壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I及其应用和制备壳寡糖的方法

壳聚糖酶ouc-csna4-s49i及其应用和制备壳寡糖的方法
技术领域
1.本发明涉及壳聚糖酶ouc-csna4-s49i及其应用和制备壳寡糖的方法，属于壳聚糖酶技术领域。


背景技术：

2.壳寡糖（cos）是n-乙酰氨基葡萄糖（glcn）通过β-1,4糖苷键连接而成的聚合度为2～10的海洋寡糖，由甲壳素脱乙酰得到的壳聚糖解聚生成。壳寡糖具有高溶解性、低分子量和良好的生物相容性等优点，具有抗氧化、消炎抑菌、抗肿瘤、促进植物生长、促进肠道微生物生长等特殊生物活性。研究发现不同聚合度（dp）的壳寡糖的生物活性和功能具有一定差异，而且高聚合度的壳寡糖在生物医药中的应用潜力更高。
3.目前制备高聚合度的壳寡糖非常困难，已知的方法主要是通过控制弱酸降解法的反应条件，获得少量高聚合度的壳寡糖，其产品的聚合度非常不稳定，具有随机性。为了获得高聚合度的壳寡糖，已经有研究尝试通过控制反应条件、酶的理性设计、固定化、酶-膜反应器等方法。然而，这些方法仍然很复杂，而且效果不显著。
4.壳聚糖酶（chitosanase，ec.3.2.1.132）是催化壳聚糖降解的糖苷水解酶，壳聚糖经壳聚糖酶降解后生成壳寡糖。壳聚糖酶的来源十分广泛，包括细菌、真菌、病毒和植物。根据碳水化合物活性酶（cazy）数据库的分类，壳聚糖酶可以分为六个家族：gh 5、gh 7、gh 8、gh 46、gh 75和gh 80。迄今为止，已报道了8种壳聚糖酶的12种三维结构，一个来自gh 8家族，一个来自gh 80家族，另外六个均来自gh 46家族。已报道的gh 46家族的壳聚糖酶在水解过程中遵循内切型催化机制，这导致了产物的聚合度随机分布，经过长时间的水解，最终得到的产物主要是（glcn）2（壳二糖）和（glcn）3（壳三糖），而不是更高聚合度的壳寡糖。因此，挖掘能够制备高聚合度壳寡糖的壳聚糖酶具有十分重要的意义和应用价值。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明提供了壳聚糖酶ouc-csna4-s49i及其应用和制备壳寡糖的方法。本发明通过对壳聚糖酶ouc-csna4进行改造，得到了壳聚糖酶ouc-csna4-s49i，壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖可得到高聚合度的壳寡糖。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：壳聚糖酶ouc-csna4-s49i，其氨基酸序列如下所示，如seq id no.4所示：hmvtfmpkgdteypsnnteypsnnteypsnntsnmknvilqmtstlenidtqlhfnyaenlgdergitfgcigfctgtydgnilikhytelnpdntlakyipaldkidtgphdaadgdgnpsveglsgfiqdvnscddplfknaqidkldelyynpameiadsigaknpltkafiydmcvrhgvdqtediikdagttpkqgtdentylqklislrdaklkqegiedvnrnqgykkllnsgnvdlktpftfvaygdsftidgklylgeyqqle。
7.所述壳聚糖酶ouc-csna4-s49i在制备壳寡糖中的应用，所述壳寡糖的聚合度为2～5。
8.进一步地，所述壳寡糖为（glcn）5（壳五糖）。
9.进一步地，具体应用时，以壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖，降解产物为（glcn）2、（glcn）3、（glcn）4和（glcn）5。
10.进一步地，以壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖的具体操作为：将含壳聚糖酶壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液加入到含壳聚糖的溶液中，在51～62℃、ph 4.0～7.0条件下反应10 min～24 h。
11.优选的，以壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖的具体操作为：将20μl含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液、180μl壳聚糖溶液和400μl ph 6.0的磷酸盐缓冲液混合，55℃条件下反应24 h；所述含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液的浓度为4.991 mg/ml；所述壳聚糖溶液的浓度为20 mg/ml，溶剂为10 mg/ml的乙酸溶液。
12.一种制备壳寡糖的方法：以壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖得到壳寡糖，壳寡糖的聚合度为2～5，即：壳寡糖由（glcn）2、（glcn）3、（glcn）4和（glcn）5组成。
13.进一步地，所述制备壳寡糖的方法为：将含壳聚糖酶壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液加入到含壳聚糖的溶液中，在51～62℃、ph 4.0～7.0条件下反应10 min～24 h。
14.优选的，所述制备壳寡糖的方法为：将20μl含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液、180μl壳聚糖溶液和400μl ph 6.0的磷酸盐缓冲液混合，55℃条件下反应24 h；所述含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液的浓度为4.991 mg/ml；所述壳聚糖溶液的浓度为20 mg/ml，溶剂为10 mg/ml的乙酸溶液。
15.本发明的壳聚糖酶ouc-csna4-s49i，是对壳聚糖酶ouc-csna4进行改造后得到的。壳聚糖酶ouc-csna4-s49i具有产物特异性，降解壳聚糖可得到高聚合度（聚合度为2～5）的壳寡糖，尤其是（glcn）5。本发明拓宽了gh 46家族的壳聚糖酶酶解壳聚糖的产物谱，可用于制备高聚合度的壳寡糖，应用潜力巨大，应用前景广阔。
16.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
17.图1：壳聚糖酶ouc-csna4与（glcn）5分子对接的示意图，其中，右侧为左侧虚线方框所示部分的放大。
18.图2：实施例2中壳聚糖酶纯化前后的sds-page电泳图，其中，1为粗酶液，2为纯化后的酶液，m为标准蛋白marker。
19.图3：温度变化对相对酶活的影响示意图。
20.图4：ph变化对相对酶活的影响示意图。
21.图5：不同温度条件下孵育不同时间对相对酶活的影响示意图。
22.图6：不同ph条件下孵育对相对酶活的影响示意图。
23.图7：实施例5中酶解产物的hplc图。
24.图8：壳聚糖酶ouc-csna4改造前后与（glcn）5分子对接对比示意图，其中，右上为左侧虚线方框所示部分的放大（改造前），右下为ouc-csna4-s40i与（glcn）5分子对接示意图（改造后）。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实
施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
26.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
27.实施例1壳聚糖酶ouc-csna4的筛选为了挖掘具有产物特异性的壳聚糖酶，本发明从尚未被报道过的可能具有产物特异性的古细菌中挖掘壳聚糖酶。通过ncbi搜索比对，筛选出了一个来源于methanosarcinasp.1.h.t.1a.1的可能具有壳聚糖酶活性的基因（genbankwp_052733549.1），其所表达的蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，命名为壳聚糖酶ouc-csna4。经密码子优化后，该基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，然后进行全基因合成。
28.壳聚糖酶ouc-csna4的氨基酸序列（如seqidno.1所示）：hmvtfmpkgdteypsnnteypsnnteypsnntsnmknvilqmtstlensdtqlhfnyaenlgdergitfgcigfctgtydgnilikhytelnpdntlakyipaldkidtgphdaadgdgnpsveglsgfiqdvnscddplfknaqidkldelyynpameiadsigaknpltkafiydmcvrhgvdqtediikdagttpkqgtdentylqklislrdaklkqegiedvnrnqgykkllnsgnvdlktpftfvaygdsftidgklylgeyqqle。
29.壳聚糖酶ouc-csna4的编码基因的核苷酸序列（方向5
’‑3’
，如seqidno.2所示）：catatggtgacctttatgccgaaaggcgataccgaatatccgagcaacaacaccgaatatccgagcaacaacaccgaatatccgagcaacaacaccagcaacatgaaaaacgtgattctgcagatgaccagcaccctggaaaacagcgatacccagctgcattttaactatgcggaaaacctgggcgatgaacgcggcattacctttggctgcattggcttttgcaccggcacctatgatggcaacattctgattaaacattacaccgaactgaacccggataacaccctggcgaaatatattccggcgctggataaaattgataccggcccgcatgatgcggcggatggcgatggtaatcctagcgtggaaggcttaagcggttttattcaggatgtgaacagctgcgatgatccgctgtttaaaaacgcgcagattgataaactggatgagctgtattataacccggcgatggaaattgcggatagcattggcgcgaaaaacccgctgaccaaagcgtttatttatgatatgtgcgtgcgccacggcgtggatcagaccgaagatattattaaagatgcgggcaccaccccgaaacagggcaccgatgaaaacacctatctgcagaaactgattagcctgcgcgatgcgaaactgaaacaggaaggcattgaagatgtgaaccgcaaccagggctataaaaagctgctgaacagcggcaacgtggatctgaaaaccccgtttacctttgtggcgtatggcgatagctttaccattgatggcaaactgtatctgggcgaatatcagcagctcgag。
30.使用mega7.0软件构建壳聚糖酶ouc-csna4与其它糖苷水解酶家族成员的系统发育树，利用smart网站对壳聚糖酶ouc-csna4的结构域进行分析，壳聚糖酶ouc-csna4属于gh46家族。
31.实施例2对壳聚糖酶ouc-csna4进行改造壳聚糖酶ouc-csna4降解壳聚糖后的最终产物中包括（glcn）2、（glcn）3、（glcn）4，虽然具有一定的产物特异性，但降解产物的聚合度仍不够高，因此本发明对其进行突变改造，以期获得具有更高产物特异性的壳聚糖酶。
32.为了改变酶与高聚合度壳寡糖的作用方式，利用espript软件对不同来源的壳聚糖酶进行蛋白序列对比分析，并使用swissmodel蛋白质建模服务器制备壳聚糖酶ouc-csna4的结构模型，与(glcn)5分子对接进行分子模拟，结果如图1所示。
33.结果表明位于末端的+3亚位点的糖单元与47位谷氨酸和49位丝氨酸形成了氢键。
根据对不同来源的壳聚糖酶进行蛋白序列对比分析，认为47位谷氨酸为壳聚糖酶ouc-csna4的催化位点，对其进行突变很有可能会导致酶的彻底失活，因此选择了保守性不强的49位丝氨酸，选取该位点进行定点突变，并在大肠杆菌（de3）中进行了功能表达，具体如下。
34.将壳聚糖酶ouc-csna4的49位由丝氨酸改为异亮氨酸，具体方式为：在残基ser49处对壳聚糖酶ouc-csna4进行定点突变，将壳聚糖酶ouc-csna4编码基因上49位丝氨酸的密码子由“agc”改为异亮氨酸的密码子“att”。
35.然后进行整个质粒（即含有壳聚糖酶ouc-csna4基因的pet32a质粒）的pcr扩增。用限制性内切酶dpni处理pcr产物以消化甲基化的亲本模板。得改造后的质粒。
36.pcr扩增所用特异性引物的核苷酸序列如下所示：上引物：5
’‑
gcagctgggtatctatgttttccagggtgctggtca-3’，如seqidno.5所示；下引物：5
’‑
gcaccctggaaaacatagatacccagctgcattttaact-3’，如seqidno.6所示。
37.突变后的核苷酸序列如seqidno.3所示，突变后的氨基酸序列如seqidno.4所示，命名为壳聚糖酶ouc-csna4-s49i。
38.壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的编码基因的核苷酸序列（方向5
’‑3’
，如seqidno.3所示）：catatggtgacctttatgccgaaaggcgataccgaatatccgagcaacaacaccgaatatccgagcaacaacaccgaatatccgagcaacaacaccagcaacatgaaaaacgtgattctgcagatgaccagcaccctggaaaacattgatacccagctgcattttaactatgcggaaaacctgggcgatgaacgcggcattacctttggctgcattggcttttgcaccggcacctatgatggcaacattctgattaaacattacaccgaactgaacccggataacaccctggcgaaatatattccggcgctggataaaattgataccggcccgcatgatgcggcggatggcgatggtaatcctagcgtggaaggcttaagcggttttattcaggatgtgaacagctgcgatgatccgctgtttaaaaacgcgcagattgataaactggatgagctgtattataacccggcgatggaaattgcggatagcattggcgcgaaaaacccgctgaccaaagcgtttatttatgatatgtgcgtgcgccacggcgtggatcagaccgaagatattattaaagatgcgggcaccaccccgaaacagggcaccgatgaaaacacctatctgcagaaactgattagcctgcgcgatgcgaaactgaaacaggaaggcattgaagatgtgaaccgcaaccagggctataaaaagctgctgaacagcggcaacgtggatctgaaaaccccgtttacctttgtggcgtatggcgatagctttaccattgatggcaaactgtatctgggcgaatatcagcagctcgag。
39.壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的氨基酸序列（如seqidno.4所示）：hmvtfmpkgdteypsnnteypsnnteypsnntsnmknvilqmtstlenidtqlhfnyaenlgdergitfgcigfctgtydgnilikhytelnpdntlakyipaldkidtgphdaadgdgnpsveglsgfiqdvnscddplfknaqidkldelyynpameiadsigaknpltkafiydmcvrhgvdqtediikdagttpkqgtdentylqklislrdaklkqegiedvnrnqgykkllnsgnvdlktpftfvaygdsftidgklylgeyqqle。
40.实施例2壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的制备步骤如下：（1）重组表达载体的构建实施例1扩增的质粒转入e.colidh5α感受态细胞。使用含硫酸卡那霉素的lb平板进行阳性转化子筛选。克隆子使用t7通用引物进行菌落pcr验证后，挑取阳性克隆测序，得重组质粒。
41.（2）重组工程菌的构建
提取测序正确的重组质粒，转化至宿主e.colibl21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出。
42.（3）壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的表达与纯化挑取在硫酸卡那霉素抗性平板上长出的重组工程菌菌株，接种在5ml含有30μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm培养12小时；按1%的接种量接入50ml含有30μg/ml硫酸卡那霉素的lb液体培养基，37℃、220rpm培养至od值为0.8；加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg），诱导16h表达壳聚糖酶。
43.取培养液，4℃、8000g离心10分钟，收集菌体，重悬于tirs-hcl缓冲液（50mm，ph8.0）中，超声破碎15min，12000g离心15min，上清液即为粗酶液。
44.粗酶液使用ni-nta柱进行亲和层析纯化，使用10mm咪唑溶液（10mm咪唑，500mmnacl，50mmtris-hcl）平衡柱子，然后用30mm咪唑溶液（30mm咪唑，500mmnacl，50mmtris-hcl）洗脱结合力弱的杂蛋白，100mm咪唑溶液（100mm咪唑，500mmnacl，50mmtris-hcl）洗脱目的蛋白，收集此部分的洗脱成分，即为纯化后的酶液，进行sds-page检测，结果如图2所示，纯化后的蛋白呈现单一条带，分子量约为35kd，与预测一致。使用bradford法测定蛋白浓度，酶液的浓度为4.991mg/ml，用于下述各实施例3～5的研究。
45.实施例3酶活测定使用dns显色法测定壳聚糖酶的酶活，反应体系组成为：180μl壳聚糖溶液，20μl酶液，400μl磷酸盐缓冲液（ph6.0）。60℃反应10min。反应结束后，沸水浴10min，5000rpm离心5min，取200μl上清与300μldns反应，沸水浴煮沸10min以显色，5000rpm离心5min，检测540nm处的吸光度值。
46.一个单位（u）的壳聚糖酶活性定义为：每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量。经测定，实施例2的酶液的壳聚糖酶活力为33.160u/ml。
47.所述壳聚糖，购自麦克林生物化学有限公司（中国上海）脱乙酰度≥95%。
48.所述壳聚糖溶液的溶剂为10mg/ml的乙酸溶液，壳聚糖浓度为20mg/ml。
49.实施例4壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的最适反应条件的测定最适温度的测定：在30～70℃范围内，按照实施例3的方法测定不同温度时的酶活，以最高酶活力为100%，计算在不同温度下的相对酶活力，结果如图3所示，最适反应温度为60℃，在51～62℃范围内活性较高，相对活性高于80%。
50.最适ph的测定：在ph4.0～10.0范围内（所使用的缓冲液为：ph4.0～6.0的醋酸盐盐缓冲液，ph6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，ph8.0～9.0的tris-hcl缓冲液，ph9.0～10.0的gly-naoh缓冲液），按照实施例3的测定方法测定酶活（60℃反应10min），以最高酶活力为100%，计算在不同ph下的相对酶活力，结果如图4所示，最适ph为6.0。
51.温度稳定性的测定：将20μl酶液与400μl磷酸盐缓冲液（ph6.0）混合，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下分别保温1h、2h，然后加入180μl壳聚糖溶液（浓度20mg/ml），按照实施例3的测定方法测定酶活（60℃反应10min），以最高酶活力为100%，计算在不同温度下保温不同时间后的相对酶活力，结果如图5所示。壳聚糖酶ouc-csna4-s49i在20～40℃条件下稳定性较好，保温2h可以保持50%以上的活力。
52.ph稳定性的测定：将20μl酶液与80μl不同ph的缓冲液（所使用的缓冲液为：ph4.0～6.0的醋酸盐缓冲液，ph6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，ph8.0～9.0的tris-hcl缓冲液，ph
9.0～10.0的gly-naoh缓冲液）混合,使体系缓冲液浓度为0.02m，4℃下保温1h。然后加入200μl壳聚糖溶液（浓度20mg/ml）和300μl磷酸盐缓冲液（ph6.0）混合，终体系缓冲液浓度为0.04m，按照实施例3的测定方法测定酶活（60℃反应10min），以最高酶活力为100%，计算在不同ph下保温1h后的相对酶活力，结果如图6所示。由图6可知，壳聚糖酶ouc-csna4-s49i在ph4～8.5之间表现出较高的稳定性，孵育1h后仍有60%以上残余酶活，ph稳定性良好。
53.实施例5壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖的产物鉴定将20μl酶液与180μl壳聚糖溶液（浓度20mg/ml）、400μl磷酸盐缓冲液（ph为6.0）混合，在55℃下反应24h；沸水浴20min以终止反应。同时以出发壳聚糖酶ouc-csna4为对照，保持体系中ouc-csna4与ouc-csna4-s49i酶活相同，并且在相同条件下进行反应。
54.利用高效液相色谱技术（hplc）进行产物鉴定。hplc是高性能尺寸排除色谱法，并配有折射率检测器（hpsecrid，agilent1260，agilenttechnologies，santacruz，ca）。该系统采用superdex30increase10/300gl柱（gehealthcare，uppsala，sweden），以0.2m碳酸氢铵为流动相，流速为0.4ml/min。10000g离心2分钟后，过滤上清液（孔径0.22μm，millipore，德国），然后，将100μl的上清液注入hplc系统中。根据相应的标准曲线，定性产物成分。
55.结果如图7所示，壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖后，终产物中出现了（glcn）5，且（glcn）2的含量明显降低，这说明改造后的壳聚糖酶对（glcn）5的降解能力下降，不能完全降解（glcn）5，使得终产物为（glcn）2～（glcn）5，高聚合度的壳寡糖的含量得到了显著增加。使用swissmodel蛋白质建模服务器制备壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的结构模型，结果如图8所示。在野生型中，多糖分子末端与ser49氨基酸间存在氢键作用，当ser49突变为ile后，由于ile侧链的烷烃链结构，导致多糖分子在口袋中的构象发生改变，多糖分子与49位氨基酸间的氢键消失，可能减弱多糖分子与蛋白间的相互作用。
56.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

技术特征：
1.壳聚糖酶ouc-csna4-s49i，其特征在于，其氨基酸序列如下所示：hmvtfmpkgdteypsnnteypsnnteypsnntsnmknvilqmtstlenidtqlhfnyaenlgdergitfgcigfctgtydgnilikhytelnpdntlakyipaldkidtgphdaadgdgnpsveglsgfiqdvnscddplfknaqidkldelyynpameiadsigaknpltkafiydmcvrhgvdqtediikdagttpkqgtdentylqklislrdaklkqegiedvnrnqgykkllnsgnvdlktpftfvaygdsftidgklylgeyqqle。2.权利要求1所述的壳聚糖酶ouc-csna4-s49i在制备壳寡糖中的应用，其特征在于：所述壳寡糖的聚合度为2～5。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述壳寡糖为（glcn）5。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：以壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖，降解产物为（glcn）2、（glcn）3、（glcn）4和（glcn）5。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将含壳聚糖酶壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液加入到含壳聚糖的溶液中，在51～62℃、ph 4.0～7.0条件下反应10 min～24 h。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将20μl含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液、180μl壳聚糖溶液和400μl ph 6.0的磷酸盐缓冲液混合，55℃条件下反应24 h；所述含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液的浓度为4.991 mg/ml；所述壳聚糖溶液的浓度为20 mg/ml，溶剂为10 mg/ml的乙酸溶液。7.一种制备壳寡糖的方法，其特征在于：以壳聚糖酶ouc-csna4-s49i降解壳聚糖得到壳寡糖，壳寡糖的聚合度为2～5；所述壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的氨基酸序列如下所示：hmvtfmpkgdteypsnnteypsnnteypsnntsnmknvilqmtstlenidtqlhfnyaenlgdergitfgcigfctgtydgnilikhytelnpdntlakyipaldkidtgphdaadgdgnpsveglsgfiqdvnscddplfknaqidkldelyynpameiadsigaknpltkafiydmcvrhgvdqtediikdagttpkqgtdentylqklislrdaklkqegiedvnrnqgykkllnsgnvdlktpftfvaygdsftidgklylgeyqqle。8.根据权利要求7所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：将含壳聚糖酶壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液加入到含壳聚糖的溶液中，在51～62℃、ph 4.0～7.0条件下反应10 min～24 h。9.根据权利要求8所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：将20μl含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液、180μl壳聚糖溶液和400μl ph 6.0的磷酸盐缓冲液混合，55℃条件下反应24 h；所述含壳聚糖酶ouc-csna4-s49i的酶液的浓度为4.991 mg/ml；所述壳聚糖溶液的浓度为20 mg/ml，溶剂为10 mg/ml的乙酸溶液。

技术总结
本发明公开了壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I及其应用和制备壳寡糖的方法，属于壳聚糖酶技术领域。所述壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I在制备壳寡糖中的应用，所述壳寡糖的聚合度为2～5。所述制备壳寡糖的方法，以壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I降解壳聚糖得到壳寡糖，壳寡糖的聚合度为2～5。本发明的壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I具有产物特异性，降解壳聚糖可得到高聚合度的壳寡糖。本发明拓宽了GH 46家族的壳聚糖酶酶解壳聚糖的产物谱，可用于制备高聚合度的壳寡糖，应用潜力巨大，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。


技术研发人员：孙建安 贾真荣 毛相朝 苏海鹏 王永臻
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.07.20
技术公布日：2023/8/28