一种生防酿酒酵母BC1及其在葡萄病害防治及酿造中的应用

一种生防酿酒酵母bc1及其在葡萄病害防治及酿造中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物及葡萄酒生产技术领域，具体涉及一种生防酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)bc1及其在葡萄病害防治及酿造中的应用。


背景技术：

2.病理性病害在我国及世界多地的葡萄栽培区普遍发生，导致葡萄树势减退，生根能力和果实品质降低，直接影响葡萄产业的健康稳定发展。目前，国内外报道的葡萄相关病理性病害进40多种，主要包括真菌病害、细菌病害及病毒病害，其中真菌病害对葡萄影响较为普遍，常给葡萄生产带来严重损失，直接影响其产量及品质。
3.真菌病害在葡萄整个生长期、全株均可受到侵害，传染性极强，且发病后很难治愈。国内报道的真菌病害主要有霜霉病、褐斑病、褐枯病、黑痘病等，其在我国大多数省份均有发生。白腐病、蔓枯病、轮斑病、苦腐病及白纹羽病只在个别省份有分布。葡萄穗轴褐枯病病原菌为半知菌亚门葡萄生链格孢霉，主要危害葡萄幼嫩的花蕾、穗轴或幼果，使其萎缩、干枯，造成大量落花落果，高湿是其流行的主要原因，链格孢霉真菌引起病害发生对葡萄产量和品质影响很大，可产生真菌毒素，对人体身体健康造成安全隐患，在生产实践中对于链格孢菌的防治主要依靠于化学合成杀菌剂进行抑制，但长期使用杀菌剂使病原菌产生耐药性降低防治效果。
4.酵母为自然界已有的微生物，可从环境中分离而来，如根、土壤、海水和水果表面等。分离筛选具有拮抗作用酵母，需具有基因稳定、低浓度有效、对营养要求不苛刻、能够在不利环境条件下存活(包括低温/高温、氧化应激)、对人体健康不产生危害、广谱抗菌等特征(wilson et al.，1989)。在本技术领域中，人们考虑利用酵母“以菌治菌”抑制病原微生物的生长，通过一定的技术途径制成液体或固体制剂，喷洒、涂抹或浸泡果实，达到水果病害防治的目的。例如，中国专利申请号no.201710784123.2公开了一种
‘
一种生防酵母ga8及其应用’，该生防酵母制剂喷施在采后的葡萄上，可以对灰葡萄孢菌具有很强的拮抗作用，可用于葡萄采后灰霉病的防治；但是该生防酵母ga8仅针对灰霉病，且其生防菌剂的制备过程工艺复杂，因此筛选出制备简单、具有广谱抑菌特性酵母具有重要的现实和应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种生防酿酒酵母saccharomyces cerevisiae-bc1，它具有广谱抑菌特性，在酿酒葡萄鲜果病害防治中具有一定潜力且对葡萄酒酿造主成分及香气物质无不良影响。该生防酿酒酵母bc1对链格孢霉、扩展青霉、灰霉等均具有一定防治效果，喷洒该菌株后能够有效防治霉菌导致的酿酒葡萄病害，并且在后续葡萄酒酿造中可以增加葡萄酒的花果类香气，改善葡萄酒香气品质。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
7.一种生防酿酒酵母bc1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2022年11月7日，保藏编号为cgmcc no 26057；保藏地址： 北京朝阳区。所述生
防酿酒酵母bc1具有广谱抑菌性。
8.所述生防酿酒酵母bc1具有以下广谱抑菌性、耐酸性和生长活性：
[0009]-有效抑制链格孢菌、扩展青霉、灰霉的繁殖与生长；
[0010]-所述生防酵母bc1能够在ph3.5下生长；
[0011]-在40℃下保持良好生长活性；
[0012]-在h2o2浓度为20mmol/l下保持良好的生长活性。
[0013]
一种生防酿酒酵母bc1在葡萄病害防治中的应用。
[0014]
以浓度为0.5
×
107cells
·
ml-1
的生防酿酒酵母bc1的酵母菌发酵液或酵母菌悬液喷洒酿酒葡萄，用于有效减少由链格孢菌、扩展青霉或灰霉所引起的烂果数量。
[0015]
所述生防酿酒酵母bc1的酵母菌发酵液经液体培养基ypd恒温振荡培养24h制得；所述酵母菌悬液经4000r/min、5min离心、无菌水清洗3次制得。
[0016]
一种生防酿酒酵母bc1在葡萄酒酿造中的应用，包括如下步骤：
[0017]
1)使用生防酿酒酵母bc1溶液喷洒处理酿酒葡萄；
[0018]
2)接种生防酿酒酵母bc1进行发酵。
[0019]
步骤2)中，酿酒葡萄经破碎后取汁接种生防酿酒酵母bc1发酵；或
[0020]
酿酒葡萄喷施生防酿酒酵母bc1常温储藏1d破碎后接种商业酿酒酵母d254发酵。
[0021]
在步骤1)中，生防酿酒酵母bc1在30℃下培养24小时后，以1ml/斤浓度0.5
×
107cells
·
ml-1
喷洒处理酿酒葡萄，用于提升葡萄酒香气品质。
[0022]
所述酵母发酵后，得到的葡萄酒香气物质中，高级醇总量在211.64～255.62mg/l之间。
[0023]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0024]
本发明的生防酿酒酵母bc1对链格孢菌、扩展青霉及灰霉均具有良好的抑制效果，且酵母bc1对链格孢菌的抑制效果介于浓度10至100mg/ml对香豆酸甲酯抑菌效果之间。
[0025]
本发明的生防酿酒酵母bc1与常见商业酿酒酵母相比，耐氧化胁迫能力比商业酿酒酵母ec1118强，但低于商业酿酒酵母d254，耐高温性要强于商业酿酒酵母ec1118和d254。本发明的生防酿酒酵母bc1能够在40℃下保持良好生长活性；能够在ph3.5下生长；能够在h2o2浓度为20mmol/l下保持良好的生长活性。
[0026]
本发明的生防酿酒酵母bc1菌悬液及发酵液处理对酿酒葡萄病害有一定抑制作用，且对葡萄酒酿造主成分及香气物质无不良影响。
附图说明
[0027]
图1-1为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例对链格孢菌的抑制效果试验结果图，(其中a.空白对照组，b.d254，c.ceca，d.ec1118，e.bc1，f.a37，g.10％多抗霉素[从左至右、从上到下浓度依次为5、0.1、1、0.5mg/ml]，h.对香豆酸甲酯[从左至右、从上到下浓度依次为100、10、1、0.1mg/ml])；
[0028]
图1-2为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例对扩展青霉的抑制效果试验结果图，(其中a.空白对照组，b.d254，c.ceca，d.ec1118，e.bc1，f.a37)；
[0029]
图1-3为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例对灰霉的抑制效果试验结果图，(其中a.空白对照组，b.d254，c.ceca，d.ec1118，e.bc1，f.a37，g.对香豆酸甲酯[从上到下浓度
依次为100、50、25mg/ml])；
[0030]
图2a为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例耐酸胁迫试验结果柱状图；
[0031]
图2b为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例耐氧化胁迫试验结果柱状图；
[0032]
图2c为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例耐高温胁迫试验结果柱状图；
[0033]
图3a为本发明的生防酿酒酵母bc1处理抑制
‘
霞多丽’酿酒葡萄病害烂果率曲线图；
[0034]
图3b为本发明的生防酿酒酵母bc1处理抑制
‘
赤霞珠’酿酒葡萄病害烂果率曲线图；
[0035]
图4a为本发明的喷洒生防酿酒酵母bc1后再接种商业酿酒酵母的
‘
霞多丽’葡萄酒精发酵速率曲线图；
[0036]
图4b为
‘
霞多丽’酒精发酵结束后各试验组香气主成分分析图(oav＞0.1)；
[0037]
图4c为本发明的喷洒生防酿酒酵母bc1后再接种商业酿酒酵母的
‘
赤霞珠’葡萄酒精发酵速率曲线图；
[0038]
图4d为
‘
赤霞珠’酒精发酵结束后各试验组香气主成分分析图(oav＞0.1)；
[0039]
图5为本发明的生防酿酒酵母bc1的菌种形态图。
[0040]
其中的附图标记为：
[0041]
1边缘较透明、光滑2菌落呈现墨绿色
具体实施方式
[0042]
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
[0043]
本发明涉及的培养基成分组成如下：
[0044]
酵母营养培养基(ypd)：酵母浸粉10g/l；蛋白胨20g/l；葡萄糖20g/l；琼脂20g/l。
[0045]
本发明的生防酿酒酵母bc1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2022年11月7日，保藏编号为cgmcc no.26057。其菌种形态如图5所示。
[0046]
生防酿酒酵母bc1抑菌广谱性特性测定
[0047]
(1)链格孢菌
[0048]
研究表明对香豆酸甲酯能够有效地抑制链格孢菌的菌丝生长和孢子萌发，菌丝生长抑制率最高分别为69.2％，在低浓度(50和100μg/ml)时，对香豆酸甲酯对菌丝生长的抑制率较强。如图1-1所示，本发明以不同浓度对香豆酸甲酯及多抗霉素为阳性对照，无菌水处理为空白对照组，与常见商业酿酒酵母浓度为1mg/ml的d254、浓度为1mg/ml的ceca和浓度为0.5mg/ml的ec1118及前期经初步筛选具有一定生防效果浓度为100mg/ml的酵母菌a37对比研究浓度为100mg/ml的生防酿酒酵母bc1对链格孢菌抑菌效果。上述酵母菌接种于ypd液体培养基中活化，在摇床(30℃，220r/min)恒温振荡培养24h得酵母菌发酵液，4000r/min、5min离心，无菌水清洗3次，调整菌悬液浓度至1
×
107cells
·
ml-1
，在pda平板均匀涂布100μl浓度为1
×
105个/ml的链格孢菌病原菌孢子菌悬液，并在经病原菌涂布的pda固体培养基中间固定灭菌滤纸片，滤纸片的直径为6mm，加入10μl酵母菌悬液或对香豆酸甲酯，每个试验处理三个平行。
[0049]
(2)扩展青霉
[0050]
如图1-2所示，与常见商业酿酒酵母d254、ceca、ec1118及前期经初步筛选具有一
定生防效果的酵母菌a37对比研究酿酒酵母bc-1对扩展青霉抑菌效果，上述酵母菌接种于ypd液体培养基中活化，在摇床(30℃，220r/min)恒温振荡培养24h得酵母菌发酵液，4000r/min、5min离心，无菌水清洗3次，调整菌悬液至1
×
107cells
·
ml-1
，在pda平板均匀100μl涂布浓度为1
×
105个/ml的扩展青霉病原菌孢子菌悬液，中间固定灭菌滤纸片，滤纸片的直径为6mm，加入10μl酵母菌悬液，每个试验处理三个平行。
[0051]
(3)灰霉
[0052]
如图1-3所示，与常见商业酿酒酵母d254、ceca、ec1118对比研究酿酒酵母bc-1对扩展青霉抑菌效果，上述酵母菌接种于ypd液体培养基中活化，在摇床(30℃，220r/min)恒温振荡培养24h得酵母菌发酵液，4000r/min、5min离心，无菌水清洗3次，调整菌悬液至1
×
107cells
·
ml-1
，在pda平板均匀100μl涂布浓度为1
×
105个/ml的灰霉病原菌孢子菌悬液，中间固定灭菌滤纸片，滤纸片的直径为6mm，加入10μl酵母菌悬液，每个试验处理三个平行。
[0053]
图1-1为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例对链格孢菌的抑制效果试验结果图，(其中a.空白对照组，b.d254，c.ceca，d.ec1118，e.bc1，f.a37，g.10％多抗霉素[从左至右、从上到下浓度依次为5、0.1、1、0.5mg/ml]，h.对香豆酸甲酯[从左至右、从上到下浓度依次为100、10、1、0.1mg/ml])。
[0054]
图1-2为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例对扩展青霉的抑制效果试验结果图，(其中a.空白对照组，b.d254，c.ceca，d.ec1118，e.bc1，f.a37)。
[0055]
图1-3为本发明的生防酿酒酵母bc1及对比例对灰霉的抑制效果试验结果图，(其中a.空白对照组，b.d254，c.ceca，d.ec1118，e.bc1，f.a37，g.对香豆酸甲酯[从上到下浓度依次为100、50、25mg/ml])。
[0056]
试验结果如图1-1、图1-2和图1-3所示，表明本发明的生防酿酒酵母bc1对链格孢菌、扩展青霉及灰霉均具有良好的抑制效果，且生防酿酒酵母bc1对链格孢菌的抑制效果介于浓度10至100mg/ml对香豆酸甲酯抑菌效果之间。
[0057]
生防酿酒酵母bc1耐受性检测
[0058]
以商业酿酒酵母d254、ec1118为对照，具体检测方法如下。
[0059]
(1)耐酸胁迫：菌株经30℃，220r/min振荡培养24h后，经10000r/min离心5min，无菌水调整酵母菌悬液浓度至1
×
107cfu/ml，并以1％接种量接种于ph为2.5、3.5、5.5的ypd培养基中，恒温振荡培养24h后测定酵母菌波长600nm处吸光度。
[0060]
(2)耐氧化胁迫：ypd液体培养基扩培菌株，发酵温度30℃，220r/min振荡培养24h，经10 000r/min离心5min，无菌水调整酵母菌悬液浓度至1
×
107cfu/ml，并以1％接种量接种于含过氧化氢浓度0、10、20mmol/ml ypd培养基中，恒温振荡培养24h后测定酵母菌波长600nm处吸光度。
[0061]
(3)耐高温胁迫：酵母振荡培养24h，经10 000r/min离心5min，无菌水调整酵母菌悬液浓度至1
×
107cfu/ml。取1ml菌悬液至离心管中，置于30、35、40℃高温中30min，而后稀释均匀涂布于wln固体培养基上，30℃恒温培养3d计数。
[0062]
生防酿酒酵母bc1及商业酿酒酵母d254、ec1118的耐受性检测结果如表1及图2a、图2b、图2c所示。
[0063]
表1酵母耐受性检测
[0064][0065]
可见，不同酵母的生长随ph的升高呈现显著性差异，当ph为2.5时，不同酵母菌生长不存在显著性差异，受强酸抑制，细胞损伤，生长缓慢。ph提高至3.5时，生防酿酒酵母bc1生长良好，但生物量低于商业酿酒酵母ec1118、d254。
[0066]
当h2o2浓度为0、10、20mmol/l时，商业酿酒酵母d254与生防酿酒酵母bc1生长不存在显著变化，具有一定的耐氧化胁迫特性，酵母24h培养od值测定，商业酿酒酵母d254及生防酿酒酵母bc1在h2o2浓度为0-20mmol/l之间均可进行生长，具有一定耐氧化胁迫性能，商业酿酒酵母ec1118在h2o2浓度为10mmol/l以下正常生长，由此可得出生防酿酒酵母bc1具有一定耐氧化胁迫性能。
[0067]
高温处理生防酿酒酵母bc1生长不存在明显抑制作用，商业酿酒酵母ec1118在不同高温下处理处理在一定程度上生物量呈上升趋势，具有一定的耐高温特性，d254在35℃温度下生物量呈上升趋势，温度到达40℃时受高温胁迫，其生物量下降。酵母36h培养经稀释涂布计数，可知商业酿酒酵母ec1118和生防酿酒酵母bc1在40℃下，具有一定耐高温胁迫性能。
[0068]
以上结果表明，生防酿酒酵母bc1与常见商业酿酒酵母相比，耐氧化胁迫能力比商业酿酒酵母ec1118强，但低于d254，耐高温性要强于商业酿酒酵母ec1118和d254。
[0069]
生防酿酒酵母bc1对酿酒葡萄病害抑制试验
[0070]
选圆润饱满、无病害及损伤、大小均一、成熟度一致的葡萄(
‘
霞多丽’、
‘
赤霞珠’)作为试验果实。试验前将果实置于1％次氯酸钠溶液中浸泡1min后，用清水反复冲洗，室温晾干。链格孢菌孢子悬浮液浸泡果实1min，静置30min后将其分为三组，每组葡萄100个，分别用酵母菌悬液、发酵液进行喷洒处理，以无菌水喷洒作为空白对照(酵母bc1经液体培养基ypd恒温振荡培养24h得酵母菌发酵液；4000r/min、5min离心，无菌水清洗3次，得酵母菌悬液；蒸馏水经灭菌后得到无菌水)。常温常压条件下贮藏统计烂果率，每组试验处理三个平行，试验重复两次。
[0071]
生防酿酒酵母bc1对酿酒葡萄病害抑制试验的试验结果如表2及图3a、图3b所示，(图中，水：蒸馏水经灭菌后喷施处理，菌：酵母bc1经24h培养后无菌水洗涤喷施处理，发酵液：酵母经24h培养直接喷施处理)。
[0072]
表2生防酿酒酵母bc1对酿酒葡萄病害抑制试验
[0073][0074]
可见，
‘
霞多丽’葡萄常温25℃条件下储藏一周，随储藏天数的延长，烂果率随储藏天数的延长而升高，葡萄水处理烂果率＞菌悬液处理烂果率＞发酵液处理烂果率且储藏第
9d时经水处理的葡萄果实烂果率(64％)明显高于经喷施拮抗菌发酵液(26％)及菌悬液组(32％)烂果率。
[0075]
‘
赤霞珠’葡萄常温25℃条件下储藏两周，随储藏天数的延长，经水处理的葡萄果实烂果率(32％)随储藏时间延长明显上升，显著高于经喷施拮抗菌发酵液(6％)及菌悬液(7.5％)组烂果率。经拮抗菌发酵液处理组与经菌悬液处理组不存在显著性差异。
[0076]
以上结果表明生防酿酒酵母bc1菌悬液及发酵液处理对酿酒葡萄病害有一定抑制作用。
[0077]
生防酿酒酵母bc1对葡萄酒精发酵的影响
[0078]
由于该生防酿酒酵母bc1应用于酿酒葡萄采前病害防治，后续酿酒会引入葡萄酒，为进一步探究生防酿酒酵母bc1对喷洒后的葡萄酿造成葡萄酒的品质影响，本发明对酒精发酵后的葡萄酒理化及香气成分进行了检测。
[0079]
(1)生防酵母bc1对
‘
霞多丽’葡萄酒精发酵的影响
[0080]
以
‘
霞多丽’葡萄为原料，分别进行不同处理：(1)新鲜葡萄经破碎后取汁接种生防酿酒酵母bc1发酵(1-b)；(2)新鲜葡萄经破碎后取汁接种酿酒酵母d254发酵(1-d)；(3)新鲜葡萄喷施生防酿酒酵母bc1常温储藏1d破碎接种酿酒酵母d254发酵(1-bd)；共3组，如下表3，商业酿酒酵母d254为葡萄酒酿造常用酵母，通过比较1-b与1-d处理组，探究生防酿酒酵母bc1酒精发酵品质；2-bd处理组为应用生防酿酒菌bc1处理酿酒葡萄。通过比较2-bd与1-d处理组评价喷施生防酿酒酵母bc1对实际葡萄酒酿造的影响。每组试验设置三个生物学平行。各处理组葡萄经除梗、破碎加入果胶酶、亚硫酸低温澄清一天，取上清葡萄汁转入250ml锥形瓶，每瓶装有200ml葡萄汁，用硅胶塞和发酵栓封住瓶口。常温(18-20℃)静置发酵，对co2损失量进行检测至酒精发酵结束(连续两天co2损失量小于0.2g/100ml)，发酵结束后，样品低温4℃、1000r/min条件下离心10min，将收集发酵液于-20℃储藏，用于各指标测定。
[0081]
按照下述方法分析发酵液的主要代谢产物：
[0082]
发酵液过滤(pes，0.22μm)后，采用高效液相色谱hplc1200(agilent technologies,inc.paloalto,ca)进行发酵主要代谢产物分析。离子交换色谱柱为hpx-87h aminex ion-exchange column(300
×
7.8mm，美国bio-rad laboratories)，流动相为5mm的h2so4溶液，等度洗脱，流速0.6ml/min。
[0083]
葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的测定使用示差折光检测器(rid，refractive index detector，g1362a，美国agilent)，进样量为20μl，柱温45℃，分析时间30min；有机酸(酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸和乙酸)的测定采用二极管阵列检测器(dad，photodiode array detector，g1315d，美国agilent)，进样量为10μl，柱温60℃，分析时间25min。
[0084]
表3
‘
霞多丽’葡萄酒精发酵处理组
[0085]
接种方式组别简称接种生防酵母bc11-b接种商业酿酒酵母d2541-d喷施生防酵母bc1常温贮藏1d接d2542-bd
[0086]
(1)不同发酵方式下发酵速率曲线如图4a所示。
[0087]
本发明各试验组均可完成酒精发酵。处理组完成酒精发酵时间均早于自然发酵。1-b、1-d和2-bd组5天完成酒精发酵。1-b、1-d、2-bd组在第2d发酵速率达到最大(co2达到最
大损失量)。
[0088]
(2)酒精发酵结束后酒样的理化指标比较，见表4所示：
[0089]
表4
‘
霞多丽’酒精发酵结束后主要的理化指标
[0090][0091]
注：1-b指葡萄经破碎取汁接种酵母菌bc1发酵；1-d指葡萄经破碎取汁接种酿酒酵母d254发酵；2-bd指葡萄喷施酵母菌bc1常温储藏1d破碎取汁接种酿酒酵母d254发酵。表中数据：平均值
±
相对标准差，同一指标不同字母代表不同处理在p＜0.05水平上存在显著性差异。
[0092]
(2)酒精发酵结束后酒样主要挥发性香气成分种类和香气主成分的比较，如表5和图4b所示。
[0093]
表5
‘
霞多丽’各试验组酒精发酵后葡萄酒样的香气物质(oav值》0.1)
[0094]
[0095][0096]
注：1-b指葡萄经破碎取汁接种酵母菌bc1发酵；1-d指葡萄经破碎取汁接种酿酒酵母d254发酵；2-bd指葡萄喷施酵母菌bc1常温储藏1d破碎取汁接种酿酒酵母d254发酵。表中数据：平均值
±
相对标准差，同一指标不同字母代表不同处理在p＜0.05水平上存在显著性差异(含下划线为oav＞1)。
[0097]
如表4所示，酒精发酵结束后，各处理组葡萄糖和果糖的总量均降低到4g/l以下，葡萄糖(2.92～3.08g/l)，果糖(0.37～0.45g/l)，甘油(5.85～7.32g/l)，乙醇(7.32～7.95％)。甘油感官阈值为5.2g/l，最高可达25g/l，感官方面甘油赋予葡萄酒粘稠、甘甜的口感。各处理组酒精发酵结束所含甘油量均在可接受范围内。接种bc1处理组(1-b)酒精发酵结束后甘油含量显著高于接种d254处理组(1-d)，接种bc1在一定程度上增加葡萄酒柔润感；喷施bc1接种d254(2-bd)与接种d254处理组(1-d)相比，上述物质含量无显著变化，2-bd组甘油含量较低。
[0098]
在有机酸方面，主要测定六种有机酸柠檬酸(0.41～0.49g/l)，酒石酸(2.53～3.13g/l)，苹果酸(4.42～5.29g/l)，琥珀酸(3.19～4.02g/l)，乳酸(0.55～1.00g/l)和乙酸(0.22～0.35g/l)。葡萄酒酸度主要取决于有机酸的含量，适宜酸度对葡萄酒口感具有积极影响，同时与其他组分相作用共同提升葡萄酒品质。酒石酸、柠檬酸及苹果酸源于果实本身。酒石酸口感较为生硬、尖锐，在酿造过程中一般不被代谢。苹果酸主要贡献涩味与生青味，在苹乳发酵过程中苹果酸可转化为乳酸，使葡萄酒更加柔和细腻，减少酸涩感，柠檬酸口感清冽，带有果香味，适量柠檬酸可改善葡萄酒的风味。琥珀酸又名丁二酸，带有苦味，能
够赋予葡萄酒独特的醇厚感。乳酸是由丙酮酸在酵母l(+)和d(-)型乳酸脱氢酶催化下还原而生成，口感较柠檬酸、酒石酸温和，在苹乳发酵过程中，乳酸菌可将苹果酸转化为乳酸，增强了其口感的柔润性。乙酸又名醋酸，是酵母主要代谢产物之一，乙酸浓度0.2～0.7g/l时，对葡萄酒具有积极贡献，浓度过高时会给葡萄酒带来令人不快的酸味和辛辣味，各处理组均在适宜浓度范围内。1-b组与1-d组相比乙酸、柠檬酸含量较低，其余有机酸有所升高，苹果酸含量升高显著，加强葡萄酒涩味；2-bd组与1-d组相比，喷施后可显著提高乙酸含量，乳酸含量显著降低，在一定程度上降低了口感的柔润型。
[0099]
对不同处理方式的酒精发酵结束后酒样进行挥发性化合物的定性及定量检验，探究不同处理方式对霞多丽葡萄酒香气的影响。本试验共鉴定出59种挥发性物质，其中28种重要挥发性香气物质，包括16种高级醇、8种酯类、4种脂肪酸、3种其它类香气物质(香茅醇，壬醛及苯乙烯)，香气活性值(odour activity value，oav)常被用来评估某种物质对葡萄酒香气的贡献大小，其可以用香气物质的浓度与感官阈值的比值求得，对各试验组酒精发酵结束后oav大于0.1的物质进行主成分分析，见图4b、表5。
[0100]
高级醇是酵母发酵产生的次级代谢产物，可利用氨基酸为前体物质或糖代谢途径产生。其质量浓度低于300mg/l时可增加葡萄酒复杂性，超过400mg/l会产生令人不悦的气味，如脂肪味、溶剂味等。本试验各处理组测得高级醇总量在211.64～255.62mg/l之间，均位于较低浓度。根据高级醇浓度1-己醇(植物味)、异丁醇(植物味和化学味)、异戊醇(脂肪味和化学味)和苯乙醇(花香和甜香)是主要的高级醇，葡萄直接接种bc1(1-b)其1-己醇、异丁醇含量高于接种d254组(1-d)；接种d-254(1-d)其1-己醇、异丁醇含量高于喷施bc1接种d254(2-bd)，经喷施bc1降低了葡萄酒的生青、溶剂味。
[0101]
酯类物质可以给葡萄酒带来愉快的水果和花香特征。这些物质具有较低的嗅觉阈值，较低浓度便可显著改变葡萄酒感知，并许多酯的感知存在协同效应，其他物质存在可能突出或掩盖该酯的效应。本试验共检测到8种主要酯类物质。乙酸乙酯是酯类物质含量最高的物质之一，拥有怡人的果香和白兰地香，但当超过150mg/l时会产生不好的气味并引起葡萄酒的腐败变质，本试验各处理组含量低150mg/l，且oav均大于0.1，直接接种bc1或提前喷施bc1能够赋予葡萄酒果香。脂肪酸乙酯类物质，尤其是中链脂肪酸乙酯与其他的发酵香气成分(如高级醇、脂肪酸和乙酸酯)相比具有较低的嗅觉阈值，本试验乙酸己酯(苹果、樱桃等香气)辛酸乙酯(甜香、花香和果香)、丁酸乙酯(香蕉、草莓香气)和己酸乙酯(香蕉、青苹果香气)oav值均超过1，提前喷施bc1接种d254主要酯类物质含量均高于1-d组，酯类总量提高了约15％，有效提升葡萄酒中的香蕉、草莓等果香浓郁度，改善葡萄酒感官品质。
[0102]
脂肪酸给葡萄酒带来水果，奶酪，脂肪以及酸腐味，含量低于自身阈值时可以增加香气复杂性，高于阈值则产生负面影响。主要检测出4种酸类物质异丁酸(腐臭、奶酪味)、己酸(奶酪、脂肪味)、正癸酸(腐臭、脂肪味)和辛酸(腐臭、奶酪味)，直接接种d254异丁酸含量高于接种bc1，喷施bc1接种d254脂肪酸总量显著高于直接接种d254组，喷施处理后脂肪酸含量增加了约46％；
[0103]
除上述物质以外，本试验检测到oav大于0.1的壬醛(草本)及香茅醇(玫瑰)。其中接种bc1处理组赋予葡萄酒较强玫瑰及草本香，喷洒bc1处理后葡萄酒草本香提高。
[0104]
为更好展现各试验组香气物质的差异，将酒精发酵结束后oav＞0.1的香气物质进行主成分分析，见图4b，共15种oav＞0.1的香气物质，可得出两主成分的总贡献率85.1％，
其中pc1的贡献率为73.7％，pc2的贡献率为11.4％，1-d和2-bd位于第二象限，与乙酸己酯、癸酸、异戊醇的相关性强，1-b位于第四象限，与壬醛、香茅醇、异丁醇和1-己醇相关性强。通过主成分分析可以发现接种bc1处理与接种商业酿酒酵母d254位于不同象限，接种bc1主要与醇类物质相关性强，接种d254位于第二象限，两者存在显著差异；接种d254及喷施bc1接种d254两者皆位于第二象限，bc1处理对酒精发酵接种d254结束香气无明显影响。
[0105]
(2)生防酵母bc1对
‘
赤霞珠’葡萄酒精发酵的影响
[0106]
以
‘
赤霞珠’葡萄为原料，分别进行不同处理：(1)新鲜葡萄经破碎后接种生防酵母bc1发酵(1-b)；(2)新鲜葡萄经破碎后接种酿酒酵母d254发酵(1-d)；(3)新鲜葡萄喷施生防酿酒酵母bc1常温储藏1d破碎接种酿酒酵母d254发酵(1-bd)，共3组，如下表6，每组试验设置3个生物学平行。各处理组葡萄经除梗、破碎加入果胶酶、亚硫酸，转入250ml锥形瓶，每瓶装有300g葡萄汁，用硅胶塞和发酵栓封住瓶口。常温(20-25℃)静置发酵。每组试验设置3个生物学平行，对co2损失量进行检测至酒精发酵结束(连续两天co2损失量小于0.2g/100ml)，发酵结束后，样品低温4℃、1000r/min条件下离心10min，将收集发酵液于-20℃储藏，用于各指标测定。
[0107]
表6
‘
赤霞珠’葡萄酒精发酵处理组
[0108]
接种方式组别简称接种生防酵母bc11-b接种商业酿酒酵母d2541-d喷施生防酵母bc1常温贮藏1d接d2542-bd
[0109]
(1)不同发酵方式下发酵速率曲线如图4c所示。
[0110]
各处理发酵速率如图4c所示，各处理组均可完成酒精发酵(糖含量连续两天小于4g/l，co2损失量连续两天低于0.2g/ml)，经处理完成酒精发酵时间组均早于空白组未处理自然发酵。1-d和2-bd历时7天完成发酵，1-b历时8天完成发酵。在第2d时，各组co2达到最大损失量且其各处理之间co2损失量趋势大致相同。
[0111]
(2)酒精发酵结束后酒样的理化指标比较，见表7所示：
[0112]
表7
‘
赤霞珠’酒精发酵结束后主要的理化指标
[0113]
注：1-b指葡萄经破碎接种酵母菌bc1发酵；1-d指葡萄经破碎接种酿酒酵母d254发
酵；2-bd指葡萄喷施酵母菌bc1常温储藏1d破碎接种酿酒酵母d254发酵。
[0114]
(3)酒精发酵结束后酒样主要挥发性香气成分种类和香气主成分的比较，如表8和图4d所示。
[0115]
表8
‘
赤霞珠’酒精发酵结束主要香气物质含量(oav＞0.1)
[0116][0117]
注：1-b指葡萄经破碎接种酵母菌bc1发酵；1-d指葡萄经破碎接种酿酒酵母d254发酵；2-bd指葡萄喷施酵母菌bc1常温储藏1d破碎接种酿酒酵母d254发酵。表中数据：平均值
±
相对标准差，同一指标不同字母代表不同处理在p＜0.05水平上存在显著性差异(含下划线为oav＞1)。
[0118]
如表7所示，酒精发酵结束后，各处理组葡萄糖和果糖的总量均降低到2g/l以下，葡萄糖(0.75～0.85g/l)，果糖(0.39～0.58g/l)，甘油(9.39～9.85g/l)和乙醇(9.88～10.18％)。酒精发酵结束所含甘油量均在可接受范围内。接种bc1处理组(1-b)酒精发酵结束后葡萄糖、果糖含量显著低于接种d254处理组(1-d)，乙醇含量较高；喷洒bc1接种d254(2-bd)与接种d254处理组(1-d)相比，果糖、甘油含量较低，乙醇含量升高，葡萄酒柔润性降低。
[0119]
在有机酸方面，主要测定六种有机酸柠檬酸(1.40～1.52g/l)，酒石酸(2.44～4.49g/l)，苹果酸(4.95～5.34g/l)，琥珀酸(3.94～4.61g/l)，乳酸(0.27～0.54g/l)和乙
酸(0.42～0.58g/l)。1-b组酒石酸含量显著低于1-d处理组，苹果酸较高，接种bc1能够减少葡萄酒的尖锐、生硬口感，经苹乳发酵后赋予其柔润性；2-bd与1-d相比，酒石酸、琥珀酸和乳酸含量降低，柠檬酸、苹果酸和乙酸含量升高。
[0120]
对不同处理方式的酒精发酵结束后的酒样进行挥发性化合物的定性及定量检验，探究不同处理方式对
‘
赤霞珠’葡萄酒香气的影响。本试验共鉴定出58种挥发性物质，其中28种重要挥发性香气物质，包括10种高级醇、10种酯类、3种脂肪酸、2种其它类香气物质(苯乙烯及丁二酮)，具体含量见表8，对各试验组酒精发酵结束后oav大于0.1的物质进行主成分分析，见图4d。
[0121]
本试验中，高级醇是所有香气化合物中浓度最高的一类，共检测出4种oav值超过0.1的主要香气物质，分别为1-丙醇(酒精味、果香)、异戊醇(溶剂味、酒精、指甲油味)、苯乙醇(玫瑰、蜂蜜味)、异丁醇(酒精、溶剂、苦味)且质量浓度低于300mg/l。接种bc1(1-b)产苯乙醇含量低于接种d254(1-d)花香味降低；喷施bc1接种d254(2-bd)处理组1-己醇、异戊醇、苯乙醇含量均高于直接接种d254(1-d)组，经过bc1喷洒处理高级醇含量提升了约8.3％。
[0122]
本试验共检测到11种主要酯类物质。其中乙酸乙酯(菠萝、溶剂味)、乙酸异戊酯(香蕉)、己酸乙酯(香蕉、青苹果)、辛酸乙酯(甜香、花香和果香)、癸酸乙酯(果香)、月桂酸乙酯(油脂、水果味)、丁酸乙酯(香蕉、草莓味)为oav值超过0.1的主要香气物质。乙酸乙酯含量超过150mg/l时会产生不好的气味并引起葡萄酒的腐败变质，1-b、2-bd处理组乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、丁酸乙酯均含量显著高于1-d组，且乙酸乙酯含量未超过150mg/l，bc1处理有效提升葡萄酒香气复杂性，赋予葡萄酒果香及花香。
[0123]
脂肪酸主要检测出3种异丁酸、正癸酸和辛酸，各处理组辛酸含量均高于其阈值，其中0-n处理组含量较低，与其他处理组存在显著性差异。其中单独接种bc1与d254时辛酸不存在差异；喷施bc1后接种d254相比直接接种d254脂肪酸总量显著上升，喷施处理后脂肪酸总量增加了约19.5％。
[0124]
为更好展现各试验组香气物质的差异，将酒精发酵结束后14种oav＞0.1的香气物质进行主成分分析，见图4d，两个主成分的总贡献率74.4％，其中pc1的贡献率为46.6％，pc2的贡献率为27.8％，其中1-b位于第二象限，与癸酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、1-己醇和辛酸乙酯的相关性强，2-bd位于第三象限，与异戊醇、丁酸乙酯、乙酸乙酯、正癸酸、辛酸和乙酸异戊酯相关性强；1-d位于第四象限，与异丁醇、苯乙醇和异丁酸相关性强。通过主成分分析，接种d254与接种bc1主要香气物质位于不同象限，两者存在较大差异，接种bc1与多种花香类物质相关联，说明经bc1处理对果实香气做出了积极贡献；喷施bc1后接种d254相关性物质多余单独接种d254，说明喷施bc1处理可以有效改变葡萄酒香气轮廓从而提高香气复杂性。

技术特征：
1.一种生防酿酒酵母bc1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2022年11月7日，保藏编号为cgmcc no 26057；所述生防酿酒酵母bc1具有广谱抑菌性。2.根据权利要求1所述的生防酿酒酵母bc1，其特征在于，所述生防酿酒酵母bc1具有以下广谱抑菌性、耐酸性和生长活性：-有效抑制链格孢菌、扩展青霉、灰霉的繁殖与生长；-所述生防酵母bc1能够在ph3.5下生长；-在40℃下保持良好生长活性；-在h2o2浓度为20mmol/l下保持良好的生长活性。3.一种如权利要求1或2所述的生防酿酒酵母bc1在葡萄病害防治中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以浓度为0.5
×
107cells
·
ml-1
的生防酿酒酵母bc1的酵母菌发酵液或酵母菌悬液喷洒酿酒葡萄，用于有效减少由链格孢菌、扩展青霉或灰霉所引起的烂果数量。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生防酿酒酵母bc1的酵母菌发酵液经液体培养基ypd恒温振荡培养24h制得；所述酵母菌悬液经4000r/min、5min离心、无菌水清洗3次制得。6.一种如权利要求1或2所述的生防酿酒酵母bc1在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：该应用包括如下步骤：1)使用生防酿酒酵母bc1溶液喷洒处理酿酒葡萄；2)接种生防酿酒酵母bc1进行发酵。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中，酿酒葡萄经破碎后取汁接种生防酿酒酵母bc1发酵；或酿酒葡萄喷施生防酿酒酵母bc1常温储藏1d破碎后接种商业酿酒酵母d254发酵。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在步骤1)中，生防酿酒酵母bc1在30℃下培养24小时后，以1ml/斤浓度0.5
×
107cells
·
ml-1
喷洒处理酿酒葡萄，用于提升葡萄酒香气品质。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酵母发酵后，得到的葡萄酒香气物质中，高级醇总量在211.64～255.62mg/l之间。

技术总结
本发明涉及微生物及葡萄酒生产技术领域，具体涉及一种生防酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BC1及其在葡萄病害防治及酿造中的应用。该生防酿酒酵母BC1已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2022年11月7日，保藏编号为CGMCC No 26057。该生防酿酒酵母BC1对链格孢霉、扩展青霉、灰霉等均具有有效的防治效果，喷洒该菌株后能够有效防治霉菌导致的酿酒葡萄病害，并且在后续葡萄酒酿造中可以增加葡萄酒的花果类香气，改善葡萄酒香气品质。改善葡萄酒香气品质。改善葡萄酒香气品质。


技术研发人员：燕国梁 段长青 许菲艳
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2023.07.10
技术公布日：2023/8/31