检测人Hrob突变的引物对、试剂盒、方法及其应用与流程

检测人hrob突变的引物对、试剂盒、方法及其应用
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测人hrob突变的引物对、试剂盒、方法及其应用。


背景技术：

2.全世界约7％的男性面临着男性不育症的困扰，包括少、弱、畸形精子症、无精子症及其他原因不明的男性不育症。其中，表型最严重的是非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,noa)，其特征是睾丸中未见单倍体长形精子。非梗阻性无精子症主要由精子发生障碍所致，且近50％的病例与遗传缺陷相关，包括染色体异常、y染色体azf微缺失、基因突变等。
3.目前，已发现超过2300个基因参与精子发生过程，其中约800个基因已通过模式动物证实其缺失可导致精子发生障碍而引起男性不育，这其中仅有400多个基因在动物模型中被证实可以导致非梗阻性无精子症；但目前仅有十几个导致非梗阻性无精子症的致病基因在人体中被证实，包括sycp3、nr5a1、tex11、tdrd7和mcm8等。然而大部分非梗阻性无精子症患者的遗传学病因并不清楚，这为患者的治疗和预防带来了极大困难。
4.在临床实践中，通常需要经过睾丸活检等有创的检测手段对非梗阻性无精子症进行确诊。由减数分裂相关基因导致的非梗阻性无精子症，在睾丸活检中无法找到单倍体精子，这类患者通常只能通过供精的方式生育。在进行睾丸活检之前，特异性地对非梗阻性无精子症患者进行基因检测，可以避免对患者进行睾丸活检，直接选择合适的助孕方式。
5.因此，明确与非梗阻性无精子症相关的致病基因具有重要的临床意义。


技术实现要素：

6.本技术研究发现临床诊断为非梗阻性无精子症的患者，其基因组中hrob发生了c.1351c》t无义突变，基因突变后编码的hrob蛋白发生了截短，导致减数分裂异常。基于此，本技术提供了一种成本低、快速、高效的检测人hrob突变的引物对、试剂盒、方法及其应用。
7.具体技术方案如下：
8.根据本技术的一个方面，提供了一种检测人hrob突变的试剂在制备诊断非梗阻性无精子症的产品中的应用，野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171253，以野生型hrob的mrna为参考，所述突变包括c.1351c》t，和/或，
9.以野生型hrob蛋白为参考，所述突变包括p.r451x。
10.根据本技术的第二方面，提供了一种用于检测人hrob突变的引物对，野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171253，以野生型hrob的mrna为参考，所述突变包括c.1351c》t。
11.在其中一个实施例中，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示。
12.在其中一个实施例中，所述引物对通过以下方法中的一种或多种方法检测所述突变：
13.普通pcr扩增法、测序法和实时荧光定量pcr法。
14.根据本技术的第三方面，提供了一种用于检测人hrob突变的试剂盒，包括上述的引物对。
15.在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、核酸提取试剂、pcr扩增试剂、测序试剂和电泳检测试剂中的至少一种。
16.根据本技术的第四方面，提供了一种检测人hrob突变的方法，包括以下步骤：
17.以待测样本的dna为模板，使用上述的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；及
18.对所述扩增产物进行分析，以确定所述人hrob的突变情况。
19.在其中一个实施例中，在对所述扩增产物进行分析之前，还包括对所述扩增产物进行测序的步骤。
20.在其中一个实施例中，对所述扩增产物进行分析的步骤包括：
21.分析所述人hrob是否发生c.1351c》t突变。
22.在其中一个实施例中，所述待测样本为外周血、精液、精囊、囊胚培养物或细胞全基因组扩增产物。
23.与传统技术相比，本技术具有如下有益效果：
24.本技术通过研究发现非梗阻性无精子症患者的hrob发生了c.1351c》t无义突变，并通过sanger测序、蛋白结构预测、wb等技术对该突变位点进行了验证，结果表明该突变导致hrob蛋白截短、空间结构异常；从而影响正常的减数分裂异常。因此，检测患者hrob是否发生c.1351c》t突变，可以在临床上辅助判断非梗阻性无精子症患者的遗传病因，为非梗阻性无精子症患者选择合适的治疗方法提供参考。
25.此外，本技术的检测hrob突变的方法，采用pcr结合sanger测序的方法，可在1～2天内完成检测，具有快速、高效、成本低等优点。
附图说明
26.为了更清楚地说明本技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本技术实施例1中非梗阻性无精子症患者的家系图，iii-2为非梗阻性无精子症患者；
28.图2为本技术实施例1中非梗阻性无精子症患者与正常对照睾丸活检样本的he染色图；
29.图3为本技术实施例1中非梗阻性无精子症患者及其家系成员的sanger测序图；
30.图4为c.1351c》t突变导致hrob蛋白发生截短的示意图；
31.图5为hrob突变前、后的蛋白空间结构示意图；
32.图6为hrob突变前、后的蛋白免疫分析结果图。
具体实施方式
33.为使本技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本技术的具体实施方
式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本技术。但是本技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本技术内涵的情况下做类似改进，因此本技术不受下面公开的具体实施例的限制。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。除非另有特别说明，本技术中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
35.本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本技术保护范围的限制。
36.本技术中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本技术保护范围的限制。
37.本技术中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
38.本技术中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
39.本技术中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如
±
5℃、
±
4℃、
±
3℃、
±
2℃、
±
1℃的范围内波动。
40.本文所述的术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，存在核苷酸和诱导剂诸如dna聚合酶和在合适的温度和ph下)，所述寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。“hek 293t细胞”是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，为常用的表达研究外源基因的细胞系，极少表达细胞外配体所需的内生受体。“3
×
flag”是一种常用于检测蛋白表达的标签。
41.申请人通过研究发现一例非梗阻性无精子症患者的hrob发生了c.1351c》t突变，并通过测序和蛋白验证了该突变导致了hrob蛋白发生截短、且存在明显的结构异常，从而影响减数分裂进程，最终表现为非梗阻性无精子症。
42.本技术的一些实施方式提供了一种检测人hrob突变的试剂在制备诊断非梗阻性无精子症的产品中的应用。
43.在其中一些实施方式中，野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171253，以野生型hrob的mrna为参考，上述突变包括c.1351c》t，和/或，
44.以野生型hrob蛋白为参考，上述突变包括p.r451x。
45.野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171253，其核苷酸序列如seq id no.3所示，c.1351c》t突变位于hrob的第5外显子区域。此外，通过多种生物信息学软件进行预测和分析，结果显示hrob的c.1351c》t突变导致蛋白发生截短，蛋白质空间结构发生α螺旋和β折叠的缺失，从而影响hrob蛋白的正常功能。
46.seq id no.3：
47.attggcggcgtcttcgaatgcggcctaaggcgcctgccgccagtctcctggcgactttccctatatcgcagagactcatccctctgaccccagcccggaagcactgtccctcggagtccgagacttccacctgggtcgtgtccaaggccccggcgactccccggactcggggtgccgggccaacctccccgccgaggcccacccgccgtcgctatggcgtgcagtttgcagaagctgtttgctgtggaagaggagtttgaagatgaggatttcttgtctgctgtggaggatgcagagaaccggtttactggctcactgcctgtgaatgctgggcgcctgagacctgtctcttctaggccacaggagactgtgcaggcacagtcctccaggctgctgctgttacaccccactgctccctcagaggctttgggcctgccagacttggacctctgcctccctgcctccagcacgcccagtgctgacagccgtccatcatgcataggagcagctcccctaaggcctgtctctacttccagcagctggattggcaatcagagaagagtgacagtgacagaagtgctcagagagacagcaagacctcagtcctcagccttacaccccctactcacctttgagagccaacagcagcaagttggtggctttgaggggcctgaacaagacgaatttgataaagtcctggcaagcatggagttggaggagcctggcatggagctggaatgtggagtcagcagtgaggccataccaatcctgcctgcccagcagcgggagggttcagtattggctaaaaaagcccgggtagttgatctgagtggatcttgccagaaggggcctgtgcctgccatccacaaagcgggtatcatgtccgcccaggatgagtctctagatcctgtcatccaatgtaggactccacgaccccccttgagacctggtgctgtgggtcaccttcctgttccaactgccttaacagttcccactcagcaactccactgggaagtctgtccgcaacgctcccctgttcaagcacttcagcctctccaagctgctagagggaccattcagagcagccctcaaaatcgtttcccttgtcagccattccagtctccaagttcctggttaagtggcaaagctcatttacccagacctcgaactcccaactcaagctgttctactccctcaaggactagctctggattatttcctcggatacccttacaaccgcaagctccagtgtcttccattgggtctcctgttggtaccccaaaaggtccccagggagctctgcagacacccatagtcaccaaccacctggtgcagctagtcactgctgccagccggacaccccagcagcccacccatccctccacccgagccaaaactcgccgtttccctggcccagctgggatcctgcctcaccagcagagtgggagaagtctggaggacatcatggtttccgcgccccaaactccaacccatggtgctctggctaaattccagacagagattgttgctagttcccaggcatctgtggaggaggattttgggcgagggccctggctgaccatgaaatccacgctaggcctggatgagagagaccctagctgcttcctctgtacctacagcattgtcatggtgctgcgcaaggcagccctgaagcagcttcctaggaacaaggtccccaacatggcggtgatgatcaagtccctgactcggagcacaatggacgccagtgtggttttcaaggaccccacgggagagatgcaggggacggtgcacaggttgctgctggagacgtgccagaatgagctgaagcctggctcagtgctgctgctgaagcagattggagtgttttctccttcacttcgaaatcactacctcaacgtgacacccaacaacctggtccatatttacagcccggattctggggatgggagcttcctcaagccatctcagcccttccccaaggattcagggagcttccagcatgatgtggctgcaaagcccgaggaaggcttcagaacagcacagaacctagaggcagaggcgtcccctgaggaagaactcccagaagcagatgacctggatggactcctgagtgagcttcctgaagacttcttctgtgggaccagtagttgagactgccccaacgcaggacaacccaccatgagcaggcagctctgggcatgtgtctggtcacatccaagggggagaagaaggccagcatgattggagagtggacacagccggggggcttctgtggttgctcccaccctgggtgttttccctgagagccccctcatctctgcgctgccctcactttgggccttcctttgccgttggcaccagaatccggccggagactggctctccagccaacaagaaaggcctgtcaccctcgccttgggtgtccctctcctgcctcagcttaattttagaggatattgggcctggttttcttgtcccttcataccctagtccctggacagctgaggagatgaaaggagccacaccacaacaatggcggcctgcccctccacacaggggagaagcacgctcaggcttcctctgctttgtctcttcagacctgtggtt
gctctgctcatccatgcccaaggttcccaggtgcaggacagaggtgtggcctattgtaccttgttctgaaataaagcatctcctgctt
48.在其中一些实施方式中，上述的检测人hrob(c.1351c》t)突变的试剂，还可以用于制备非梗阻性无精子症的动物点突变敲除模型。
49.本技术的一些实施方式还提供了一种用于检测人hrob突变的引物对，野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171253，以野生型hrob的mrna为参考，上述突变包括c.1351c》t。
50.在其中一些实施方式中，上述引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示。
51.seq id no.1所示的核苷酸序列为：5
’‑
cgaggggatttgcctttcct-3’。
52.seq id no.2所示的核苷酸序列为：5
’‑
ggtctcagcacccagaatcc-3’。
53.在其中一些实施方式中，上述引物对的核苷酸序列还可以选自与seq idno.1～2的核苷酸序列实质上相似的序列。“实质上相似”意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列共有至少95％的同一性。
54.在其中一些实施方式中，上述引物对通过以下方法中的一种或多种检测上述突变：
55.普通pcr扩增法、测序法和实时荧光定量pcr法。
56.在其中一些具体示例中，测序法为sanger测序，测序所使用的引物对与相应的pcr扩增产物相同。
57.本技术的上述引物对，能够特异性地用于检测人hrob是否发生c.1351c》t突变，具有成本低、特异性高等优点。
58.临床上，非梗阻性无精子症患者一般通过对其致病基因进行检测，即基因诊断(gene diagnosis)技术明确患者遗传病因，进而选择合适的辅助生殖助孕方式，保证生育健康后代。目前对于表型明确且致病基因已知的患者，主要通过pcr-sanger测序技术对单个基因外显子区及其侧翼序列进行基因检测，该技术设计较为个性化、成本低、耗时短，但通用性低。而对于未明确致病基因突变的患者，目前首选采用包括全外显子组测序在内的新一代测序技术，该技术具有检测的通量高，可同时检测基因组中所有的编码基因，但该技术检测到的基因变异还需要进行大量的生物信息学分析及sanger测序验证，需要配套专门的生物信息学分析工程师，且成本较高。
59.此外，据不完全统计，通过标准化的生物学信息学分析筛选候选致病变异并验证为阳性的患者比例不足5％。因此，对于明确致病基因并开发相应的辅助诊断试剂盒对于这类患者的生育治疗具有重要的参考依据。
60.本技术的一些实施方式还提供了一种用于检测人hrob突变的试剂盒，包括上述任一实施方式的引物对。
61.在其中一些实施方式中，上述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、核酸提取试剂、pcr扩增试剂、测序试剂、电泳检测试剂中的至少一种。
62.在一些具体示例中，上述pcr扩增试剂包括pcr预混液。在一个可选的具体示例中，pcr预混液中包括mg
2+
、反应缓冲液、dna聚合酶和dntps。
63.在一些具体示例中，上述阳性对照品为人hrob发生c.1351c》t突变的dna样品。
64.在一些具体示例中，上述阴性对照品为去离子水。可以理解的是，在其他一些具体
示例中，上述阴性对照品可以是其他hrob未发生c.1351c》t突变的样品。
65.可以理解的是，在一些具体示例中，上述试剂盒可以不包括阳性对照品、阴性对照品、pcr扩增试剂、测序试剂和电泳检测试剂中的任意一些试剂，不包括的试剂可以合理从外部获得。
66.在其中一些实施方式中，上述试剂盒中，引物对的浓度为10μmol/l。
67.采用本技术上述任一实施方式的试剂盒，能够快速、准确地检测人hrob的突变情况，检测结果能够在临床上为非梗阻性无精子症的诊断和治疗提供参考。基于上述试剂盒的检测结果，患者无需再额外进行有创的睾丸活检，能够在一定程度上减轻患者的身体负担和经济压力。
68.本技术的一些实施方式还提供了一种检测人hrob突变的方法。
69.在其中一些实施方式中，上述检测人hrob突变的方法，包括以下步骤：
70.以待测样本的dna为模板，使用上述的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；及
71.对上述扩增产物进行分析，以确定上述人hrob的突变情况。
72.在一些具体示例中，pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s～45s、56℃～60℃退火30s～60s、72℃延伸45s～60s，共循环30～35次；最后72℃延伸3min～7min，pcr扩增产物放置于4℃保存。可以理解的是，在其他一些具体示例中，pcr程序可以合理调整。
73.在一个示例中，pcr的扩增程序设置为：95℃预变性5min；94℃变性45s、57.5℃退火30s、72℃延伸45s，共循环34次；72℃延伸5min，pcr扩增产物于4℃保存。
74.在其中一些实施方式中，在对上述扩增产物进行分析之前，还包括对上述扩增产物进行测序的步骤。
75.在一些具体示例中，测序的方法为sanger测序。
76.在一些具体示例中，将测序所得序列与野生型hrob的mrna进行比对，从而分析待测样本hrob的突变情况。
77.在其中一些实施方式中，上述待测样本为外周血、精液、精囊、囊胚培养物或细胞全基因组扩增产物。此外，待测样本也可以来源于无生命的人体或动物体。
78.可理解地，该方法可以用于诊断目的或非诊断目的。非诊断目的包括用于遗传学研究、人种研究、人类进化学研究等领域。
79.上述检测人hrob突变的方法，使用本技术设计的引物，结合pcr扩增和测序分析，在1～2天之内即可完成基因突变检测；此外，与转录组测序、全外显子测序等方法相比，上述方法操作更简单、成本更低。
80.下面将结合具体实施例和对比例对本技术作进一步说明，但不应将其理解为对本技术保护范围的限制。
81.本技术实施例中所用到的部分试剂如下：
82.dna抽提试剂盒：dna qiamp dna blood mini kit，51106，qiagen，德国；
83.green pcr master mix：ref m7123，promega，usa；
84.琼脂糖：tsj001，擎科生物，北京；
85.tae缓冲液：tsg001，擎科生物，北京；
86.核酸染料：tsj003，擎科生物，北京；
87.dl2000 dna marker：tsj011-100，擎科生物，北京。
88.实施例1：
89.(1)在临床科研实践中，申请人收集到一个来自近亲结婚家系的原发性不育患者(家系图谱如图1所示)，先证者(iii-2，男，31岁)的常规精液结果显示完全无精，激素水平正常；体检结果(包括身高、体重、毛发分布、外生殖器及双侧睾丸大小等)正常，且该患者的染色体核型和y染色体azf未见异常。
90.(2)对该患者的睾丸活检组织进行he染色(hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红染色法)，结果如图2所示，发现患者睾丸组织中未见单倍体精子，表现为减数分裂阻滞，因此临床诊断为非梗阻性无精子症表型。
91.(3)对先证者的外周血gdna进行全外显子测序技术。
92.采用德国qiagen公司的dna抽提试剂盒(dna qiamp dna blood mini kit；51106)用于抽提外周血dna：
93.往1.5ml的ep管中加入200μl的全血和20μl的蛋白酶k，混匀；加200μl al，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心3s，56℃水浴15min；加200μl无水乙醇，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心3s；将液体倒入装有离心管的柱子中，13000
×
g，1min，弃滤液和离心管；将柱子放入新的离心管，加500μl aw1，13000
×
g，1min，弃滤液和离心管；将柱子放入新的离心管，加入500μl aw2，13000
×
g，1min，弃掉滤液；弃掉滤液，离心3min，弃掉滤液和离心管；弃掉滤液和离心管，将柱子放在新的ep管中，加入80μl的ae，室温静置5min，13000
×
g，1min，4℃保存或-70℃长期保存。
94.取30μg患者外周血gdna样品送往华大基因进行全外显子测序(whole exome sequencing，wes)，wes测序及分析交由深圳华大基因科技有限公司执行，包括dna文库构建、wes上机和数据分析，并使用基因组分析工具包进行变异识别。测序发现的变异(包括单核苷酸变异、小插入或缺失等)均使用annovar软件进行注释。随后对全外测序的注释结果进行个性化的候选致病基因筛选。
95.候选致病基因的筛选策略如下：1)过滤公共遗传突变数据库(1000genomes、dbsnp，exac数据库)中频率大于1％的突变；2)选取生物信息学软件(mutation taster，sift，ployphen-2)预测可能为致病的突变；3)优先考虑纯合突变或复合杂合突变；4)选取突变的基因功能与精子发生相关，或特异性高表达于睾丸组织，或模式动物表现为雄性不育表型。
96.结果如表1所示，通过全外显子测序发现该非梗阻性无精子症患者携带hrob纯合无义突变(nm_001171251:exon5:c.1351c》t:p.r451x)。
97.表1 hrob突变的详细信息
98.基因(gene)hrob位点(position)chr17:42230047基因id(refseq id)nm_001171251变异(variant)c.1351c＞t:p.r451x变异类型(varint type)stopgain深度(depth)1601000gnago-espna
exac0.00000824mutation tasternasiftnapoly phen2nacadd37
99.(4)pcr及sanger测序验证剪切位点突变。
100.为了验证全外显子组测序的结果，针对该突变位点设计了特异性的pcr扩增引物seq id no.1和seq id no.2，引物序列信息如表2所示；该引物的pcr扩增特异性良好，产物中没有检测到目的条带除外的非特异性条带。
101.pcr扩增体系如表3所示；pcr扩增反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s，57.5℃退火45s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃延伸5min，扩增产物放置于4℃保存。以患者及其家属的dna为模板进行pcr扩增，将扩增出目的片段进行sanger测序。
102.表2引物序列信息
[0103][0104]
表3 pcr反应体系
[0105]
成分用量green master mix，2
×
15μlrnase-free water13μldna模板1μl(约50ng)引物f/r各0.5μl(10μmol/l)total30μl
[0106]
将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增的目的条带无误后，将剩余的pcr扩增产物送至擎科生物科技有限公司(北京，中国)进行sanger法测序验证。
[0107]
琼脂糖凝胶电泳步骤如下：配制2％琼脂糖(tsj001，擎科生物)凝胶，称取2g琼脂糖于500ml锥形瓶中，加入100ml的1
×
tae缓冲液(tsg001，擎科生物)，微波炉大火加热3min，冷却到35℃左右，加4μl滴核酸染料(tsj003，擎科生物)，混匀，倒入事先安好梳子的槽中，室温冷却；取3μl pcr扩增产物和dl2000 dna marker(tsj011-100，擎科生物)进行电泳，220v电泳9min，紫外凝胶成像系统拍摄。
[0108]
结果如图3所示，先证者1(iii-2)携带hrob的纯合突变(c.1351c》t:p.r451x)，而先证者的父母则携带该hrob突变位点的杂合突变，符合常染色体隐性遗传模式。
[0109]
(4)为了明确该无义突变的致病性，采用蛋白3d结构进行预测，结果显示该无义突变导致编码的蛋白发生截短(如图4所示)，该无义突变导致hrob蛋白的空间结构发生明显异常，包括部分α螺旋和β折叠的缺失(如图5所示)。
[0110]
进一步将该突变转染至hek 293t细胞中，通过蛋白印迹(western blot,wb)分析hek 293t细胞中野生型和突变型hrob蛋白表达水平。结果如图6所示，wt、mut分别表示编码
了hrob-3
×
flag和r451x_hrob-3
×
flag的质粒；wb结果显示突变后的hrob产生了截短蛋白，提示该纯合无义突变可能影响了hrob蛋白的功能，从而破坏了正常的减数分裂进程，最终表现为非梗阻性无精子症。
[0111]
以上结果表明，采用本技术的特异性引物序列结合pcr-sanger测序技术，能够特异性地检测hrob基因是否发生c.1351c》t(p.r451x)突变，该检测结果在临床上可用于辅助诊断非梗阻性无精子症。本技术的检测方法，只需一对引物即可在1～2天内完成检测，检测效率高；相较于dna文库构建、全外显子测序结合生物信息学分析，pcr-sanger测序技术流程简单，成本更低。
[0112]
综上，本技术的上述引物对、试剂盒和检测方法对于研究非梗阻性无精子症的遗传学病因具有重要意义，且在临床上应用范围广泛，可以在一定程度上减轻患者的身体负担和经济压力。
[0113]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0114]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.检测人hrob突变的试剂在制备诊断非梗阻性无精子症的产品中的应用，野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171251.3，以野生型hrob的mrna为参考，所述突变包括c.1351c>t，和/或，以野生型hrob蛋白为参考，所述突变包括p.r451x。2.一种用于检测人hrob突变的引物对，其特征在于，野生型hrob的mrna在ncbi数据库中的编号为nm_001171251.3，以野生型hrob的mrna为参考，所述突变包括c.1351c>t。3.根据权利要求2所述的用于检测人hrob突变的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示。4.根据权利要求2～3任一项所述的用于检测人hrob突变的引物对，所述引物对通过以下方法中的一种或多种方法检测所述突变：普通pcr扩增法、测序法和实时荧光定量pcr法。5.一种用于检测人hrob突变的试剂盒，包括权利要求2～4任一项所述的引物对。6.根据权利要求5所述的用于检测人hrob突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、核酸提取试剂、pcr扩增试剂、测序试剂和电泳检测试剂中的至少一种。7.一种检测人hrob突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测样本的dna为模板，使用权利要求2～3任一项所述的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；及对所述扩增产物进行分析，以确定所述人hrob的突变情况。8.根据权利要求7所述的检测人hrob突变的方法，其特征在于，在对所述扩增产物进行分析之前，还包括对所述扩增产物进行测序的步骤。9.根据权利要求8所述的检测人hrob突变的方法，其特征在于，对所述扩增产物进行分析的步骤包括：分析所述人hrob是否发生c.1351c>t突变。10.根据权利要求7～9任一项所述的检测人hrob突变的方法，其特征在于，所述待测样本为外周血、精液、精囊、囊胚培养物或细胞全基因组扩增产物。

技术总结
本申请提供了一种检测人Hrob突变的引物对、试剂盒、方法及其应用。本申请通过研究发现非梗阻性无精子症患者的Hrob发生了c.1351C>T无义突变(p.R451X)，并通过Sanger测序、蛋白结构预测、WB等技术对该突变位点进行了验证，结果表明该突变导致Hrob蛋白截短、空间结构异常；从而影响正常的减数分裂异常。因此，检测患者Hrob是否发生c.1351C>T突变，可以在临床上辅助判断非梗阻性无精子症患者的遗传病因，为非梗阻性无精子症患者选择合适的治疗方法提供参考。供参考。供参考。


技术研发人员：涂超峰 粟丽兰 王韦力 贺佳欣 赖子怡 陈智野 汤蕊欣 周子皓 蒙岚岚 谭琛 谢春波 王芙艳 谭跃球 林戈
受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/24