一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料及其制备方法

1.本发明属于水凝胶敷料技术领域，具体涉及一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料及其制备方法。


背景技术：

2.创面细菌感染是常见的慢性伤口并发症，除了给病人造成痛苦与不适外，还有可能会引起毒血症和感染性休克，严重时甚至会引起死亡。为了应对细菌感染，长期使用抗生素进行治疗，非常容易产生耐药细菌。因此，探索科学有效的新型抗菌策略应对耐药细菌创面感染具有重要意义。
3.水凝胶由天然或合成的聚合物分子链交联而成的三维网状结构的材料，通常含有较高的含水量，并具有良好的润湿性，可以为干燥结痂的伤口长期补充水分，介导伤口的水合作用，避免敷料因伤口的干燥而发生粘连，因此被认为是治疗创面的理想敷料。然而，现有已被商业化并广泛应用的水凝胶敷料功能较为单一，大多只能调节伤口愈合的一两个特定阶段。
4.因此，开发一种新型的能够有效调节创面各个阶段愈合的多功能伤口敷料就显得尤为重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料及其制备方法。该水凝胶敷料具有高效止血性、抗菌能力、促进细胞粘附、增殖、迁移和组织重塑能力的多功能，可实现在耐药细菌创面的多通路管理。
6.本发明首先是将丙烯酸甲酯(ma)与二乙烯三胺(deta)通过迈克尔加成反应和酰胺化反应制备超支化阳离子聚合物抗菌剂(h-pamam)，将h-pamam修饰甲基丙烯酰化透明质酸(hama)得到的hama-h-pamam作为大分子交联剂，与丙烯酸羟乙酯(hea)共聚制备得到含有阳离子聚合物水凝胶的多功能敷料(hea-hama-h-pamam)。其中酶促氧化偶联反应能够在短时间内产生h2o2和
·
oh，通过创面快速原位聚合成型起到屏障作用，实现良好的止血功能。h2o2和
·
oh还可以与h-pamam协同作用通过多重抗菌机制高效杀灭耐药细菌，并能避免耐药细菌的产生，同时起到了缓解创面炎症，促进血管新生的作用。透明质酸具有调节细胞渗透压、促进细胞修复的重要生理功能。本发明所述的hea-hama-h-pamam多功能敷料能够在伤口愈合的不同阶段均有调节作用，以实现耐甲氧西林金色葡萄球菌(mrsa)感染创面的一体化治疗，全面促进伤口愈合。
7.为实现上述目的，本发明所述的一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料的制备方法，其步骤如下：
8.步骤(1)透明质酸大分子交联剂(hama-h-pamam)的制备
9.称取0.003～0.004mol二乙烯三胺溶于6～7ml甲醇中，随后将终浓度为0.20～0.30mol％的丙烯酸甲酯滴入，在冰水浴中氮气气氛下反应1～3h，再在20～30℃下加热40
～50min；随后将终浓度为0.05～0.06mol％丙烯酸甲酯滴入该反应体系，在冰水浴中氮气气氛下反应1～3h，再在20～30℃加热40～50min得到粗产物；将粗产物在35～45℃下真空脱除甲醇溶剂，收集黄色粘性产物并用乙醚清洗3～5次，室温真空干燥得到超支化阳离子聚合物抗菌剂(h-pamam)；
10.将0.7～1g透明质酸(mw＝10000da)置于100ml去离子水(di-water)中，搅拌使其完全溶解；然后，向其中滴加0.25～0.4g甲基丙烯酸酐，保持温度为4℃和ph为8～9搅拌过夜；随后将所得溶液转移到透析袋中(mw＝1000da)，用去离子水透析2～4天；最后，收集透析袋内产物并冷冻干燥，将得到的冻干粉末在室温下加入到去离子水中搅拌至完全溶解，冻干粉末的浓度为5～10％w/w，得到甲基丙烯酰化透明质酸(hama)溶液；
11.向得到的hama溶液中加入终浓度为0.04～0.06mol/l的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和终浓度为0.04～0.06mol/l的n-羟基丁二酰亚胺，再加入终浓度为4～6％w/w的h-pamam，在室温下搅拌20～30小时；随后将溶液转移到透析袋中(mw＝1000da)，用去离子水透析2～4天；最后，收集透析袋内产物并冷冻干燥，得到透明质酸大分子交联剂(hama-h-pamam)；
12.步骤(2)多功能水凝胶敷料的制备
13.将丙烯酸羟乙酯(hea)和hama-h-pamam溶解于1ml、20mg/ml的葡萄糖溶液中，丙烯酸羟乙酯(hea)的终浓度为0.2mol/l，hama-h-pamam的终浓度为5％w/w；再向该溶液中加入1mg抗坏血酸钠和1μl、10mg/ml血红素的n,n-二甲基甲酰胺溶液，最后加入2mg葡萄糖氧化酶，快速震荡混匀后将其倒在3mm培养皿上，40s～60s即可快速成型，得到本发明所述的多功能水凝胶敷料(hea-hama-h-pamam)。
14.本发明所述的一种新型多功能水凝胶敷料，其是由上述方法制备得到。
15.本发明所述的应用方法为：将步骤(2)加入葡萄糖氧化酶后的溶液迅速震荡混合，倾倒于感染创面上即可，一日一次。
附图说明
16.图1为本发明实施例1制备的抗菌水凝胶敷料凝胶化前后的照片；
17.图2为本发明实施例1得到的hea-hama-h-pamam水凝胶敷料对金黄色葡萄球菌(s.aureus)的抑制效果对比图。
18.图3为本发明实施例1得到的hea-hama-h-pamam水凝胶敷料对大肠杆菌(e.coli)的抑制效果对比图。
19.图4为本发明实施例1得到的hea-hama-h-pamam水凝胶敷料对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的抑制效果对比图。
20.图5为本发明实施例1得到的hea-hama-h-pamam水凝胶敷料与金色葡萄球菌共孵育后诱导30代后杀菌率柱形图。
21.图6为本发明实施例1得到的hea-hama-h-pamam水凝胶敷料对耐药细菌感染创口愈合情况照片。
22.图7为本发明实施例1得到的hea-hama-h-pamam水凝胶敷料通过imagej软件量化伤口区域面积形成耐药细菌感染创口区域变化率(wound)随时间变化柱形图。
23.图8为本发明实施例1中小鼠组织切片的he染色实验结果照片。
24.图9为本发明实施例1中小鼠组织切片的马松染色实验结果照片。
具体实施方式
25.以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明并不局限于此。
26.实施例1：新型多功能水凝胶敷料的制备
27.步骤(1)透明质酸大分子交联剂(hama-h-pamam)的制备
28.在三颈烧瓶中，称取0.0035mol二乙烯三胺溶于6.25ml甲醇中，随后将终浓度为0.25mol％的丙烯酸甲酯滴入，在冰水浴中氮气气氛下反应2h，再在25℃下加热45min；随后将终浓度为0.0575mol％丙烯酸甲酯滴入该反应体系，在冰水浴中氮气气氛下反应2h，再在25℃加热45min得到粗产物；将粗产物用旋转蒸发器在40℃下真空脱除甲醇溶剂，收集黄色粘性产物并用乙醚清洗3次，室温真空干燥得到超支化阳离子聚合物抗菌剂(h-pamam)3.5g。
29.将0.806g透明质酸(mw＝10000da)置于100ml去离子水(di-water)中，搅拌使其完全溶解；然后，向其中滴加0.308g甲基丙烯酸酐，保持温度为4℃和ph为8.5搅拌过夜；随后将所得溶液转移到透析袋中(mw＝1000da)，用去离子水透析3天；最后，收集透析袋内产物并用冷冻干燥机冷冻干燥，将得到的冻干粉末在室温下加入到去离子水中搅拌至完全溶解，冻干粉末的浓度为5％w/w，得到甲基丙烯酰化透明质酸(hama)溶液；
30.向得到的hama溶液中加入终浓度为0.05mol/l的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和终浓度为0.05mol/l的n-羟基丁二酰亚胺，再加入终浓度为5％w/w的h-pamam，在室温下搅拌24小时；随后将溶液转移到透析袋中(mw＝1000da)，用去离子水透析3天；最后，收集透析袋内产物并冷冻干燥，得到透明质酸大分子交联剂(hama-h-pamam)0.732g。
31.步骤(2)多功能水凝胶敷料的制备
32.将丙烯酸羟乙酯(hea)和hama-h-pamam溶解于1ml、20mg/ml的葡萄糖溶液中，丙烯酸羟乙酯(hea)的终浓度为20％w/w，hama-h-pamam的终浓度为5％w/w；再向该溶液中加入1mg抗坏血酸钠和1μl、10mg/ml血红素的n,n-二甲基甲酰胺溶液，最后加入2mg葡萄糖氧化酶，快速震荡混匀后将其倒在3mm培养皿上，45s即可快速成型，得到本发明所述的多功能水凝胶敷料(hea-hama-h-pamam)。
33.如图1所示。该抗菌水凝胶敷料在未形成凝胶前(左图)为无色透明溶液，凝胶化后(after gelation)得到的是一种柔软的无色透明凝胶(hea-hama-h-pamam，右图)。
34.如图2、图3、图4所示，凝胶与细菌共孵育后(右图)与共孵育前(左图)相比，出现了明显的抑菌效果，并无菌落形成。
35.如图5所示，抗菌水凝胶敷料(syc)仍然有92％的杀菌率，证明抗菌水凝胶敷料可以避免新型耐药细菌的产生。
36.如图6和图7所示，在第14天对照组(con，未使用酶促氧化偶联反应和未使用树突状聚合物-h-pamam修饰的hama)伤口闭合率为50％，在制备过程中未使用酶促氧化偶联反应组(pho)和在制备过程中未使用树突状聚合物-h-pamam修饰的hama组(bio)的伤口闭合率分别为80％与90％，而本发明所述的新型多功能水凝胶敷料(syc)组几乎达到了100％，证明在酶促氧化偶联反应与h-pamam协同作用下显著促进创面愈合。
37.如图8所示，第5天可以发现con组表现出高于其他三组的淋巴细胞浸润，这说明对
照组(con)炎症反应最为强烈，而水凝胶处理组淋巴细胞数量均明显减少，炎症水平得到有效控制。在第10天，syc组的上皮组织和棘皮明显增厚。表皮与真皮紧密相连，这些现象在第14更加明显。syc组真皮中毛囊、皮脂腺较多，这有利于皮肤组织功能的恢复。
38.如图9所示，可以观察到第7天con组显示较少胶原纤维束。而第7天syc处理组胶原纤维增厚，排列整齐。第14天，各组均观察到胶原沉积和组织再生。syc组胶原沉积物最丰富，分布最为均匀。

技术特征：
1.一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料的制备方法，其步骤如下：(1)透明质酸大分子交联剂hama-h-pamam的制备称取0.003～0.004mol二乙烯三胺溶于6～7ml甲醇中，随后将终浓度为0.20～0.30mol％的丙烯酸甲酯滴入，在冰水浴中氮气气氛下反应1～3h，再在20～30℃下加热40～50min；随后将终浓度为0.05～0.06mol％丙烯酸甲酯滴入该反应体系，在冰水浴中氮气气氛下反应1～3h，再在20～30℃加热40～50min得到粗产物；将粗产物在35～45℃下真空脱除甲醇溶剂，收集黄色粘性产物并用乙醚清洗3～5次，室温真空干燥得到超支化阳离子聚合物抗菌剂h-pamam；将0.7～1g透明质酸置于100ml去离子水中，搅拌使其完全溶解；然后，向其中滴加0.25～0.4g甲基丙烯酸酐，保持温度为4℃和ph为8～9搅拌过夜；随后将所得溶液转移到透析袋中，用去离子水透析2～4天；最后，收集透析袋内产物并冷冻干燥，将得到的冻干粉末在室温下加入到去离子水中搅拌至完全溶解，冻干粉末的浓度为5～10％w/w，得到甲基丙烯酰化透明质酸hama溶液；向得到的hama溶液中加入终浓度为0.04～0.06mol/l的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和终浓度为0.04～0.06mol/l的n-羟基丁二酰亚胺，再加入终浓度为4～6％w/w的h-pamam，在室温下搅拌20～30小时；随后将溶液转移到透析袋中，用去离子水透析2～4天；最后，收集透析袋内产物并冷冻干燥，得到透明质酸大分子交联剂hama-h-pamam；(2)多功能水凝胶敷料的制备将丙烯酸羟乙酯hea和hama-h-pamam溶解于1ml、20mg/ml的葡萄糖溶液中，丙烯酸羟乙酯hea的终浓度为0.2mol/l，hama-h-pamam的终浓度为5％w/w；再向该溶液中加入1mg抗坏血酸钠和1μl、10mg/ml血红素的n,n-二甲基甲酰胺溶液，最后加入2mg葡萄糖氧化酶，快速震荡混匀后将其倒在培养皿上，40s～60s快速成型，得到所述的多功能水凝胶敷料hea-hama-h-pamam。2.如权利要求1所述的一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：透明质酸的mw＝10000da。3.如权利要求1所述的一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于：透析袋的mw＝1000da。4.一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料，其特征在于：是由权利要求1～3任何一项所述的方法制备得到。

技术总结
一种应用于创面细菌感染的多功能水凝胶敷料及其制备方法，属于水凝胶敷料技术领域。是将丙烯酸甲酯与二乙烯三胺通过迈克尔加成反应和酰胺化反应制备超支化阳离子聚合物抗菌剂h-PAMAM，将h-PAMAM修饰甲基丙烯酰化透明质酸HAMA得到的HAMA-h-PAMAM作为大分子交联剂，与丙烯酸羟乙酯HEA共聚制备得到的多功能敷料HEA-HAMA-h-PAMAM。本发明制备的多功能敷料能够在伤口愈合的不同阶段均有调节作用，以实现耐甲氧西林金色葡萄球菌(MRSA)感染创面的一体化治疗，全面促进伤口愈合。具有高效止血性、抗菌能力、促进细胞粘附、增殖、迁移和组织重塑能力的多功能，可实现在耐药细菌创面的多通路管理。多通路管理。多通路管理。


技术研发人员：汤钧 金冠甬 吕枭枭 姜拓豪
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/5