一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法。


背景技术：

2.乳腺癌是女性最常见的恶性疾病。在这些患者中，导致死亡的主要原因不是原发肿瘤，而是远处转移的肿瘤。癌细胞转移的机制，包括乳腺癌转移，在很大程度上是未知的，也是癌症研究的一个焦点。大多数乳腺癌是侵袭性的，经常转移到淋巴结，然后转移到远处的器官，包括骨、肺、肝和脑。目前还没有有效的转移性乳腺癌治疗方法。
3.因此，在基础研究中开发抑制转移性乳腺癌的化疗和免疫治疗药物具有重要意义。监测活体小鼠的肿瘤进展在技术上也是具有挑战性的。基础和转化乳腺癌研究在很大程度上依赖于实验动物模型。理想情况下，乳腺癌模型应在肿瘤病因、生物学行为、病理学和对治疗的反应方面与人类乳腺癌具有共性。乳腺癌转移模型具有短期追踪肿瘤进展和易于跟踪活体小鼠肿瘤进展的优势。
4.为了解决本领域当前所面临构建得到的乳腺癌转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案的技术问题，本发明提供了一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法。


技术实现要素：

5.本发明实施例的目的在于提供一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，旨在解决本领域当前所面临构建得到的乳腺癌转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案的技术问题。
6.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；（2）肿瘤细胞预处理；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激25-35min，每隔2.5-3.5h刺激1次，每天进行2-5次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统1-3h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；
c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
7.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
8.下面对本技术的技术方案作进一步的说明:一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；（2）肿瘤细胞预处理；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激30min，每隔3h刺激1次，每天进行4次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统2h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
9.在其中一个实施例中,所述动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊。
10.优化的，所述动物为小鼠，其中小鼠为6周龄balb/c雌性，体重为17～22g。
11.在其中一个实施例中,在所述步骤（2）中，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞在步骤（2）中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml。
12.在其中一个实施例中,在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
13.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
14.优化的，所述切口长度为0.5-1.5cm。
15.所述切口长度为1cm。
16.优化的，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器。
17.与现有技术相比，本发明一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法具
有：通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
附图说明
18.图1为本发明小鼠种植4t1乳腺癌细胞示意图；图2为本发明的一般状况观察检测方法中对照组、模型组、6-ohda组和解郁消癥颗粒组的小鼠体重变化统计图；图3为本发明糖水偏好实验和旷场试验统计图（其中，a-c分别为小鼠糖水偏好实验、旷场中心区域的活动距离、旷场穿梭次数）；图4为本发明小鼠血清中crh、cort及ne含量统计图（其中，a-c分别为 crh含量、cort含量、 ne含量）；图5为本发明中小鼠肝转移he染色图（其中，a-d分别为对照组、模型组、6-ohda组、解郁消癥颗粒组显微镜照片；大图为1000um，小图100um；）；图6为本发明小动物活体成像仪检测肝转移荧光成像；图7为本发明小动物mri活体成像肝转移图（其中，a-d分别为对照组、 模型组、 6-ohda组、解郁消癥颗粒组）；图8为本发明肝转移灶肿瘤细胞凋亡水平图（其中，a-d分别为对照组、 模型组、 6-ohda组、解郁消癥颗粒组）。
实施方式
19.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
20.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性60只，体重为17～22g；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，
夹尾刺激：每次夹尾刺激25min，每隔2.5h刺激1次，每天进行2次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统1h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
21.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
22.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
23.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为0.5cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
24.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性，体重为17～22g；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激35min，每隔3.5h刺激1次，每天进行5次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统3h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；
c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
25.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
26.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
27.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为1.5cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
28.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性60只，体重为18～20g，小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号：scxk(京)2019-003）。所有动物均饲养于山东省肿瘤医院spf级动物实验中心（实验动物使用许可号：syxk(鲁)2021-0012），并接受标准实验室食物和水，以及，适应性喂养1周，通过旷场实验将中心区域的活动距离和穿梭次数不足的小鼠剔除，采用随机数字表法将合格小鼠40 只，随机分为4组，具体为：第一组-对照组（不对小鼠进行干预）、第二组-模型组（慢性不可预知性应激联合孤养，慢性不可预知性应激简称cus）、第三组-cus联合孤养和6-羟基多巴胺（6-ohda）组合组（以下简称为6-ohda组）、第四组-cus联合孤养和解郁消癥颗粒组合组（以下简称为解郁消癥颗粒组）；需要说明的是：解郁消癥颗粒的主要成分包括柴胡15g、土贝母9g、蟾酥粉0.015g（由山东省肿瘤防治研究院药剂科制备提供）；6-ohda溶液配制：称取6-ohda后按20mg/ml浓度溶于含有0.4%（wt/vol）抗坏血酸的生理盐水，充分混匀后0.22
µ
m分子筛过滤除菌备用；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml（具体参见图1小鼠种植4t1乳腺癌细胞示意图）；（3）、建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激30min，每隔3h刺激1次，每天进行4次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统2h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；
电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
29.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
30.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
31.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为1cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
32.同时，第一组-对照组（不对小鼠进行干预）：正常饲养2周后予以乳腺垫接种4t1-luc乳腺癌细胞株；第二组-模型组（慢性不可预知性应激联合孤养，慢性不可预知性应激简称cus）：cus联合孤养建模2周后，乳腺垫接种4t1-luc乳腺癌细胞株，再cus持续刺激4周，4周期间每天cus持续2次；第三组-cus联合孤养和6-羟基多巴胺（6-ohda）组合组：cus联合孤养建模2周后，接种4t1-luc乳腺癌细胞株，继续cus刺激及每周第1、3天腹腔注射6-ohda（100mg/kg）和cus持续刺激4周，4周期间每天cus持续2次；第四组-cus联合孤养和解郁消癥颗粒组合组：cus联合孤养建模2周后，给予乳腺垫接种4t1-luc乳腺癌细胞株，再每天解郁消癥颗粒1.9mg/kg剂量灌胃（相当于临床等效剂量）4周和cus持续刺激4周，4周期间每天cus持续2次。
实施例
33.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性60只，体重为18～20g，小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号：scxk(京)2019-003）。所有动物均饲养于山东省肿瘤医院spf级动物实验中心（实验动物使用许可号：syxk(鲁)2021-0012），并接受标准实验室食物和水，以及，适应性喂养1周，通过旷场实验将中心区域的活动距离和穿梭次数不足的小鼠剔除，采用随机数字表法将合格小鼠40 只，随机分为4组，具体为：第一组-对照组（不对小鼠进行干预）、第二组-模型组（慢性不可预知性应激联合孤养，慢性不可预知性应激简称cus）、第三组-cus联合孤养和6-羟基多巴胺（6-ohda）组合组（以下简称为6-ohda组）、第四组-cus联合孤养和解郁消癥颗粒组合组（以下简称为解郁消癥颗粒组）；需要说明的是：解郁消癥颗粒的主要成分包括柴胡15g、土贝母9g、蟾酥粉0.015g（由山东省肿瘤防治研究院药剂科制备提供）；6-ohda溶液配制：称取6-ohda后按20mg/ml浓度溶于含有0.4%（wt/vol）抗坏血酸的生理盐水，充分混匀后0.22
µ
m分子筛过滤除菌备用；
（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml（具体参见图1小鼠种植4t1乳腺癌细胞示意图）；（3）、建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激30min，每隔3h刺激1次，每天进行4次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统2h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
34.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
35.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
36.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为0.5cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
37.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性60只，体重为18～20g，小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（生产许可证号：scxk(京)2019-003）。所有动物均饲养于山东省肿瘤医院spf级动物实验中心（实验动物使用许可号：syxk(鲁)2021-0012），并接受标准实验室食物和水，以及，适应性喂养1周，通过旷场实验将中心区域的活动距离和穿梭次数不足的小鼠剔除，采用随机数字表法将合格小鼠40 只，随机分为4组，具体为：第一组-对照组（不对小鼠进行干预）、第二组-模型组（慢性不可预知性应激联合孤养，慢性不可预知性应激简称cus）、第三组-cus联合孤养和6-羟基多巴胺（6-ohda）组合组（以下简称为6-ohda组）、第四组-cus联合孤养和解郁消癥颗粒组合组（以下简称为解郁消癥颗粒组）；
需要说明的是：解郁消癥颗粒的主要成分包括柴胡15g、土贝母9g、蟾酥粉0.015g（由山东省肿瘤防治研究院药剂科制备提供）；6-ohda溶液配制：称取6-ohda后按20mg/ml浓度溶于含有0.4%（wt/vol）抗坏血酸的生理盐水，充分混匀后0.22
µ
m分子筛过滤除菌备用；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml（具体参见图1小鼠种植4t1乳腺癌细胞示意图）；（3）、建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激30min，每隔3h刺激1次，每天进行4次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统2h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
38.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
39.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
40.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为1.5cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
41.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性60只，体重为17～22g；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移
性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激25min，每隔2.5h刺激1次，每天进行2次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统1h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
42.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
43.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
44.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为1.5cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
45.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性60只，体重为17～22g；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激25min，每隔2.5h刺激1次，每天进行2次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统1h，每日1次；
倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
46.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
47.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
48.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为1cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
49.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性，体重为17～22g；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激35min，每隔3.5h刺激1次，每天进行5次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统3h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
50.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一
个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
51.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
52.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为0.5cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
实施例
53.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；其中，动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊；优选采用的动物为小鼠，小鼠为6周龄balb/c雌性，体重为17～22g；（2）肿瘤细胞预处理；具体的，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激35min，每隔3.5h刺激1次，每天进行5次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统3h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；其中，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。
54.通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
55.在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。
56.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口（切口长度为1cm）；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；
s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。
57.造模期间每日观察各组小鼠精神状态、毛发及大便性状等一般状况的变化；每周对小鼠进行称重。
58.实验前所有动物进行48小时的蔗糖饮水训练，将2瓶1%的蔗糖水放置于笼上，24小时后，将其中一瓶蔗糖水用饮用水替代，继续 24小时（每隔6小时交换两个水瓶的位置）；禁食禁水24小时，在笼上放置两瓶水，其中一瓶为1%蔗糖水，一瓶为饮用水；小鼠1小时称重两瓶的饮水量，取走两瓶并称质量；采用蔗糖偏嗜度作为评价指标，即蔗糖偏嗜度（%）=蔗糖水饮用量+饮用水饮用量）
×
100%。
59.将小鼠放在50cm*50cm*40cm无色不透明旷场实验箱中，其中心区25 cmx25 cm, 小鼠在中心区域自由活动5 min，通过smart3.0 小动物行为学记录分析系统（瑞沃德，中国），记录分析小鼠在中心区的行走距离和穿梭次数。
60.小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，所有的血液样本通过眼眶静脉丛取血；3000 rpm 离心10分钟，取上清，
−
80
°
c冻存；按促肾上腺皮质激素释放激素（crh）、血清皮质酮（cort）及去甲肾上腺素（ne）elisa试剂盒说明书进行操作。
61.乳腺癌接种使用ivis系统活体成像，小鼠腹腔注射溶于pbs（15mg/ml）的150mg/kg d-luciferin；15min后，用麻醉机进行小鼠异氟烷麻醉，置于小动物活体三维多模式成像系统（caliper/perkin elmer，美国），曝光时间为5～10 s，在乳腺脂肪垫肿瘤周围手动定义感兴趣区域（roi）的生物发光，数据通过ivis spectrum分析图像测量原位移植瘤的荧光强度，监测肿瘤生长情况。
62.实验结束时行9.4t小动物mri系统扫描（贝克曼biospec 94/30，德国）。用1%戊巴比妥钠麻醉动物。将小鼠俯卧放置在mri台上并固定。使用回波时间（te）为33ms、重复时间（tr）为250ms的加权t2进行mr扫描。所有存活的动物都接受了mri扫描，以记录肝脏转移灶数量。两名放射科专家独立评估了所有mri图像。
63.小鼠肝脏组织在室温下用10%多聚甲醛林固定24小时，常规石蜡包埋切片，厚4μm。采用苏木精-伊红染色，zeiss全自动数码玻片扫描仪（蔡司axio scan.z1，德国）显微镜下观察。
64.采用tunel检测试剂盒检测（肝转移灶）肿瘤细胞凋亡水平；肿瘤组织行常规石蜡包埋切片，厚4μm；石蜡切片脱蜡至水，画圈滴加蛋白酶k工作液，室温作用22min；pbs洗涤3次；在样品上加50μl tunel检测液，37℃避光孵育60分钟，pbs洗涤3次；dapi染色5分钟，pbs洗涤3遍后用抗荧光淬灭封片液封片，tg全景组织细胞定量分析系统（tissuegnostics tissuefaxs plus s，奥地利）显微镜下选择肝转移肿瘤细胞；镜下356nm波长下正常肿瘤细胞核呈蓝色，488nm波长下凋亡细胞核呈绿色颗粒，在tissuegenostics strataquest分析软件上，在400倍视野下，每张切片选取5个阳性视野，每个视野计数200个细胞核，根据阳性细胞所占的百分比作为凋亡指数；肿瘤细胞凋亡指数=凋亡阳性细胞数/总细胞数。
65.应用spss 26.0 对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数
±
标准差表示，两组间均数比较采用t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。
66.具体参考图2，建模前，各组小鼠体重、外观体征、行为活动及状态等均无异常；与对照组比较，模型组组小鼠体重明显减轻，差异具有统计学意义（p《0.05），各给药组体重与
模型组比较均明显增加（p《0.05）。
67.糖水偏好实验的结果如下：具体参考图3中的a，糖水偏好实验结果显示，建模前各组间的蔗糖水偏嗜度无明显改变（p》0.05）；28天后与对照组比较，模型组应激后对蔗糖水偏嗜度明显降低，差异具有统计学意义（p《0.05）；与模型组比较，6-ohda组和解郁消癥颗粒组对蔗糖水偏嗜度明显升高，差异具有统计学意义（p《0.05）；与6-ohda组比较，解郁消癥颗粒组对蔗糖水偏嗜度无明显差异（p》0.05）。
68.旷场试验的结果如下：具体参考图3中的b和c，旷场试验结果显示，建模前各组间在旷场中心区域的活动距离和穿梭次数均无明显改变（p》0.05）。与对照组比较，模型组小鼠在旷场中心区域的活动距离和穿梭次数明显降低，差异具有统计学意义（p》0.05）。与模型组比较，6-ohda组和解郁消癥颗粒组在旷场中心区域的活动距离和穿梭次数明显升高，差异具有统计学意义（p《0.05）；与6-ohda组比较，解郁消癥颗粒组在旷场中心区域的活动距离和穿梭次数无明显改变（p》0.05）。
69.小鼠血清中crh、cort及ne含量的结果如下：具体参考图4，elisa结果显示显示，与对照组比较，模型组血清中crh表达水平显著增加（87.71
±
5.33 vs. 27.32
±
3.92，p《0.05）；与模型组比较，解郁消癥颗粒组crh表达水平显著降低（48.87
±
3.33 vs. 87.71
±
5.33，p《0.05），6-ohda组crh表达水平显著降低（54.67
±
3.59 vs. 87.71
±
5.33，p《0.05）；与解郁消癥颗粒比较，6-ohda组crh表达水平显著升高（54.67
±
3.59 vs. 48.87
±
3.33，p《0.05）；与对照组比较，模型组血液中cort表达水平显著增加（154.9
±
4.48 vs. 198.9
±
5.64，p《0.05）；与模型组比较，解郁消癥颗粒组cort表达水平显著降低（156.0
±
5.65 vs. 198.9
±
5.64，p《0.05），6-ohda组cort表达水平显著降低（164.2
±
6.02 vs. 198.9
±
5.64，p《0.05）；与解郁消癥颗粒比较，6-ohda组cort表达水平显著升高（164.2
±
6.02 vs. 156.0
±
5.65，p《0.05）。
70.与对照组比较，模型组血液中ne表达水平显著增加（246.5
±
11.21 vs. 371.0
±
16.08，p《0.05）；与模型组比较，解郁消癥颗粒组ne表达水平显著降低（371.0
±
16.08 vs. 262.9
±
7.98，p《0.05），6-ohda组ne表达水平显著降低（371.0
±
16.08 vs. 291.9
±
17.44，p《0.05）；与解郁消癥颗粒比较，6-ohda组ne表达水平显著升高（291.9
±
17.44 vs. 262.9
±
7.98，p《0.05）。
71.小鼠肝转移he染色的结果如下：具体参考图5，对照组和模型组可见癌细胞, 它们的大小形状均不同, 癌细胞呈巢状或条索状排列生长, 有明显的肝细胞坏死, 细胞核和细胞质均被染色变深；6-ohda组小鼠肝脏中可见癌细胞, 它们的大小形状均不同, 癌细胞呈巢状或条索状排列生长, 有明显的肝细胞坏死, 细胞核和细胞质均被染色变深；解郁消癥颗粒组可见泡沫型改变的肝细胞水肿, 在汇管区有异常细胞浸润，细胞核变形。
72.小动物活体成像仪检测荧光成像具体参考图6，在小动物活体成像中，模型组中促进了原位乳腺癌小鼠的肝转移，肝脏区域明显出现荧光成像斑点；与对照组比较，模型组对小鼠肝转移rio区域明显增高
（4.59
±
0.37 vs. 5.52
±
0.23，p《0.05）；与模型组比较，解郁消癥颗粒组小鼠抗肝转移rio区域明显降低（5.52
±
0.23 vs.1.98
±
0.39，p《0.05），6-ohda组小鼠抗肝转移rio区域明显降低（5.52
±
0.23 vs.2.58
±
0.27，p《0.05）；与6-ohda组比较，解郁消癥颗粒小鼠抗肝转移rio区域明显降低（2.58
±
0.27 vs. 1.98
±
0.39，p《0.05）。
73.小动物mri活体成像肝转移具体参考图7，mr结果显示， t2加权像上呈高信号的区域，说明小鼠肝肿瘤为转移性肝肿瘤；与对照组比较，模型组乳腺癌肝转移数量显著增加（3.8
±
0.9 vs. 7.5
±
1.1，p《0.05）；与模型组比较，6-ohda组乳腺癌肝转移数量显著降低（7.5
±
1.1 vs. 4.3
±
0.9，p《0.05），解郁消癥颗粒组乳腺癌肝转移数量显著降低（7.5
±
1.1 vs.3.5
±
0.8，p《0.05）；与6-ohda组比较，解郁消癥颗粒乳腺癌肝转移数量无显著差异（4.3
±
0.9 vs. 3.5
±
0.8，p》0.05）。
74.肝转移灶肿瘤细胞凋亡水平具体参考图8，与对照组比较，模型组乳腺癌肝转移细胞凋亡指数降低（50.30
±
8.45 vs. 31.70
±
3.74，p《0.05）；与模型组比较，解郁消癥颗粒组乳腺癌肝转移细胞凋亡指数显著降低（98.00
±
6.63 vs. 31.70
±
03.74，p《0.05），6-ohda组乳腺癌肝转移细胞凋亡指数著降低（74.00
±
12.94 vs. 31.70
±
03.74，p《0.05）；与解郁消癥颗粒组比较，6-ohda组乳腺癌肝转移细胞凋亡指数显著降低（74.00
±
12.94 vs. 98.00
±
6.63，p《0.05）。
75.进而，通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。
76.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
77.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；（2）肿瘤细胞预处理；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激25-35min，每隔2.5-3.5h刺激1次，每天进行2-5次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统1-3h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。2.根据权利要求1所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）实验动物的准备；（2）肿瘤细胞预处理；（3）建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型：a、对动物进行慢性不可预知性应激刺激和孤养，包括夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底，将夹尾刺激、频闪照明、模具束缚、倾斜鼠笼垫湿辅料和电击足底5种刺激方法纳入随机表格之中，每天随机给予2种刺激；其中，夹尾刺激：每次夹尾刺激30min，每隔3h刺激1次，每天进行4次；频闪照明：每天2h；模具束缚：夹尾刺激后将每只老鼠独立关入动物约束系统2h，每日1次；倾斜鼠笼和垫湿辅料：每次倾斜鼠笼2h；电击足底：电流强度1.0ma，10s/次，间隔1 min刺激1次，共30次；b、14天后，将肿瘤细胞注射到动物第四对乳腺脂肪垫内中；c、肿瘤细胞株原位种植完成后，再进行步骤a，对动物进行慢性不可预知性应激刺激联合孤养。3.根据权利要求1或2所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物包含有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猴、绵羊、山羊。4.根据权利要求3所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，所述动物为小鼠，其中小鼠为6周龄balb/c雌性，体重为17～22g。5.根据权利要求1或2所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，
在所述步骤（2）中，肿瘤细胞为乳腺癌细胞，乳腺癌细胞，由luciferace荧光标记的4t1鼠源乳腺癌细胞；其中，4t1鼠源乳腺癌细胞在步骤（2）中的用量为1
×
105～5
×
105cells/ml。6.根据权利要求4所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，肿瘤细胞注射到小鼠第四对乳腺脂肪垫内中还包括如下步骤：s1、去除小鼠的腹部乳房部位毛发，清洁暴露的腹部皮肤；s2、采用碘酒和/或75％酒精清洁皮肤。7.s3、在清洁后的第四对乳房皮肤做一个切口；s4、切口采用外科手术刀对清洁后的颈部皮肤进行切割得到的；s5、将肿瘤细胞注射到乳房垫中s6、将分离的肌肉复位，覆盖伤口部位，手术缝合。8.根据权利要求6所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，所述切口长度为0.5-1.5cm。9.根据权利要求7所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，所述切口长度为1cm。10.根据权利要求6所述的一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，其特征在于，所述的将肿瘤细胞注射到乳房垫中采用设备是可调节计量微量注射器。

技术总结
本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型的构建方法，包括实验动物的准备、肿瘤细胞预处理、建立慢性不可预知性应激联合孤养法模型的三阴性乳腺癌肝气郁滞证肝转移性动物模型；通过该方法构建得到的肝气郁滞型乳腺癌肝转移动物模型为临床试验提供了一个很好的替代方案，为临床药物作用机制的研究、药物筛选和评价、疫苗研究与开发提供了实验材料，具有较好的临床应用价值。用价值。用价值。


技术研发人员：林家茂 李洋 张志钦 陈云松
受保护的技术使用者：山东第一医科大学附属肿瘤医院（山东省肿瘤防治研究院、山东省肿瘤医院）
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/8/31