含有ATG7siRNA的外泌体及其应用

含有atg7 sirna的外泌体及其应用
技术领域
1.本发明属于医学领域，具体涉及一种含有atg7 sirna的外泌体及其应用。


背景技术：

2.胆管癌(cholangiocarcinoma,cca)是起源于胆道上皮细胞的浸润性恶性肿瘤，具有高度致死性，根据其病灶的解剖部位可分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌和远端胆管癌。虽然胆管癌总体发病率较低，但近年来其全球发病率逐渐升高，约占所有原发性肝肿瘤的15％和胃肠道肿瘤的3％。胆管癌具有极强的侵袭转移能力，手术治疗是目前的主要干预手段，而术后复发转移率高达80％以上。此外，胆管癌起病隐匿，绝大多数患者发现时因晚期肿瘤转移而错过了进行根治性手术的机会。尽管胆管癌的诊断和治疗手段有所进步，但患者的预后在过去十年中并未得到实质性改善，其5年生存率(7％-20％)仍不令人满意，探索其分子靶向治疗尤为重要。
3.自噬本质上是一种蛋白降解系统，可以被肿瘤细胞用于应对“环境压力”的一种分解代谢过程，其通过降解非必需的蛋白质、长寿蛋白、受损的细胞期等起到回收再利用的目的。自噬主要有三种类型：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy)，我们通常理解的自噬即是巨自噬。在自噬过程中，被降解成分被一种双层膜结构的囊泡所包裹，即自噬小体；自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体后完成降解过程。自噬因为其独特的再回收机制和应对“环境压力”的特性参与了许多病理、生理过程。
4.在肿瘤细胞中自噬常与肿瘤化疗敏感性有关。s.salcher等发现依托泊苷和阿霉素可以诱导神经母细胞瘤自噬，对自噬的抑制作用显着增加了依托泊苷和阿霉素诱导的细胞凋亡。在神经母细胞瘤中，组蛋白脱乙酰基酶10(hdac10)可以促进自噬介导的细胞存活。食管鳞状细胞癌(escc)单一载体上的ly294002(ly)和5-fu的组合具有比单一药物更高的细胞毒性。ly可抑制自噬，从而增强癌细胞对5-fu的敏感性并导致更多的细胞死亡。
5.自噬相关基因atg7编码的活化酶是自噬体膜延伸中的关键作用因子，参与自噬过程的两个重要的泛素结合系统，一是与将水溶性的lc3ⅰ转化成脂溶性的lc3ⅱ，二是与atg12结合到atg5上，并与atg16l1分子结合参与形成前自噬体结构。atg7还具有不依赖泛素激活酶的特点。atg7可与p53结合并协同p53参与细胞周期和凋亡的调控，在应激状态下激活细胞自噬。我们既往的研究发现，对atg7进行靶向性抑制，能够抑制胆管癌的生长转移，并具有化疗增敏作用，说明atg7可以成为胆管癌的治疗靶点。
6.sirna是一种双链分子，通常为19-21个碱基对，能够通过切断同源mrna来调控特定基因的表达。尽管sirna技术在肿瘤治疗具有很高的潜力，但迄今为止，临床应用仍然受到限制。一方面sirna都是分子量大的或带负电的分子，它们不能通过被动扩散的方式穿过细胞膜的脂质双分子层。另一方面，裸露的sirna在人体内环境中很脆弱，容易受到酶促降解和清除，使sirna很难到达肿瘤部位发挥功能。因此，迫切需要一种能够将sirna安全、高效地递送至胆管癌以实现其作用的载体。
7.外泌体(exosome)是一种直径约为40-160nm的细胞外囊泡。可以选择性分装蛋白质、脂质和核酸等释放到细胞外，释放到细胞外的外泌体，可以被驻留在微环境中的细胞捕获，也可以随生物体液被携带到远距组织器官，携带和传递重要的信号分子，构成一种全新的细胞之间的信息传递系统。
8.为了最大限度地提高递送效率，克服sirna传递过程的障碍，从而提高atg7 sirna造成胆管癌的自噬水平下降，抑制生长，基于外泌体的sirna递送系统具有显著的优势。工程化的设计使其表面修饰特定分子来获得胆管癌特异性靶向性，其具有以下优势：(1)良好的生物相容性和低毒性；(2)使sirna免受体内环境破坏，延长sirna在血液中的循环时间；(3)可以使sirna特异性的靶向到胆管癌，以减少全身的副作用。
9.虽然通过外泌体输送atg7 sirna可以实现对于atg7的靶向抑制，但是如果外泌体不能特异性识别胆管癌细胞的话，那么这种外泌体也能够抑制正常细胞中的atg7的表达，由此可能产生对正常细胞的毒副作用，因此输送atg7 sirna的外泌体需要具有胆管癌细胞特异性。载脂蛋白是脂蛋白的重要组分蛋白，载脂蛋白与非极性的脂质核心及游离胆固醇的隣脂单层组成生物大分子，参与体内脂质转运。另外，载脂蛋白作为脂蛋白受体的配体，还参与细胞表面受体特异性结合脂蛋白的作用，以确保下游信号通路顺利进行。目前的研究发现，载脂蛋白大致分为a、b、c、e五大类，其中每类中又包含不同的亚类，如a类中又分为a-1、a-2、a-4，迄今发现载脂蛋白20余种，目前发现，apo-a1的受体sr-b1在胆管癌细胞膜表面大量表达。
10.293t细胞是一种有极低的免疫原性以及旁分泌性的细胞系。其分泌的纳米级外泌体，可以通过靶向递送atg7 sirna发挥治疗作用。本发明通过在293t细胞表达cd63-apo-a1重组蛋白以获得胆道癌靶向性的纳米级外泌体，该外泌体可以通过向胆道癌细胞靶向递送atg7 sirna，从而发挥只针对胆道癌细胞的治疗作用，避免对正常细胞的毒副作用。
11.然而现有技术中，关于能特异性识别胆道癌细胞的atg7 sirna外泌体还鲜有报道。


技术实现要素：

12.本发明通过在293t细胞表达cd63-apo-a1重组蛋白以获得胆道癌靶向性的纳米级外泌体，该外泌体可以通过向胆道癌细胞靶向递送atg7 sirna，从而发挥只针对胆道癌细胞的治疗作用，避免对正常细胞的毒副作用。
13.具体的，本发明的技术方案如下：
14.本发明第一个方面公开了一种用于胆道癌治疗的工程化外泌体的制备方法，包括：
15.s1：提取表达重组蛋白cd63-apo-a1的靶向性外泌体；
16.s2：将atg7 sirna装载入s1中的靶向性外泌体得到用于胆道癌治疗的工程化外泌体。
17.优选的，在s2中，所述atg7 sirna的核苷酸序列为seq id no：5-9中的至少一种。
18.优选的，所述s1包括：
19.s11：制备cd63-apo-a1融合蛋白；
20.s12：构建表达载体plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr；
21.s13：提取重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr；
22.s14：转染重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr到细胞中，提取表达重组蛋白cd63-cxcl17的靶向性外泌体。
23.更优选的，在s12中，将plentai-puror-cmv-egfrvector与cd63-apo-a1回收产物连接，接着将连接产物转染大肠杆菌。
24.更优选的，cd63-apo-a1融合基因的核苷酸序列如seq id no：14所示，所述cd63-apo-a1融合基因翻译成所述cd63-apo-a1融合蛋白。
25.本发明第二个方面公开了一种用于胆道癌治疗的工程化外泌体，所述工程化外泌体含有atg7 sirna。
26.优选的，所述工程化外泌体包膜上表达重组cd63-apo-a1融合蛋白。
27.本发明第三个方面公开了上述方法制备得到的工程化外泌体或上述的工程化外泌体在制备用于胆道癌治疗的药物中的应用。
28.本发明第四个方面公开了一种治疗胆道癌的药物，所述药物包括上述的工程化外泌体或上述的方法制备得到的工程化外泌体。
29.本发明第五个方面公开了上述的治疗胆道癌在癌症治疗领域中的应用。
30.与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
31.本发明以自噬相关癌基因atg7为治疗靶点，采用工程化外泌体，实现针对胆管癌细胞的肿瘤组织特异性药物递送，仅在胆管癌细胞中抑制atg7，从而避免对正常细胞的毒副作用。
附图说明
32.图1为酶切验证结果。*nc＝未酶切对照，1kb＝1kb dnamarker，e＝xmai-bamhi酶切。
33.图2为流式细胞仪检测空载体与重组质粒egfp荧光强度荧光强度统计学分析示意图，**p《0.01。
34.图3为验证293t细胞中cd63和apo-a1的表达。
35.图4为工程化外泌体孵育正常细胞和胆管癌细胞红色荧光强弱统计学分析，**p《0.01。
36.图5为工程化外泌体介导胆道癌细胞lrpprc表达下调示意图。
具体实施方式
37.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
38.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
39.实施例1
40.1.方法：
41.1.1cd63-apo-a1融合基因的构建
42.1.1.1引物的设计与合成
43.根据融合蛋白cd63-apo-a1的基因序列，自行设计pcr引物如下
44.p1：5
’‑
ccaccgccatggtggcgcccggga-3’(cccggg为xmai识别位点)(seq id no：1)
45.p2：5
’‑
agtggctacgaggtgatgt-3’(seq id no：2)
46.p3：5
’‑
atgtagatgaaagctgcgg-3’(seq id no：3)
47.p4：5
’‑
tcactgggtgttgagggatccgc-3’(ggatcc为bamhi识别位点)(seq id no：4)
48.1.1.2cd63、apo-a1基因片段的扩增
49.以293t细胞cdna为模板，以cd63基因的p1、p2为引物，扩增cd63基因，反应体系如下：
[0050][0051]
pcr反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，61℃退火1min，72℃延伸2min，35cycle，72℃延伸10min，4℃保存。
[0052]
以293t cdna为模板，以apo-a1序列的p3、p4为引物，扩增apo-a1序列，反应体系如下：
[0053][0054]
pcr反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，61℃退火1min，72℃延伸2min，35cycle，72℃延伸10min，4℃保存。
[0055]
1.1.3pcr产物的纯化
[0056]
将扩增后的pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分析后，切下目的条带，经过dna凝胶回收试剂盒纯化，获得纯化后的pcr产物。
[0057]
1.1.4cd63-apo-a1融合基因的扩增
[0058]
使用重叠、延伸、拼接pcr(soe-pcr)的方法，以cd63、apo-a1的pcr回收产物为模板，以p1、p4为引物，扩增融合基因cd63-apo-a1，反应体系如下：
[0059][0060]
pcr反应条件为：98℃预变性8min，98℃变性30s，64℃退火1min，72℃延伸2min，42cycle，72℃延伸10min，4℃保存。
[0061]
扩增后的pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分析后，切下目的条带，经过dna凝胶回收纯化试剂盒纯化。
[0062]
1.2表达载体plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr的构建
[0063]
1.2.1plentai-puror-cmv-egfrvector酶切步骤
[0064]
用bamhi和xmai酶切载体plentai-puror-cmv-egfr，配置反应体系：
[0065][0066]
混匀后在37度水浴锅中孵育2小时；1.5％琼脂糖凝胶电泳，可见7700bp和848bp两个条带，取7700bp载体条带回收。(10xnebufferr3.1来自new englandbiolabs货号b6003s)1.2.2t4连接步骤
[0067]
建立t4连接体系
[0068][0069]
混匀后，16摄氏度连接过夜。(10x t4连接buffer来自thermo scientific货号b69)
[0070]
1.2.3连接产物的转化
[0071]
(1)-80℃冰箱中取出感受态top10大肠杆菌细胞，放置于超净工作台冰盒上，当其融化为冰水混合物时，加入5μl连接产物，轻轻吹打使其混匀，冰浴30min；
[0072]
(2)42℃水浴90s，冰浴4min；
[0073]
(3)加入800μl培养基，37℃振荡培养4h；
[0074]
(4)吸取300μl培养产物涂布在amp抗性(10μg/ml)的固体培养平板，37℃培养箱培养过夜。
[0075]
1.3重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr的提取
[0076]
使用质粒小提试剂盒(中国甄选(labselect)有限公司)进行质粒提取。
[0077]
(1)取1至5ml菌液，12000rpm，离心1分钟，吸弃上清，随后加入200μl溶液p1，充分混合后加入200μl溶液p2，温和上下翻转6～8次至溶液变得清亮粘稠，立刻加入250μl溶液p3，温和翻转6到8次。随后12000rpm，离心10分钟。
[0078]
(2)将上清转移至吸附柱，12000rpm，离心1分钟；弃去废液，加入700μl washing buffer，12000rpm，离心1分钟，重复两次。将吸附柱放入回收管，12000rpm离心2分钟，弃废液后室温静置至吸附柱内剩余液体晾干。将吸附柱转移至新的ep管，滴加洗脱液20μl，室温下静置5分钟，12000rpm，离心2分钟。收集溶液，thermo nanodrop-2000检测质粒浓度后置于-20℃保存。
[0079]
1.4293t细胞转染重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr
[0080]
使用thermo fisher scientific公司lipofectamine试剂盒进行细胞转染，步骤如下：
[0081]
(1)使用处于对数生长期的293t细胞进行实验。细胞消化、计数后按每孔2
×
105的密度接种于6孔板，培养过夜，当细胞贴壁后进行转染。
[0082]
(2)配制溶液1：mem培养基(250μl)+lipo3000(3.75μl)。配制溶液2：mem培养基(250μl)+质粒(5μg)+p3000。溶液1和2分别在室温下静置15分钟，随后混合，并孵育5分钟。
[0083]
(3)细胞用pbs润洗后加入(2)中的混合液，培养6小时换成dmem完全培养基。
[0084]
1.5通过western blot方法鉴定cd63-apo-a1融合蛋白在293t细胞中的表达。
[0085]
(1)蛋白裂解：首先配制裂解液：200μl ripa裂解液加入4μl蛋白酶抑制剂，4μl磷酸酶抑制剂和2μl pmsf，冰上混合，现配现用。向细胞沉淀或外泌体沉淀中加入200μl裂解液，然后在冰上孵育20分钟后，12000
×
g，4℃下离心5分钟，收集上清。使用bca定量法测定蛋白质的浓度。
[0086]
(2)蛋白变性：向上清中加入sds-page蛋白上样缓冲液(5
×
)，随后100℃水浴10分钟，使蛋白充分变性。
[0087]
(3)电泳：制备8％sds-page凝胶，上样后于80v恒压电泳30分钟，然后在120v恒压下电泳，直至溴酚蓝距凝胶下缘0.5cm时终止电泳。
[0088]
(4)转膜，取出sds-page凝胶，按电源阴极、海绵、滤纸、sds-page凝胶、pvdf膜、滤纸、海绵、电源阳极的顺序固定后，放置于转膜槽，在100v恒压下转膜90分钟。
[0089]
(5)封闭，取出pvdf膜，放置在用tbst配制的含5％脱脂奶粉的封闭液中，放置于室温下封闭1小时。
[0090]
(6)孵育一抗：取出pvdf膜，用封闭液按1：1000的比例稀释一抗，将膜置于一抗溶液中，放在摇床上轻摇，4℃孵育过夜。
[0091]
(7)孵育二抗：取出pvdf膜，用tbst洗涤3次后，室温下孵育二抗，1小时后用tbst洗涤3次。
[0092]
(8)显色：配制ecl发光液：增强液：稳定液＝1：1。将ecl发光液滴加于pvdf膜的蛋白结合面。用滤纸吸去多余的发光液后，用x光胶片压片，随后将胶片依次放入显影液、定影液后，用水冲洗，拍照并统计结果。
[0093]
1.6表达重组蛋白cd63-apo-a1的靶向性外泌体的提取
[0094]
吸弃293t细胞旧培养液，用pbs润洗3遍，为确保收集到的培养上清中无外界外泌体混杂因素的影响，将培养基换成含10％去除外泌体的fbs(超速离心去除外泌体)配制的dmem培养基，常规培养36小时后收集培养液。取50ml培养液在300
×
g，4℃下离心10分钟，弃去沉淀。随后2000
×
g，4℃下离心10分钟，弃去沉淀。随后10000
×
g，4℃下离心30分钟，弃去沉淀。随后在100000
×
g，4℃下离心70分钟，此时的沉淀为外泌体。吸弃上清，随后加入200μl pbs重悬，然后100000
×
g，4℃下离心70分钟，吸弃上清，加入50μl pbs重悬。置于-80℃冰箱保存。
[0095]
1.7atg7 sirna序列及靶向位点
[0096]
设计并合成靶向atg7位点的sirna如下表所示：
[0097]
[0098]
1.8通过电穿孔方式将atg7 sirna装载入靶向性外泌体中构建工程化外泌体
[0099]
将纯化的靶向性外泌体和atg7混合在电穿孔缓冲液中，使用bio-rad gene pulserxcell电穿孔系统在电穿孔比色杯中以350v的电压进行电穿孔，随后将混合物在37℃下孵育30min以恢复外泌体包膜。
[0100]
1.9通过透射电子显微镜观察外泌体
[0101]
将10μl外泌体悬液滴加至formvar-碳膜包被的载样铜网，静置1分钟后风干。使用pbs润洗formvar膜面3次，保持铜网另一面干燥。使用1％戊二醛室温下固定20分钟。使用ddh2o润洗两次后，用2％乙酸铀酰染色15分钟。随后使用甲基纤维素-ua润洗10分钟后风干。在透射电子显微镜下观察并拍照。
[0102]
1.10外泌体的粒径鉴定
[0103]
用ddh2o稀释外泌体悬液，外泌体颗粒浓度控制在1x107/ml至1x109/ml之间，使用zetaview pmx110仪器在405nm激光下测定样本中例子数量和大小，采用纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis，nta)软件分析外泌体大小。
[0104]
1.11外泌体示踪与靶向性鉴定
[0105]
(1)外泌体染色
[0106]
采用bca定量法测定外泌体含量，取500μg外泌体，与4μg/ml的dil红色染料等体积混合，4℃避光孵育2小时。随后用1ml pbs将外泌体重悬后，100000
×
g，4℃下离心70分钟，吸弃上清并用50μl pbs重悬，此为红色荧光标记的外泌体(dil-exosome)。将其放置在-80℃冰箱中避光保存。
[0107]
(2)外泌体与细胞孵育
[0108]
采用不同种细胞系共同孵育带dil荧光标记的外泌体，在相同时间内，观察胆管癌对比其他种细胞系对工程化外泌体的摄取情况。以下操作均避光进行。将5x105个细胞接种于放置有细胞爬片的6孔板，12小时后将50μg dil-exosome加入培养液，24小时后吸弃培养液，随后用pbs润洗3次并加入1ml 4％多聚甲醛常温下固定细胞15分钟。将固定液吸出后，加入1ml 0.1％tritonx-100，孵育细胞5分钟，随后用pbs洗涤3次。最后用预混dapi的抗荧光淬灭剂的封片液封片，并避光15分钟。在荧光显微镜下观察外泌体吞噬情况。运用流式细胞仪检测外泌体吞噬情况。
[0109]
1.12通过实时荧光定量pcr实验检测胆管癌细胞atg7表达水平
[0110]
实验所需引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。本部分涉及的引物序列见下表：
[0111][0112]
使用roche公司的sybr green pcr master mix进行实验，体系如下：
[0113][0114][0115]
将上述反应体系置于lightcycler 96实时荧光定量pcr仪。cdna的pcr扩增采用两步法进行。
[0116]
条件为：步骤1，预变性：95℃，30秒，设置1个循环；步骤2，pcr反应：95℃，5秒，60℃，30秒，设置40个循环。每个样品设置3个复孔。以gapdh作为内参，随后检测每个样本的ct值(荧光强度达到所设阈值时所需要的循环数)，目的基因的相对表达水平用2
‑△△
ct
法计算：
[0117]
△
ct(实验组)＝ct(目的基因，实验组)－ct(内参基因，实验组)
[0118]
△
ct(对照组)＝ct(目的基因，对照组)－ct(内参基因，对照组)
[0119]
△△
ct＝
△
ct(实验组)－
△
ct(对照组)
[0120]
2.结果
[0121]
2.1重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr的鉴定
[0122]
将重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr用xmai和bamhi双酶切，结果见图1，可见两条大约为9000和3500bp大小条带，分别为plentai-puror-cmv-egfrvector线性片段和cd63-apo-a1融合基因片段，成功构建了重组表达质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr。
[0123]
2.重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr转染至293t细胞
[0124]
将重组质粒转染至293t细胞，293t细胞表达egfp而发出绿色荧光，使用流式细胞仪检测荧光强度。表明工程质粒可以在细胞内表达整合重组的cd63-apo-a1基因，如图2所示。
[0125]
2.3融合基因cd63-apo-a1的验证
[0126]
转染了空载体的293t细胞内低表达cd63和apo-a1，而转染了工程质粒的293t细胞内高表达cd63和apo-a1，表明重组质粒能成功在293t细胞中表达整合的cd63和apo-a1，如图3所示。
[0127]
2.4工程化外泌体的提取、制备和鉴定
[0128]
收集转染了工程质粒的293t细胞培养液，通过超速离心法提取培养液中的外泌体，通过电穿孔的方式将atg7 sirna递送到外泌体中，构建为为工程化外泌体，在电子显微镜下观察外泌体的结构，该结构与一般外泌体没有明显差异，表明改造的工程化外泌体没有改变其结构性质。通过nta检测工程化外泌体的粒径。其粒径大小没有明显差异，表明改造的工程化外泌体没有改变外泌体的结构性质。
[0129]
2.5工程化外泌体靶向性的测定
[0130]
为了验证工程化外泌体的靶向性，使用红色染料dil标记工程化外泌体，并用于孵育人正常胆管细胞(hibepic)和胆管癌细胞(rbe)，通过流式细胞仪测定红色荧光，发现胆管癌细胞中的红色荧光较多，表明工程化外泌体倾向于富集在肿瘤细胞中而非正常组织细
胞，表明该工程化外泌体有对胆管癌的靶向性，如图4所示。
[0131]
2.6工程化外泌体造成胆管癌细胞内atg7表达下调
[0132]
通过实时荧光定量pcr方法，检测转染普通外泌体(control)和工程化外泌体(cd63-apo-a1)的胆管癌细胞中atg7的表达，如图5所示。
[0133]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于胆道癌治疗的工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括：s1：提取表达重组蛋白cd63-apo-a1的靶向性外泌体；s2：将atg7 sirna装载入s1中的靶向性外泌体得到用于胆道癌治疗的工程化外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在s2中，所述atg7 sirna的核苷酸序列为seq id no：5-9中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1包括：s11：制备cd63-apo-a1融合蛋白；s12：构建表达载体plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr；s13：提取重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr；s14：转染重组质粒plentai-puror-cmv-cd63-apo-a1-egfr到细胞中，提取表达重组蛋白cd63
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cxcl17的靶向性外泌体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在s12中，将plentai-puror-cmv-egfr vector与cd63-apo-a1回收产物连接，接着将连接产物转染大肠杆菌。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，cd63-apo-a1融合基因的核苷酸序列如seq id no：14所示，所述cd63-apo-a1融合基因翻译成所述cd63-apo-a1融合蛋白。6.一种用于胆道癌治疗的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体含有atg7 sirna。7.根据权利要求6所述的工程化外泌体，其特征在于，所述工程化外泌体包膜上表达重组cd63-apo-a1融合蛋白。8.根据权利要求1-5所述方法制备得到的工程化外泌体或权利要求6-7所述的工程化外泌体在制备用于胆道癌治疗的药物中的应用。9.一种治疗胆道癌的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求6-7所述的工程化外泌体或权利要求1-5所述的方法制备得到的工程化外泌体。10.根据权利要求9所述的治疗胆道癌在癌症治疗领域中的应用。

技术总结
本发明属于医学领域，具体涉及一种ATG7 siRNA的外泌体在制备治疗胆道癌药物中的应用。该方法包括：S1：提取表达重组蛋白CD63-APO-A1的靶向性外泌体；S2：将ATG7 siRNA装载入S1中的靶向性外泌体得到用于胆道癌治疗的工程化外泌体。本发明制备得到一种ATG7 siRNA的外泌体；该工程化外泌体通过向胆道癌靶向递送ATG7 siRNA以杀伤肿瘤细胞，从而实现针对胆道癌细胞的精准药物递送，只针对胆道癌细胞的治疗作用，避免对正常细胞的毒副作用。避免对正常细胞的毒副作用。避免对正常细胞的毒副作用。


技术研发人员：李伟 梁展文 陈凯 龚斐然 何康 徐梦丹 吴梦瑶 徐彩华
受保护的技术使用者：苏州大学附属第一医院
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/8/30