一种高产L-苯丙氨酸的大肠杆菌及其构建方法和应用

一种高产l-苯丙氨酸的大肠杆菌及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产l-苯丙氨酸的大肠杆菌及其应用。


背景技术：

2.l-苯丙氨酸(l-phenylalanine，l-phe)是人体必需氨基酸之一。作为一种重要的生物化工产品，l-phe在食品添加剂、营养增补剂、医疗制药等领域具有广泛的应用。例如，l-苯丙氨酸是重要的食品添加剂-甜味剂阿斯巴甜的主原料，在医药行业主要用于氨基酸输液和氨基酸类抗癌药物的生产。l-苯丙氨酸的生产方法有蛋白质水解提取法、化学合成法、酶法与微生物发酵法，前两种方法由于工艺复杂、污染严重、产物纯度低等问题逐渐被酶法和发酵法取代。酶法生产虽然产物纯度高，生产能力强，但是由于底物和酶等主要原料成本高、来源有限，且反应过程中酶稳定性差等缺点，导致酶法逐渐失去市场竞争力。微生物发酵法是指以葡萄糖等廉价原料为底物，利用微生物菌种发酵生产l-苯丙氨酸的一种方法，因其生产成本低廉，易于放大，环境污染小等优点，成为了目前国内外生产l-苯丙氨酸工业化生产的主流方法。
3.大肠杆菌是一种典型的模式微生物，具有遗传背景清晰、操作简单、生长周期短等优点，常用作有机酸、氨基酸等生产菌种。诱变育种是一种传统、常用的微生物育种手段，可以在短时间内提高突变率并获得大量突变类型，也存在有益突变体频率低、突变方向难以控制等问题。利用代谢工程和合成生物学手段靶向性改造，可以实现在传统非定向诱变育种的基础上进行定向、理性的育种。莽草酸途径是大肠杆菌以葡萄糖为碳源发酵生产l-苯丙氨酸的唯一合成路径。增加莽草酸途径的通量，降低莽草酸途径向其他芳香族氨基酸的转化，能够提高l-苯丙氨酸的合成能力。从微生物生长代谢上看，l
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苯丙氨酸合成理论上和微生物生长同步。在实际发酵过程中，合理调节碳流在l-苯丙氨酸合成途径和微生物生长间的分布，是实现工业化发酵生产l-苯丙氨酸的基础。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种能够高产l-苯丙氨酸技的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
5.技术方案：本发明提供了一株大肠杆菌(escherichia coli)jnypq，其于2022年1 月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国，广东省广州市，保藏编号为gdmcc no.62245。
6.本发明内容还包括一株大肠杆菌重组菌，所述大肠杆菌重组菌是将表达重组质粒 pacyc177-ci-arof-phea
fbr
导入所述的大肠杆菌(escherichia coli)jnypq菌株中得到 e.coli jny021。
7.本发明内容还包括所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，所述构建方法是将表达重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
fbr
导入所述的大肠杆菌(escherichia coli)jnypq菌株中
得到。
8.其中，所述重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
fbr
是将ci-arof-phea基因片段连接到质粒pacyc177上，得到质粒pacyc177-ci-arof-phea，并对质粒 pacyc177-ci-arof-phea上的phea基因进行定点突变得到。
9.其中，所述phea基因定点突变是将phea基因的第977位核苷酸由t替换为g。
10.其中，所述重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
fbr
包括以下步骤构建得到：
11.1)以大肠杆菌k12的基因组为模板，用引物对arof-f/arof-r和phea-f/phea-r通过pcr扩增得到arof和phea基因；2)合成包含有λpr启动子的ci857基因，将arof 基因连接到λpr启动子右侧，λpl启动子序列连接到phea基因上游，另一端同源重组到arof基因的下游，得到同源重组连接产物ci-arof-phea；3)将同源重组连接产物 ci-arof-phea酶切连接到pacyc177质粒上，得到表达载体pacyc177-ci-arof-phea； 4)以pacyc177-ci-arof-phea表达质粒为模板，采用引物对phea
fbr-u-f/phea
fbr-u-r 和phea
fbr-d-f/phea
fbr-d-r分别扩增含有突变位点的phea基因的上游和下游序列，通过同源重组连接上游和下游序列得到ci-arof-phea
fbr
基因片段，将ci-arof-phea
fbr
基因片段连接到pacyc177质粒上，得到pacyc177-ci-arof-phea
fbr
质粒。
12.其中，所述引物对arof-f/arof-r序列如seq id no：1和seq id no：2所示，所述引物对phea-f/phea-r序列如seq id no：3和seq id no：4所示，所述引物对 phea
fbr-u-f/phea
fbr-u-r序列如seq id no：5和seq id no：6所示，所述引物对 phea
fbr-d-f/phea
fbr-d-r序列如seq id no：7和seq id no：8所示。
13.其中，所述ci-arof-phea
fbr
基因片段的基因序列如seq id no：11所示。
14.本发明内容还包括一种l-苯丙氨酸生产方法，所述方法为挑取所述的大肠杆菌重组 e.coli jny021菌接种到种子培养基中培养，然后再转接到发酵培养基中继续发酵培养得到含有l-苯丙氨酸的发酵液。
15.其中，所述种子培养基每升组成包括：胰蛋白胨32g，酵母粉20g，氯化钠5g，甘油5g，卡那霉素50mg。
16.其中，所述种子培养基中培养温度是33℃，培养时间16h，转速220rpm。
17.其中，所述发酵培养基每升组成包括：葡萄糖22.5g，酵母粉2g，酪氨酸1.2g，硫酸镁1g，磷酸氢二钾7g，硫酸铵3g，柠檬酸2g，富马酸2g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.01g，氯化钙0.02g，氯化钴0.002g，硫酸锌0.001g，维生素b2 0.005g，磷酸吡哆醛0.01g，烟酸0.01g，硫胺素0.01g，卡那霉素50mg。
18.其中，所述发酵培养采取补料分批发酵的方式，所述分批发酵的参数设定为：初始发酵温度33℃，两阶段控制发酵温度，菌体进入对数生长中后期，提高温度到38℃；初始ph值7.0，用20％氨水控制ph在6.7-7.0；初始葡萄糖浓度22.5g/l，后期以不同速率补加600g/l葡萄糖；初始转速和通气量分别为400rpm和1.3vvm，整个发酵过程溶氧不低于20％；发酵时间56h。
19.其中，所述方法根据菌体生长阶段采取不同补料策略，当发酵罐内当糖即将耗尽时，以指数流加进行补加葡萄糖，当菌体进入稳定期，以线性降低速率流加葡萄糖。
20.其中，在菌体对数生长期，按照公式以指数流加形式进
行补加葡萄糖。
21.其中，在菌体进入稳定期后，按照公式f(ml/h)＝-0.1518t+9.473以线性降低速率流加葡萄糖。
22.首先，本发明通过紫外诱变先得到酪氨酸、色氨酸两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌，再利用常温常压等离子体诱变筛选抗5mg/ml 4-氨基-dl-苯丙氨酸的突变株e.colijnypq(tyr-、trp
lea
、papr)。该菌株已经保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.62245。
23.其次，构建重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
fbr
转化到jnypq菌株，利用λ噬菌体ci温度敏感性阻遏蛋白和强启动子pl、pr，调控l-苯丙氨酸合成途径关键基因phea
fbr (编码3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶)和arof(编码分支酸变位酶)的表达得到能高产l-苯丙氨酸的大肠杆菌重组菌。
24.具体地，大肠杆菌重组菌发酵生产l-苯丙氨酸方法具体培养包括，挑取斜面上一环上述构建得到的大肠杆菌重组菌e.coli jny021菌落到种子培养基，种子液培养温度是 33℃，培养时间14h，培养至od
600
在16左右，以15％接种量从种子培养液转接到5l 发酵罐中，发酵初始转速为400rpm，初始通气量为1.3vvm，溶氧不低于20％。用20％氨水控制ph在6.7-7.0。生长初期，发酵温度设为33℃，当进入对数生长中后期，发酵温度设为38℃。初始葡萄糖浓度22.5g/l，当发酵罐内当糖即将耗尽时，以指数流加进行补加葡萄糖，当菌体进入稳定期，以线性降低速率流加葡萄糖，使发酵中后期残糖浓度在0.5-2g/l。
25.其中，生产l-苯丙氨酸的培养基组成为：
26.斜面培养基每升组成为，氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉20g，卡那霉素50mg；
27.种子培养基每升组成为，胰蛋白胨32g，酵母粉20g，氯化钠5g，甘油5g，卡那霉素50mg；
28.发酵培养基每升组成为(摇瓶水平)，葡萄糖10g，酵母粉5g，七水合硫酸镁2g，磷酸氢二钾3g，硫酸铵5g，柠檬酸2g，nacl 1g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.01g，氯化钙0.02g，氯化钴0.002g，硫酸锌0.001g，维生素b2 0.005g，磷酸吡哆醛0.01g，烟酸0.01g，硫胺素0.01g，卡那霉素50mg。
29.发酵培养基每升组成为(发酵罐水平)，葡萄糖22.5g，酵母粉2g，酪氨酸1.2g，硫酸镁1g，磷酸氢二钾7g，硫酸铵3g，柠檬酸2g，富马酸2g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.01g，氯化钙0.02g，氯化钴0.002g，硫酸锌0.001 g，维生素b2 0.005g，磷酸吡哆醛0.01g，烟酸0.01g，硫胺素0.01g，卡那霉素50mg。
30.有益效果：本发明通过紫外诱变先得到酪氨酸、色氨酸两种氨基酸营养缺陷型大肠杆菌(escherichia coli)jnypq，构建重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
fbr
转化到jnypq 菌株中得到了高产l-苯丙氨酸的大肠杆菌重组菌e.coli jny021，该菌株在特定的发酵条件下56h可以积累下62g/l l-苯丙氨酸，糖酸转化率为25.2％。因此该菌株可以在 l-苯丙氨酸的实际生产中具有应用前景。
附图说明
31.图1为l-苯丙氨酸标准样品和发酵液样品的hplc检测图；
32.图2为本发明l-苯丙氨酸合成相关基因表达质粒构建流程图；
33.图3为大肠杆菌重组菌e.coli jny021在种子液中生长情况；
34.图4为大肠杆菌重组菌e.coli jny021在摇瓶上的发酵情况；
35.图5为大肠杆菌重组菌在5l发酵罐上生长和产酸情况。
具体实施方式
36.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
37.实施例1大肠杆菌k12多轮诱变筛选l-苯丙氨酸生产底盘菌
38.(1)紫外诱变筛选酪氨酸和色氨酸缺陷型菌株
39.筛选酪氨酸和色氨酸双缺菌株，可以切断l-苯丙氨酸、l-酪氨酸的代谢支路，目的是促使莽草酸途径碳流流向l-苯丙氨酸。将4℃保藏的大肠杆菌k12单菌落接种于5ml 的lb试管液体(蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，去离子水定容至1l，调ph7.0) 培养基中，37℃，220rpm过夜培养至对数生长期，测定菌体浓度，收集细胞，用生理盐水稀释至约为108cfu/ml。吸取上述菌液3ml于直径6cm培养皿形成薄层，在距紫外灯管28.5cm处开盖照射1min(根据70％致死率前期确定)后，锡箔纸包裹，将3ml lb液体培养基加入上述处理好的培养皿中，避光37℃恒温培养18h。取5ml菌液用等体积生理盐水洗去培养基，取0.1ml菌液加入5ml无氮源培养基(每升含葡萄糖20g，磷酸氢二钾10g，柠檬酸钠2g，七水硫酸镁0.2g)，37℃培养12h，加入10ml 含2g/l氯化铵的无氮源培养基，同时加入青霉素使培养液终浓度约为1000u/ml。培养18h，取菌液0.1ml，涂布lb，置37℃恒温箱中培养36h。
40.用牙签挑取lb上菌落，分别先点种m9培养基(每升含葡萄糖4g，na2hpo
4 6.78 g，kh2po
4 3g，nacl 0.5g，nh4cl 1g，mgso4
·
7h2o 0.493g，cacl
2 0.01lg)和lb培养基，培养12h。选择在m9培养基上不生长，而在lb培养基上生长的菌落，初步判断为营养缺陷型。将菌落分别接种到液体lb培养基中，37℃培养14-16h，用无菌生理盐水洗去培养基。取0.1ml菌液接种到只含酪氨酸、只含色氨酸、既有酪氨酸又有色氨酸的m9液体试管中，筛选在前两种培养基上不长，而在第三种培养基上生长的菌落， jnyp25、jnyp33、jnyp92。将这三株酪氨酸和色氨酸双缺菌株接种到试管种子培养液， 37℃过夜培养，再按10％接种量转接至装有30ml发酵培养基的500ml摇瓶中，33℃、 220rpm培养24h，jnyp25、jnyp33、jnyp92菌株l-苯丙氨酸产量分别为1.92g/l、 1.56g/l、1.98g/l。
41.(2)等离子体诱变筛选l-苯丙氨酸结构类似物抗性突变株
42.选育l-苯丙氨酸结构类似物抗性突变株，是为了在一定程度上解除l-苯丙氨酸对特异性合成途径的反馈抑制和阻遏，有利于进一步提高菌株的产酸能力。将菌株jnyp92 在试管lb培养后用生理盐水稀释至约为108cfu/ml，吸取10μl菌悬液置于artp诱变育种仪中，诱变条件为温度20℃、功率100w、氦气流量10l/min、处理时间180s。将诱变的菌体涂布于含有5mg/ml 4-氨基-dl-苯丙氨酸(pap)的lb培养基。挑选生长快速、单菌落较大的菌株，接种到含1ml发酵培养基的48孔板中培养48h后，利用氨基酸分析仪检测l-苯丙氨酸含量进行初筛。对l-苯丙氨酸产量较高的突变株 jnyp92-12、jnypq、jnyp92-25、jnyp92-26、jnyp92-31进行摇瓶发酵实验，经检测 jnyp92-17(tyr-、trp
lea
、papr)l-苯丙氨酸产量最高为4.12g/l，将该菌株命名为大肠杆菌(escherichia coli)jnypq，于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.62245。
43.实施例2、l-苯丙氨酸的检测方法
44.基于氨基酸衍生的方法检测l-苯丙氨酸。色谱柱agilent zorbax sb-aq，水相 a：0.01mol/l kh2po4，有机相b∶乙腈∶甲醇∶水相a＝5∶3∶1(体积比)。8μl样品与4μl衍生剂邻苯二甲醛混合进样后进行在线衍生。0-25min内两相梯度洗脱(0min，20％a相80％b相；5min，65％a相35％b相；10min，35％a相65％b相；15min， 30％a相70％b相；20min，50％a相50％b相；23min，80％a相20％b相)。柱温35℃、1ml/min流速。利用荧光检测器检测，激发(ex)和发射波长(em)分别为 330nm和465nm。如图1所述，l-苯丙氨酸标样和发酵液的出峰时间均为13.837min。
45.实施例3、在底盘菌中表达l-苯丙氨酸合成途径关键基因
46.如图2所示，以pacyc177(淼灵质粒平台购买)为骨架质粒，利用λ噬菌体ci 温度敏感性阻遏蛋白构建温度拨动开关，以l-苯丙氨酸合成途径关键基因phea
fbr
(编码3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶)和arof(编码分支酸变位酶)为靶标基因，调控l-苯丙氨酸合成途径的表达。
47.以大肠杆菌k12的基因组为模板，用引物对arof-r/arof-f(seq id no：1～2)和引物对phea-r/phea-f(seq id no：3～4)，pcr扩增得到arof和phea基因。arof基因的pcr体系为：primestar max premix (2
×
)25μl、arof-r/arof-f各1.5μl、模板 2μl、ddh2o 2μl。98℃预变性5min，98℃变性10s，57℃退火5s，72℃延伸60s，29 个循环，72℃延伸2min，得到arof基因片段。phea基因的pcr退火温度为50℃，其他和arof基因pcr体系以及扩增条件均相同，得到phea基因片段。为了实现λ噬菌体 ci温敏调控元件调控调控l-苯丙氨酸合成相关基因的表达，需要合成得到ci阻遏蛋白、λpr、λpl启动子相关序列。以ci857阻遏蛋白编码基因在ncbi中blast，搜索比对得到bacteriophage sp.isolate 528基因组序列，以它为模板合成ci857及其上下游序列 (包含λpr启动子)(其基因序列参见seq id no：9所示)。基于同源重组原理，将 pcr扩增得到的arof基因片段，连接到λpr启动子右侧。同源重组连接体系为：6μl pcr 得到phea基因片段、合成ci857-λpr序列2μl，同源重组酶(购自abm公司)2μl，冰上放置30min连接。同理，为了实现ci857调控phea的表达，将经过合成的λpl启动子序列(其基因序列参见seq id no：10所示)连接到phea上游，另一端同源重组到arof基因的下游得到同源重组连接产物ci-arof-phea。
48.将上述多片段同源重组连接产物ci-arof-phea，酶切连接到bamhi和psti酶切处理的pacyc177质粒上，得到表达载体pacyc177-ci-arof-phea。以 pacyc177-ci-arof-phea质粒为模板，用引物对phea
fbr-u-f/phea
fbr-u-r(seq id no： 5和seq id no：6所示)和引物对phea
fbr-d-f/phea
fbr-d-r(seq id no：7和seq idno：8所示)分别扩增含有突变位点(phea基因第977位核苷酸t替换位g)的phea 基因上游和下游序列，带有突变位点phea基因上游序列pcr的退火温度为55℃退火， 72℃延伸5s，其他和arof基因pcr体系以及扩增条件相同，得到phea
fbr
基因上游片段；有突变位点phea基因下游序列pcr的退火温度为55℃退火，72℃延伸50s，其他和arof 基因pcr体系以及扩增条件相同，得到phea
fbr
基因下游片段。基于同源序列将phea
fbr
基因上游片段和phea
fbr
基因下游片段连接起来得到phea
fbr
基因片段，同源重组连接体系为：phea
fbr
上游片段5μl、phea
fbr
下游片段3μl、同源重组酶(购自abm公司)2μl，冰上放置30min连接。将质粒pacyc177-ci-arof-phea用bamhi和ecori酶切，与含有突变位点的-phea
fbr
基因片段用t4连接酶连接，得到pacyc177-ci-arof-phea
fbr
质粒， ci-arof-phea
fbr
参见seq id no：11。将pacyc177-ci-arof-phea
fbr
质粒转化到大肠杆菌
jnypq中，得到大肠杆菌重组菌e.coli jny021。
49.seq id no：1：arof-r：
50.seq id no：2：arof-f：
51.seq id no：3：phea-r：5
’‑
cgcggatcctcaggttggatcaacag-3’52.seq id no：4：phea-f：5
’‑
ccgccggaattcctcccaaatcgggg-3’53.seq id no：5：phea
fbr-u-f：5
’‑
cgcggatcctcaggttggatcaacaggc-3’54.seq id no：6：phea
fbr-u-r：
55.seq id no：7：phea
fbr-d-f：
56.seq id no：8：phea
fbr-d-r：5
’‑
ccggaattcctcccaaatcgggg-3’。
57.下划线酶切位点和保护碱基，斜体是与目标基因连接的同源片段，加粗字体的是 phea点突变碱基。
58.实施例4、大肠杆菌重组菌e.coli jny021在摇瓶上生长和发酵产酸测定
59.将-80℃保藏的大肠杆菌重组菌e.coli jny021接种至斜面培养基中，于37℃培养2 代，每代12h。将二代斜面中的菌株接种至装有30ml种子培养基的500ml圆底瓶中， 37℃、220rpm培养24h。大肠杆菌重组菌e.coli jny021在种子培养基中的生长曲线如图3所示，菌株在10h左右进入对数生长期，在24h左右进入稳定期。在13-14小时，od600在12.33-16.85区间，达到接种要求，可以接入发酵培养基进一步培养。菌株最终od600可达到30.05，说明该重组大肠杆菌生长能力较强。其中，斜面培养基每升组成为：氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂粉20g，卡那霉素50mg；种子培养基每升组成为：胰蛋白胨32g，酵母粉20g，氯化钠5g，甘油5g，卡那霉素 50mg；培养基灭菌条件121℃灭菌20min，温度降到65℃左右时，加入卡那霉素母液摇匀备用。
60.此外，考察大肠杆菌重组菌e.coli jny021在摇瓶水平的发酵l-苯丙氨酸情况。按上述培养到10～12h的大肠杆菌重组菌e.coli jny021种子培养液，以10％接种量转接至装有30ml发酵培养基的500ml圆底瓶中，33℃、220rpm培养24h，如图4所示，苯丙氨酸产量可达8.21g/l。发酵培养基中添加终质量浓度为8mg/l的苯酚红作为酸碱指示剂，培养过程中需根据培养基颜色变化手动补加氨水以维持培养基ph 7.0左右，当葡萄糖耗尽时，培养基颜色呈红色且不变色，通过移液枪一次性补加0.5ml的600g/l 葡萄糖溶液。
61.实施例5、大肠杆菌重组菌e.coli jny021在5l发酵罐上l-苯丙氨酸生产情况
62.将-80℃保藏的大肠杆菌重组菌e.coli jny021接种至斜面培养基中，于37℃培养 2代，每代12h。将二代斜面中的菌株接种至装有30ml种子培养基的500ml圆底瓶中，33℃，220rpm，培养14h，摇至od600至15左右。按15％接种量接种到装液量 2.4l的5l发酵罐中，进行补料分批发酵。发酵培养基组成为：葡萄糖22.5g，酵母粉2 g，酪氨酸1.2g，硫酸镁1g，磷酸氢二钾7g，硫酸铵3g，柠檬酸2g，富马酸2g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.01g，氯化钙0.02g，氯化钴0.002g，硫酸锌0.001g，维生素 b2 0.005g，磷酸吡哆醛0.01g，烟酸0.01g，硫胺素0.01g，卡那霉素50mg，ph值7.0。补加底物葡萄糖浓度s0为600g/l。发酵初始转速为400rpm，初始通气量为1.3vvm，前期溶氧自动下降，后期调节通气量与转速维持溶氧在30％-45％。用20％氨水自动调节ph在6.7-7.0。
63.根据菌体处于不同生长阶段采取不同补料策略，以不同速率添加600g/l葡萄糖。
在16h时，发酵罐内葡萄糖浓度下降到0.9g/l，碳源快耗尽，启动补料控制。在菌体对数生长期(16h-32h)，每4h为一个阶段，按照公式以指数流加形式进行补加葡萄糖。其中流加初始细胞浓度(x0)和培养基体积(v0)分别为43.31 g/l和2.4l、细胞对葡萄糖得率(y)为2.0、初始葡萄糖浓度(s0)为600g/l葡萄糖，t 为发酵时间，f为葡萄糖补料速度。μset依次设定为0.18h-1
、0.15h-1
、0.12h-1
、0.09h-1
、 0.06h-1
。在菌体进入稳定期后(36h-52h)，按照公式f(ml/h)＝-0.1518t+9.473以线性降低速率流加葡萄糖，其中f为葡萄糖补料速度，t为发酵时间。
64.大肠杆菌重组菌e.coli jny021整个发酵过程菌体的生长、产酸和糖耗情况如图5 所示。大肠杆菌重组菌e.coli jny021生长初期的生长温度控制在33℃，在4h后菌体开始加速生长，8h已经进入对数生长期，od600为14.3。进入对数生长中后期(28h， od600为118.62)，发酵温度提高到38℃，菌体在进入稳定期后生物量维持在130—140。 l-苯丙氨酸产量的增长相对于生物量增长滞后，发酵16h后，l-苯丙氨酸产量开始快速增长，至发酵结束56h，l-苯丙氨酸产量为62g/l。发酵初始葡萄糖22.5g/l，发酵前期糖耗速率较快，在16h时，发酵罐内葡萄糖浓度下降到0.9g/l，开始以不同速率添加600g/l葡萄糖。发酵过程中总糖耗268.47g/l，l-苯丙氨酸对葡萄糖得率25.2％(摩尔比)。

技术特征：
1.一株大肠杆菌（escherichia coli）jnypq，其于2022年1月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.62245。2.一株大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌是将表达重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
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导入权利要求1所述的大肠杆菌（escherichia coli）jnypq菌株中得到e. coli jny021。3.权利要求2所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是将表达重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
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导入权利要求1所述的大肠杆菌（escherichia coli）jnypq菌株中得到e. coli jny021。4.根据权利要求3所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
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是将ci-arof-phea基因片段连接到质粒pacyc177上得到质粒pacyc177-ci-arof-phea，并对质粒pacyc177-ci-arof-phea上的phea基因进行定点突变得到。5.根据权利要求4所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，所述 phea基因定点突变是将phea基因的第977位核苷酸由t替换为g。6.根据权利要求3所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pacyc177-ci-arof-phea
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包括以下步骤构建得到：1）以大肠杆菌k12的基因组为模板，用引物对arof-f/arof-r和phea-f/phea-r通过pcr扩增得到arof和phea基因；2）合成包含有λpr启动子的ci857基因，将arof基因连接到λpr启动子右侧，λpl启动子序列连接到phea基因上游，另一端同源重组到arof基因的下游，得到同源重组连接产物ci-arof-phea；3）将同源重组连接产物ci-arof-phea酶切连接到pacyc177质粒上，得到表达载体pacyc177-ci-arof-phea；4）以pacyc177-ci-arof-phea表达质粒为模板，采用引物对phea
fbr-u-f/phea
fbr-u-r和phea
fbr-d-f/phea
fbr-d-r分别扩增含有突变位点的phea基因的上游和下游序列，通过同源重组连接上游和下游序列得到ci-arof-phea
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基因片段，将ci-arof-phea
fbr
基因片段连接到pacyc177质粒上，得到pacyc177-ci-arof-phea
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质粒。7.根据权利要求6所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，所述引物对arof-f/arof-r序列如seq id no：1和seq id no：2所示，所述引物对phea-f/phea-r序列如seq id no：3和seq id no：4所示，所述引物对phea
fbr-u-f/phea
fbr-u-r序列如seq id no：5和seq id no：6所示，所述引物对phea
fbr-d-f/phea
fbr-d-r序列如seq id no：7和seq id no：8所示。8.根据权利要求6所述的大肠杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，所述ci-arof-phea
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基因片段的基因序列如seq id no：11所示。9.一种l-苯丙氨酸生产方法，其特征在于，所述方法为挑取权利要求2所述的大肠杆菌重组菌e. coli jny021接种到种子培养基中培养，然后再转接到发酵培养基中继续发酵培养得到含有l-苯丙氨酸的发酵液。10.根据权利要求4所述的l-苯丙氨酸生产方法，其特征在于，所述发酵培养采取补料分批发酵的方式，所述分批发酵的参数设定为：初始发酵温度33.5
±
0.5℃，两阶段控制发
酵温度，菌体进入对数生长中后期，提高温度到38.5
±
0.5℃；初始ph值7.0
±
0.2℃，用20%氨水控制ph在6.7-7.0；初始葡萄糖浓度20-30 g/l，当发酵罐内当糖即将耗尽时，以不同速率补加600 g/l葡萄糖；初始转速和通气量分别为400 rpm和1.3 vvm，整个发酵过程溶氧不低于20%；发酵时间56 h。

技术总结
本发明公开了一种重组大肠杆菌及其构建方法和应用，所述重组大肠杆菌可用于L-苯丙氨酸的生产。本发明利用多轮诱变筛选对L-苯丙氨酸结构类似物具有高抗性，且具有酪氨酸营养缺陷型突变菌株，并以温敏型重组质粒形式调控L-苯丙氨酸合成途径中编码3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶和分支酸变位酶基因表达。本发明构建的重组大肠杆菌，在5 L发酵罐中，根据菌体生长阶段采取不同控温和补料方式，发酵时间为56 h条件下，L-苯丙氨酸产量在62 g/L，糖酸转化率为25.2%，具有工业化应用前景和价值。具有工业化应用前景和价值。具有工业化应用前景和价值。


技术研发人员：徐楠 刘立明 郭亮 刘佳
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2023/8/31