用于肝内胆管癌FGFR2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法和检测试剂盒与流程

用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法和检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于肿瘤的靶向检测领域，具体涉及用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，肝内胆管癌的检测试剂盒，和用于扩增fgfr2基因框内缺失突变位点的引物探针，及其在制备诊断肝内胆管癌的检测试剂盒中的应用。


背景技术：

2.胆管癌（cholangiocarcinoma, cca）是除了肝细胞癌之外发生率最高的原发性肝脏恶性肿瘤，根据其解剖位置的不同分为肝外胆管癌、肝内胆管癌和肝门部胆管癌。近年来，肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, icc）的发病率逐年升高，据流行病学预测，在未来的20-30年间，icc的发病数量将达到现在的10倍之多。但由于icc发病隐匿，多数患者在初诊时就已经是晚期，丧失了手术机会，而常规的系统性治疗方法对患者获益甚微，因此迫切需要从肝内胆管癌的发病机制出发寻找新的治疗方法和治疗策略。
3.2020年美国食品药品监督管理局(fda)批准了fgfr选择性抑制剂pemigatinib用于治疗携带fgfr2（纤维细胞生长因子受体2）重排的局部晚期或转移性胆管癌患者，该药也于2022年在中国获批上市。作为首个获批应用于胆管癌治疗的靶向药物，pemigatinib的成功上市开启了靶向治疗胆管癌的新纪元。既往对胆管癌中fgfr2基因变异的研究主要集中在基因融合/重排中。文献报道，fgfr2基因融合主要富集于icc而鲜少发生于肝外和肝门部胆管癌，且fgfr2融合基因的引入可以诱导正常的小鼠肝脏发生胆管癌，证明fgfr2基因融合/重排是icc的重要发病机制之一。除了基因融合/重排(fusion/translocation)之外，点突变（site mutation）、基因扩增(amplification)、框内缺失(in-frame deletion)、截断突变(truncated deletion)等多种变异形式都可导致基因的功能性获得，从而将正常的基因转变为驱动性致癌基因。但迄今为止，在icc中对除了重排之外的fgfr2其它变异体研究甚少。
4.2022年4月，来自哈佛大学医学院的研究者首次提出发生在fgfr2胞外结构域的短片段框内缺失(extracellular domain in-frame deletions ，eids)也是导致icc发生的驱动因素。并尝试将口服fgfr选择性抑制剂debio 1347应用于三名携带fgfr2 eids但丧失手术机会的icc患者，后期的影像学数据证明三名患者在使用了debio 1347一段时间后均获得了疾病的部分缓解。其中一名患者在口服debio 1347一段时间后发生了fgfr2 l618f耐药位点的突变，继续使用二代tki抑制剂futibatinib后又获得了17个月的部分缓解。这一结果证明fgfr2 eids的发生不仅在发育过程中会导致一系列的遗传性疾病，同时强调了在肿瘤发生过程中的致癌性驱动作用和应用靶向药物的前景。携带fgfr2 eids患者对于fgfr抑制剂良好的反应性大大拓展了胆管癌靶向治疗的应用范围并为临床针对fgfr2ome亚型肿瘤进行靶向治疗提供了依据。
5.肝内胆管癌的治疗方法非常有限，fgfr2基因融合是目前被批准的可以用于靶向治疗的位点之一。除了基因融合之外，fgfr2基因框内短片段缺失也可望成为治疗靶点。精准治疗的前提是精准的检测，通过多中心泛癌种的研究显示，虽然fgfr2基因短片段缺失在
id no. 9依次的比例为5:5:5:4:4:4:4:4:4，在进行pcr反应时，mix1的总量为2-5ul；mix2中9个探针seq id no.10至 seq id no. 18依次的比例为5:5:5:4:4:4:4:4:4，在进行pcr反应时，mix2的总量为4.3ul；mix3中6个探针seq id no.19至 seq id no. 24依次的比例为4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix3的总量为2.8ul；mix4中6个探针seq id no.25至 seq id no. 30依次的比例为 4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix4的总量为2.1ul；mix5中6个探针seq id no.31至 seq id no. 36依次的比例为4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix6的总量为2.7ul；mix6中3个探针seq id no.37至 seq id no. 39依次的比例为1:1:1，在进行pcr反应时，mix6的总量为1.7ul。
12.表1 fgfr2框内缺失突变引物探针序列表
13.表2 pcr扩增体系的反应液
14.表3 pcr扩增反应的程序
15.本发明还公开了一种用于扩增fgfr2基因框内缺失突变位点的引物探针在制备诊断肝内胆管癌的检测试剂盒中的应用，包括针对fgfr2基因缺失突变位点的引物探针，所述引物探针的序列包括seq id no.01
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seq id no.39。所述fgfr2基因框内缺失突变的位点包括：fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del，p.p286_k292 del，p.p170_k176del，p.l258_g271del，p.n631_m640del，p.i288_d304 del，p.e489del， p.p263_a266del，p.k545del，p.q285_d304 del，p.i548wfs*8，p.v280_k292del。
16.本发明还公开了一种肝内胆管癌的检测试剂盒，所述试剂盒中含有检测fgfr2基因框内缺失突变的引物探针，所述引物探针检测fgfr2基因的13个缺失突变位点。所述fgfr2基因的13个缺失突变位点包括：fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del，p.p286_k292 del，p.p170_k176del，p.l258_g271del，p.n631_m640del，p.i288_d304 del，p.e489del， p.p263_a266del，p.k545del，p.q285_d304 del，p.i548wfs*8，p.v280_k292del。
17.本发明的有益效果为：本发明通过汇总来自南京鼓楼医院的研究数据、数据库的数据、以及多中心泛癌
种的研究数据，确定了肝内胆管癌中fgfr2基因框内缺失突变的位点以及发生频率。同时筛选了13个发生频率最高的fgfr2框内缺失突变位点，设计了多重荧光检测探针，在制备诊断肝内胆管癌的检测试剂盒中的应用。以肝内胆管癌中fgfr2基因框内缺失突变作为检测标志物能够指导临床靶向治疗，具有首创性。
附图说明
18.图1 来自南京鼓楼医院的283例肝内胆管癌中fgfr2基因变异图谱，其中3例为fgfr2基因点突变，1例框内缺失突变和1例移码突变。
19.图2 来自公共数据库的1534例肝内胆管癌中fgfr2基因变异图谱，其中8例为fgfr2框内缺失突变。
20.图3来自多中心的共91129例泛肿瘤样本中fgfr2框内缺失突变在各癌种中的发生频率及发生位置示意图。
21.图4 7例肝内胆管癌组织样本的多重荧光pcr结果。
实施方式
22.下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
23.我们前期在来自南京鼓楼医院的283例肝内胆管癌（icc）样本中运用二代测序的方法检测了fgfr2基因框内缺失突变。共检测到3名患者携带fgfr2点突变（fgfr2 r203c, p253r, c382r）及2名患者携带fgfr2框内缺失突变或截短突变，位点为p.k545del和p.i548wfs*8，如图1所示。
24.我们从公共数据库中收集了10个研究中的1534名icc患者，以调查icc中fgfr2突变类型的分布情况。共发现了36名患者（2.33%，36/1534）中的38个fgfr2基因突变(不包括融合突变)。我们将38个变异位点做成了示意图，如图2所示，包括错义突变、框内缺失突变、移码或截短突变。其中8例为fgfr2缺失突变，包括框内缺失（h167_n173del（3例），s282_n297del，v280_k292del和p286_k292del）和单氨基酸缺失（v233del和h624del）。
25.我们使用了来自北京吉因加和至本的多中心研究数据集分析了fgfr2基因内的短缺失突变。这个研究数据集搜集了中国各地的91129名肿瘤患者样本，用二代测序检测了肿瘤的基因变异情况。将携带有fgfr2基因框内缺失突变的病例进行汇总，发现总共有31个患有11种不同类型的肿瘤的患者被发现带有fgfr2基因的短缺失突变，图3展示了31个病例的发生癌种，在癌种中的发生频率及其发生位置。与其他肿瘤相比，icc患者中有最高比例（0.62%, 7/1122）的患者出现了fgfr2基因缺失突变，其次是肺鳞癌（0.53%, 5/945）和子宫内膜癌（0.53%, 1/188）。这些缺失突变分布广泛，从外显子4到外显子17在不同的肿瘤类型中有出现。在icc中，框内缺失突变主要发生在外显子7中，最主要的突变是i288-d304del和l285-d304del。
26.在汇总了来自南京鼓楼医院、数据库以及多中心的研究数据后，我们选取了13个fgfr2基因框内缺失突变位点，其为fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del， p.p286_k292 del，p.p170_k176del，p.l258_g271del，p.n631_m640del，p.i288_d304 del，p.e489del，p.p263_a266del，p.k545del，p.q285_d304 del，p.i548wfs*8，p.v280_
k292del，设计多重荧光定量pcr引物。具体的引物核苷酸序列见表1。其中seq id no.1和seq id no.2为扩增fgfr2 p.a97_g103 del的引物序列，seq id no.3为fam通道的引物序列；seq id no.4和 seq id no.5为扩增p.h167_n173del的引物序列， seq id no.6为rox通道的引物序列；seq id no.7和seq id no.8为扩增p.p286_k292 del的引物序列，seq id no.9为cy5通道的引物序列；我们同时将seq id no.1
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seq id no.9的所有引物置于mix1中用于同时观察fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del和p.p286_k292 del这三个位点的扩增情况。seq id no.10和seq id no.11为扩增p.p170_k176del的引物序列，seq id no.12为fam通道的引物序列；seq id no.13和seq id no.14为扩增p.l258_g271del的引物序列，seq id no.15为rox通道的引物序列；seq id no.16和seq id no.17为扩增p.n631_m640del的引物序列，seq id no.18为cy5通道的引物序列；我们同时将seq id no.10
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seq id no.18的所有引物置于mix2中用于同时观察p.p170_k176del, p.l258_g271del和p.n631_m640del这三个位点的扩增情况。seq id no.19和 seq id no.20为扩增p.i288_d304 del的引物序列，seq id no.21为rox通道的引物序列；seq id no.22和seq id no.23为扩增p.e489del的引物序列，seq id no.24为cy5通道的引物序列；我们同时将seq id no.19
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seq id no.24的所有引物置于mix3中用于同时观察fgfr2 p.i288_d304 del和p.e489del这二个位点的扩增情况。seq id no.25和seq id no.26为扩增fgfr2 p.p263_a266del的引物序列，seq id no.27为fam通道的引物序列；seq id no.28和 seq id no.29为扩增p.i548wfs*8的引物序列，seq id no.30为rox通道的引物序列；我们同时将seq id no.25
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seq id no.30的所有引物置于mix4中用于同时观察fgfr2 p.p263_a266del和p.i548wfs*8这二个位点的扩增情况。seq id no.31和seq id no.32为扩增fgfr2 p.k545del的引物序列，seq id no.33为rox通道的引物序列；seq id no.34和seq id no.35为扩增p.q285_d304 del的引物序列，seq id no.36为fam通道的引物序列；我们同时将seq id no.31
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seq id no.36的所有引物置于mix5中用于同时观察fgfr2 p.k545del和p.q285_d304 del这二个位点的扩增情况。seq id no.37和seq id no.38为扩增fgfr2 p.v280_k292del的引物序列，seq id no.39为fam通道的引物序列；我们同时将seq id no.37
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seq id no.39的所有引物置于mix6中用于观察fgfr2 p.v280_k292del这个位点的扩增情况。
实施例1
27.在设计好引物序列后，我们选取了7例已经二代测序验证的样本进行了基于该肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测试剂盒的检测。这7例样本均来自于南京鼓楼医院病理科，样本仅病理诊断均为肝内胆管癌，样本名称为3ts-1.5，3t3-2.5，3t3-3.5，3ts-4.5，3t3-5.5，3t3-6.5，3t3-7.5。将这7例石蜡包埋组织样本切成5um的切片，每例样本10张，脱蜡后，提取dna。本发明对所述提取dna的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取方法即可。在本发明实施例中，用qiaamp dna ffpe tissue kit提取基因组dna。样本及提取后的核酸信息见表4。
28.表4.样本及核酸信息
29.提取基因组dna后，配置多重荧光pcr反应液（引物探针混合液）；引物探针混合液包括mix1-mix6，mix1中9个探针seq id no.01至 seq id no. 9依次的比例为5:5:5:4:4:4:4:4:4，在进行pcr反应时，mix1的总量为2-5ul；mix2中9个探针seq id no.10至 seq id no. 18依次的比例为5:5:5:4:4:4:4:4:4，在进行pcr反应时，mix2的总量为4.3ul；mix3中6个探针seq id no.19至 seq id no. 24依次的比例为4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix3的总量为2.8ul；mix4中6个探针seq id no.25至 seq id no. 30依次的比例为 4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix4的总量为2.1ul；mix5中6个探针seq id no.31至 seq id no. 36依次的比例为4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix6的总量为2.7ul；mix6中3个探针seq id no.37至 seq id no. 39依次的比例为1:1:1，在进行pcr反应时，mix6的总量为1.7ul。本实验使用罗氏480进行多重荧光pcr反应，其反应的程序见表3，具体为：50℃ 5min，95℃预变性5min；94℃ 10s，64℃ 30s，5个循环；94℃ 10s，64℃ 31s，35个循环，在35个循环结束后采集荧光信号。
30.最后通过荧光信号判断fgfr2框内缺失突变的位点。图4展示了7例样本的检测结果，a-g的样本名称分别为3ts-1.5，3t3-2.5，3t3-3.5，3ts-4.5，3t3-5.5，3t3-6.5，3t3-7.5。如图4中的c、d所示，在本次实验中3t3-3.5检测到了fgfr2 p.h167_n173del位点突变，3ts-4.5检测到了fgfr2 p.i288_d304 del位点突变，其余5例样本未检测到fgfr2基因相关位点框内缺失突变。在检测结果图中m2和m8起跳的曲线代表为阳性扩增曲线，其余曲线为内参扩增曲线。具体检测结果见图4。
31.需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于扩增fgfr2基因框内缺失突变位点的引物探针在制备诊断肝内胆管癌的检测试剂盒中的应用，其特征在于，包括针对fgfr2基因缺失突变位点的引物探针，所述引物探针的序列包括seq id no.01
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seq id no.39。2.根据权利要求1所述的一种用于扩增fgfr2基因框内缺失突变位点的引物探针在制备诊断肝内胆管癌的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述fgfr2基因框内缺失突变的位点包括：fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del，p.p286_k292 del，p.p170_k176del，p.l258_g271del，p.n631_m640del，p.i288_d304 del，p.e489del， p.p263_a266del，p.k545del，p.q285_d304 del，p.i548wfs*8，p.v280_k292del。3.一种肝内胆管癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测fgfr2基因框内缺失突变的引物探针，所述引物探针检测fgfr2基因的13个缺失突变位点。4.根据权利要求3所述的一种肝内胆管癌的检测试剂盒，其特征在于，所述fgfr2基因的13个缺失突变位点包括：fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del，p.p286_k292 del，p.p170_k176del，p.l258_g271del，p.n631_m640del，p.i288_d304 del，p.e489del， p.p263_a266del，p.k545del，p.q285_d304 del，p.i548wfs*8，p.v280_k292del。5.一种用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将肝内胆管癌中发生频率较高的fgfr2框内短片段缺失突变位点构成一个集合；（2）据突变位点的位置及碱基特征设计引物探针，引物探针核苷酸序列包括seq id no.01
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seq id no.39；（3）配置引物探针混合液；（4）提取肝内胆管癌组织样本的基因组dna；配置pcr扩增体系；进行pcr扩增反应，多重荧光定量检测。6.根据权利要求5所述的一种用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，其特征在于，步骤（1）中，集合包括了：fgfr2 p.a97_g103 del，p.h167_n173del，p.p286_k292 del，p.p170_k176del，p.l258_g271del，p.n631_m640del，p.i288_d304 del，p.e489del，p.p263_a266del，p.k545del，p.q285_d304 del，p.i548wfs*8，p.v280_k292del共13个位点。7.根据权利要求5所述的一种用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，其特征在于，步骤（3）中，引物探针混合液包括mix1-mix6，mix1中9个探针seq id no.01至 seq id no. 9依次的比例为5:5:5:4:4:4:4:4:4，在进行pcr反应时，mix1的总量为2-5ul；mix2中9个探针seq id no.10至 seq id no. 18依次的比例为5:5:5:4:4:4:4:4:4，在进行pcr反应时，mix2的总量为4.3ul；mix3中6个探针seq id no.19至 seq id no. 24依次的比例为4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix3的总量为2.8ul；mix4中6个探针seq id no.25至 seq id no. 30依次的比例为 4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix4的总量为2.1ul；mix5中6个探针seq id no.31至 seq id no. 36依次的比例为4:4:4:3:3:3，在进行pcr反应时，mix6的总量为2.7ul；mix6中3个探针seq id no.37至 seq id no. 39依次的比例为1:1:1，在进行pcr反应时，mix6的总量为1.7ul 。8.根据权利要求5所述的一种用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，其特征在于，步骤（4）中，pcr扩增反应的程序为50℃ 5min， 95℃预变性5min；
94℃ 10s，64℃ 30s，5个循环；94℃ 10s，64℃ 31s，35个循环。9.根据权利要求5所述的一种用于肝内胆管癌fgfr2基因框内缺失突变的多重荧光定量检测方法，其特征在于，步骤（4）中，pcr扩增体系的反应液包括pcr buffer、引物探针混合液、taq酶反应液、样本和纯化水。

技术总结
胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）恶性程度高，治疗方法有限，根据其解剖位置的不同分为肝外胆管癌、肝内胆管癌和肝门部胆管癌；FGFR2基因融合在肝内胆管癌中相对富集，且针对FGFR2基因融合的药物Pemigatinib是少数已经获批的胆管癌靶向治疗的药物之一；除了FGFR2基因融合，近年来的研究发现FGFR2框内缺失突变在肝内胆管癌中也相对富集并且可以作为靶向治疗的位点，但是目前除了二代测序之外并没有关于FGFR2基因的多种荧光定量的检测方法；本发明为了解决二代测序价格昂贵耗时长且判读困难等缺点，特将扩增FGFR2基因框内缺失突变位点包括：FGFR2 p.A97_G103 del，p.H167_N173del，p.P286_K292 del，p.P170_K176del，p.L258_G271del，p.N631_M640del，p.I288_D304 del，p.E489del，p.P263_A266del，p.K545del，p.Q285_D304 del，p.I548Wfs*8，p.V280_K292del的引物探针制备于一个试剂盒中，简单、快捷、价格低廉，适用于在临床检测。适用于在临床检测。适用于在临床检测。


技术研发人员：濮晓红 陈骏 祁良 李琳 付尧 刘彬彬 陈绍宇
受保护的技术使用者：南京鼓楼医院
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/31