一株植物乳杆菌LY19及其联合发酵酶解棕榈粕的方法和应用

一株植物乳杆菌ly19及其联合发酵酶解棕榈粕的方法和应用
技术领域
1.本发明属于饲料生产方法技术领域，特别涉及一株植物乳杆菌ly19及其联合发酵酶解棕榈粕的方法和应用。


背景技术：

2.棕榈粕含15-21％粗蛋白和8-10％粗脂肪，可以作为一种饲料资源，但由于含有14-17％纤维素，限制其在单胃动物上的应用。发酵或者酶解可以改善棕榈粕的营养价值。微生物能降解棕榈粕中的部分纤维，产生还原糖，提高蛋白的含量，是因为微生物可优先利用还原性单糖增殖，从而更进一步降解纤维，产生菌体蛋白。酶制剂可针对性地解开纤维结构，高效降解纤维素和甘露聚糖，产生更多的还原糖，尤其是甘露糖，促进发酵菌株的增殖，改善其风味。
3.据报道，将pkc用乳酸菌厌氧发酵7天后，粗蛋白由20.04％增加到23.42％，粗纤维由15.47％下降到12.44％。将pkc用黑曲霉发酵7天，发酵时添加100mg/kg的腐殖酸，得到发酵pkc的粗蛋白为23.20％，粗纤维为10.59％。利用β-甘露聚糖酶和纤维素酶对pkc进行预处理，半纤维素含量和纤维素含量分别降低26.26％和32.62％，且还原糖释放量提高几倍。
4.在发酵饲料生产实践中，微生物产生的酶可能存在如下问题：酶活不高、种类少、酶量低，难以对饲料原料进行充分的分解。酶解饲料虽然可以通过控制酶量达到较好的分解效果，但是不会生成有益的微生物代谢产物，改变风味。菌酶协同工艺弥补了单纯微生物发酵或酶解的缺点，既能对饲料原料中的大分子物质进行充分的降解，又能产生各种有益微生物代谢产物，具有较大的生产应用价值。
5.随着畜牧业的快速发展，对饲料需求的增加，面对优质饲料资源单一，价格上涨等情况，有效开发利用农副食品加工产物不失为一种新思路。棕榈粕是棕榈油的副加工产物，年产量超1000万吨，且价格较玉米与豆粕相比低廉，约1500元/吨。因此，充分开发杂粕类资源，合理利用微生物和酶制剂发酵可进一步将高纤维的棕榈粕转化为更适合单胃动物可消化利用的饲料，缓解玉米及豆粕紧张的压力。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一株植物乳杆菌ly19及其联合发酵酶解棕榈粕的方法和应用。发酵酶解棕榈粕的制剂能进一步将棕榈粕转化为更适合单胃动物可消化利用的饲料，缓解玉米及豆粕紧张的压力。
7.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
8.本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)ly19，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022043。
9.本发明还提供了所述的植物乳杆菌ly19在发酵酶解棕榈粕中的应用。
10.本发明还提供了一种联合发酵酶解棕榈粕的方法，其包括如下步骤：
11.s1：棕榈粕去除杂物后粉碎备用；
12.s2：活化纳豆芽孢杆菌和权利要求1所述的植物乳杆菌ly19，培养后得到种子液，并混合得到复合菌液；
13.s3：将甘露聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶混合，得到复合酶制剂；
14.s4：将步骤s2所述的复合菌液、步骤s3所述的复合酶制剂加入步骤s1所述的棕榈粕中，混合均匀后，调整水量并充分搅拌发酵，发酵至出现酸香味即可。
15.进一步的，所述步骤s2中，纳豆芽孢杆菌采用的是保藏编号为cctccno：m 2022042的纳豆芽孢杆菌nd1；所述纳豆芽孢杆菌nd1种子液和植物乳杆菌ly19种子液的混合比例为1：2。
16.进一步的，以棕榈粕重量计，所述步骤s3中，甘露聚糖酶的用量为45u/g，纤维素酶的用量为160u/g，酸性蛋白酶的用量为250u/g。
17.进一步的，以棕榈粕重量计，所述步骤s4中复合菌液的用量为7％(v/w)。
18.进一步的，所述步骤s4中，使用0.1n ph 4.8醋酸缓冲液调整水量至80％，且搅拌发酵的温度为37℃，时间为48h。
19.本发明还提供了一种联合发酵酶解棕榈粕的制剂，其中含有所述的植物乳杆菌ly19、纳豆芽孢杆菌、甘露聚糖酶、纤维素酶和酸性蛋白酶。
20.本发明还提供了所述的制剂在制备改善家畜动物饲料营养价值的添加剂中的应用。
21.进一步的，所述添加剂能够提高饲料中还原糖、酸溶蛋白、酸溶蛋白/粗蛋白含量，并降低粗纤维含量；还能够显著提高家畜动物在食用含棕榈粕的饲料后的胃肠消化率。
22.与现有的技术相比，本发明效果和优点是：
23.1、本发明通过发酵酶解复合的固态发酵技术简便、易操作，较物理法节约成本，既能对饲料原料中的大分子物质进行充分的降解，又能产生各种有益微生物代谢产物，具有较大的生产应用价值；
24.2、本发明所达到的效果突出，还原糖含量达到61.21mg/g，粗纤维从15.40％降至6.88％，酸溶蛋白从0.72％增加至2.26％，酸溶蛋白/粗蛋白从3.90％增加至12.61％，体外干物质和蛋白质消化率显著提高，且添加30％的发酵棕榈粕对育肥猪后期生长性能无明显不良影响。
25.3、本发明所使用的是菌酶联合处理固态发酵的技术，控制水量，能较长时间密封保存，适应实际生产应用周期。
附图说明
26.图1为体外干物质消化率，其中*表示p《0.05。
27.图2为体外粗蛋白消化率，其中*表示p《0.05。
具体实施方式
28.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实例表述的范围。
29.实施例1
30.原料：棕榈粕自马来西亚购入，去除石头杂物后粉碎过40目筛备用；
31.酶制剂：纤维素酶、甘露聚糖酶、蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司。准确称量甘露聚糖酶45u/g、纤维素酶160u/g、酸性蛋白酶250u/g(w/w，以棕榈粕重量计)；
32.菌株的活化：将-20℃保存的纳豆芽孢杆菌nd1、植物乳杆菌ly19按1％(v/v)接种量分别接种于lb、mrs(青岛海博生物有限公司)，37℃培养24h进行活化，制备种子液。
33.菌株的特征：将已活化的种子液按1％(v/v)接种量分别接种于lb、mrs培养基中，置于37℃培养箱中24h，此时nd1活菌数108cfu/ml，发酵液ph 6.60，滤纸酶活测得24.51fpu/ml，乳酸产量为22.83mmol/l；ly19活菌数109cfu/ml，发酵液ph 3.76，乳酸产量为107.24mmol/l。
34.菌种的保藏：将纳豆芽孢杆菌nd1进行菌种保藏，其保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年01月10日；纳豆芽孢杆菌nd1 bacillus natto nd1的保藏编号为cctcc no：m 2022042。
35.将植物乳杆菌ly19进行菌种保藏，其保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2022年01月10日；植物乳杆菌ly19 lactobacillus plantarum ly19的保藏编号为cctcc no：m2022043。
36.复合菌液制备：纳豆芽孢杆菌nd1、植物乳杆菌ly19种子液按1％(v/v)接种量分别接种于lb、mrs培养基中，置于37℃培养箱中24h后，按1：2的比例混合(v/v)。
37.混合：将复合菌液7％接种(v/w，以棕榈粕重量计，体积单位为ml，重量单位为g)、复合酶制剂加入棕榈粕中，混合均匀后，调整外加水量为80％(0.1n ph 4.8醋酸缓冲液)，并进行充分搅拌均匀；
38.发酵：将上述混合物放入单向排气发酵袋中密封，置于37℃发酵48h，发酵产物用于下述实验。
39.一、营养成分分析
40.参考gb/t 6435-2014饲料中水分的测定、gb/t 6432-2018饲料中粗蛋白的测定(凯氏定氮法)、gb/t 6438-2007饲料中粗灰分的测定、gb/t 6433-2006饲料中粗脂肪的测定、dns法测定还原糖、量热仪测定能值、纤维分析仪(滤袋法)测定粗纤维等。
41.二、体外模拟消化试验
42.称取2g样品称入250ml锥形瓶中，加入100ml 0.1m磷酸缓冲液(ph6.0)与40ml 0.2m hcl溶液，加入1ml氯霉素溶液(0.5g/100ml乙醇)；浸泡一夜后，加入4ml现配的胃蛋白酶溶液(20g/l猪胃蛋白酶)，混匀后于50rpm恒温摇床培养箱39℃消化2h。胃蛋白酶消化后，加入40ml 0.2m磷酸缓冲液(ph 6.8)和20ml 0.6m naoh溶液；随后将4ml胰酶液(100g/l胰液素)添加锥形瓶中，相同条件消化16h。消化完毕后，使用50μm孔径尼龙布过滤未消化残渣，并使用25ml 95％乙醇和25ml 99.5％丙酮冲洗，于105℃烘干。
43.三、动物饲养试验
44.1、试验设计：选取24头体重100kg的健康育肥猪，按照体重和性别配比原则，将供试猪随机分为三组，分别为对照组(con组)(n＝8)、未发酵组(pkc组)(n＝6)、发酵组(fepkc组)(n＝6)。各组猪体重差异不显著，组间平均体重相对偏差小于5％。各组日粮配方如表1所示。
45.表1日粮配方
[0046][0047]
2、饲养管理：试验前进行3天预实验，在此期间对供试猪进行编号、分组，并使其适应新的日粮和圈舍环境。适应环境后转入正试期，正试期30天，试验期间供试猪的日粮均按配方制成全混合日粮，采取定时、规定次数饲喂，自由饮水。定期对圈舍进行消毒。
[0048]
3、测定指标：
[0049]
分别在预饲期开始和正试期始、末，逐头对供试猪进行空腹地磅称重，以测定其活重。
[0050]
四、数据统计分析：
[0051]
表2棕榈粕原料与发酵酶解棕榈粕营养成分分析
[0052][0053]
注：数据表示为平均值
±
标准差。
[0054]
由表2可知，与棕榈粕原料组相比，经发酵酶解后，棕榈粕的还原糖含量从4.45mg/g增至61.21mg/g，粗纤维从15.40％降至6.88％；酸溶蛋白从0.72％增加至2.26％，酸溶蛋白/粗蛋白也从3.90％增加至12.61％。从结果来看，发酵酶解促进了棕榈粕纤维的降解并提高了酸溶蛋白的含量，达到改善其营养价值的需求。
[0055]
由图1与图2可知，与棕榈粕原料pkc组相比，发酵酶解fepkc组体外干物质消化率和体外粗蛋白消化率明显提高。
[0056]
表3生长性能分析
[0057][0058][0059]
注：数据表示为平均值
±
标准误。
[0060]
由表3可知，与con组相比，添加30％的棕榈粕对育肥猪后期生长性能未造成显著影响。与pkc组相比，fepkc组的日增重、tmr料重比更接近于con组。
[0061]
五、结论
[0062]
综上所述，棕榈粕经发酵酶解后，营养价值及其风味得到较大改善，作为替代玉米和豆粕饲喂对生长育肥猪健康和生产性能并无不良影响，且对于降低饲料成本、拓宽饲料来源、促进养猪业良性发展具有一定的意义。
[0063]
以上事实案例均只代表本发明技术方案，而不是对实验进行限制，虽然我们对实
验方案进行了改进，但是同领域的科研人员仍然可以对前面叙述的实验方案进行进一步的改善或者对实验环节进行科学等同替换，这些变动并不使相应技术解决方案的实质偏离本发明要求保护的技术解决方案的精神和范围。

技术特征：
1.一株植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)ly19，其特征在于：所述植物乳杆菌ly19保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022043。2.权利要求1所述的植物乳杆菌ly19在发酵酶解棕榈粕中的应用。3.一种联合发酵酶解棕榈粕的方法，其特征在于：包括如下步骤：s1：棕榈粕去除杂物后粉碎备用；s2：活化纳豆芽孢杆菌和权利要求1所述的植物乳杆菌ly19，培养后得到种子液，并混合得到复合菌液；s3：将甘露聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶混合，得到复合酶制剂；s4：将步骤s2所述的复合菌液、步骤s3所述的复合酶制剂加入步骤s1所述的棕榈粕中，混合均匀后，调整水量并充分搅拌发酵，发酵至出现酸香味即可。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中，纳豆芽孢杆菌采用的是保藏编号为cctcc no：m 2022042的纳豆芽孢杆菌nd1；所述纳豆芽孢杆菌nd1种子液和植物乳杆菌ly19种子液的混合比例为1：2～4。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以棕榈粕重量计，所述步骤s3中，甘露聚糖酶的用量为45u/g～60u/g，纤维素酶的用量为160u/g～200u/g，酸性蛋白酶的用量为250u/g～280u/g。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以棕榈粕重量计，所述步骤s4中复合菌液的用量为7％～10％(v/w)。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤s4中，使用0.1nph 4.8醋酸缓冲液调整水量至80％；且搅拌发酵的温度为37℃，时间为48h。8.一种联合发酵酶解棕榈粕的制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述的植物乳杆菌ly19、纳豆芽孢杆菌、甘露聚糖酶、纤维素酶和酸性蛋白酶。9.权利要求8所述的制剂在制备改善家畜动物饲料营养价值的添加剂中的应用。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述添加剂能够提高饲料中还原糖、酸溶蛋白、酸溶蛋白/粗蛋白含量，并降低粗纤维含量；还能够显著提高家畜动物在食用含棕榈粕的饲料后的胃肠消化率。

技术总结
本发明公开了一株植物乳杆菌LY19及其联合发酵酶解棕榈粕的方法和应用。本发明筛选到一株植物乳杆菌LY19，并通过与纳豆芽孢杆菌ND1混合联用，辅以甘露聚糖酶、纤维素酶和酸性蛋白酶，制得用于联合发酵酶解棕榈粕的制剂。本发明还公开了联合发酵酶解棕榈粕的方法，包括步骤：棕榈粕预处理、制备复合菌液、配置复合酶制剂、混合和发酵，且取得了较好的发酵效果，降低了棕榈粕的纤维含量，增加了还原糖和酸溶蛋白的比例，提高了粗蛋白和干物质的消化率，增强了棕榈粕的适口性，有助于实现开发棕榈粕替代玉米和豆粕的饲料的利用。替代玉米和豆粕的饲料的利用。替代玉米和豆粕的饲料的利用。


技术研发人员：杭苏琴 曾慧 朱伟云
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/5