为p38mapk联级激酶可以有效地活化p38mapk，而p38mapk对卵母细胞gvbd又存在重要的调控作用，这说明有一种关键因子通过介导mekk6/p38mapk联络信号通路来调控卵母细胞的gvbd，需要进一步分析。
[0142]
实施例2，筛选明确猪卵母细胞中介导p38mapk信号通路的调控基因。
[0143]
1.卵母细胞体外成熟是动物胚胎工程基本技术，获取优质成熟健康卵母细胞则是动物胚胎工程发展的保障。猪不仅是主要的经济动物，更是生物医学应用的模型动物，因此，探讨猪卵母细胞成熟对生殖发育领域发展非常重要。目前虽然建立了卵母细胞体外成熟体系，但体外成熟的卵母细胞无法与体内卵母细胞质量相比，生产的胚胎质量更差。发明表明，猪卵母细胞成熟受到多种复杂机制调控，体外获得卵母细胞的细胞核和核细胞质成熟不同步，后续发育能力差。因此，急需明确卵母细胞成熟调控机制，提高卵母细胞成熟率。现有技术表明，体内卵母细胞受到卵泡液及颗粒细胞介导的各种信号调控，卵母细胞长期处于gv期，这对于卵母细胞camp依赖的mapk信号通路激活卵母细胞核成熟是至关重要的。目前各种现有技术表明，体内成熟的卵母细胞由于在gv期被卵泡液中的gvbd抑制因子抑制，卵母细胞在gv期积累了足够的胞质成熟蛋白后，经成熟诱导激素诱导gvbd发生，进入减数分裂期，排出卵母细胞。p38应激活化蛋白激酶(p38mapk)是丝裂原活化蛋白激酶(mapk)家族途径的成员，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在卵母细胞诱导发生gvbd时呈现表达。成熟诱导信号启动后，母体的c-mosmrna开始翻译为另一种生殖细胞特异性的丝氨酸/苏氨酸激酶mos蛋白，即mekk。越来越多的数据表明，活化p38mpak是导致细胞快速增殖的主要机制，mekk作为一种特异性的活化p38mapk激酶，在卵母细胞中，mos蛋白激活p38mapk，通过磷酸化激活p38mapk活性，从而促进cdc25介导的mpf活化，进入减数分裂期(chaetal.,2007；rimeetal.,1994)。因此mekk/p38mapk信号转导途径有助于卵母细胞由gv期到gvbd期转变。但在整个联级中，mekk上游的调控信号尚不明确，具体通过什么途径将信号转导p38mapk还需进一步验证。
[0144]
目前随着高通量转录组测序技术的广泛应用，使得挖掘新调控基因成为可能(guoetal.,2017)。本发明通过对不同发育时间段gv期和gvbd期卵母细胞进行转录组测序分析，阐明卵母细胞gvbd前后转录差异，筛选出差异表达的基因，构建分子调控网络和信号
通路网络，筛选出调控卵母细胞gvbd的关键因子。
[0145]
2材料：2.1试验材料，猪gv期和gvbd期卵母细胞获取：需在卵母细胞体外培养0h、19h时分别对卵母细胞脱卵丘处理，将卵母细胞从成熟培养液中转移到透明质酸酶中，震荡，捡取标准质量的卵母细胞，处理具体步骤实施例1中猪卵母细胞去卵丘处理操作，将获得的猪卵母细胞-80℃冻存，以备后续检测使用。使用试剂如表3。
[0146]
表3主要试剂
[0147][0148]
3.方法：3.1转录组测序包括：3.1.1实验流程，totalrna样品检测：使用agilent2100bioanalyzer(agilentrna6000nanokit)检测totalrna的浓度、rin值、28s、18s和片段大小。totalrna处理：提取样品总rna后，用带有oligo(dt)的磁珠富集mrna，加入适量打断试剂，高温条件下使其片段化，以打断后的mrna为模板合成一链cdna，然后配置二链合成反应体系，合成二链cdna，并使用试剂盒纯化回收、粘性末端修复、cdna的3末端加上碱基“a”并连接接头，然后进行片段大小选择，最后进行pcr扩增，构建好的文库用agilent2100bioanalyzer和abisteponeplusreal-timepcrsystem质检，合格后进行测序。
[0149]
3.1.2信息分析流程，测序所得的原始数据称为rawreads。本发明过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基n含量过高的reads，过滤后的数据称为cleanreads。然后将cleanreads比对到参考基因组上，之后进行新转录本预测、snp&indel和差异剪接基因检测。得到新转录本之后，将具有蛋白编码潜力的新转录本加入参考基因序列中，构成一个完整的参考序列，然后计算基因表达水平。3.2转录组测序数据分析，根据需求检测不同样品之间的差异表达基因，并对差异表达基因做聚类分析和功能富集分析等。
[0150]
3.2.1基因表达量分析，使用bowtie2将cleanreads比对到参考序列以统计基因比对率，再使用rsem计算基因和转录本的表达水平。rsem是用于rna-seqreads计算基因以及转录本表达量的便捷软件。借助r软件里的cor函数计算了每两个样品之间的pearson相关系数，使用r软件里的hclust函数进行层次聚类分析，使用r软件里的princomp函数进行pca分析，最终绘制分析图形。rsem：是一款用于计算基因表达水平的软件，根据reads的比对结果以及相应的注释信息计算出相应的表达量。bowtie2：是一款序列比对软件，能快速地将测序reads比对到相应的参考序列上。3.2.2差异表达基因检测，针对的不同时期的卵母细胞，本发明使用deseq2算法进行差异基因检测。deseq2方法基于负二项分布原理，进行不同时期卵母细胞之间的差异基因检测。差异倍数在两倍及以上且校正的p值小于等于0.05来筛选差异基因。
[0151]
3.2.3差异表达基因go功能分析，根据go注释结果以及分类，将差异基因进行功能
分类，同时使用r软件中的phyper函数进行富集分析，p-value计算方法如下式，然后对pvalue进行fdr校正，通常fdr《＝0.01的功能视为显著富集。
[0152]
3.2.4差异表达基因pathway功能分析，根据kegg注释结果以及官方分类，本发明将差异基因进行生物通路分类，同时使用r软件中的phyper函数进行富集分析。p-value计算方法如上，然后对p-value进行fdr校正，通常fdr《＝0.01的通路视为显著富集。
[0153]
3.3qrt-pcr分析差异基因表达模式及关键蛋白亚细胞定位：3.3.1猪卵母细胞rna提取与反转录，操作步骤参考实施例1。
[0154]
3.3.2荧光定量反应体系及步骤，根据猪卵母细胞高通量测序筛选结果，有ncbi查询rap1b序列，按照同源重组要求设计引物序列，引物如表4。dna序列分别为seq id no：13～seq id no：40。
[0155]
3.3.3关键蛋白免疫荧光染色，关键目的蛋白的亚细胞定位，操作步骤参考实施例1亚细胞定位免疫荧光染色方法。
[0156]
4结果：4.1基因比对与表达，使用bowtie2将cleanreads比对到参考序列，之后再使用rsem计算基因和转录本的表达水平。reads对基因的比对率见表5，样品中基因及转录本数目见表6。
[0157]
表4qrt-pcr聚合酶链式反应引物序列
[0158]
[0159][0160]
表5基因比对率统计表
[0161][0162]
表6基因、转录本数目统计
[0163]
样品总的基因已知基因新的基因总的转录本knowntranscript新的转录本gd11973919074665335262312810398gd21954718893654328992262310276gd31959918938661329732268910284gv12020719533674345752402610549gv22005919395664338292346510364gv31986019184676334872315810329
[0164]
4.2样品间的相关性，为了反映样本间基因表达的相关性，本发明计算了每两个样品之间所有基因表达量的pearson相关系数，并将这些系数以热图的形式反映出来。如图2样品间相关性分析热图，用所有基因的表达量对所有样本进行层次聚类分析，结果见图3样
品间层次聚类分析图，该图能够直接反映每个样本之间的关系。图3中，样品间彼此靠得越近代表样品的表达谱越相似。
[0165]
4.3样品间及组间的基因表达情况，对于多个样品的表达量数据，利用维恩图展示了基因在不同样品间及组间的表达情况，如图4样品间及组间维恩图分析图。该维恩图能够表示一个样品(组)中特异表达的和在多个样品(组)中都表达的基因数。
[0166]
4.4差异表达基因检测，根据各个样品基因表达水平，检测样品(样品组)之间的差异表达基因(deg)，本发明使用deseq2方法进行差异检测，检测结果统计如图5明显差异表达基因(dge)，并对每组deg作表达量热图如图6，x轴代表每组差异比对方案，y轴代表相应的deg数目。深黑色代表上调的deg数目，浅黑色代表下调的deg数目。x轴代表聚类分析的样品，y轴代表差异基因。颜色代表取log后的foldchange值，颜色越深表示表达量差异越大，越浅表示表示表达量差异越小。
[0167]
4.5关键基因rap1b的筛选及基因表达模式：
[0168]
根据高通量测序结果，本发明筛选出12个具有明显差异表达的基因，分别为mapkapk3、ccsap、baz2a、kdm6b、rap1b、ak6、cdt1、klf2、adgra3、cep57、ccsap20、wrnip1，根据ncbi网站查询基因序列，使用primer5引物设计软件设计了引物，设置gv期卵母细胞为对照组，gvbd期卵母细胞为实验组，对两组卵母细胞分别进行qrt-pcr检测，分析结果如图7不同发育时期猪卵母细胞差异基因表达模式图，其中control：体外培养0h猪卵母细胞；treated：体外培养至19h猪卵母细胞(**p《0.01，***p《0.001)，mapkapk5、kdm6b、rap1b、wrnip1存在明显上升趋势，ccsap、klf2、adgre3、cep57存在明显的下降趋势，其中rap1b上升趋势尤为显著(p＜0.01)。然后对rap1b基因在卵母细胞发育过程中不同时间点mrna水平的表达进行检测，如图8不同发育时期rap1bmrna表达模式图，(**p《0.01，***p《0.001)，显示rap1b在0h表达量最低，在19h表达量显著上调(p＜0.001)。
[0169]
4.6rap1b在不同时期卵母细胞中的定位，结合rap1bmrna的表达，考虑到卵母细胞gvbd发生时细胞核状态的变化，对rap1b进行免疫荧光染色，结果显示，在gv期rap1b分布在以细胞核为中心的细胞质周围中，随着卵母细胞的发育，rap1b向细胞核聚拢，结果如图9不同发育时期rap1b免疫荧光染色图所示。hoechst33342显示核的状态；a12925显示rap1b在卵母细胞中的定位。
[0170]
4.7高通量测序预测rap1b信号转导途径模式图，通过高通量测序结果的预测，显示rap1b在gvbd过程中，作为mek6/p38mapk联络上游信号分子起转导信号的作用，rap1b信号传导模式图如10rap1b信号转导途径模式图。
[0171]
5.哺乳动物早期卵母细胞的发育受到各种基因的调节，其中差异表达基因对卵母细胞的发育，尤其是卵母细胞成熟产生重要调控作用。在卵母细胞成熟过程中，尤其是第一个显著转折点gvbd，有大量转录基因发生改变(meneauetal.,2020a)，其中调控卵母细胞gvbd的关键基因未得到证实，在本发明已证明了gvbd的发生与细胞中mapk信号通路的调控有关的基础上，明确gvbd过程中重要的转录因子，能对理解卵母细胞发育机制提供巨大帮助。
[0172]
gvbd作为卵母细胞成熟启动的标志，这一过程伴随显著的基因表达的变化。目前发明表明，哺乳动物特定的mrna能驱动蛋白活化，促进卵母细胞发育(susorandkubelka,2017)，当特定的mrna的表达水平达到阈值水平将推动卵母细胞的发育成熟。当然，在细胞
中想要特定的转录因子达到阈值水平，需要细胞质提供充足的原料以及满足关键因子激活转录的时间，已在非洲爪蟾中得到验证(meneauetal.,2020b)。在本发明进行了猪卵母细胞gv期与gvbd期的高通量测序，筛选出共82种具有显著差异的基因，其中包含了与camp密切相关的pka基因，与细胞质成熟多腺苷酸化相关的cdk基因，与细胞凋亡相关的ccsap基因等等，其中rap1b基因，作本发明首次发现在猪卵母细胞gvbd过程中发生了显著性变化，并且通过对不同时期卵母细胞中rap1b基因进行了mrna水平的检测，结果提示，随着gvbd发生，rap1b呈现上升趋势，当到达一定阈值，随即下降，这与爪蟾中rap1b抑制gvbd的发明相反(campaetal.,1991)，另外早在1998年rap1b细胞外调节信号的分析也表明，rap1b的激活不会导致ral激活引起的erk与camp合成相关的细胞进程(zwartkruisetal.,1998)，因此，本发明在猪卵母细胞中存在rap1b通过一个与mapk信号相关的转导途径来调控卵母细胞gvbd。
[0173]
通过高通量测序并绘制的rap1b信号转导途径中可以发现rap1b在猪卵母细胞中与下游的mek6作为一条信号通路连接，而mek6作为p38mapk上游联级激酶，因此针对rap1b在存在大量转录的情况下，激活或抑制mek6进而激活p38mapk，诱导卵母细胞gvbd发生。通过分析了gv期和gvbd期猪卵母细胞的基因表达模式，以及对差异基因的筛选，明确调控猪卵母细胞gvbd的关键基因为rap1b，为丰富和完善早期卵母细胞发育成熟调控机制提供重要参考。
[0174]
实施例3，rap1b经p38mapk信号通路调控卵母细胞gvbd分子机制分析。
[0175]
1.rap1b在细胞生长和分化过程中发挥重要调控作用(zhouetal.,2020a)，ras相关蛋白rap1b通过camp相关交换因子camp-gefs被激活，并协同与camp直接激活epac，共同参与细胞的发育进程(wangetal.,2018)。许多现有技术表明，rap1b蛋白存在多种调节机制，其中主要的信号通路包括rap1b下游途径中的p38和jnk，在黑色素瘤中，rap1b表达改变，进而影响p38和jnk/c-jun表达，在很大程度上影响肿瘤的迁移和侵袭(zhouetal.,2020b)。另外有技术表明，rap1b与p38mapk信号通路之间存在一条mek6/p38的信号转导通路，rap1过表达会增强p38活性；在肌肉细胞中，rap1b的行为方式是将信号转导到mek6/p38通路，但不参与mek3/jnk通路转导(sawadaandnakamuraetal.,2001)。据有关发明介绍，rap1b对于p38mapk信号通路是一种正向调节因子，通过表达rap1b活化p38mapk，进而促进细胞的发育或死亡(gutierrez-uzquizaetal.,2010)。这说明rap1b在不同细胞中起着独特的作用。
[0176]
在卵母细胞中对rap1b介导的p38mapk信号通路发明较少，据相关发明表明，在卵母细胞中rap1b的激活可能在p38mapk激活的上游起作用(ahnetal.,2006)。有趣的是，rap1b的激活是由多种第二信使介导的，其中，最主要的包含钙离子、二酰基甘油和camp(zwartkruisandbos,1999)。camp的下降会激活mapk，进而诱使卵母细胞生发泡构型发生改变(sunetal.,2016)。即由原来的弥散状态转变为凝集化状态，这也是作为卵母细胞发生gvbd的重要指标之一。
[0177]
为了明确rap1b通过介导p38mapk信号通路调控卵母细胞gvbd，本发明通过体外构建过表达载体和干扰sirna，通过显微注射的方式扰低和过表达rap1b，检测rap1b表达改变后p38的活化和卵母细胞的gvbd发生情况，最终明确rap1b介导p38mapk信号通路对卵母细胞gvbd的调控。
[0178]
2材料：2.1试验材料包括：2.1.2试验试剂，本试验所用试剂包括克隆基因所用试剂盒、体外转录反应所用试剂盒、免疫荧光染色抗体、westernblot蛋白检测抗体和相关试剂，具体见表7。
[0179]
表7主要试剂
[0180][0181][0182]
3方法：3.1rap1b过表达载体构建包括：3.1.1rap1b引物设计及扩增，基因克隆pcr采用艾克瑞公司taq系列dna聚合酶，根据ncbi网站提供的猪rap1b的基因序列以及p-easy-t3中spei酶切位点两侧序列，设计引物序列，引物合成由上海生工而合成(表8)。
[0183]
表8rap1b克隆引物序列
[0184][0185]
克隆反应条件为：95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s；40个循环，4℃保存。反应体系如表9。
[0186]
表9克隆反应组分
[0187]
pcr扩增反应组分体积taqdna聚合酶(2
×
)10μlprimerf/r(10μm)1.6μlcdna2μlddh2o6.4μl
[0188]
3.1.2琼脂糖凝胶电泳和胶回收，称取1g琼脂糖加入100mltae缓冲液中，放入微波炉加热至沸腾，待液体冷却至50℃左右加入10μlgoldviewnuclcicacid核酸染料至锥形瓶底。将琼脂糖倒入准备好的板中，待充分凝固后拔出梳子。在20μl样品中添加4μ
l6xdnaloadingbuffer，吹打混匀，将处理好的样品加入孔中，120v电压，跑电泳30min。琼脂糖凝胶电泳后，用abclonal公司的多功能dna回收纯化试剂盒进行胶回收，使用超微分光光度计对浓度进行检测，后续连接备用。
[0189]
3.1.3t3载体与rap1brap1b的连接和转化，连接：将胶回收的pcr扩增产物，与peasy-t3cloningvector混合，室温下反应10min。反应结束后将离心管置于冰上，反应体系如表10：
[0190]
表10连接转化体系
[0191]
转化：加连接产物于50μltrans1-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，放入42℃热水中，热激30sec，立即置于冰上2min。随后将感受态细胞加入250μllb培养基中，200rpm、37℃培养1h，使菌体复苏。将菌液进行离心，弃上清后取浓缩的100ul菌液，并涂在含有50ug/ml氨苄的lb固体培养平板中，37℃倒置，避光培养16-20h。
[0192]
3.1.4菌液pcr检测及测序，pcr检测：将本发明获得的菌落加入含amp的lb液体培养基中，在37℃，180rpm振荡培养12-16h；以获得的菌液为模板，进行引物pcr扩增，鉴定插入片段。反应体系如表11：
[0193]
表11反应体系
[0194]
反应组分体积taqdna聚合酶(2
×
)10μlprimerf/r(10μm)2μl菌液8μl
[0195]
反应条件：95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s；40个循环，4℃保存。然后进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，检测阳性克隆。将菌液送于生工生物技术有限责任公司测序部测序验证。
[0196]
3.1.5线性化rap1b，分别使用质粒提取试剂盒，胶回收的试剂盒得到插入rap1b的t3载体质粒，使用限制性内切酶spei-hf，在冰上建立反应体系如下：
[0197]
反应组分：t3载体质粒dna1μg，10xnebbuffer5μl，restrictionenzyme，1μl，nuclease-freewater50μ。反应条件为：37℃，15min；80℃，20min。然后进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。
[0198]
3.1.6过表达rap1bmrna的获取，使用mmessaget7ultra转录试剂盒，对插入rap1b的质粒dna进行反转录，并进行poly(a)tailingprocedure，将获得的mrna使用qiagen公司的rneasyminikit进行纯化回收，使用超微分光光度计对rna浓度进行检测，-80℃保存备用。
[0199]
3.6rap1bsirna序列合成，rap1b基因干扰序列依托上海生工生物技术有限责任公司合成，针对rap1b基因，设计三种不同干扰片段，分别对应起始点15、100、383位点，干扰片段序列如表12。
[0200]
表12rap1b干扰片段位点和干扰序列
[0201][0202][0203]
3.2猪卵母细胞体外培养，同实施例1。3.3卵母细胞免疫荧光染色，同实施例1。3.4westernbolt蛋白印迹分析，同实施例1。3.5qrt-pcr荧光定量分析，同实施例1。3.6显微注射，在进行注射前，进行卵母细胞固定针的制备和显微操作的配置。使用modelp-97拉针仪，获得玻璃针，使用narishige断针仪烤制固定针外径约120μm，内径约40μm，即可使用。使用大平皿作为容器，在200μlman(操作液+bsa)中添加7.5μg/ml的cb，将操作液制成梭形置于平皿中央，液状石蜡覆盖。将处理好的卵母细胞加入操作液滴中，置于倒置显微镜下，将固定针尖端调整到与平台角度约30
°
，将卵母细胞固定后，使用内径约为1μm的无rna酶的注射针，插入细胞约70μm深度，然后使用eppendorf系统，通过调节注射压力和注射时间将sirna或mrna注射到卵母细胞中。
[0204]
为确保注射成功，首先使用带有荧光标记物的山羊抗小鼠igg对注射系统进行检测，在荧光显微镜下确保注射成功后，进行注射。注射条件为：注射压力200hpa，补偿压力70hpa，注射时间0.5s，注射体积为10pl。
[0205]
4结果：4.1过表达载体的构建与体外转录，根据ncbirap1b序列设计特异性引物，序列为：
[0206]
f:tgatcctggttggtaataagtgtga，seq id no：41；
[0207]
r:agtttttctgttaatttgtcgcact，seq id no：42；
[0208]
以猪卵母细胞cdna为模板，用高保真酶进行pcr扩增，rap1brap1b大小为555bp，seq id no：9；琼脂糖凝胶电泳结果显示其条带大小与目的条带大小一致(图11)；将目的条带进行胶回收并纯化，通过凝胶电泳结果显示纯化效果满足实验要求(图12)；纯化后的rap1b与t3载体连接，连接成功后对菌液进行pcr，将条带大小同rap1b片段一致的菌液进行测序。对测序正确的菌液提取质粒，并进行验证(图13)，使用限制性内切酶对环状质粒进行切割并验证(图14)，线性化质粒的长度符合rap1brap1b同载体连接后，使用t7反转录试剂盒，获得添加poly(a)尾修饰的rap1bmrna。m：dl1000marker；m1：dl5000marker；m2：dl5000marker；a：扩增的rap1b基因；b：胶回收rap1brap1b片段；c：纯化结果验证；d：1、2为单切酶spel线性化处理后的rap1b-peasy-t3的线性化质粒；图15为rap1b-peasy-t3电泳图：菌液pcr验证2，3，4，6，7五个菌样凝胶电泳结果显示rap1b体外转录载体构建成功。
[0209]
4.2注射时间点的确定及注射后效果检测，显微注射操作前需将包围在卵母细胞外围的卵丘细胞去除，本发明的实验结果显示，6h时去除卵丘细胞对卵母细胞gvbd几乎不产生影响，卵母细胞gvbd发生率维持在60％以上。在使用eppendorf系统注射了带有荧光标记物的山羊抗小鼠igg后，荧光显微镜下可见明显荧光(图16显微注射后的荧光效果)，因此，卵母细胞体外培养至6h时进行脱卵丘处理可行，且显微注射系统可正常使用。图16中，
对6h脱卵丘卵母细胞进行显微注射，注射液为荧光标记物山羊抗小鼠igg浓度1：200，注射压力200hpa，补偿压力70hpa，0.5sec注射时间。
[0210]
4.3扰低和过表达rap1b对卵母细胞基因表达的影响：4.3.1rap1b扰低片段的确定，针对三条rap1b扰低片段，使用eppendorf系统注射后，对卵母细胞提取rna并进行基因表达检测(图17注射不同sirna片段对rap1b基因表达的影响图)，检测结果显示，rap1b-10对rap1b基因的扰低效果不明显，rap1b-100和rap1b-383对rap1b基因干扰低效果显著(p＜0.001)，rap1b-100最为显著，因此，后续实验中确定了使用rap1b-100扰低片段进行注射。图17中，control：空白对照组，培养至19h卵母细胞；r1，r2，r3：分别代表注射干扰片段rap1b15，rap1b100，rap1b383培养至19h卵母细胞；(**p《0.01，***p《0.001)。
[0211]
4.3.2扰低和过表达后rap1b基因表达水平与蛋白表达水平的变化，通过实时荧光定量pcr检测分析，扰低组卵母细胞中rap1b基因的表达受到了显著性抑制，而过表达组rap1b的表达呈现出显著上调(图18扰低和过表达后卵母细胞中rap1bmrna表达模式，control：对照组；disturbance：扰低组；overexpression：过表达组(**p《0.01，***p《0.001))，另外通过westernblot检测并验证了显微注射后rap1b表达情况，wb条带显示，过表达组rap1b蛋白较对照组显著上调，扰低组rap1b蛋白较对照组受到抑制(图19干扰和过表达后rap1b蛋白表达效果图、图20干扰和过表达后rap1b蛋白表达柱状图)，以上实验结果表明，卵母细胞注射的干扰片段和过表达的mrna，可以有效地抑制或促进rap1b在卵母细胞中的表达。
[0212]
4.4扰低和过表达rap1b基因对卵母细胞gvbd的影响，对注射sirna和过表达mrna的卵母细胞进行免疫荧光染色分析后发现，rap1b基因参与卵母细胞gvbd的发生。在前期中发现，rap1b基因在卵母细胞gv期到gvbd期的整个过程中都存在着显著上调的趋势，在gvbd后rap1b的表达开始下降，因此本发明通过扰低和过表达rap1b基因，对处理过后的卵母细胞gvbd发生率进行了统计，结果发现，当rap1b过表达后gvbd发生率高达到71.7％，出现明显促进作用；对rap1b扰低后，卵母细胞gvbd受到显著抑制，gvbd率下降到26.2％。卵母细胞显微注射后培养至19h发育情况如表13。
[0213]
表13不同处理方式后卵母细胞发育统计数据表
[0214][0215]
4.5扰低和过表达rap1b对卵母细胞纺锤体和核纤层的影响，纺锤体的形态随卵母细胞的发育产生变化，纺锤体的定位随着卵母细胞的发育由细胞核周围逐渐向内靠拢，通过扰低和过表达rap1b后发现，在扰低组中，纺锤丝在细胞质中散乱分布，失去原有的自核周围向核内凝聚的趋势，而在过表达的卵母细胞中，本发明明显看到纺锤体集中在了细胞核处(图21扰低和过表达后卵母细胞中纺锤体形态及定位)，另纺锤体的这种明显的规则性动态变化，与正常细胞发育相符合，这说明rap1b的扰低或过表达对卵母细胞核成熟产生了影响，并且rap1b对卵母细胞的gvbd存在正向促进作用。
[0216]
lamina/c对于卵母细胞核而言，参与核膜的组装，当磷酸化的p38mapk被激活时，核纤层蛋白lamina/c接收到来自p38mapk上的刺激信号，进而引起lamina/c的磷酸化，从而有序地调控卵母细胞核膜的解体，使得卵母细胞发生gvbd这一分子现象。磷酸化的lamina/c在扰低和过表达的过程中也进行了相应的法范围分析，尤其是通过免疫荧光染色确定了其在细胞中的定位及表达(图22扰低和过表达后卵母细胞中p-lamina/c免疫荧光染色)，在过表达组中磷酸化的lamina/c被显著活化，扰低组则处于未激活状态。
[0217]
4.6扰低和过表达rap1b对卵母细胞p-mekk6和p-p38mapk的影响，首先对6h脱卵丘的卵母细胞进行显微注射，分别注射的rap1b的过表达mrna和扰低用的sirna，再将卵母细胞放入培养箱培养至19h，对19h卵母细胞进行处理，检测了p-mekk6和p-p38蛋白的表达量，如图23扰低和过表达后卵母细胞中p-p38免疫荧光染色，图24扰低和过表达后卵母细胞中相关蛋白westernblot检测。如图25-图28分别为p-p38mapk蛋白、p-mekk6蛋白、p38mapk蛋白、mekk6蛋白；其中柱状图为均一化处理后与β-actin作对比(单因素方差分析，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)。
[0218]
其中过表达组相较于对照组而言，mekk6和p38mapk均发生了磷酸化，wb条带提示磷酸化蛋白的含量在卵母细胞中呈现显著上调的趋势；在扰低组中，mekk6和p38总的蛋白含量并未发生明显变化，但磷酸化的mekk6和磷酸化的p38蛋白含量在卵母细胞中较对照组相比，呈现出明显的下调趋势；结合对卵母细胞gvbd发生率的统计，以及高通量测序结果中rap1b与mekk6和p38mapk信号通路的上下游关系，过表达组gvbd率显著上调，而扰低组gvbd发生率受到明显抑制，因此最终得出在猪卵母细胞发育过程中，rap1b的激活和抑制调控了下游mekk6蛋白的激活和抑制进而对p38mapk信号通路产生调控，最终影响卵母细胞的发育进程，即促进或阻断卵母细胞gvbd的发生。
[0219]
5.猪卵母细胞的gvbd发生与众多因素有关，在注射了rap1b基因的过表达和干扰片段后，猪卵母细胞gvbd进程发生明显的改变，卵母细胞的纺锤体形态，与核膜组装相关的核纤层蛋白磷酸化程度也产生了相应变化。相关发明表明，核纤层蛋白a/c的功能主要体现在早期细胞的核包膜中，改变细胞核形态、传导信号、参与应激反应、维持细胞核内空间稳定、稳定染色质形态、调节基因表达以及促进细胞周期进程等(murray-nergerandcristea,2021)。本发明通过对卵母细胞rap1b基因的调控，使其呈现相应扰低和过表达，分别检测与gvbd相关的mapk信号通路蛋白，实验结果表明，注射了sirnarap1b干扰片段，卵母细胞gvbd发生率下调到26.6％，受到了显著抑制，对于p38蛋白的活化检测则表现出磷酸化p38水平显著抑制的结果；而在过表达rap1b处理后的卵母细胞中呈现出与这一结果相反的结论，
[0220]
为此本发明对卵母细胞p38蛋白上游的mekk6进行了进一步检测。相关发明表明mapk磷酸酶能同时去磷酸化活化p38上的苏氨酸和酪氨酸上的磷酸基团，因此mekk6可以起到调控p38蛋白活化的功能(owensandkeyse,2007)，这一现象在mekk6和p38蛋白之间呈现出一种正向相关的关系，本发明的结果也证实了这一点。
[0221]
在扰低和过表达rap1b后，卵母细胞出现的p38磷酸化活化水平与卵母细胞gvbd具有正向相关的作用，这种现象在以往的发明中并不少见，比如，最为深入的erk特异性磷酸酶，它对mkp3传导的成纤维细胞生长因子信号位点的表达呈现出动态表达模式(dickinsonetal.,2002)。在鸡胚胎发育肢体神经组织的发明表明，mkp-3表达由fgf介导，fgf作为关键介导因子调控活化erk水平而发挥作用(eblaghieetal.,2003)。目前，rap1b作
为p38上游信号转导因子也得到证实，本发明的实验结果也表明rap1b通过调控p38mapk而对卵母细胞gvbd的进程产生影响，但是rap1b并不是直接作用于下游受体，p38mapk信号通路上有还存在一种关健蛋白mekk6，过表达和扰低rap1b基因对mekk6的检测结果都说明了mekk6在gvbd过程中起到关键传导信号作用。
[0222]
在扰低和过表达rap1b基因后，卵母细胞mkk6蛋白的活化，p38蛋白的活化，以及核纤层蛋白lamina/c的活化均发生了一系列的改变，进而调控卵母细胞的gvbd进程，这为后续卵母细胞早期成熟调控机制的阐明提供了重要参考。
[0223]
总之，上述实施例表明：本发明旨在解析猪卵母细胞成熟调控机制，着重发明猪卵母细胞gvbd调控机制。本发明以猪卵母细胞为实验材料，在进行高通量测序的基础上进行筛选，并构建关键基因体外转录载体和干扰序列，以显微注射技术调控关键基因的表达，并分析卵母细胞成熟机制，得到以下结论：
[0224]
(1)猪卵母细胞体外培养成熟前经过两个重要阶段，分别为gv期和gvbd期，gv期所处时间较长，体外成熟培养0-16h卵母细胞多数均处于gv期，当卵母细胞体外成熟培养至19h时，卵母细胞发生gvbd。
[0225]
(2)明确了p38mapk在卵母细胞gvbd前被激活，gvbd发生时p38mapkmrna水平和蛋白表达水平显著上调。在p38mapk信号通路抑制剂sb203580处理后，卵母细胞gvbd发生受到显著抑制，进一步说明了p38mapk信号通路调控卵母细胞gvbd。
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(3)对gv期和gvbd期卵母细胞高通量测序，通过荧光定量检测分析，筛选出了调控gvbd的关键因子rap1b，rap1b在猪卵母细胞gvbd过程中呈现出显著上调趋势。
[0227]
(4)扰低和过表达rap1b，通过qrt-pcr和westernblot蛋白印记分析确定，卵母细胞中rap1b和p38的活化之间存在正调控关系，gvbd的发生受卵母细胞中rap1b介导的mekk6-p38信号通路调控。
[0228]
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途，其特征在于，所述关键基因为rap1b，dna如seq id no：9，并从卵母细胞中克隆合成。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，关键基因rap1b在体外通过介导mekk6/p38mapk联络信号通路调控卵母细胞的gvbd应用。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，关键基因在体外调控卵母细胞gvbd的用途中关键基因的筛选方法包括：通过对不同发育时间段gv期和gvbd期卵母细胞进行转录组测序分析，确定卵母细胞gvbd前后转录差异，筛选出差异表达的基因，构建分子调控网络和信号通路网络，筛选出调控卵母细胞gvbd的关键因子rap1b。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，筛选出差异表达的基因包括mapkapk3、ccsap、baz2a、kdm6b、rap1b、ak6、cdt1、klf2、adgra3、cep57、ccsap20、wrnip1，根据ncbi网站查询基因序列，使用primer5引物设计软件设计引物，设置gv期卵母细胞为对照组，gvbd期卵母细胞为实验组，对两组卵母细胞分别进行qrt-pcr检测，然后对rap1b基因在卵母细胞发育过程中不同时间点mrna水平的表达进行检测、rap1b在不同时期卵母细胞中的定位、高通量测序预测rap1b信号转导途径模式，通过高通量测序结果的预测，确定rap1b在gvbd过程中，作为mek6/p38mapk联络上游信号分子起转导信号的作用。5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，关键基因构建的体外过表达载体dna如seq id no：10。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的体外过表达载体的构建方法包括：步骤1，rap1b引物设计及扩增，根据ncbi网站提供的猪rap1b的基因序列以及p-easy-t3中spei酶切位点两侧序列，设计克隆引物序列，克隆引物序列包括seq id no：1、seq id no：2；步骤2，琼脂糖凝胶电泳和胶回收；步骤3，peasy-t3载体与rap1b的连接和转化；peasy-t3载体的dna序列为seq id no：11；步骤4，菌液pcr检测及测序；步骤5，线性化rap1b，分别使用质粒提取试剂盒，胶回收的试剂盒得到插入rap1b的peasy-t3载体质粒，使用限制性内切酶spei-hf，在冰上建立反应体系；peasy-t3载体质粒的dna序列为seq id no：12；步骤6，过表达rap1bmrna的获取，使用mmessaget7ultra转录试剂盒，对插入rap1b的peasy-t3载体质粒dna进行反转录，并进行poly(a)尾修饰，获得过表达rap1bmrna。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，在步骤1中，克隆反应条件为：95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s；40个循环，4℃保存；反应体系包括：taqdna聚合酶(2
×
)10μl，primerf/r(10μm)1.6μl，cdna2μl，ddh2o6.4μl。8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，在步骤3中，连接：将胶回收的pcr扩增产物，与peasy-t3cloningvector混合，室温下反应10min。反应结束后将离心管置于冰上，反应体系包括：pcrproduct0.5-4μl，peasy-t3cloningvector1μl；转化包括：加连接产物于50μltrans1-t1感受态细胞中，混匀，冰浴30min，放入42℃热水中，热激30sec，置于冰上2min；随后将感受态细胞加入250μllb培养基中，200rpm、37℃培
养1h，使菌体复苏；将菌液进行离心，弃上清后取浓缩的100ul菌液，并涂在含有50ug/ml氨苄的lb固体培养平板中，37℃倒置，避光培养16-20h。步骤4中，pcr检测：将获得的菌落加入含amp的lb液体培养基中，在37℃，180rpm振荡培养12-16h；以获得的菌液为模板，进行引物pcr扩增，鉴定插入片段；反应体系包括：taqdna聚合酶(2
×
)10μl，primerf/r(10μm)2μl；反应条件：95℃，10s；60℃，15s；72℃，20s；40个循环，4℃保存；然后进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，检测阳性克隆；步骤5中，在冰上建立反应体系包括：反应组分：peasy-t3载体质粒dna1μg，10xnebbuffer5μl，restrictionenzyme，1μl，nuclease-freewater50μ；反应条件为：37℃，15min；80℃，20min；然后进行琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。9.一种利用权利要求1所述用途中的关键基因构建的体外干扰片段。10.根据权利要求9所述的干扰片段，其特征在于，根据rap1b基因，设计三种不同干扰片段，分别对应起始点15、100、383位点，分别为rap1b-15、rap1b-100、rap1b-383；rap1b-15的扰低序列为seq id no：5、seq id no：6，rap1b-100的扰低序列为seq id no：7、seq id no：8，rap1b-383的扰低序列为seq id no：3、seq id no：4。

技术总结
本发明属于基因学技术领域，公开了关键基因在体外调控卵母细胞GVBD的用途及干扰片段。通过对不同发育时间段GV期和GVBD期卵母细胞进行转录组测序分析，确定卵母细胞GVBD前后转录差异，筛选出差异表达的基因，构建分子调控网络和信号通路网络，筛选出调控卵母细胞GVBD的关键因子RAP1B。本发明阐明了Rap1B可通过介导p38MAPK信号通路调控猪卵母细胞GVBD发生，对丰富和完善卵母细胞成熟机理提供了重要理论参考，对提高卵母细胞成熟质量和促进动物胚胎工程乃至生猪产业的发展将起到积极推动作用。用。用。


技术研发人员：郇延军 孙建强 相洪晓 李健 毕方龙 王宁 高文举
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：2023.06.17
技术公布日：2023/8/28