一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法与流程

1.本发明涉及婴幼儿辅食米面制品检测技术领域，尤其涉及一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法。


背景技术：

2.美拉德反应是食品中羰基化合物和氨基化合物之间的自然反应，广泛存在于食品的热加工、贮藏及运输过程中，是形成食品香味物质的主要来源之一。研究表明食品在热加工或高温贮存过程中会发生美拉德反应，并产生糠氨酸、糠醛类化合物、丙烯酰胺等。其中糠醛类化合物主要由5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛4种化合物组成。在美拉德反应过程中，会造成了食品中部分氨基酸降解，并产生一些损害营养的物质，其中部分可能还有毒性。如5-羟甲基糠醛已被证实具有神经毒性，可通过吸入或皮肤接触进入人体，与人体蛋白质相结合产生蓄积而中毒。因此，美拉德反应产物的研究已成为食品研究的焦点之一。
3.目前检测食品中美拉德反应产物的方法有分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法等，其中分光光度法的前处理复杂，灵敏度较低，无法满足痕量分析需求；液相色谱-串联质谱法准确性高，但是仪器昂贵、成本高；气相色谱法需要柱前衍生化，操作烦琐；高效液相色谱法是最常用的仪器分析方法，被广泛应用于食品中有毒有害物质的分析检测。对于检测食品中的美拉德反应产物，文献多报道于检测乳制品、调味品、蜂王浆等食品，目前针对米面制品中美拉德反应产物的检测研较为少见。


技术实现要素：

4.为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种定量、准确、简便的高效液相色谱法同时测定婴幼儿辅食米面制品中的糠氨酸、5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、呋喃甲基酮、甲基糠醛6种美拉德反应产物，优化前处理和液相色谱条件，以填补婴幼儿辅食米面制品中美拉德反应产物检测的空白，为研究婴幼儿辅食米面制品加工、贮藏及运输过程中糠氨酸、呋喃酮及糠醛类物质产生规律，进而评价米面制品品质和新鲜度提供技术支撑。
5.为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，6种美拉德反应产物为糠氨酸、呋喃酮、5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛；该方法包括以下的步骤：1）样品前处理称取试样2g，精确至0.0001g，置于50ml离心管中，加入12ml水，涡旋混匀，超声提取30min，振荡20min；加入5ml0.15mol/l草酸溶液，振荡20min；加5ml40g/100ml三氯乙酸溶液，振荡10min，4000r/min离心5min，取上清液至25ml容量瓶；向剩余残渣加入5ml4g/100ml
的三氯乙酸溶液，涡旋混匀后振荡10min，4000r/min离心5min，合并上清液，加入4g/100ml三氯乙酸溶液定容至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜后，供高效液相色谱仪分析；2）色谱条件色谱柱：agilenteclipsexdb-c18，150mm
×
4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液梯度洗脱；柱温：30℃；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；进样量：5μl；所述的梯度洗脱程序如下：时间min乙腈%0.1%三氟乙酸溶液%019951991010901515852050502519930199
6.作为优选，10mg/ml标准储备溶液的制备方法如下：分别准确称取0.1000g，精确至0.1mg，糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛标准品，用水充分溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为10mg/ml的标准储备溶液；称取0.1000g，精确至0.1mg呋喃酮，用甲醇充分溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为10mg/ml的标准储备溶液，于4℃冷藏储存。
7.作为优选，100μg/ml混合标准中间液的制备方法如下：分别准确移取100μl上述各标准储备溶液，于10ml容量瓶中，加水定容，配制成浓度为100μg/ml混合标准中间液。
8.作为优选，标准工作溶液的制备方法如下：分别准确移取一定量的上述混合标准中间液，用水溶液溶解逐级稀释至0.2、0.4、0.8、2.0、4.0μg/ml糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛，0.4、0.8、1.6、4.0、8.0μg/ml呋喃酮，0.8、1.6、3.2、8.0、16μg/ml糠氨酸的系列标准工作溶液，1℃～4℃冰箱避光保存，有效期3个月。
9.作为优选，该方法还包括将配制好的系列标准工作溶液依次进入液相色谱检测，以质量浓度作为横坐标（x），峰面积作为纵坐标(y)进行线性回归，所得线性范围、线性方程、相关系数和定量限结果如下：化合物线性范围/(mg/l)线性方程相关系数定量限/(μg/100g)糠氨酸0.8-16.0y=0.0003x0.999510005-羟甲基糠醛0.2-4.0y=0.0008x0.9992250糠醛0.2-4.0y=0.0001x0.9992250呋喃酮0.4
–
8.0y=0.0003x0.9992500呋喃甲基酮0.2-4.0y=0.0007x0.9991250甲基糠醛0.2-4.0y=0.0009x0.9995250
10.作为优选，该方法还包括采用分别在不含有美拉德反应产物的空白面粉样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率和方法的精密度测定，糠氨酸的添加水平分别为1000、2000、10000μg/100g，5-羟甲基糠醛,糠醛,呋喃甲基酮，甲基糠醛的添加水平分别为250，500，2500μg/100g，呋喃酮的添加水平分别为500、1000、5000μg/100g，平行测定6次，计算加
标回收率及rsd；6种目标化合物的回收率范围为71.2%~100%，rsd(n=6)范围为0.9%~4.9%。
11.本发明由于采用了上述的技术方案，建立高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定婴幼儿辅食米面制品中糠氨酸、呋喃酮及4种糠醛类化合物（5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮、甲基糠醛）的方法。样品经水和草酸溶液提取、三氯乙酸沉淀蛋白后，采用eclipsexdb-c18色谱柱分离，以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液为流动相，以流速0.6ml/min进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。6种组分的线性范围为0.2~16.0mg/l，相关系数大于0.999，方法的定量限为250~1000μg/100g(s/n=10)。6种组分的回收率范围为71.2%~100%，相对标准偏差为0.9%~4.9%。该方法灵敏度高、分离度好，适用于婴幼儿辅食米面制品中美拉德反应产物的同时定量检测。
附图说明
12.图1为4种色谱柱对6种分析物分离效果的影响；a．eclipsexdb-c
18
；b.zorbaxsb-c
18
；c.eclipseplus-c
18
；d.thermoacclaim
tm
120-c
18
；色谱峰：1.糠氨酸；2.5-羟甲基糠醛；3.糠醛；4.呋喃酮；5.呋喃甲基酮；6.甲基糠。
13.图2为4种流动相对6种分析物分离效果的影响；a．乙腈-水；b.乙腈-0.1%三氟乙酸溶液；c.乙腈-0.5%三氟乙酸溶液；d.乙腈-1.0%三氟乙酸溶液；色谱峰：1.糠氨酸；2.5-羟甲基糠醛；3.糠醛；4.呋喃酮；5.呋喃甲基酮；6.甲基糠醛。
14.图3为标准溶液、空白面粉样品和添加回收的色谱图；a．标准溶液，b.空白样品，c.添加回收谱图；色谱峰：1.糠氨酸；2.5-羟甲基糠醛；3.糠醛；4.呋喃酮；5.呋喃甲基酮；6.甲基糠醛。
具体实施方式
15.实验部分1.1仪器、材料与试剂高效液相色谱仪（美国赛默飞公司，配有dad检测器）；p300h超声波清洗器（德国elmasonic公司）；multifugex1r高速冷冻离心机（美国thermo公司）；mms-3020恒温振荡仪（日本东京理化公司）；jj100b电子天平（美国双杰天平公司）；ae260电子天平（瑞士mettler toledo公司）；wh-861涡旋混匀器（太仓市华利达实验设备有限公司）；synergy185超纯水仪（美国millipore公司）；微孔过滤膜（0.45
µ
m，水相）；agilenteclipsexdb-c
18
（150mm
×
4.6mm，5μm）（美国安捷伦科技（中国）有限公司）；agilentzorbaxsb-c
18
（150mm
×
4.6mm，5μm）（美国安捷伦科技（中国）有限公司）；agilenteclipseplus-c
18
（150mm
×
3.0mm，3.5μm）（美国安捷伦科技（中国）有限公司）；thermoacclaim
tm
120-c
18
（150mm
×
4.6mm，5μm）（美国thermo公司）。
16.三氟乙酸（分析纯，浙江常青化工有限公司）；三氯乙酸（分析纯，浙江常青化工有限公司）；草酸（分析纯，浙江常青化工有限公司）；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。
17.标准品：糠氨酸（纯度99.7%）、糠醛（纯度99.7%），均购自bepure公司；5-羟甲基糠醛（纯度99.0%）、2-乙酰呋喃（纯度99.9%）、4-羟基-2,5-二甲基-3-（2h）呋喃酮）（纯度
99.7%）、5-甲基糠醛（纯度99.9%），均购自anpel公司；1.2标准溶液配置标准储备溶液（10mg/ml）：分别准确称取0.1000g（精确至0.1mg）糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛标准品，用水充分溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为10mg/ml的标准储备溶液；称取0.1000g（精确至0.1mg）呋喃酮，用甲醇充分溶解并定容至10ml容量瓶中，配制成浓度为10mg/ml的标准储备溶液，于4℃冷藏储存。
18.混合标准中间液(100μg/ml)：分别准确移取100μl上述各标准储备溶液，于10ml容量瓶中，加水定容，配制成浓度为100μg/ml混合标准中间液。
19.标准工作溶液：分别准确移取一定量的上述混合标准中间液，用水溶液溶解逐级稀释至0.2、0.4、0.8、2.0、4.0μg/ml（糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛），0.4、0.8、1.6、4.0、8.0μg/ml（呋喃酮），0.8、1.6、3.2、8.0、16μg/ml（糠氨酸）的系列标准工作溶液，1℃～4℃冰箱避光保存，有效期3个月。
20.样品前处理称取试样2g（精确至0.0001g）于50ml离心管中，加入12ml水，涡旋混匀，超声提取30min，振荡20min；加入5ml0.15mol/l草酸溶液，振荡20min；加5ml40g/100ml三氯乙酸溶液，振荡10min，4000r/min离心5min，取上清液至25ml容量瓶。向剩余残渣加入5ml4g/100ml的三氯乙酸溶液，涡旋混匀后振荡10min，4000r/min离心5min，合并上清液，加入4g/100ml三氯乙酸溶液定容至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45μm滤膜后，供高效液相色谱仪分析。
21.色谱条件色谱柱：agilenteclipsexdb-c
18
（150mm
×
4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液（梯度洗脱程序见表1）；柱温：30℃；流速：0.6ml/min；检测波长：280nm；进样量：5μl。
22.表1梯度洗脱程序时间（min）乙腈（%）0.1%三氟乙酸溶液（%）0199519910109015158520505025199301992.结果和讨论2.1提取条件的优化由于温度对美拉德反应产物的产生有很大的影响，因此本发明考察了前处理过程中水浴的温度和时间对回收率的影响。采用分别在4份空白样品中添加标准溶液的方法进行添加回收实验，分别考察了不同水浴温度30、60、80、100℃和水浴时间0、10、30、60min对6种化合物的水解提取实验，结果发现水浴加热会使不含目标化合物的空白样品中产生5-羟甲基糠醛，且随着水浴温度的升高和时间的增加，所产生的5-羟甲基糠醛含量会逐渐增加，但空白样品中未产生其他5种目标化合物，添加回收样品中6种目标化合物的回收率差异不显著。因此，本发明选择了提取过程中不进行水浴加热提取，采用常温超声振荡提取。
23.色谱柱的选择美拉德反应产物检测较常用的色谱柱为c
18
色谱柱。为了实现6种美拉德反应产物同时分离，本试验比较了eclipsexdb-c
18
、zorbaxsb-c
18
、eclipseplus-c
18
和acclaim
tm
120-c
18
柱的分离效果，结果表明，选用eclipsexdb-c
18
色谱柱时，在优化的梯度洗脱程序下，各组分均得到较好的分离，色谱峰形对称且尖锐（图1a）；选用zorbaxsb-c
18
和acclaim
tm
120-c
18
色谱柱时，各组分均能流出色谱柱，在色谱图上均显示色谱峰，但17min处两个色谱峰的分离度较差，未能实现基线分离，22min处的基线抬高，影响目标化合物的积分定量（图1b和图1d）；选用plus-c
18
色谱柱时，分析时间较短，各组分未能完全出峰，色谱图上只显示了5个色谱峰（图1c），在分析测定实际样品时，第1个色谱峰容易受到样品杂质的干扰。因此试验选择eclipsexdb-c
18
柱作为分析柱。
24.流动相的选择实验考察了不同流动相：乙腈-水、乙腈-0.1%三氟乙酸溶液、乙腈-0.5%三氟乙酸溶液和乙腈-1.0%三氟乙酸溶液对6种目标化合物的分离情况。结果表明，采用乙腈-水体系作为流动相时，糠氨酸出峰时间为2.25min，容易受样品中的杂质干扰,且7min处两个色谱峰的分离度较差，未能实现基线分离（图2a）。实验发现，在流动相中加入少量三氟乙酸，目标化合物的保留时间会相应的延长。选用乙腈-0.5%三氟乙酸溶液和乙腈-1.0%三氟乙酸溶液时，分别在13min和14min处的两个色谱峰的基线未完全分离（图2c和图2d），而当选用乙腈-0.1%三氟乙酸溶液时，6目标化合物的色谱峰形和分离度均达到最佳（图2b）。综合分离度、色谱峰形及分析时间等因素,试验选择乙腈-0.1%三氟乙酸溶液梯度作为流动相。
25.标准曲线、线性范围和定量限将10mg/ml的各种糠醛标准溶液依次稀释配制成质量浓度为0.2、0.4、0.8、2.0、4.0mg/l（糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛），0.4、0.8、1.6、4.0、8.0mg/l（呋喃酮），0.8、1.6、3.2、8.0、16mg/l（糠氨酸）的混合标准工作溶液，在优化的最佳色谱条件下，将配制好的系列标准溶液依次进入液相色谱检测，以质量浓度作为横坐标（x），峰面积作为纵坐标(y)进行线性回归，所得线性范围、线性方程、相关系数和定量限结果见表2。
26.表2各个化合物的线性范围、线性方程、相关系数、定量限化合物线性范围/(mg/l)线性方程相关系数定量限/(μg/100g)糠氨酸0.8-16.0y=0.0003x0.999510005-羟甲基糠醛0.2-4.0y=0.0008x0.9992250糠醛0.2-4.0y=0.0001x0.9992250呋喃酮0.4
–
8.0y=0.0003x0.9992500呋喃甲基酮0.2-4.0y=0.0007x0.9991250甲基糠醛0.2-4.0y=0.0009x0.99952502.5回收率采用分别在不含有美拉德反应产物的空白面粉样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率和方法的精密度测定，糠氨酸的添加水平分别为1000、2000、10000μg/100g，5-羟甲基糠醛,糠醛,呋喃甲基酮，甲基糠醛的添加水平分别为250，500，2500μg/100g，呋喃酮的添加水平分别为500、1000、5000μg/100g，平行测定6次，计算加标回收率及rsd，相关色谱图见图3，结果见表3。6种目标化合物的回收率范围为71.2%~100%，rsd(n=6)范围为0.9%~
4.9%。该回收率和精密度符合sante/12682/2019[30]的要求，能够满足婴幼儿辅食米面制品的分析要求，可用于日常分析的检测。
[0027]
表36种分析物在空白面粉样品中的加标回收率和相对标准偏差（n=6）
[0028]
2.6实际样品的测定为了考察本方法的有效性和实用性，应用所建立的方法对随机抽取的67份市售婴幼儿辅食米面制品样品（其中米粉12份、面条22份、饼干33份）中6种美拉德化合物进行检测。结果显示，2份饼干样品中检出5-羟甲基糠醛，含量分别为335μg/100g和436μg/100g，其他样品均未检出。

技术特征：
1.一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，6种美拉德反应产物为糠氨酸、呋喃酮、5-羟甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛；该方法包括以下的步骤：1）样品前处理称取试样2 g，精确至0.0001 g，置于50 ml离心管中，加入12 ml水，涡旋混匀，超声提取30 min，振荡20 min；加入5 ml 0.15 mol/l草酸溶液，振荡20 min；加5 ml 40 g/100ml三氯乙酸溶液，振荡10 min，4000 r/min离心5 min，取上清液至25 ml容量瓶；向剩余残渣加入5 ml 4 g/100ml的三氯乙酸溶液，涡旋混匀后振荡10 min，4000 r/min离心5 min，合并上清液，加入4 g/100ml三氯乙酸溶液定容至刻度，摇匀，取适量溶液过0.45 μm滤膜后，供高效液相色谱仪分析；2）色谱条件色谱柱：agilent eclipse xdb-c
18
，150 mm
×
4.6 mm，5 μm；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液梯度洗脱；柱温：30 ℃；流速：0.6 ml/min；检测波长：280 nm；进样量：5 μl；所述的梯度洗脱程序如下：时间min乙腈%0.1%三氟乙酸溶液%019951991010901515852050502519930199。2.根据权利要求1所述的一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，10 mg/ml标准储备溶液的制备方法如下：分别准确称取0.1000 g，精确至0.1 mg，糠氨酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛标准品，用水充分溶解并定容至10 ml容量瓶中，配制成浓度为10 mg/ml的标准储备溶液；称取0.1000 g，精确至0.1 mg呋喃酮，用甲醇充分溶解并定容至10 ml容量瓶中，配制成浓度为10 mg/ml的标准储备溶液，于4 ℃冷藏储存。3.根据权利要求2所述的一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，100 μg/ml混合标准中间液的制备方法如下：分别准确移取100 μl上述各标准储备溶液，于10 ml容量瓶中，加水定容，配制成浓度为100 μg/ml混合标准中间液。4.根据权利要求3所述的一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，标准工作溶液的制备方法如下：分别准确移取一定量的上述混合标准中间液，用水溶液溶解逐级稀释至0.2、0.4、0.8、2.0、4.0 μg/ml糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛，0.4、0.8、1.6、4.0、8.0 μg/ml呋喃酮，0.8、1.6、3.2、8.0、16 μg/ml糠氨酸的系列标准工作溶液，1℃～4℃冰箱避光保存，有效期3个月。5.根据权利要求4所述的一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，该方法还包括将配制好的系列标准工作溶液依次进入液相色谱检测，以
质量浓度作为横坐标（x），峰面积作为纵坐标(y)进行线性回归，所得线性范围、线性方程、相关系数和定量限结果如下：化合物线性范围/(mg/l)线性方程相关系数定量限/(μg/100g)糠氨酸0.8-16.0y=0.0003x0.999510005-羟甲基糠醛0.2-4.0y=0.0008x0.9992250糠醛0.2-4.0y=0.0001x0.9992250呋喃酮0.4
–
8.0y=0.0003x0.9992500呋喃甲基酮0.2-4.0y=0.0007x0.9991250甲基糠醛0.2-4.0y=0.0009x0.9995250。6.根据权利要求1所述的一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法，其特征在于，该方法还包括采用分别在不含有美拉德反应产物的空白面粉样品中添加标准溶液的方法进行添加回收率和方法的精密度测定，糠氨酸的添加水平分别为1000、2000、10000 μg/100g，5-羟甲基糠醛,糠醛,呋喃甲基酮，甲基糠醛的添加水平分别为250，500，2500 μg/100g，呋喃酮的添加水平分别为500、1000、5000 μg/100g，平行测定6次，计算加标回收率及rsd；6种目标化合物的回收率范围为71.2% ~ 100%，rsd (n=6)范围为0.9% ~ 4.9%。

技术总结
本发明涉及婴幼儿辅食米面制品检测技术领域，尤其涉及一种同时测定婴幼儿辅食米面制品中6种美拉德反应产物的方法。本发明样品经水和草酸溶液提取、三氯乙酸沉淀蛋白后，采用Eclipse XDB-C18色谱柱分离，以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液为流动相，以流速0.6 mL/min进行梯度洗脱，二极管阵列检测器检测，外标法定量。6种组分的线性范围为0.2~16.0 mg/L，相关系数大于0.999，方法的定量限为250~1000μg/100g(S/N=10)。6种组分的回收率范围为71.2%~100%，相对标准偏差为0.9%~4.9%。该方法灵敏度高、分离度好，适用于婴幼儿辅食米面制品中美拉德反应产物的同时定量检测。产物的同时定量检测。产物的同时定量检测。


技术研发人员：张雅琴 张文华 侯建波 祝泽龙 赵非 毛壬熠 胡晓莉 徐欣 徐敦明
受保护的技术使用者：浙江省检验检疫科学技术研究院
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/8/31