一种用于类风湿关节炎的诊断标志物及其检测芯片和应用

1.本发明属于疾病诊断技术领域，具体涉及一种用于类风湿关节炎的诊断标志物及其检测芯片和应用。


背景技术：

2.类风湿关节炎(ra)是一种以滑膜炎和进行性关节破坏为特征的自身免疫性疾病。抗环瓜氨酸多肽/瓜氨酸蛋白抗体(anti-ccp/acpa)和类风湿因子(rf)是目前在ra中应用的具有高效诊断能力的生物标志物。然而，acpa阴性ra患者仍因诊断和治疗的延误而导致病情进展，新型诊断性自身抗体的筛选对于提高ra的早期诊断和及时治疗至关重要，尤其是对于acpa阴性及rf阴性的ra。
3.大约三分之一的ra患者为acpa阴性。除了rf和acpas外，在ra血清中还存在多种自身抗体，然而这些抗体是否对诊断ra患者具有特异性(包括acpa阴性ra患者和rf阴性ra患者)还未有相关报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于类风湿关节炎的诊断标志物，通过筛选得到存在于ra疾病发生早期或acpa阴性患者中特异性抗体作为诊断标志物来提高类风湿关节炎的诊断准确性。
5.本发明提供了一种用于类风湿关节炎的诊断标志物，包括以下至少一种抗体：
6.抗anapc15抗体、抗lsp1抗体、抗apbb1抗体、抗副胸腺素抗体和抗ubl7抗体。
7.本发明提供了一种用于诊断类风湿关节炎的免疫芯片，所述免疫芯片包被有所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原。
8.优选的，所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原经过gst标记。
9.本发明提供了一种用于诊断类风湿关节炎的试剂盒，包括所述免疫芯片和标记物修饰的抗人igg抗体。
10.优选的，所述标记物修饰的抗人igg抗体中标记物包括荧光染料：alexa-647和cy5中的一种。
11.优选的，还包括阳性标准品：
12.所述阳性标准品包括小鼠抗gst抗体和标记物修饰的抗小鼠igg抗体。
13.本发明提供了所述免疫芯片在制备诊断类风湿关节炎的试剂盒中的应用。
14.优选的，所述免疫芯片联合以下一种或几种制备诊断类风湿关节炎的试剂盒：标记物修饰的抗人igg抗体、小鼠抗gst抗体和标记物修饰的抗小鼠igg抗体。
15.本发明提供了抗副胸腺素抗体在制备防治骨侵蚀的药物中的应用。
16.本发明提供了抗副胸腺素抗体在制备诊断骨侵蚀或骨侵蚀预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
17.本发明提供了一种用于类风湿关节炎的诊断标志物，包括以下至少一种抗体：抗
anapc15抗体、抗lsp1抗体、抗apbb1抗体、抗副胸腺素抗体和抗ubl7抗体。本发明使用huprot阵列进行了ra自身抗体筛查，经过初步筛选和后续验证，确定5种ra的潜在诊断标志是在疾病早期和acpa阴性患者中表达。
18.本发明还提供了用于诊断类风湿关节炎的免疫芯片，所述免疫芯片阵列式包被有所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原。本发明基于上述方案提供的类类风湿关节炎的特异性抗体作为诊断标志物，利用抗原抗体特异性结合的性质，对待测血清中目标抗体进行检测。本发明提供的免疫芯片操作简便，且可高通量、高效率、高准确性地完成诊断标志物的检测，具有成本低，检测快速的特点，适合市场推广应用。
附图说明
19.图1为芯片的线性相关性和再现性结果；
20.图2为kegg(kyoto encyclopedia ofgenes and genomes)分析51个抗原的信号传导通路；
21.图3为lsp1(bc001785.1)的荧光强度的厢式图；
22.图4为ptms(nm_002824)的荧光强度的厢式图；
23.图5为anapc15(nm_014042)的荧光强度的厢式图；
24.图6为apbb1(nm_145689)的荧光强度的厢式图；
25.图7为ubl7(nm_032907)的荧光强度的厢式图；
26.注：ra表示类风湿关节炎，oa表示骨关节炎，sle表示系统性红斑狼疮，pss表示原发性干燥综合征，spa表示血清阴性脊柱关节炎，hc表示健康对照，control表示对照；
27.图8为5种自身抗体与ra临床特点的关系；热图展示了5种自身抗体与ra临床及免疫学特征的相关分析结果，填充颜色代表相关系数r值大小；负相关表示为蓝色，正相关表示为红色；**p《0.01，*p《0.05；5个抗体包括：anti-anapc15(nm_014042)，anti-lsp1(bc001785.1)，anti-apbb1(nm_145689)，anti-ptms(nm_002824)和anti-ubl7(nm_032907)。
具体实施方式
28.本发明提供了一种用于类风湿关节炎的诊断标志物，包括以下至少一种抗体：抗anapc15抗体、抗lsp1抗体、抗apbb1抗体、抗副胸腺素抗体和抗ubl7抗体。
29.在本发明中，所述诊断标志物是从51种疾病相关的自身抗原中筛选得到，涉及的上述5种抗体具有抗原特异性强、抗原敏感度高的特点，敏感性在39.6％～46.2％之间，特异性在90％～95％之间，保证了诊断的准确性。所述诊断标志物中一种抗体即可诊断类风湿关节炎是否发病，而2种或多种抗体联合诊断，增加了诊断的阳性率。
30.本发明提供了一种用于诊断类风湿关节炎的免疫芯片，所述免疫芯片阵列式包被有所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原。
31.在本发明中，所述抗原优选为重组表达的抗原。所述抗原的种类优选包括以下：anapc15(nm_014042)、lsp1(bc001785.1)、apbb1(nm_145689)、副胸腺素(parathymosin，ptms，nm_002824)(nm_002824)和ubl7(nm_032907)。
32.在本发明中，所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原优选经过gst标记。所述
gst的编码基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述gst的氨基酸序列如seq id no:2所示。所述标记的方法优选委托北京华大蛋白质研发中心公司完成。
33.本发明对所述免疫芯片的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的免疫芯片的制备方法即可，例如将重组表达的标记抗原经包被液溶解滴加到芯片上，洗涤，封闭，再次洗涤和干燥，真空包装得到。在本发明实施例中，所述免疫芯片委托北京华大蛋白质研发中心公司完成。
34.本发明提供了一种用于诊断类风湿关节炎的试剂盒，包括所述免疫芯片和标记物修饰的抗人igg抗体。
35.在本发明中，所述标记物修饰的抗人igg抗体中标记物优选包括各种荧光染料，如af-647或cy5。
36.在本发明中，所述试剂盒还包括阳性标准品。所述阳性标准品优选包括小鼠抗gst抗体和标记物修饰的抗小鼠igg抗体。
37.在本发明中，所述试剂盒的检测原理优选如下：将待检测血清或经过稀释后的血清滴加到所述免疫芯片上，待测血清中目标抗体与包被的抗原特异性反应，再添加标记物修饰的抗人igg抗体后，形成包被抗原-目标抗体-标记物修饰的抗人igg抗体三元复合物，检测标记物的信号后，与阳性标准品的检测信号相同，判断待测血清可能为患类风湿关节炎患者，结合其他医学检测指标综合判断。
38.本发明提供了所述免疫芯片在制备诊断类风湿关节炎的试剂盒中的应用。
39.在本发明中，所述免疫芯片优选联合以下一种或几种制备诊断类风湿关节炎的试剂盒：标记物修饰的抗人igg抗体、小鼠抗gst抗体和标记物修饰的抗小鼠igg抗体。
40.本发明提供了抗副胸腺素(ptms)抗体在制备防治骨侵蚀的药物中的应用。
41.本发明提供了抗副胸腺素抗体在制备诊断骨侵蚀或骨侵蚀预后评估的试剂或试剂盒中的应用。
42.在本发明中，采用spearman相关性分析方法分别分析上述5种诊断标志物与临床相关性，结果表明，抗副胸腺素抗体与疾病活动评分28(das28)、肿胀关节计数相关，提示抗副胸腺素抗体可能参与了ra炎症的发病过程。抗副胸腺素抗体与关节x线进展呈负相关，提示可能对ra骨侵蚀起保护作用，用于骨侵蚀结局的预测。
43.下面结合实施例对本发明提供的一种用于类风湿关节炎的诊断标志物及其检测芯片和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
44.实施例1
45.在i期研究中，19,275个人类蛋白质组蛋白(huprot)中有51个被鉴定为与ra血清igg反应。
46.人类蛋白质组微阵列(huprot
tm
)v3.1芯片：由约19,275个全长人类蛋白质组成，由cdi公司构建。这个微阵列包含48个模块，以25
×
32的阵列布局排列。每个样品2个重复，对照探针包括空白缓冲液、人igg、人igm、生物素标记bsa、bsa、gst(谷胱甘肽巯基转移酶)。所有重组人蛋白均由酿酒酵母表达系统表达，并带有n端gst(seq id no:1)标记。采用小鼠抗gst抗体和抗小鼠igg抗体检测芯片质量。
47.huprot
tm
(human proteome microarray v3.1,cdi labs,mayaguez,pr)包含超过19,275个完整的单独纯化的人类蛋白质，覆盖蛋白质组的75％以上。简单地说，在室温下用
封闭溶液(5％bsa/tbs-t)封闭huprot
tm
阵列1小时，然后在4℃下用血清样本(稀释1:1000)检测过夜。然后用1
×
tbs-t清洗阵列3次，每次10分钟，用alexa-647标记抗人igg(jackson immuno research,west grove,pa)在室温下检测1小时，然后用1
×
tbs-t清洗三次，每次10分钟，然后旋转至干燥，然后扫描。在genepix 4200a微阵列扫描仪(axon instruments)上扫描幻灯片。为了识别huprot
tm
阵列上的阳性样本，两个重复的蛋白质点必须一致，但不存在于空白或仅含有二抗的对照中。
48.结果：
49.在i期研究中，招募了10名处于疾病早期(病程小于2年)的ra患者。10例ra包括5例抗ccp阳性和5例抗ccp阴性。这些ra患者的血清在含有19,275个人类蛋白质的高通量蛋白质组微阵列上进行了筛选(huprot
tm
，cdi laboratories,usa)，用健康人3例的血清作为对照。直方图、密度图和并行检验表明，芯片的线性相关性和再现性良好(图1)。51个ra相关候选自身抗原的自身抗体经p值《0.05和倍变》1.3鉴定(见表1)。
50.为了明确被ra自身抗体识别的51个自身抗原的潜在生物学通路，我们进行了kegg富集分析(见表2)。富集的最显著的2条通路是“内质网蛋白加工”和“代谢通路”(图2)。结果提示这些ra自身抗体可能干预了这两种生物学过程，并参与了ra的发病。
51.表1 51种抗原列表
[0052][0053]
表2 51个抗原的kegg通路分析
[0054][0055][0056]
实施例3
[0057]
一种免疫芯片的制备方法和检测方法
[0058]
1.融合蛋白的制备方法
[0059]
选择实施例1中51个自身抗原，并且在各抗原编码基因的n端连接gst编码基因(seq id no:2)，经过基因合成，得到51种gst-抗原融合蛋白的编码基因。将得到的51种gst-抗原融合蛋白的编码基因经酵母酵母菌重组表达，分离和纯化重组蛋白，得到gst-抗原融合蛋白，具体操作委托北京华大蛋白质研发中心公司完成。
[0060]
2.免疫芯片的制备和检测方法
[0061]
在室温下用封闭溶液(含5％bsa的tbs-t溶液)封闭huprot
tm
/定制芯片1小时，然后在4℃下用血清样本(稀释1:1000)检测过夜。然后用1
×
tbs-t清洗阵列3次，每次10分钟，加入荧光染料alexa-647标记的抗人igg(jackson immunoresearch,west grove,pa)在室温下孵育1小时，然后用1
×
tbs-t清洗三次，每次10分钟，然后旋转至干燥，然后扫描。同时还进行阳性标准品的检测，用小鼠抗gst抗体滴加到芯片中孵育，洗涤，再滴加荧光染料alexa-647标记抗小鼠igg孵育，洗涤。在genepix 4200a微阵列扫描仪(axon instruments)上扫描芯片，并对原始genepixarray list文件进行比对。芯片阵列上的点样蛋白都有重复(双复孔)。这51个候选抗原都是单独读取数值。
[0062]
anapc15(nm_014042)、lsp1(bc001785.1)、apbb1(nm_145689)、副胸腺素(parathymosin，ptms，nm_002824)(nm_002824)和ubl7(nm_032907)的检测结果见图3～图7。
[0063]
实施例3
[0064]
非修饰蛋白抗原(non-ampas)作为ra诊断标志物的筛选方法
[0065]
在ii期研究中，51个选择的自身抗原经人工合成后经过包被液稀释以阵列式点样在实施例2制备的免疫芯片中，具体委托北京华大蛋白质研发中心公司完成。待验证人群包括182名ra患者和261名对照组(103名健康对照组和158名疾病对照组)(人群信息见表3)。采用实施例2中的方法检测待测人群的血清。
[0066]
曲线下面积(auc)值在0.7至0.9之间被认为具有良好的鉴别能力。auc大于0.7的自身抗体有22个(见表4)。其中抗chac2(nm_001008708)、抗anapc15(nm_014042)、抗gde1(nm_016641)、抗tsr2(nm_058163)、抗ccdc32(nm_052849)、抗rdh16(nm_003708)、抗extl3(nm_001440)诊断特异性均高于90％。roc分析得出auc值为0.713-0.755(见表4)。抗anapc15抗体(nm_014042)被认为是最特异性的1个ra诊断生物标志物(敏感性为41.8％，特异性为91.5％，见表4)。
[0067]
同时，表4数据可知，抗anapc15抗体、抗lsp1抗体、抗apbb1抗体、抗副胸腺素抗体和抗ubl7抗体均能够检测出acpa阴性ra患者，并且抗anapc15抗体的检出率最高达到20.8％。这表明本发明提供的上述5种自身抗体不仅具有较高的敏感性和特异性，还可用于acpa阴性ra患者的诊断中。
[0068]
表3筛选人群信息
[0069][0070]
表4 22种抗原敏感性及特异性
[0071]
[0072][0073]
实施例4
[0074]
具有代表性的非修饰蛋白抗原(non-ampas)的临床相关性
[0075]
采用spearman对上述筛选的5种acpa阴性ra高特异性自身抗体与非ampas的临床症状做相关性分析。
[0076]
图8分析总结了5种acpa阴性ra高特异性自身抗体的临床意义。结果表明，5种自身抗体均与红细胞沉降率(esr)、igg、类风湿因子(rf)呈正相关。抗副胸腺素(nm_002824)抗体与疾病活动评分28(das28)、肿胀关节计数相关(r＝0.170，p＝0.031，r＝0.184，p＝0.020)，提示抗副胸腺素抗体可能参与了ra炎症的发病过程。
[0077]
同时，抗副胸腺素抗体与关节x线进展呈负相关(sharp-van derheijde评分，r＝-0.175，p＝0.047)，提示可能对ra骨侵蚀起保护作用，用于骨侵蚀结局的预测。
[0078]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用于类风湿关节炎的诊断标志物，其特征在于，包括以下至少一种抗体：抗anapc15抗体、抗lsp1抗体、抗apbb1抗体、抗副胸腺素抗体和抗ubl7抗体。2.一种用于诊断类风湿关节炎的免疫芯片，其特征在于，所述免疫芯片阵列式包被有权利要求1所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原。3.根据权利要求2所述用于诊断类风湿关节炎的免疫芯片，其特征在于，所述诊断标志物中的抗体特异性识别的抗原经过gst标记。4.一种用于诊断类风湿关节炎的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述免疫芯片和标记物修饰的抗人igg抗体。5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述标记物修饰的抗人igg抗体中标记物包括荧光染料、鬼笔环肽和花菁染料中的一种。6.根据权利要求4或5所述试剂盒，其特征在于，还包括阳性标准品：所述阳性标准品包括小鼠抗gst抗体和标记物修饰的抗小鼠igg抗体。7.权利要求2或3所述免疫芯片在制备诊断类风湿关节炎的试剂盒中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述免疫芯片联合以下一种或几种制备诊断类风湿关节炎的试剂盒：标记物修饰的抗人igg抗体、小鼠抗gst抗体和标记物修饰的抗小鼠igg抗体。9.抗副胸腺素抗体在制备防治骨侵蚀的药物中的应用。10.抗副胸腺素抗体在制备诊断骨侵蚀或骨侵蚀预后评估的试剂或试剂盒中的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于类风湿关节炎的诊断标志物及其检测芯片和应用，属于疾病诊断技术领域。本发明提供的用于类风湿关节炎的诊断标志物，包括以下至少一种抗体：抗ANAPC15抗体、抗LSP1抗体、抗APBB1抗体、抗副胸腺素抗体和抗UBL7抗体。本发明基于上述方案提供的类风湿关节炎的特异性抗体作为诊断标志物，利用抗原抗体特异性结合的性质，对待测血清中目标抗体进行检测。本发明提供的免疫芯片操作简便，且可高通量、高效率、高准确性地完成诊断标志物的检测，具有成本低，检测快速的特点，适合市场推广应用。场推广应用。场推广应用。


技术研发人员：刘栩 孙晓麟 栗占国
受保护的技术使用者：北京大学人民医院
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/9/5