CD73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用

cd73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及cd73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用。


背景技术：

2.糖尿病可引起皮肤炎症、皮肤大疱、皮肤感染和硬化性水肿等皮肤损伤，造成皮肤血供减少，伴随着真皮结缔组织和其他附属器官受损。糖尿病皮肤损伤属于慢性创面，患者多以中老年为主。相关研究表明，其发生多与病原微生物、炎症介质、不等渗糖分子、晚期糖基化终末产物(ages)等在皮肤损伤局部形成一个特殊的细胞微环境，损伤局部修复细胞呈现不活泼的低反应性，细胞增殖、迁移、分化等修复功能下降，创面局部血管新生、再上皮化等迟缓等机制有关，成为临床防治的重点和难点。因此，探究糖尿病皮肤损伤的治疗方法具有重要的现实意义。
3.细胞移植疗法为糖尿病皮肤损伤的治疗带来了新的曙光。脂肪间充质干细胞(admscs)因其易于获取、伦理问题少，体外增殖速度快等优点，具有广阔的应用前景。目前本领域采用admscs进行疾病的治疗时大多采用的是未分选admscs混合细胞群，使用纯化的admscs细胞亚群开展的体内外研究鲜有报道。此外，在体外所培养的admscs有多种免疫表型表达，但是缺乏特异的标记分子。大部分扁平细胞伴随损失一个或多个msc表面标记，主要缺乏cd73表达。前期实验结果表明cd105、cd56显示出高度协同的表达特性，而cd73的表达呈现出高度异质性，且与培养时间呈负相关，其在msc分化的早期阶段下调。推测cd73可能是描述admscs最敏感的标记物，可为细胞治疗糖尿病皮肤损伤提供细胞筛选的分子参考标准和实验依据。
4.糖尿病皮肤损伤创面愈合过程可以被恶劣的缺氧微环境(hme)所阻碍，hme由一系列内源性和外源性因素组成，如局部出血、细菌感染和微血管病变-缺氧反馈循环等。急性缺氧可通过缺氧诱导因子hif-1促进血管生成，而糖尿病慢性缺氧可通过多个因素抑制血管生成，例如，暴露于高糖水平可通过调节hif-1α翻译后羟化和降解导致hif-1α稳定性降低，进而逆转缺氧诱导的血管内皮生长因子(vegf)的表达。在这些病理条件下，正反馈加重了缺血缺氧综合征。cd73又称为胞外-5
′‑
核苷酸酶，通过糖基-磷脂酰肌醇锚定于细胞膜外表面，本质上是一种糖蛋白，具有酶活性和信号转导的双重功能。本领域尚未有关于cd73阳性admscs对糖尿病皮肤损伤具有治疗优势的相关报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供cd73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用，首次提出纯化的cd73
+
admscs较admscs和cd73-admscs明显增加血管密度，促进血管新生，进而促进糖尿病皮肤损伤创面愈合，治疗效果显著。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
7.本发明提供了cd73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用。
8.本发明还提供了cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进糖尿病创面愈合产品中的应用。
9.本发明还提供了cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进血管新生产品中的应用。
10.本发明还提供了cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进人脐静脉血管内皮细胞迁移和/或愈合产品中的应用。
11.本发明还提供了cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进血管内皮生长因子a表达产品中的应用。
12.优选的，所述产品包括药物。
13.优选的，所述糖尿病包括2型糖尿病。
14.本发明的有益效果：
15.本发明首次提出cd73
+
admscs比admscs和cd73-admscs更易促进糖尿病创面愈合，纯化的cd73
+
admscs与admscs和cd73-admscs相比，能够明显增加血管密度，促进血管新生，促进创面愈合，治疗效果较好，是治疗糖尿病皮肤损伤的优势亚群。
16.在临床应用领域，本发明首次提出cd73可以作为细胞体外扩增，使用时的质量控制鉴定标准。
附图说明
17.图1不同组别hadmscs上清培养huvec细胞的结果，其中a为transwell小室实验结果，bars＝100μm，**p《0.01，b为划痕实验结果，bars＝100μm，**p《0.01；
18.图2为不同组别admscs对糖尿病压疮小鼠皮肤创面作用结果，其中a为各组细胞皮下移植治疗c57bl/6n糖尿病压疮小鼠，创面愈合的图像，bars＝100μm；b为细胞移植后糖尿病压疮组织中vegfa的ihc染色结果，bars＝100μm，**p《0.05；c为vegfr2转基因糖尿病压疮小鼠接受各组细胞移植，第7天用小动物活体成像仪进行拍照的结果，**p《0.01；d为第7天采集创面蛋白样品，westernblotting检测不同组别hif-1α和vegfa的表达结果，**p《0.01；
19.图3为对cd73
+
hadmscs和cd73-hadmscs进行基因芯片分析的结果，其中a为cd73
+
和cd73-hadmscs细胞内的差异表达基因热图；b为在cd73的差异表达基因中筛选出top20基因并分析相关的信号通路结果；c为根据热图做出go分析图展示与cd73相关的信号通路结果。
具体实施方式
20.本发明提供了cd73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用。
21.本发明对于脂肪间充质干细胞的具体来源没有特殊限定。在本发明中，所述产品优选的包括药物。
22.本发明还提供了cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进糖尿病创面愈合、促进血管新生、促进人脐静脉血管内皮细胞迁移和/或愈合、促进血管内皮生长因子a表达产品中的应用。
23.本发明以从人体美容术后所取脂肪组织为取材标本，培养admscs，以cd73为分选标准，采用流式细胞仪分选出cd73
+
admscs和cd73-admscs。本发明将培养的人admscs移植入糖尿病皮肤损伤小鼠体内，发现并无明显的免疫排斥反应。在本发明中，所述产品优选的包括药物，所述糖尿病优选的包括2型糖尿病。
24.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
25.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
26.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1
28.人脂肪间充质干细胞的培养
29.成人脂肪间充质干细胞经得18-45岁健康成人同意后行皮下脂肪抽取手术所得脂肪组织分离获得，保存于液氮中。使用时，从液氮罐中取出脂肪间充质干细胞，在37℃水浴锅2-3min迅速解冻，使用dmem低糖细胞完全培养基(含10％fbs、100mg/l链霉素和10iu/l青霉素)，将细胞放于培养瓶中培养，培养瓶存放在37℃、5％co2浓度的培养箱，培养并传代，倒置显微镜观察细胞密度和细胞形态。
30.admscs流式细胞学检测免疫表型和分选
31.取第3代admscs消化、离心，用pbs制备细胞悬液2
×
106个/ml。每1ml细胞悬液中，加1：500的单克隆i抗cd29、cd44、cd45和cd73，同时设立空白和阴性对照。流式细胞分选仪对加cd29、cd44和cd45一抗的细胞进行检测，对加cd73一抗的细胞进行分选，分选后的细胞悬液，加入培养瓶培养，24h后换液，之后正常传代获取cd73
+/-亚群的admscs。
32.实施例2
33.通过划痕实验和transwell实验检测admscs分泌的细胞因子对人脐静脉血管内皮细胞(huvec)的迁移愈合能力影响。具体步骤如下：
34.transwell实验：
35.(1)收集cd73
+
hadmscs和cd73-hadmscs上清液；
36.(2)将huvec细胞用无血清培养基重悬，保证每毫升细胞数为1
×
105个；
37.(3)24孔板，每孔加入250μl ecm培养基+250μl cd73
+
hadmscs上清液或cd73-hadmscs上清液，并将小室分别放在孔内，使培养基浸泡小室薄膜，然后将含有huvec细胞的无血清培养基悬液200μl加至小室上层，37℃，5％co2细胞培养箱培养16h左右；
38.(4)用200μl加样枪轻轻吸弃小室上层多余的培养基，随后用4％的多聚甲醛浸泡小室30min，用pbs或ddh2o清洗3次；
39.(5)每孔加入500μl结晶紫染料，小室浸泡其中，染色30min，pbs或ddh2o清洗3次；
40.(6)去掉transwell小室上层未洗净的染色残渣和未穿过小室的细胞，室温晾置一天；
41.(7)将24孔板里的小室放在显微镜下进行成像，imagej软件计数。结果如图1a所示，cd73
+
hadmscs组上清可促进huvec细胞的迁移。
42.划痕实验：
43.(1)细胞处理：培养huvec细胞，将细胞铺到6孔板中。然后收集hadmscs的上清液加至6孔板中，共设置3组：cd73
+
hadmscs(0.75ml上清液+0.75mlecm培养基)、cd73-hadmscs组(0.75ml上清液
44.+0.75mlecm培养基)、阳性对照组(1.5ml ecm培养基)。
45.(2)划痕：6孔板每个孔背面用记号笔画两条笔直的横线，沿细胞板孔内，使用100μl枪头尖，进行划痕(两条竖线)，划痕时力度速度稳定，使得到的划痕宽度均匀笔直。
46.(3)拍照：每次拍照前用预热的pbs润洗三次，洗去未贴壁的细胞，更换培养基。在划痕后0h，24h进行拍照，保证两个时间点在相同位置拍照。
47.(4)结果处理：image j软件计算愈合的间隙面积，用prism 8软件作图分析，结果如图1b所示，cd73
+
hadmscs组上清可促进huvec细胞的愈合。
48.实施例3
49.糖尿病全层皮肤损伤模型的制作
50.采用雄性c57bl/6n 4-5周龄小鼠，随机分为对照组(ctrl组)和糖尿病组(dm组)，dm组空腹注射柠檬酸缓冲液配制的链脲佐菌素(stz，45mg/kg)，连续3d。之后每周测量小鼠的空腹血糖水平，称量小鼠体重。1个月后，小鼠体重停止下降且保持稳定且血糖均大于11.1mmol/l，成功建立2型糖尿病小鼠模型。将小鼠放入装有异氟烷的气体麻醉箱内，调整诱导浓度为3.5％，维持浓度为2％。麻醉成功后，剔除小鼠背部脊柱两侧毛发，75％酒精进行皮肤消毒。沿脊柱中线旁开5mm，左右两侧各放置一个直径为1cm、厚度为5mm的圆形磁铁，夹闭12h后松开12h，重复3次，制作1cm
×
1cm全层皮肤缺损的压疮创面。小鼠糖尿病压疮模型制备完成。创周皮肤酒精消毒后体式显微镜拍照，透明敷贴覆盖。
51.细胞标记及移植
52.实验分组：vehicle组(pbs组)、hadmscs组(实施例1所得)、cd73
+
hadmscs(实施例1所得)组和cd73-hadmscs(实施例1所得)组，将各组细胞用胰酶消化，50μlpbs重悬，移植到糖尿病压疮创面区域。采用一次性胰岛素注射器在创面区域进行多点细胞注射，注射时，cd73
+
hadmscs组和cd73-hadmscs组细胞在创口注射量约为1
×
106个细胞，hadmscs组细胞注射量为1.2
×
106个细胞。
53.创面大体观察和创面愈合率
54.admscs移植后第1、3、5、7、9、11天进行消毒后，对比创面的愈合情况。应用体式显微镜进行跟踪拍照，由课题组其他未参与建模人员评估创面愈合情况，运用image j软件(美国国立卫生研究院)测量创面大小并计算注射后3d、5d、7d、9d、11d的创面愈合率，创面愈合率＝(原始创面面积一剩余创面面积)
÷
原始创面面积
×
100％。结果如图2a和表1所示，发现移植cd73
+
admscs到糖尿病压疮小鼠皮肤创面，愈合率显著提高。
55.表1不同时间创面愈合率比较(n＝6)
[0056][0057]
注：与空白对照组比较，**p＜0.01
[0058]
免疫组化和免疫荧光检测创面组织新生血管情况
[0059]
75％酒精消毒后剪取创面及周围小鼠皮肤组织，4％多聚甲醛进行固定过夜，脱水、透明和浸蜡处理后，进行石蜡包埋，以5μm厚度制备石蜡切片。二甲苯脱蜡，梯度酒精水
化，3％h2o2室温灭活10min，pbs洗涤5min
×
3次，微波修复10min，山羊血清封闭60min，滴加稀释的一抗(兔源vegfa抗体，1︰100，abcam公司)，4℃孵育过夜，pbs洗涤5min
×
3次，滴加二抗，37℃40min，pbs洗涤5min
×
3次，dab显色15min，苏木精复染，脱水透明，封片镜检。每组切片在200倍视野下计数5个视野中阳性表达的血管数，取其均数。用motic images advanced软件进行分析。结果如图2b所示，发现cd73表达变化可以影响vegfa的表达。
[0060]
使用vegfr2-fluc转基因小鼠造糖尿病压疮模型，在创面多点注射vehicle(pbs)、hadmscs、cd73
+
hadmscs和cd73-hadmscs组细胞，具体操作方法同上述细胞标记及移植步骤。在细胞移植第7天将小鼠用异氟烷气体麻醉，通过小鼠尾静脉打入25ul腔肠素溶液，立即使用小动物活体成像仪器监测创面区域的荧光素信号，结果如图2c所示。于第7天将小鼠以颈椎脱臼法处死，然后将各组小鼠从脊柱两侧背部创面剪下相同大小皮肤组织，组织匀浆，ripa裂解液裂解后收集蛋白样品，用10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，一抗hif-1α和vegfa孵育过夜，室温下与二抗孵育2小时，通过westernblotting法检测vehicle组、cd73
+
hadmcss组和cd73-hadmcss组hif-1α和vegfa蛋白表达情况，结果如图2d所示，cd73的变化可通过调控hif-1α和vegfa的表达，影响创面血管新生的程度。
[0061]
实施例4
[0062]
对cd73
+
hadmscs和cd73-hadmscs进行基因芯片分析，采用已分选的第5代细胞，随后由吉凯生物科技有限公司进行微阵列分析，采用基因芯片通过go分析差异表达的基因(包括细胞成分、生物过程和分子功能)，p《0.05认为显著差异。结果如图3所示，从基因层面来看的话，cd73可通过hif-1信号通路和pi3k-akt信号通路增强admscs促血管新生的作用。
[0063]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.cd73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用。2.cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进糖尿病创面愈合产品中的应用。3.cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进血管新生产品中的应用。4.cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进人脐静脉血管内皮细胞迁移和/或愈合产品中的应用。5.cd73
+
脂肪间充质干细胞在制备促进血管内皮生长因子a表达产品中的应用。6.根据权利要求1-5任意一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物。7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述糖尿病包括2型糖尿病。

技术总结
本发明提供了CD73在制备增强脂肪间充质干细胞促血管新生产品中的应用，属于生物技术领域。本发明首次提出CD73


技术研发人员：李琼 侯慧芳 张达 孙雪雪 王国栋 李宗金 郭志坤 崔朝初
受保护的技术使用者：新乡医学院三全学院
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/24