褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂

褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂
技术领域
1.本发明涉及害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及一种褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂。


背景技术：

2.杀虫剂在农业害虫防治中发挥了重要作用，但连续、大量、单一使用一种或一类药剂加速了害虫抗药性进化速度。害虫抗药性已成为世界范围内普遍存在的问题并日趋严重，至今已有700余种昆虫及螨类对不同种类农药产生了不同程度的抗药性。褐飞虱nilaparvata lugens(brown planthopper)是一种世界性的水稻害虫，具有繁殖快、爆发性强等特点，由于化学农药长期、不合理使用以及褐飞虱自身的生物学特性，褐飞虱已对多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。代谢抗性是昆虫对杀虫剂产生抗药性的重要原因，主要表现为一系列解毒酶活性的提高。
3.在目前的害虫抗药性治理当中，由于农业生产者的不专业，导致害虫抗药性增加、农药用量增加、害虫抗药性进一步增加的恶性循环在害虫抗药性治理中屡见不鲜。目前害虫抗药性治理面临着巨大的困境，害虫抗药性发展速度已经超过了新药剂开发速度，并且新药的开发困难重重，新的靶标难以引入，所以如何利用好现有杀虫剂，并且高效精准克服害虫抗药性成为重要的科学问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1及其治理农业害虫抗药性的杀虫剂，本发明以zif-8为载体，同时负载杀虫剂与dsrna，高效靶向递送dsrna沉默靶标基因并提高了杀虫剂的递送效率，达到克服害虫抗药性的目的，进而实现对害虫的抗药性治理。
5.为实现上述目的，本发明所设计了以下技术方案：
6.本发明提供了一种褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.本发明还提供了一种用于获得上述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的引物对，所述引物对为：
8.上游引物：5
’‑
gctctagagtcaacttctacgtttactcctattg-3’，下游引物：5
’‑
ccctcgagatcacattcagcccgtagttgtttg-3’。
9.本发明还提供了一种重组载体pesi-t-nlcyp6er1，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的表达载体，其中，所述表达载体为pesi-t载体。
10.本发明还提供了一种重组载体l4440-nlcyp6er1，所述重组载体含有上述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的表达载体，其中，所述表达载体为l4440。
11.本发明还提供了一种含有上述重组载体l4440-nlcyp6er1的宿主细胞，所述宿主细胞为ht115感受态细胞。
12.本发明还提供了一种利用上述宿主细胞诱导提取dsnlcyp6er1的方法，所述方法是将含有重组载体l4440-nlcyp6er1的宿主细胞培养，摇至od600＝0.40左右加入iptg，使其终浓度为1mm，进行诱导表达，37℃振荡培养4h，提取细菌总rna，纯化后得到的dsrna，即为dsnlcyp6er1。
13.本发明还提供了一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂，其特征在于：所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2-甲基咪唑、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsnlcyp6er1。
14.进一步地，所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13.86份的2-甲基咪唑、1份的吡虫啉和0.080份的dsnlcyp6er1。
15.本发明还提供了一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂的制备方法，包括以下步骤：
16.1)按重量份数比称取1份的六水合硝酸锌溶液、13～14份的2-甲基咪唑溶液、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsnlcyp6er1；
17.2)将六水合硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于水中，分别得到六水合硝酸锌溶液(zn(no3)2·
6h2o溶液)和2-甲基咪唑溶液；
18.3)将吡虫啉溶液溶于二甲基亚砜dmso中，得到吡虫啉饱和dmso溶液；
19.4)将dsnlcyp6er1加入六水合硝酸锌溶液，室温搅拌；得到反应溶液；然后向反应溶液中加入吡虫啉饱和dmso溶液，室温搅拌混合均匀，最后加入2-甲基咪唑溶液室温反应，反应结束后，10000rpm下离心收集吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8纳米颗粒，用去离子水和无水乙醇洗涤三次，真空干燥；最终得到纳米化杀虫剂。
20.本发明还提供了一种上述的治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂在防治褐飞虱中的应用。
21.本发明原理：
22.rna干扰(rnai)是生物学中普遍存在的现象。它是一种小干扰rna(sirna)介导的转录后基因沉默，具有特异性、高效性和可传递性等特点。在过去的几年里，借助rna干扰(rnai)下调多细胞生物的靶基因已成为成熟的技术，但是rnai存在一定缺陷，将dsrna注入体腔可以成功触发rnai，而饲喂相同dsrna的效率较低，或完全无效。所以增加rnai效率是目前rnai技术应用于克服害虫抗药性的首要任务。
23.纳米材料作为一种新兴材料在多个领域得到运用，我们发现以纳米材料作为载体，保护并递送dsrna或sirna可以大幅提升rnai效率，并且粒径200nm以下的纳米材料可以在植物体内吸收传导。纳米材料的这些特性对于rnai技术在实际的应用提供了更多的可能。沸石咪唑酯骨架材料(zeolitic imidazolate framework-8,zif-8)是由zn(ⅱ)与2-甲基咪唑配位自组装形成的多孔结晶材料，具备化学稳定性高，晶型和孔径可控，比表面积和孔体积大，生物相容性良好等优点，是极具潜力的纳米农药载体。
24.基于以上原因本发明选择褐飞虱作为模式昆虫，选择nlcyp6er1作为靶标基因，提供一种纳米材料共同递送dsrna与杀虫剂在害虫抗药性治理中的方法。
25.本发明的有益效果：
26.(1)利用ht115-l4440体系诱导表达得到dsrna，大大降低了dsrna的合成成本；
27.(2)利用rnai技术，沉默了褐飞虱杀虫剂抗药性的相关基因，提高了褐飞虱对杀虫剂的敏感性，并且通过zif-8递送dsnlcyp6er1提高了dsnlcyp6er的rnai效率；
28.(3)构建了杀虫剂与dsrna共同负载体系，利用zif-8同时负载了dsrna与杀虫剂，合成方法简单反应条件温和，具备实际应用的潜力；
29.(4)nlcyp6er1与褐飞虱多种新烟碱类杀虫剂抗药性密切相关，因此该体系可以用于多种新烟碱类杀虫剂的抗药性治理；
30.(5)更换靶标基因与杀虫剂，该体系也可以完成对其他害虫的抗药性治理。
附图说明
31.图1为诱导表达纯化后dsnlcyp6er1凝胶电泳图，
32.图中，1：marker 2：dsnlcyp6er1；
33.图2为吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8透射电镜图；
34.图3为吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8扫描电镜图；
35.图4为吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8透射电镜能谱图；
36.图5为不同处理下褐飞虱的生曲线图；
37.图中，“*”表示与存在显著差异(student’s；p＜0.05)；
38.图6为不同处理下褐飞虱nlcyp6er1表达量图，
39.图中，柱形图表示平均值
±
标准误；采用tukey法进行多重比较，柱上不同字母表示显著性差异(p《0.05)；
40.图7为盆栽实验不同处理下褐飞虱存活率图，
41.图中，柱形图表示平均值
±
标准误；“*”表示与存在显著差异(student’s；p＜0.05)。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
43.实施例1褐飞虱p450基因的nlcyp6er1基因全长克隆
44.按照takara公司rna iso plus动植物组织总rna提取试剂操作说明进行褐飞虱总rna提取，按照hifair ii 1st strand cdna synthesis supermix for qpcr(gdna digester plus)反转录试剂盒(yeasen公司)操作步骤进行cdna第一链的合成。设计引物正向引物：5
’‑
atgtgggaaaactcgtggttggc-3’；
45.反向引物：5
’‑
agctggtagcgagagatacttag-3’46.以cdna为第一模板，采用rt-pcr方法，克隆nlcyp6er1序列，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。按照e.z.n.a胶回收试剂盒操作方法回收nlcyp6er1基因片段，将回收得到的pcr产物与pesi-t载体连接，连接产物转化至trelief tm5α感受态细胞菌株后，涂布于加有氨苄青霉素的固体lb培养基平板上，培养12h左右，挑取白色单菌落于lb+amp液体培养基中培养。用2
×
hieff pcr mester mix(yeasen公司)进行菌液pcr初步验证，取验证正确的样品进一步进行测序验证。褐飞虱nlcyp6er1基因核酸序列1521bp，序列表中seq id no：1所示。
47.实施例2褐飞虱p450基因的nlcyp6er1基因的dsrna合成
48.1大肠杆菌ht115(de3)诱导dsrna表达
49.1.1nlcyp6er1基因片段的克隆及干扰载体的构建
50.根据实施例1中所克隆得到的褐飞虱p450基因nlcyp6er1全长，设计合成引物，引物两端需插入酶切位点x-bai和x-hoi，
51.上游引物：
[0052]5’‑
gctctagagtcaacttctacgtttactcctattg-3’[0053]
下游引物：
[0054]5’‑
ccctcgagatcacattcagcccgtagttgtttg-3’[0055]
下划线部分为引入酶切位点
[0056]
根据实施例1中得到的cdna第一链为模板，通过pcr法扩增得到长度为522bp的片段序列，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并采用e.z.n.a.胶回收试剂盒操作方法回收该目的片段。将目的片段与pesi-t载体连接，连接产物转化至trelief tm5α感受态细胞菌株后，涂布于加有氨苄青霉素的固体lb培养基平板上，培养12h左右，挑取白色单菌落于lb+amp液体培养基中培养。用2
×
hieff pcr mester mix(yeasen公司)进行菌液pcr初步验证，取验证正确的样品进一步进行测序验证。将测序验证正确的阳性克隆菌株用omega的e.z.n.a.plasmid mini kit试剂盒提取质粒，获得pesi-t-nlcyp6er1。
[0057]
将已经构建好的pesi-t-nlcyp6er1载体与l4440载体分别同时用x-bai和x-hoi(takara公司)进行双酶切，回收连接，转化trelief tm5α感受态细胞菌株后，涂布于加有氨苄青霉素的固体lb培养基平板上，培养12h左右，挑取白色单菌落于lb+amp液体培养基中培养。用2
×
hieff
tm pcr master mix(yeasen公司)进行菌液pcr初步验证，用omega的e.z.n.a.plasmid mini kit试剂盒提取质粒。
[0058]
1.2dsrna诱导表达及提取纯化
[0059]
将已经构建好的l4440-nlcyp6er1载体转化至ht115感受态细胞后，涂布于加有氨苄青霉素的固体lb培养基平板上，培养12h左右，挑取白色单菌落于lb+amp液体培养基中培养。用2
×
hieff pcr mester mix(yeasen公司)进行菌液pcr初步验证，选择菌检阳性的菌液送测序，并冻存菌种。37℃振荡培养含有l4440-nlcyp6er1质粒的菌液摇至od600＝0.40左右加入iptg，使其终浓度为1mm，进行诱导表达，37℃振荡培养4h。提取细菌总rna，纯化后得到的dsrna(dsnlcyp6er1)以分光光度计及1％琼脂糖凝胶电泳检测dsrna的浓度与质量(图1)，于-80℃保存备用。
[0060]
由图1可知：在500bp左右存在明亮条带，大小与目的条带一致，表明dsnlcyp6er1被成功制备。
[0061]
实施例3治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂的制备
[0062]
一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂(吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8)的原料按重量份数比计包括1g的六水合硝酸锌、13.86g的2-甲基咪唑、1g的吡虫啉和0.080g的dsnlcyp6er1。
[0063]
上述治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂(吡虫啉
[0064]
/dsnlcyp6er1@zif-8)的制备方法，包括以下步骤：
[0065]
1)称取1g的六水合硝酸锌、13.86g的2-甲基咪唑、1g的吡虫啉和0.080g的
dsnlcyp6er1。
[0066]
2)将六水合硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于水中，分别得到六水合硝酸锌溶液(zn(no3)2·
6h2o，100mg/ml)和2-甲基咪唑溶液(1540mg/ml)；
[0067]
3)将吡虫啉溶液溶于二甲基亚砜dmso中，得到吡虫啉饱和dmso溶液；
[0068]
4)将dsnlcyp6er1的溶液加入六水合硝酸锌溶液(zn(no3)2·
6h2o溶液)，室温搅拌5min；得到反应溶液；然后向反应溶液中加入吡虫啉饱和dmso溶液，室温搅拌5min混合均匀，最后加入2-甲基咪唑溶液室温反应30min，反应结束后，10000rpm下离心收集吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8纳米颗粒，用去离子水和无水乙醇洗涤三次，真空干燥；最终得到纳米化杀虫剂吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8。
[0069]
对吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8进行透射电镜，扫描电镜和透射电镜能谱表征，结果由图2～4可知，吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8粒径在200nm左右，材料分散性良好，p，cl，zn元素在材料上均匀分布，表明zif-8成功同时负载了吡虫啉与dsnlcyp6er。表征结果证明吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8被成功制备。
[0070]
实施例4纳米化制剂在褐飞虱抗药性治理中的应用
[0071]
1.1基于纳米化制剂的褐飞虱室内生物活性测定
[0072]
利用稻苗浸渍法对褐飞虱进行生物活性测定，共设计5组处理，分别以zif-8、dsnlcyp6er1@zif-8、吡虫啉、吡虫啉@zif-8和吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8进行处理，以清水处理为对照。每组处理1头试虫，试验重复50次，记录褐飞虱死亡情况至第八天。
[0073]
如图5可知：zif-8和dsnlcyp6er1@zif-8处理组褐飞虱的存活率与对照组相比差异不显著，说明zif-8和dsnlcyp6er1@zif-8处理组对褐飞虱的存活率没有影响。但吡虫啉@zif-8处理组褐飞虱的存活率明显低于吡虫啉处理组，由82％下降到62％。表明zif-8能显著提高褐飞虱对吡虫啉的敏感性。吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8处理组褐飞虱存活率仅为8％，显著低于吡虫啉和吡虫啉@zif-8处理组，为所有处理组中最低。表明吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8具备良好的抗性治理的潜力。
[0074]
利用稻苗浸渍法对褐飞虱进行处理，共设计7组处理，分别为zif-8、dsnlcyp6er1、dsnlcyp6er1@zif-8吡虫啉、吡虫啉@zif-8和吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8，以清水处理为对照。每组处理30头试虫，试验重复3次。处理24h后取样，提取总rna，利用qrt-pcr技术检测褐飞虱nlcyp6er1基因表达量。
[0075]
由定量结果(图6)可知，dsnlcyp6er1和zif-8处理组褐飞虱nlcyp6er1的表达均未显著降低。表明zif-8对nlcyp6er1表达无显著影响，裸dsnlcyp6er1不能通过水稻植株实现对褐飞虱nlcyp6er1表达的沉默。dsnlcyp6er1@zif-8处理组nlcyp6er1的表达较裸dsnlcyp6er1处理组明显降低，说明zif-8可以显著提高dsnlcyp6er1对nlcyp6er1的沉默效率。吡虫啉@zif-8处理组nlcyp6er1表达较吡虫啉处理组明显降低，但吡虫啉@zif-8处理与对照组nlcyp6er1表达无显著差异。这可能是因为吡虫啉被zif-8覆盖，而装载吡虫啉的zif-8降低了褐飞虱对吡虫啉的应激反应。与吡虫啉和吡虫啉@zif-8处理相比，吡虫啉
[0076]
/dsnlcyp6er1@zif-8处理显著降低了nlcyp6er1的表达，说明dsnlcyp6er1成功抑制了nlcyp6er1的表达。定量结果表明zif-8可以显著提高dsnlcyp6er1对靶基因的干扰效率。
[0077]
1.2基于纳米化制剂的褐飞虱盆栽实验
[0078]
利用喷雾法进行盆栽实验，共设计3组处理，分别为吡虫啉和吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8，以清水处理为对照。每组处理100头试虫，试验重复3次。7天后记录试虫死亡情况(图7)
[0079]
如图7可知：通过盆栽实验进一步验证吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8对褐飞虱的生物活性。吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8处理组褐飞虱存活率较吡虫啉处理组明显下降，从54％下降到24％。表明吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8对褐飞虱的防治效果优于吡虫啉。这与生存曲线的结果一致，说明dsnlcyp6er1@zif-8可以克服褐飞虱对吡虫啉的抗性。
[0080]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1，其核苷酸序列如seq id no：1所示。2.一种用于获得权利要求1所述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的引物对，其特征在于：所述引物对为：上游引物：5
’‑
gctctagagtcaacttctacgtttactcctattg-3’，下游引物：5
’‑
ccctcgagatcacattcagcccgtagttgtttg-3’。3.一种重组载体pesi-t-nlcyp6er1，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的表达载体，其中，所述表达载体为pesi-t载体。4.一种重组载体l4440-nlcyp6er1，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述褐飞虱细胞色素p450基因nlcyp6er1的表达载体，其中，所述表达载体为l4440。5.一种含有权利要求4所述重组载体l4440-nlcyp6er1的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为ht115感受态细胞。6.利用权利要求5所述宿主细胞诱导提取dsnlcyp6er1的方法，其特征在于：所述方法是将含有重组载体l4440-nlcyp6er1的宿主细胞培养，摇至od600＝0.40左右加入iptg，使其终浓度为0.4mm，进行诱导表达，37℃振荡培养4h，提取细菌总rna，纯化后得到的dsrna，即为dsnlcyp6er1。7.一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂，其特征在于：所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2-甲基咪唑、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsnlcyp6er1。8.根据权利要求7所述治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂，其特征在于：所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13.86份的2-甲基咪唑、1份的吡虫啉和0.080份的dsnlcyp6er1。9.一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)按重量份数比称取1份的六水合硝酸锌溶液、13～14份的2-甲基咪唑溶液、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsnlcyp6er1；2)将六水合硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于水中，分别得到六水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑溶液；3)将吡虫啉溶液溶于二甲基亚砜dmso中，得到吡虫啉饱和dmso溶液；4)将dsnlcyp6er1加入六水合硝酸锌溶液，室温搅拌；得到反应溶液；然后向反应溶液中加入吡虫啉饱和dmso溶液，室温搅拌混合均匀，最后加入2-甲基咪唑溶液室温反应，反应结束后，10000rpm下离心收集吡虫啉/dsnlcyp6er1@zif-8纳米颗粒，用去离子水和无水乙醇洗涤三次，真空干燥；最终得到纳米化杀虫剂。10.一种权利要求7所述的治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂在防治褐飞虱中的应用。

技术总结
本发明公开了涉及害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及一种褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。纳米化杀虫剂的原料包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2-甲基咪唑、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsNlCYP6ER1。本发明以ZIF-8为载体，同时负载杀虫剂与dsRNA，高效靶向递送dsRNA沉默靶标基因并提高了杀虫剂的递送效率，达到克服害虫抗药性的目的，进而实现对害虫的抗药性治理。进而实现对害虫的抗药性治理。进而实现对害虫的抗药性治理。


技术研发人员：何顺 万虎 马康生 于畅 李建洪
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/24