一种pH响应型抗菌抗氧化载药水凝胶及其制备方法和应用

一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病(diabetes mellitus,dm)是一种由高血糖引起的常见慢性代谢疾病。随着糖尿病发病率的增加，难愈合慢性伤口作为糖尿病常见的并发症之一，给患者和社会都带来了沉重的经济负担。如何促进糖尿病慢性创面的快速愈合及皮肤组织的有序修复是目前临床上所面临的一大挑战。糖尿病创面处潮湿高糖，易受细菌感染，产生乳酸和乙酸，导致局部酸化(ph4.5～6.5)。同时，创面处产生的过量活性氧(reactive oxygen species,ros)引起氧化应激升高，炎症反应加剧，阻碍再上皮化进程。因此，我们认为清除ros，降低氧化应激，减缓炎症可作为一种加速糖尿病伤口修复的治疗策略。
3.水凝胶(hydrogel)其内部是由高分子聚合物通过物理或化学交联形成的三维网络结构，具有良好的生物相容性，可作为治疗伤口感染的功能性药物载体，已广泛应用于组织工程、药物缓释等生物医学领域。基于糖尿病伤口特殊的生理微环境设计一种具有ph响应型的载药水凝胶对于促进糖尿病创面快速愈合具有非常重要的研究意义。
4.明胶(gelatin)是从胶原蛋白中提取的天然蛋白质，是促进细胞粘附、增殖和分化的仿生肽，但其力学性质较差，性脆易损坏，极大限制了其应用领域。常利用其分子链上大量的氨基、羧基和羟基等进行改性或连接，通过化学交联形成各类互穿网络结构、双网络结构的复合水凝胶。pluronic f127是一种两亲性三嵌段共聚物，可在水中自组装形成胶束。通过一步反应在pluronic f127上修饰醛基，使其可与明胶上的氨基在温和条件下发生席夫碱反应形成亚胺键。亚胺键是具有ph敏感性的一类可逆动态共价键，在中性或碱性条件下比较稳定，而在酸性条件(ph《6.5)下，由于氨基的质子化导致亚胺键水解断裂，实现药物响应性释放。亚胺键不仅赋予水凝胶ph响应性，而且使其具备一定的可注射性和自修复能力以改善纯明胶的力学性能。
5.镁微马达(mg motor)是以镁微粒为内核形成的一种新型h2原位储库，利用镁在水介质中与水反应生成氢氧化镁并释放出h2这一特征来实现h2持续递送，清除炎症部位的ros和促炎因子，已有最新研究将其应用于治疗肿瘤、类风湿性关节炎等各类炎症疾病。目前，微马达的递送方法通常为口服或静脉注射，但复杂的体液环境会破坏其结构导致过早失活。将微马达包载于水凝胶中，可减少外界环境对微马达的损耗，延长h2释放时间，有效清除ros，减轻炎症，加速糖尿病创面愈合进程。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶及其制备方法和应用。所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶具备可注射性和自修复能力。在创面微酸性环境下，水凝胶中的亚胺键断裂，加速药物释放，改善炎症氧化应激微环境，促进糖尿病慢性创面愈
合。
7.本发明通过以下技术方案实现：
8.一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶，由明胶、端醛基化pluronic f127载药胶束及镁微马达所组成，利用明胶分子链上的氨基与端醛基化pluronic f127胶束上的醛基之间发生席夫碱反应所形成的亚胺键构建动态可逆的交联网络，并在其中负载ros清除剂镁微马达。
9.所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
10.步骤1：端醛基化pluronic f127(fcho)的合成
11.将pluronic f127、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺超声混合溶于无水四氢呋喃中，室温反应；将反应液浓缩后，用冷乙醚沉淀；将过滤干燥所得白色固体溶于纯水中，离心取上清液冷冻干燥，得到端醛基化pluronic f127(fcho)；
12.步骤2：fcho载药胶束的制备
13.将端醛基化pluronic f127与疏水性抗炎药物超声溶于有机溶剂中，经旋转蒸发得到聚合物薄膜，水化溶解，得到负载药物的fcho胶束溶液；
14.步骤3：镁微马达(mg motor)的制备
15.用丙酮洗涤镁微粒，在n2下干燥；将镁微粒分散在预涂有聚乙烯吡咯烷酮的玻片上；在镁微粒层上再涂覆一层聚乳酸-羟基乙酸共聚物，干燥后刮下，得到镁微马达(mg motor)；
16.步骤4：ph响应型水凝胶的制备
17.将明胶溶液和不同浓度fcho载药胶束溶液均匀混合后，加入镁微马达，室温静置，得到ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶(gel/fcho/mg motor)。
18.所述步骤1中，所述的pluronic f127、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺的反应摩尔比1:(4～7.5):(0.4～0.6):(5～10)；pluronic f127、无水四氢呋喃的用量比为10g:(50～100)ml；反应时间为24～36h。
19.所述步骤2中，所述的疏水性抗炎药物选自姜黄素(curcumin)、小檗碱、槲皮素、布洛芬、吲哚美辛、塞来昔布、双氯芬酸钠中的任意一种，优选为姜黄素。
20.所述步骤2中，疏水性抗炎药物与端醛基化pluronic f127质量比为1:15～50。
21.所述步骤2中，所述的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的任意一种；水化溶剂为pbs缓冲液(0.01m，ph＝7.4)；旋蒸与水化的温度皆为40℃。
22.所述步骤3中，所述的聚乙烯吡咯烷酮溶于乙醇中，浓度为1～4％(w/v)，分子量为24～30kda；所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷中的任意一种，浓度为0.5～2％(w/v)；所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的比例为75:25，分子量为8～10kda。
23.所述步骤4中，所述的明胶溶液的浓度为10～15％(w/v)，fcho载药胶束溶液的浓度为2.5～15％(w/v)，mg motor的浓度为0.1～0.3％(w/v)；所述的明胶溶液与fcho载药胶束溶液的体积比为1:0.5～1.5。
24.本发明还公开了采用上述方法制得的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶作为伤口敷料在治疗糖尿病全层缺损皮肤创面中的应用。
25.本发明与现有技术相比，具有以下优点：
26.(1)本发明中端醛基化pluronic f127(fcho)作为两亲性材料，通过其内部的非极性疏水基团与疏水性药物的疏水侧基之间的相互作用形成胶束，实现药物包载，有效提高水凝胶对疏水性药物的载药能力。
27.(2)本发明所提供的制备工艺简单，原料易得，反应条件温和，无需添加其他引发剂。利用明胶分子链上的氨基和fcho胶束表面的醛基通过席夫碱反应形成的动态亚胺键来改善纯明胶的力学性能且赋予该水凝胶一定的自修复能力和可注射性，使其可以填充不规则伤口。
28.(3)本发明采用抗炎药物作为负载物，不仅具有清除自由基、降低氧化应激的作用，而且可通过破坏细菌细胞膜的完整性和通透性，导致细菌死亡。抗炎药物的加入使该水凝胶具备优异的抗氧化和抗菌性能，满足实际应用需求。
29.(4)本发明中明胶分子链上的氨基在弱酸性炎症微环境下会发生质子化，使分子间静电作用增强，亚胺键断裂，实现药物的响应性快速释放。
30.(5)本发明利用不对称涂覆plga层制备的镁微马达，其外壳上的缺口可作为内核镁微粒与水反应生成h2的通道。由于该缺口面积有限，可以控制反应速度，实现h2的持续释放。
31.(6)本发明提出将氢疗法用于治疗糖尿病慢性创面。氢气(h2)作为一种具有抗炎能力的内源小分子气体，能轻易穿透细胞膜，选择性清除高毒性的氧化自由基，下调促炎因子的表达水平，并且不影响正常细胞的代谢和信号传导。此外，h2还可通过激活内源性抗氧化酶，发挥抗氧化作用，是一种新型ros清除剂。
32.(7)本发明利用水凝胶作为镁微马达的递送载体，对微马达起到一定的保护作用并控制其释放，大大提升了微马达在生物医学领域的应用潜力。
附图说明
33.图1为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶的结构示意图；
34.图2为本发明中端醛基化pluronic f127(fcho)的合成路线图；
35.图3为本发明中端醛基化pluronic f127(fcho)的1h-nmr图；
36.图4为本发明中mg motor的制备步骤及结构示意图；
37.图5为本发明中mg motor的sem图；
38.图6为本发明中gel、fcho和gel/fcho/mg motor水凝胶的ft-ir图；
39.图7为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶的sem图；
40.图8为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶的自修复过程演示图及流变学表征；其中(a)和(b)分别为对比例1中纯明胶水凝胶和实施例1中gel/fcho/mg motor水凝胶的自修复过程演示；(c)为gel/fcho/mg motor水凝胶的连续阶跃应变(γ＝1％
→
1000％)测试结果，连续3个循环；
41.图9为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶的剪切稀化特性和可注射性测试结果；
42.图10为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶的体外ph响应释放药物曲线；
43.图11为本发明中的纯镁微粒、镁微马达以及gel/fcho/mg motor水凝胶的体外释放氢气曲线；
44.图12为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶对dpph自由基的清除效率；
45.图13为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果；
46.图14为本发明制备的gel/fcho/mg motor水凝胶对糖尿病全层皮肤缺损创面的治疗效果图。
具体实施方式
47.为了更好地理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
48.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.实施例1
50.一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，具体操作步骤如下：
51.(1)端醛基化pluronic f127(fcho)的制备：
52.将pluronic f127(10.0g)、对醛基苯甲酸(0.6g)、4-二甲氨基吡啶(0.05g)和二环己基碳二亚胺(1.0g)超声混合并溶于无水四氢呋喃(50ml)中，室温反应36h；将反应液在40℃下旋蒸浓缩并用冷乙醚沉淀过滤三次；将干燥所得白色粉末溶于纯水中，12000rpm离心15min，收集上清液冷冻干燥，得到端醛基化pluronic f127(fcho)。
53.端醛基化pluronic f127的合成路线及化学结构式见图2，其核磁共振氢谱(1h-nmr)结果见图3，其红外光谱(ft-ir)结果见图6。如图2所示，fcho聚合物中芳环上的氢原子在8.14ppm及7.88ppm处出现信号，醛基的氢原子在10.03ppm处出现信号，表明成功将对醛基苯甲酸接枝到pluronic f127上。如图6所示，与f127相比，fcho在1716cm-1
、1699cm-1
和761cm-1
处出现新的吸收峰，分别归因于酯键c＝o的拉伸振动，醛基c＝o的拉伸振动和芳环c-h的平面外弯曲，进一步证明已成功合成fcho。
54.(2)fcho载药胶束的制备：
55.将100mg fcho与4mg姜黄素超声充分溶于10ml无水乙醇中，经40℃旋转蒸发得到聚合物薄膜，再用5ml的pbs(0.01m，ph＝7.4)40℃水化，将溶液离心(8000rpm，10min)，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到负载姜黄素的fcho胶束溶液。
56.由表1可知，当cur:fcho质量比在1:15～1:50之间，包封率可达到90％以上。其中，在cur:fcho质量比为1:25时，包封率最高为97.17
±
1.81％。
57.表1不同投药比下fcho胶束对姜黄素包封率
[0058][0059]
(3)镁微马达(mg motor)的制备：
[0060]
用丙酮洗涤镁微粒，在n2下干燥。将1mg镁微粒分散在预涂有100μl pvp乙醇溶液(2％w/v)薄膜的玻片上，在形成的镁微粒层上涂覆50μl plga乙酸乙酯溶液(1％w/v)，干燥后从玻片上小心刮下，得到镁微马达(mg motor)。
[0061]
镁微马达的制备步骤及结构示意图见图4，其扫描电镜图(sem)见图5。证明镁微马达在其plga外壳上具有一个缺口，可以作为释放h2的通道。
[0062]
(4)水凝胶的制备：
[0063]
将500μl明胶溶液(15％w/v)和500μl fcho载药胶束溶液(10％w/v)均匀混合后，再加入1mg mg motor，静置得到ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶gel/fcho/mg motor-2。
[0064]
水凝胶的结构示意图见图1，水凝胶各组分的红外光谱(ft-ir)结果见图6。如图6所示，gcm水凝胶在1683cm-1
出现的吸收峰是由于明胶分子链上的氨基和fcho的醛基之间新形成的c＝n键，表明水凝胶网络已成功通过席夫碱反应构建。
[0065]
实施例2
[0066]
同实施例1，不同的是步骤(4)中改变fcho载药胶束溶液的浓度为5％w/v，其他制备工艺条件及工艺参数不变，得到ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶gel/fcho/mg motor-1。
[0067]
实施例3
[0068]
同实施例1，不同的是步骤(4)中改变fcho载药胶束溶液的浓度为2.5％w/v，其他制备工艺条件及工艺参数不变，得到ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶gel/fcho/mg motor-0.5。
[0069]
对比例1
[0070]
纯明胶水凝胶的制备
[0071]
将500μl明胶溶液(15％w/v)和500μl pbs溶液均匀混合后，静置得到纯明胶水凝胶gel。
[0072]
下面结合附图及实验数据进行详细分析。对实施例1中制得的水凝胶进行表征及性能测试，具体如下：
[0073]
(1)水凝胶的形貌表征：
[0074]
将制备的水凝胶冻干后用金层喷涂其表面和横截面，通过扫描电子显微镜(sem)表征其微观结构。
[0075]
实验结果如图7所示，水凝胶呈现出不规则的多孔网络结构，表明该系列水凝胶具备良好的吸水性及透气性，有利于药物释放。
[0076]
(2)水凝胶的自修复性和注射性测试：
[0077]
将切割后的水凝胶进行重新组合观察其宏观自修复性，实验结果如图8(a)和(b)所示，对比例1中制得的纯明胶水凝胶无法实现自修复，而gel/fcho/mg motor水凝胶在一定时间后可相互连接形成一个整体，证明该水凝胶具有稳定的自修复性。
[0078]
使用流变仪评估水凝胶的微观自修复性。将水凝胶置于流变仪样品台，选择直径20mm的平行板。在恒定扫描频率(1hz)下，通过改变应变值(1％
→
1000％)，观察在多个循环中水凝胶储能模量(g')和损耗模量(g”)的变化情况。
[0079]
实验结果如图8(c)所示，当施加大应变(γ＝1000％)时，水凝胶的g'明显下降且低于g”，表明此时水凝胶内部的三维网络结构被破坏。当切换至小应变(γ＝1％)时，g'迅速回升，表明水凝胶内部结构已经重新构建，且在经历3次循环后g'和g”没有明显变化，再次表明该水凝胶具有良好的自修复功能，可快速实现自身结构恢复。
[0080]
使用流变仪评估水凝胶的剪切稀化行为，将水凝胶置于流变仪样品台上，选择稳态粘度扫描模式，设置剪切速率为1～100s-1
。
motor)，该水凝胶性能稳定且可以通过注射的方式敷于创面，提高覆盖效果。水凝胶结构中的亚胺键赋予其ph响应性，可控制药物释放。同时，该水凝胶具备优异的抗菌、抗氧化及清除ros能力，在治疗糖尿病全层皮肤缺损创面中显示出优于商用敷料(tegaderm tm film)的治疗效果，具有广阔的应用前景。

技术特征：
1.一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶，其特征在于，所述水凝胶由明胶、端醛基化pluron ic f127载药胶束以及镁微马达组成，利用明胶分子链上的氨基与端醛基化pluronic f127胶束上的醛基之间发生席夫碱反应所形成的亚胺键构建动态可逆的交联网络，并在其中负载ros清除剂镁微马达。2.根据权利要求1所述的一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶，其特征在于，所述药物为疏水性抗炎药物，选自姜黄素、小檗碱、槲皮素、布洛芬、吲哚美辛、塞来昔布、双氯芬酸钠。3.一种权利要求1或2所述ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：fcho的合成将pluronic f127、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺超声混合溶于无水四氢呋喃中，室温反应；将反应液浓缩后，用冷乙醚沉淀；将过滤干燥所得白色固体溶于纯水中，离心取上清液冷冻干燥，得到端醛基化pluronic f127，记为fcho；步骤2：fcho载药胶束的制备将端醛基化pluronic f127与疏水性抗炎药物超声溶于有机溶剂中，经旋转蒸发得到聚合物薄膜，水化溶解，得到负载药物的fcho胶束溶液；步骤3：镁微马达的制备用丙酮洗涤镁微粒，在n2下干燥；将镁微粒分散在预涂有聚乙烯吡咯烷酮的玻片上；在镁微粒层上再涂覆一层聚乳酸-羟基乙酸共聚物，干燥后刮下，得到镁微马达；步骤4：ph响应型水凝胶的制备将明胶溶液和不同浓度fcho载药胶束溶液均匀混合后，加入镁微马达，室温静置，得到ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶。4.根据权利要求3所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述的pluronic f127、对醛基苯甲酸、4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺的反应摩尔比1:(4～7.5):(0.4～0.6):(5～10)；pluronic f127、无水四氢呋喃的用量比为10g:50～100ml；反应时间为24～36h。5.根据权利要求3所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述的疏水性抗炎药物选自姜黄素、小檗碱、槲皮素、布洛芬、吲哚美辛、塞来昔布、双氯芬酸钠中的任一种；疏水性药物与端醛基化pluronic f127质量比为1:15～50。6.根据权利要求3所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙酮中的任一种；水化溶剂为0.01m，ph＝7.4的pbs缓冲液。7.根据权利要求3所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述的聚乙烯吡咯烷酮溶于乙醇中，浓度为1～4％(w/v)，分子量为24～30kda；所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于乙酸乙酯、丙酮或二氯甲烷中，浓度为0.5～2％(w/v)；所述的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乳酸和羟基乙酸的比例为75:25，分子量为8～10kda。8.根据权利要求3所述的ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述的明胶溶液的浓度为10～15％(w/v)，fcho载药胶束溶液的浓度为2.5～15％(w/v)，镁微马达的浓度为0.1～0.3％(w/v)；所述的明胶溶液与fcho载药胶束溶液的
体积比为1:0.5～1.5。9.权利要求1或2所述的一种ph响应型抗菌抗氧化载药水凝胶作为伤口敷料在治疗糖尿病全层缺损皮肤创面中的应用。

技术总结
一种pH响应型抗菌抗氧化载药水凝胶及其制备方法和应用，属于生物医用材料领域，由明胶、端醛基化Pluronic F127载药胶束及镁微马达组成；利用明胶分子链上的氨基与端醛基化Pluronic F127胶束上的醛基之间发生席夫碱反应所形成的亚胺键构建动态可逆的交联网络，并在其中负载用于清除ROS的镁微马达，得到pH响应型抗菌抗氧化载药水凝胶敷料。本发明制备工艺简单，原料易得，反应条件温和且无需添加其他引发剂。制备的水凝胶具备可注射性和自修复能力，可作为药物缓释载体，在酸性微环境下加速药物释放，改善炎症氧化应激微环境，已证实其在治疗糖尿病慢性创面感染方面具有积极的治疗效果和广阔的应用前景。治疗效果和广阔的应用前景。治疗效果和广阔的应用前景。


技术研发人员：赵秀丽 张湉 张九龙
受保护的技术使用者：沈阳药科大学
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/8/28