新型乳酸菌及其用途的制作方法

新型乳酸菌及其用途
1.本技术是申请日为2018年01月31日、发明名称为“新型乳酸菌及其用途”、申请号为201880009638.8的中国发明申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及新型乳酸菌，更具体地说，涉及新型乳酸菌及其各种食品和药物用途，其可通过各种生理活性如免疫调节作用、炎症反应抑制作用等抑制过敏反应。


背景技术：

3.超敏反应是指通过在人体内对非病原体引起过度免疫反应(而不是对其产生免疫耐受)而对人体造成伤害的反应。根据其作用机制，超敏反应大致分为四种类型。1型超敏反应以特定抗原与ig结合的方式发生，ig主要与肥大细胞的fc受体结合。由于反应在暴露于抗原后立即发生，这种反应也称为立即超敏反应。1型超敏反应通常由通过呼吸吸入的颗粒抗原引起。对于所述的颗粒抗原，存在植物花粉等。由1型超敏反应引起的疾病或症状，有急性荨麻疹、特应性皮炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘等。2型超敏反应由小分子引起，其共价结合至人细胞表面的组分，从而产生改性的结构，免疫系统将其识别为异质材料。在2型超敏反应中，b细胞产生针对新表位的igg，之后igg结合改性的细胞，从而通过互补活性和吞噬作用引起细胞破坏。3型超敏反应由可溶性免疫复合物引起，所述可溶性免疫复合物通过可溶性蛋白质抗原和igg之间的结合形成，所述igg是针对可溶性蛋白质抗原产生的。在3型超敏反应中，一部分免疫复合物附着于小血管壁或肺的肺泡，从而激活补体，引起损伤组织的炎症反应，并恶化组织的生理功能。4型超敏反应由抗原特异性效应t细胞的产物引起，也称为迟发型超敏反应，因为它在暴露于抗原后一至三天出现。
4.1型超敏反应是由ige介导的立即反应。ige抗体由主要存在于呼吸和消化器官的粘膜中的浆细胞产生。这种方式产生的ige抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的表面受体具有非常高的亲和力，因此主要与这些细胞结合。它是致敏状态，其中肥大细胞和嗜碱性粒细胞的大多数表面受体与ige抗体结合。如果在致敏状态，暴露于过敏原，过敏原与ige抗体结合，从而引起受体之间的反应，之后肥大细胞中的颗粒体与细胞膜融合，从而分泌化学介质如组胺、半胱氨酰白三烯、前列腺素和血栓素。这些化学介质通过增加血管通透性、扩张血管、收缩平滑肌和加速分泌腺功能而引起早期过敏反应。
5.过敏性鼻炎是由所述1型超敏反应引起的疾病之一，是指在过敏原暴露后通过诱导ige介导的炎症导致鼻、眼、耳、咽喉等症状的症状性疾病。根据过敏性鼻炎及其对哮喘工作组的影响，这种过敏性鼻炎根据症状的持续时间分为间歇性ar或持续性ar，并再次细分为轻度、中度和重度。过敏性鼻炎的患病率一般在成人中约为10-30％，在幼儿中约为40％，根据不同国家的报导而略有不同。过敏性鼻炎的危险因素是室内和室外过敏原，以及6岁前血清ige水平为100iu/ml或更高的情况。过敏性鼻炎可能引起鼻窦炎、中耳炎或结膜炎作为并发症。如果长期发展，这种疾病可能加重哮喘和鼻窦炎，从而导致睡眠障碍、注意力不集中或不适应社会生活。哮喘是由所述1型超敏反应引起的疾病之一，是指一种呼吸窘迫、咳
嗽、喘息声等症状反复或断续性地发生的疾病，并且还指由遗传和环境因素的结合引起的代表性过敏性疾病。换句话说，这种哮喘以这样的方式发生：从父母遗传的过敏性体质和周围的哮喘诱导因子参与彼此的相互作用，从而引起对免疫系统的干扰，并且主要是慢性和复发的。
6.已经研究了各种治疗方法来治疗由1型超敏反应引起的过敏性疾病。例如，抗过敏药物、组胺受体拮抗剂(抗组胺剂)、类固醇等已用于治疗。然而，众所周知，以下所有都具有相当大的副作用：抗组胺剂，其通过与组胺竞争结合组胺受体来抑制外周神经的信号转导；抗过敏药物，其试图通过削弱产生化学介质的细胞的活性来减轻症状；和类固醇，其通过减弱免疫反应来减少炎症，其中大多数没有可靠的治疗效果。
7.另一方面，乳酸菌是metchnikoff首次获得的产品，其试图酸化肠内容物以防止腐败生物生长并因此实现治疗效果。对于被认为是代表性乳酸菌的乳杆菌(lactobacillus)属，迄今已发现超过165种。作为用于治疗过敏性疾病的益生乳酸菌的活体形式，在日本报道有，例如，用于由喜马拉雅雪松花粉引起的过敏症状的嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)菌株l-92。
8.对人体有益的许多乳酸菌存在于人体消化道中，并且一直在研究将从人消化道分离的乳酸菌应用于药物或功能性食品。特别是，过敏性疾病的治疗剂可能需要长时间服用，因此需要诸如容易摄入和高安全性的特征。乳酸菌属于一组候选物，它们非常适合于如上所述的疾病的治疗，并且也满足这种治疗的要求。
9.发明详述
10.技术问题
11.本发明应用于传统的技术背景，本发明的目的是提供具有免疫调节作用和炎症反应抑制作用的新型乳酸菌。
12.另外，本发明的另一个目的是提供新型乳酸菌的各种食品和药物用途。
13.特别地，本发明的目的是提供长双歧杆菌(bifidobacterium longum)im55或植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)im76的新型乳酸菌。
14.本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗过敏性疾病的药物组合物，其含有长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物。
15.本发明的另一个目的是提供一种用于预防或减轻过敏性疾病的食品组合物，其含有长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物。
16.本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗免疫疾病或炎性疾病的药物组合物，其含有长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物。
17.另外，本发明的另一个目的是提供一种预防或治疗过敏性疾病的方法，包括将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物给予个体的步骤。
18.此外，本发明的另一个目的是提供长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物在预防或治疗过敏性疾病中的用途。
19.此外，本发明的另一个目的是提供长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物在制备用于预防或治疗过敏性疾病的药物中的用途。
20.此外，本发明的另一个目的是提供含有长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物的组合物，用于预防或治疗过敏性疾病。
21.技术方案
22.在实现所述目的的一个方面，本发明提供了长双歧杆菌im55(保藏机构：韩国微生物培养中心(kccm)，保藏日期：2017年1月20日，保藏编号：kccm11961p)。
23.本发明的长双歧杆菌im55的特征在于是从人的排泄物中分离和鉴定的为长双歧杆菌的新型乳酸菌。
24.用于鉴定和分类本发明的长双歧杆菌im55的16s rdna序列与本说明书中所附的seq id no：1相同。因此，本发明的长双歧杆菌im55 kccm11961p可包括seq id no：1的16s rdna序列。
25.所述seq id no：1的16s rdna序列的分析结果是，这种序列与已知的长双歧杆菌菌株具有99％的同源性，因此显示出与长双歧杆菌的最高分子系统发育关系。因此，所述乳酸菌被鉴定为长双歧杆菌，随后命名为长双歧杆菌im55，然后于2017年1月20日保藏于kccm(保藏编号：kccm11961p)。
26.在本发明中，所述长双歧杆菌im55可用d-葡萄糖、d-甘露醇、d-乳糖、d-蔗糖、d-麦芽糖、水杨苷、d-木糖、l-阿拉伯糖、七叶苷枸橼酸铁、d-棉子糖和d-山梨糖醇作为碳源。
27.在实现所述目的的另一方面，本发明提供了植物乳杆菌im76(保藏机构：韩国微生物培养中心(kccm)，保藏日期：2017年1月20日，保藏编号：kccm11962p)。
28.本发明的植物乳杆菌im76的特征在于是从传统发酵食品泡菜中分离和鉴定的为植物乳杆菌的新型乳酸菌。
29.用于鉴定和分类本发明的植物乳杆菌im76的16s rdna序列与本说明书中所附的seq id no：2相同。因此，本发明的植物乳杆菌im76 kccm11962p可包括seq id no：2的16s rdna序列。
30.所述seq id no：2的16s rdna序列的分析结果是，这种序列与已知的植物乳杆菌菌株的序列具有99％的同源性，因此显示出与植物乳杆菌的最高分子系统发育关系。因此，所述乳酸菌被鉴定为植物乳杆菌，随后命名为植物乳杆菌im76，然后于2017年1月20日保藏于kccm(保藏编号：kccm11962p)。
31.在本发明中，所述植物乳杆菌im76可用l-阿拉伯糖、d-核糖、d-半乳糖、d-葡萄糖、d-果糖、d-甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、n-乙酰基-葡糖胺、扁桃苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、龙胆二糖、d-松二糖和葡萄糖酸盐作为碳源。
32.在实现所述目的的另一方面，本发明提供用于预防或治疗过敏性疾病的药物组合物，其含有长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物。
33.在本发明中，术语“过敏性疾病”是指通过人体对某种物质引起超反应性，即通过引起免疫系统对从外部引入的物质的过度反应而诱发的疾病、病症或异常状态。从外部引入的所述物质可以是过敏原，即成为过敏性疾病的原因的抗原。所述过敏可以指以这样的方式引起的过敏反应：通过从外部引入的物质释放诸如组胺的炎症介质从而导致疾病，并且所述过敏反应可以是1型超敏反应、2型超敏反应、3型超敏反应或4型超敏反应。在本发明中，所述过敏性疾病可以是由ige介导的1型超敏反应引起的疾病，特别是可以选自鼻炎、特应症、哮喘、特应性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性中耳炎、荨麻疹和过敏性休克。更具体地，本发明中的所述过敏性疾病可以是鼻炎、特应症或哮喘。
34.除了控制、预防、缓解和治疗上述过敏性疾病的效果之外，根据本发明的组合物还通过使经过敏性疾病改性的肠道微生物正常化而在控制、预防、减轻和治疗过敏性疾病及其并发症方面显示出优异的效果。
35.本发明的“长双歧杆菌im55”与上述相同。
36.特别地，本发明的药物组合物中包含的长双歧杆菌im55可以是其活细胞体、其死细胞体、其培养产物、其粉碎产物或其提取物，但任何形式的长双歧杆菌im55可以无限制地使用，只要它可以实现对过敏性疾病的预防或治疗效果。
37.本发明的“植物乳杆菌im76”与上述相同。
38.特别地，本发明的药物组合物中包含的植物乳杆菌im76可以是其活细胞体、其死细胞体、其培养产物、其粉碎产物或其提取物，但是任何形式的植物乳杆菌im76可以无限制地使用，只要它可以实现对过敏性疾病的预防或治疗效果。
39.在本发明中，长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的混合物可以在能够达到预防或治疗过敏性疾病的效果的范围内混合，并且所述混合比可以是10：1至1:10，但不是限于此。特别地，长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的比例可以是10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1:10。根据这些乳酸菌之间的混合，其混合物通过协同作用显示出预防或治疗过敏性疾病的显著效果。
40.在本发明中，术语“活细胞体”是指本发明的新型乳酸菌本身；“死细胞体”是指通过加热、加压、药物处理等进行灭菌的乳酸菌；“粉碎产物”是指通过酶处理、均质化、超声波处理等被粉碎的乳酸菌。此外，在本发明中，术语“提取物”是指通过用已知的提取溶剂对乳酸菌进行提取而获得的产物。
41.在本发明中，术语“培养产物”是指通过在已知培养基中培养乳酸菌获得的产物，并且所述产物可包括新型乳酸菌。所述培养基可以选自已知的液体培养基或固体培养基，并且可以是，例如mrs液体培养基、gam液体培养基、mrs琼脂培养基、gam琼脂培养基或bl琼脂培养基，但不限于此。
42.此外，在本发明中，术语“预防”是指通过给予本发明的药物组合物来抑制过敏性疾病的症状或延缓其进展的所有行为。
43.此外，在本发明中，术语“治疗”是指通过给予本发明的药物组合物来改善或有益地改变过敏性疾病症状的所有行为。
44.为本发明药物组合物的有效成分的新型乳酸菌等的含量可以根据组合物的具体形式和其使用目的或方向在各种范围内调节。在根据本发明的药物组合物中，有效成分的含量没有很大限制，并且可以是，例如，0.01至99wt％，特别是0.1至75wt％，更特别是0.5至50wt％，基于组合物的总重量。
45.本发明的药物组合物可以进一步含有至少一种已知的有效成分，其具有免疫调节作用，抑制炎症反应的效果和预防或治疗过敏性疾病(例如，哮喘、鼻炎、特应性皮炎等)的效果。
46.特别地，本发明的药物组合物可以进一步含有选自壳聚糖、菊粉和柑橘果胶中的至少一种。
47.所述壳聚糖、菊粉、柑橘果胶或其至少两种的混合物包含在本发明的药物组合物中，从而可以在新型乳酸菌达到预防和治疗过敏性疾病的效果时作为益生元。
48.此外，除了作为有效成分的新型乳酸菌之外，根据本发明的药物组合物还可以包含添加剂，如药学上可接受的载体。可以包含在本发明的药物组合物中的载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。
49.本发明的药物组合物可以通过常规方法配制成用于口服给药的剂型或用于肠胃外给药的剂型，并且可以通过使用常规的用于配制制剂的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、表面活性剂等进行预混进行复合。
50.如果配制成口服给药的固体制剂，本发明的药物组合物可包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂在其有效成分中可含有至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等。此外，除了简单的赋形剂之外，固体制剂可以含有润滑剂等，例如硬脂酸镁和滑石粉，但不限于此。
51.如果配制成口服给药的液体制剂，本发明的药物组合物可包括悬浮剂、内用液体、乳液、糖浆等，也可含有各种赋形剂，例如保湿剂、甜味剂、调味剂、防腐剂等，除常用的简单稀释剂水和液体石蜡外，但不限于此。
52.如果配制成肠胃外给药制剂，本发明的药物组合物可包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳液、冷冻干燥制剂或栓剂。作为非水溶剂和悬浮溶剂，可包括以下物质，但不限于此：丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射酯等。作为栓剂的基质，可以使用以下物质：硬脂(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂酯(laurinum)、甘油明胶等。
53.本发明的药物组合物可以根据预期的方法口服或胃肠外给予包括人在内的哺乳动物。对于肠胃外给药方法，有皮肤外用、腹腔内注射、直肠注射、皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸腔内注射方法等。只要是药学有效量，本发明的药物组合物的剂量不大受限制，并且其范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、排泄率和疾病的严重程度而变化。本发明药物组合物的常规日剂量没有很大限制，但基于有效成分可以特别是0.1至3000mg/kg，更特别是0.5至2000mg/kg，并且可以每天给药一次或一天分成几次给药。
54.所述“药学有效量”是指足够以适用于医学治疗的合理的益处/风险比治疗疾病的量，并且可以根据以下因素来确定，包括个体的疾病类型、严重性、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物，以及制药领域熟知的其他因素。所述“给药”是指通过任何适当的方法向个体提供本发明的预定药物组合物。此时，个体是指动物，并且可以是典型的哺乳动物，在其上使用本发明的新型乳酸菌的治疗可以显示出有益效果。这种个体的优选实例可包括像人类一样的灵长类动物。此外，这样的个体可以包括具有过敏性疾病症状或具有患有这种症状的风险的所有个体。
55.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供用于预防或减轻过敏性疾病的食物组合物，其包含长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物。
56.在本发明中，术语“长双歧杆菌im55”、“植物乳杆菌im76”、“过敏性疾病”等与上述相同。
57.本发明的食品组合物可用作保健功能食品。所述“保健功能食品”是指通过使用原
料或组分制备和加工的食品，其具有根据健康功能食品法对人体有用的功能，并且“功能”是指为了调整与人体结构和功能有关的营养素或获得对健康用途有价值的效果，例如生理作用等而服用这些食品。
58.本发明的食品组合物可以含有常规食品添加剂，并且某一添加剂是否适合作为所述“食品添加剂”是基于该添加剂的规格和标准，根据食品药品安全部批准的食品添加剂规范的一般规则、其他一般测试方法来决定的，除非有其他规定。
59.作为所述“食品添加剂规范”中列出的项目有，例如酮、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸、肉桂酸等化学化合物；如柿子色、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色、瓜尔胶等天然添加剂；和混合制剂，如l-谷氨酸钠制剂、面条碱添加剂、防腐制剂、焦油色制剂等。
60.本发明的食品组合物可以含有长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物，其含量为组合物总重量的0.01至99wt％，特别是0.1至75wt％，更特别是0.5至50wt％，基于组合物的总重量。
61.此外，为了预防和/或减轻过敏性疾病，可以以片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸剂等形式制备和加工本发明的食物组合物。
62.例如，所述片剂形式的食物组合物可以通过以下步骤制备：通过常规方法将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物，以及赋形剂、粘合剂、崩解剂和其它添加剂的混合物制粒，接着将助流剂等加入其中，然后进行压缩成型；或者可以通过直接加入所述混合物进行压缩成型来制备。此外，如果需要，所述片剂形式的保健功能食品可以含有矫正剂等，并且如果需要，可以用适当的包衣剂包衣。
63.在胶囊形式的食物组合物中，可以通过将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物，和如赋形剂等的添加剂的混合物，或其颗粒或包衣颗粒填充入常规的硬胶囊中来制备硬胶囊制剂；可以通过将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物，和如赋形剂等的添加剂的混合物填充至具有明胶等的胶囊基质来制备软胶囊制剂。如果需要，所述软胶囊制剂可含有增塑剂、着色剂、防腐剂等，如甘油、山梨糖醇等。
64.可以通过适当的方法将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物，以及赋形剂、粘合剂、崩解剂等的混合物成型，从而复合成丸剂形式的食物组合物，如果需要，可以用白糖或其它合适的涂层剂包衣，或者用淀粉、滑石粉或适当的材料用药丸涂层剂覆盖。
65.颗粒形式的食物组合物可以通过适当的方法制备成具有长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物以及赋形剂、粘合剂、崩解剂等的混合物的颗粒形式，并且如果需要，可以包含调味剂、矫正剂等。当用12目(1680μm)、14目(1410μm)和45目(350μm)筛对颗粒形式健康功能食品进行以下粒度测试时，全部通过12目筛，总量的5％或更少保留在14目筛，总量的15.0％或更少可以通过45目筛。
66.术语例如所述赋形剂、粘合剂、崩解剂、助流剂、矫味剂、调味剂等的定义，包括与本领域已知文献(韩国药典的解释性版本，文圣出版社，韩国药学院协会，第5修订版，p33-48,1989)描述的那些具有相同或相似的功能的那些。
67.所述食物的类型没有特别限制。作为可以添加本发明的提取物的食物的实例，有饮料、口香糖、维生素复合物、饮料等，包括常规意义上的食物组合物，特别是保健功能食品。
68.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供用于预防或治疗免疫疾病或炎性
疾病的药物组合物，其含有长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76kccm11962p或其混合物。
69.在本发明中，与药物组合物有关的术语，包括“长双歧杆菌im55”和“植物乳杆菌im76”，与上述相同。
70.在本发明中，术语“免疫疾病”是指在发生某种免疫反应时成为问题的疾病，特别是可以是自身免疫疾病、移植排斥或移植物抗宿主病，但不限于此。所述自身免疫疾病可以是克罗恩病、红斑、类风湿性关节炎、桥本氏甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森氏病、i型糖尿病、狼疮、慢性疲劳综合症、纤维肌痛综合征、甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进症、硬皮病、白塞氏病、炎性肠病、多发性硬化症、重症肌无力、梅尼尔氏综合征、吉兰-巴雷综合征、干燥综合征、白斑、子宫内膜异位症、牛皮癣、粘膜白斑病、系统性硬皮病、哮喘、溃疡性结肠炎等。
71.在本发明中，术语“炎性疾病”统称为疾病，其主要病变是炎症。本发明的炎性疾病可以是选自包括关节炎、痛风、肝炎、肥胖症、角膜炎、胃炎、肠炎、肾炎、结肠炎、糖尿病、结核、支气管炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、胰腺炎、炎性疼痛、尿道炎、膀胱炎、阴道炎、动脉硬化、败血症、烧伤、皮炎、牙周炎和牙龈炎的组中的至少一种。特别地，所述炎性疾病可以是结肠炎。
72.除了控制、预防、缓解和治疗上述炎性疾病的效果之外，本发明的组合物还通过使被炎症性疾病所改变的肠道微生物正常化而在控制、预防、减轻和治疗炎性疾病及其并发症方面显示出优异的效果。
73.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供用于预防或减轻免疫疾病或炎性疾病的食物组合物，其含有长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76kccm11962p或其混合物。
74.在本发明中，与食物组合物有关的术语，包括“长双歧杆菌im55”和“植物乳杆菌im76”，与上述相同。
75.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供了预防或治疗过敏性疾病的方法，包括将长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物给予个体的步骤。
76.在本发明中，诸如“长双歧杆菌im55”、“植物乳杆菌im76”、“给药”、“个体”、“过敏性疾病”等术语与上述相同。
77.另外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供了长双歧杆菌im55kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物在预防或治疗过敏性疾病中的用途。
78.另外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供了长双歧杆菌im55kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物在制备用于预防或治疗过敏性疾病的药物中的用途。
79.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供含有长双歧杆菌im55kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物的组合物用于预防或治疗过敏性疾病。
80.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供预防或治疗免疫疾病或炎性疾病的方法，包括给予个体长双歧杆菌im55 kccm11961p、植物乳杆菌im76kccm11962p或其混合物的步骤。
81.在本发明中，诸如“长双歧杆菌im55”、“植物乳杆菌im76”、“给药”、“个体”、“免疫
疾病”、“炎性疾病”等术语与上述相同。
82.此外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供了长双歧杆菌im55kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物在预防或治疗免疫疾病或炎性疾病中的用途。
83.此外，在实现所述目的的另一个方面，本发明提供了长双歧杆菌im55kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物在制备用于预防或治疗免疫疾病或炎性疾病的药物中的用途。
84.另外，在实现所述目的的另一方面，本发明提供含有长双歧杆菌im55kccm11961p、植物乳杆菌im76 kccm11962p或其混合物的组合物用于预防或治疗免疫疾病或炎性疾病。
85.有益效果
86.根据本发明的长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76在人体中是安全的而没有毒性的，具有良好的生理活性，如免疫调节作用和炎症反应抑制作用，并具有使肠道微生物正常化的作用。因此，长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物可用作预防、缓解或治疗过敏性疾病以及免疫疾病和炎性疾病的材料。
附图说明
87.图1是示出用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理巨噬细胞时il-10浓度增加的图(nor，正常对照组；lps，具有诱导的炎症反应的组；i55，具有诱导的炎症反应+给予1
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105cfu/ml长双歧杆菌im55的组；和i76，具有诱导的炎症反应+给予1
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105cfu/ml植物乳杆菌im76的组，与下文图2至4相同)。
88.图2是示出用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理巨噬细胞时il-12浓度降低的图。
89.图3是示出用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理树突细胞时il-10浓度增加的图。
90.图4是示出用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理树突细胞后tnf-α浓度降低的图。
91.图5是示出诱导t细胞分化为th2细胞，作为长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理的结果，gata3的表达水平被抑制的图(nor，正常对照组；thi，给予th2细胞分化诱导剂的组；i55，诱导th2细胞分化+给予1
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105cfu/ml长双歧杆菌im55的组；和i76，诱导th2细胞分化+给予1
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105cfu/ml植物乳杆菌im76的组，与下文图6中的相同)。
92.图6是示出诱导t细胞分化为th2细胞，用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理的结果，il-5的表达水平受到抑制的图。
93.图7是示出诱导t细胞分化成treg细胞，用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理的结果，foxp3的表达水平增加的图(nor，正常对照组；tri，给予treg细胞分化诱导剂的组；i55，诱导treg细胞分化+给予1
×
105cfu/ml长双歧杆菌im55的组；和i76，诱导treg细胞分化+给予1
×
105cfu/ml植物乳杆菌im76的组，与下文图8中的相同)。
94.图8是示出诱导t细胞分化成treg细胞，用长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76处理的结果，il-10的表达水平增加的图。
95.图9是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型中il-5血清浓度降低的图(nor，正常对照组(仅口服pbs)；con或ar，患有诱导
疾病的组；dx，患有诱导疾病+腹腔内给予1mg/kg体重的地塞米松的组；i55，患有诱导疾病+口服给予1
×
109cfu/小鼠长双歧杆菌im55的组；和i76，患有诱导疾病+口服给予1
×
109cfu/小鼠植物乳杆菌im76的组，与下文图10至17中相同)。
96.图10是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，ige血清浓度降低的图。
97.图11是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，il-4血清浓度降低的图。
98.图12是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，支气管肺泡灌洗液(balf)中il-5浓度降低的图。
99.图13是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，balf中il-4浓度降低的图。
100.图14是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，balf中th2细胞的分布率降低的图。
101.图15是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，balf中嗜酸性粒细胞的分布率降低的图。
102.图16是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导性变应性鼻炎和哮喘的动物模型，balf中il-10浓度增加的图。
103.图17是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，balf中treg细胞的分布率增加的图。
104.图18是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，鼻炎症状评分(打喷嚏和揉鼻)下降的图(nor，正常对照组(仅口服pbs)；ar，患有诱导疾病的组；dx，患有诱导疾病+腹腔内给予1mg/kg体重的地塞米松的组；i55，患有诱导疾病+口服给予1
×
109cfu/小鼠长双歧杆菌im55的组；和i76，患有诱导疾病+口服给予1
×
109cfu/小鼠植物乳杆菌im76的组，与下文图19至26中相同)。
105.图19是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，鼻腔中il-4浓度降低的图。
106.图20是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，鼻腔中il-5浓度降低的图。
107.图21是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，鼻腔破裂和鼻腔上皮细胞扩张减少的图。
108.图22是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导性变应性鼻炎和哮喘的动物模型，肺组织中gata3的表达水平降低的图。
109.图23是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，肺组织中il-10的表达水平增加的图。
110.图24是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，肺组织中foxp3的表达水平增加的图。
111.图25是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，肺组织中il-5的表达水平降低的图。
112.图26是示出将长双歧杆菌im55或植物乳杆菌im76施用于具有诱导过敏性鼻炎和
哮喘的动物模型，肺组织的诱导炎症和水肿程度降低的图。
113.图27是示出将长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的混合物(以1：1、1：3和1：9的比例)施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，鼻腔症状评分(打喷嚏和揉鼻)和鼻腔中il-5浓度降低的图(nor，正常对照组(仅口服pbs)；ar，患有诱发疾病的组；dx，患有诱发疾病+腹腔内给予1mg/kg体重的地塞米松的组；1：1，口服1：1比例的长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的混合物(总共1
×
109cfu/只小鼠)的组；1：3，口服1：3比例的长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的混合物(总共1
×
109cfu/只小鼠)的组；和1：9，口服1：9比例的长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的混合物(总共1
×
109cfu/只小鼠)的组，与下文图28中的相同)。
114.图28是示出将长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76(比例为1：1、1：3和1：9)的混合物施用于具有诱发过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，血清中il-5的表达水平降低的图。
115.图29是示出将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物施用于具有诱发过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，结肠中il-4和il-5的浓度降低并且其中il-10的浓度增加的图(nor，正常对照组(仅口服pbs)；ar，患有诱导疾病的组；dx，患有诱导疾病+腹腔内给予1mg/kg体重的地塞米松的组；i55，患有诱导疾病+口服给予1
×
109cfu/小鼠长双歧杆菌im55的组；i76，患有诱导疾病+口服给予1
×
109cfu/小鼠植物乳杆菌im76的组；和pm，患有诱导疾病+口服给予各5
×
108cfu/小鼠长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的组，与下文图30中相同)。
116.图30是示出将长双歧杆菌im55、植物乳杆菌im76或其混合物施用于具有诱导过敏性鼻炎和哮喘的动物模型，肠微生物的构成发生变化的图。
具体实施方式
117.在下文中，将通过示例性实施例更详细地描述本发明。然而，提供以下示例性实施例仅为了进一步清楚地说明本发明的技术特征，而不应解释为限制本发明的保护范围。
118.实施例1.乳酸菌的分离和鉴定
119.(1)乳酸菌的分离
120.居住在首尔的20多岁的健康人或居住在耶罗南多省古里(gurye,jeollanam-do provinc)的60岁的健康人的排泄物或家中制作的白菜泡菜被嵌入并悬于gam肉汤中(日本日水制药株式会社)。之后，取其上清液并移至mrs琼脂培养基(difco，usa)或gam琼脂培养基(日本日水制药株式会社)中。将得到的培养基在37℃下厌氧培养约48小时，之后从中分离出具有形成的菌落的乳酸杆菌属菌株和双歧杆菌属菌株。
121.(2)鉴定分离的乳酸菌
122.对于从人类排泄物或白菜泡菜中分离的菌株，确认其种类，并根据这些菌株的革兰氏染色、生理特征、16s rdna序列等给予其名称。管理编号和分离的乳酸菌的菌株名称如下表1和2所示。从人类排泄物中分离的乳酸菌是15种长双歧杆菌(表1中的管理编号51至65)，10种青春双歧杆菌(表1中的管理编号66至75)和10种嗜酸乳杆菌(表2中的管理编号90至99)，而从白菜泡菜中分离的乳酸菌是14种植物乳杆菌(表2中的管理编号76至89)。
123.表1
124.管理编号菌株名管理编号菌株名
51长双歧杆菌im5164长双歧杆菌im64 52长双歧杆菌im5265长双歧杆菌im65 53长双歧杆菌im5366青春双歧杆菌im66 54长双歧杆菌im5467青春双歧杆菌im67 55长双歧杆菌im5568青春双歧杆菌im68 56长双歧杆菌im5669青春双歧杆菌im69 57长双歧杆菌im5770青春双歧杆菌im70 58长双歧杆菌im5871青春双歧杆菌im71 59长双歧杆菌im5972青春双歧杆菌im72 60长双歧杆菌im6073青春双歧杆菌im73 61长双歧杆菌im6174青春双歧杆菌im74 62长双歧杆菌im6275青春双歧杆菌im7563长双歧杆菌im63
ꢀꢀ
125.表2
[0126][0127][0128]
在上表1中描述的菌株中，鉴定出长双歧杆菌im55是革兰氏阳性杆菌，其既不显示过氧化氢酶活性也不具有孢子。此外，显示长双歧杆菌im55的16s rdna具有seq id no：1的序列。通过blast搜索比较长双歧杆菌im55的16s rdna序列的结果，显示完全没有检索到具有相同16s rdna序列的长双歧杆菌菌株，并且与已知的长双歧杆菌菌株的16s rdna序列有99％的同源性。此外，在长双歧杆菌im55的生理特征中，使用api试剂盒(型号名称：api 20链球菌strep；和制造商：梅里埃，美国)用糖发酵试验分析碳源的可用性，其中其结果显示于下表3。在下表3中，“+”表示碳源的可用性为正，
“‑”
表示碳源的可用性为负。
[0129]
表3
[0130][0131]
在上表2中描述的菌株中，鉴定出植物乳杆菌im76是革兰氏阳性杆菌。此外，显示植物乳杆菌im76的16s rdna具有seq id no：2的序列。通过blast搜索比较植物乳杆菌im76的16s rdna序列的结果，显示完全没有检索到具有相同16srdna序列的植物乳杆菌菌株，并且这种序列与已知的植物乳杆菌菌株的16s rdna序列具有99％的同源性。此外，在植物乳杆菌im76的生理特征中，使用api试剂盒(型号名称：api 50chl；和制造商：梅里埃，美国)，使用糖发酵试验分析碳源的可用性，其中其结果显示于下表4。在下表4中，“+”表示碳源的可用性为正，
“‑”
表示碳源的可用性为负。
[0132]
表4
[0133]
[0134][0135]
实施例2测试乳酸菌的炎症反应抑制作用
[0136]
(1)测试乳酸菌对巨噬细胞的炎症反应抑制作用
[0137]
从raonbio有限公司购买6周龄的c57bl/6j雄性小鼠(20-23g)。将2ml灭菌的4％硫代乙醇酸盐腹腔内给予小鼠，然后在96小时后麻醉。之后，将8ml rpmi1640培养基腹腔内给予小鼠。在5至10分钟后，再次从小鼠腹腔内提取rpmi培养基(包括巨噬细胞)，随后在1000rpm的条件下离心10分钟，然后再用rpmi 1640培养基洗涤两次。将巨噬细胞以每孔0.5
×
106个细胞接种到24孔板中，随后培养24小时，然后从其中去除未附着的细胞。用测试材料即乳酸菌以及炎症反应诱导剂即脂多糖(lps)处理巨噬细胞培养液90分钟或24小时，然后从其中获得上清液和细胞。此时，乳酸菌的处理浓度为1
×
104cfu/ml。另外，为了比较乳酸菌的效果，使用各种益生元作为试验材料。
[0138]
借助elisa试剂盒检测来自所述获得的上清液的tnf-α的表达水平。此外，通过免疫印迹法检测所述获得的细胞的p65(nf-κb)、p-p65(磷-fnf-κb)和β-肌动蛋白的表达水平。特别地，取50μg上清液并在sds 10％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳一个半小时。100v和400ma的条件下1小时10分钟，将电泳的样品转移到硝酸纤维素纸上。将转移有样品的硝化纤维素纸用5％脱脂乳封闭30分钟，然后用pbs-吐温洗涤3次，每次5分钟，然后以1：100比例加入第一抗体(圣克鲁斯生物技术，美国)反应过夜。将该纸洗涤三次，每次10分钟，
并以1：1000的比例加入二抗(圣克鲁斯生物技术，美国)进行反应1小时20分钟。然后，将该纸洗涤三次，每次15分钟，接着进行荧光颜色形成，然后显影，再测量发色团带的强度。乳酸菌对巨噬细胞的炎症反应抑制作用的测试结果示于下表5至7中。
[0139]
表5
[0140][0141]
表6
[0142]
[0143][0144]
表7
[0145][0146][0147]
*抑制率：-,《10％；+,10-30％；++,30-60％；+++,》60％
[0148]
作为表5至7中的测试结果，确定了对巨噬细胞的炎症反应抑制作用根据乳酸菌的类型而不同。特别是在双歧杆菌属乳酸菌和乳杆菌属乳酸菌的情况下，已经确定炎症反应抑制效果不仅取决于种属而且还取决于菌株，即使这些菌株是相同的种属。在这些菌株中，在长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的情况下，发现nf-κb活化抑制率和tnf-α表达抑制率都同时高。
[0149]
此外，在壳聚糖、菊粉和柑橘果胶作为益生元的情况下，发现与其他益生元相比，nf-κb活化抑制率和tnf-α表达抑制率是优异的。
[0150]
(2)测试乳酸菌对树突细胞的炎症反应抑制作用
[0151]
通过使用含有10％fbs，1％抗生素，1％谷氨酰胺和0.1％巯基乙醇的rpmi 1640从c57bl/6小鼠(雄性，20-23g)的骨髓中分离免疫细胞，接着用rbc裂解缓冲液处理，然后洗涤。将所述细胞分至24孔板的每个孔，然后以1：1000的比例用gm-csf和il-4处理，然后培养。在培养的第5天，用新培养基替换细胞，然后在第8天收集细胞，然后用作树突细胞。之后，将树突细胞以每孔0.5
×
106个细胞接种到24孔板中，随后用测试材料(即乳酸菌)以及
炎症反应诱导剂(即脂多糖(lps))处理90分钟或24小时，接着从中获得上清液和细胞。此时，乳酸菌的处理浓度为1
×
104cfu/ml。另外，为了比较乳酸菌的效果，使用各种益生元作为试验材料。
[0152]
借助elisa试剂盒检测所述获得的上清液的il-10和il-12的表达水平。此外，采用与上述实施例2(1)相同的免疫印迹方法，检测用测试材料处理90分钟后获得的细胞的p65(nf-κb)、p-p65(磷-nf-κb)和β-肌动蛋白的表达水平，。乳酸菌对树突细胞的炎症反应抑制作用的测试结果显示在下表8至10中。
[0153]
表8
[0154][0155][0156]
表9
[0157][0158][0159]
表10
[0160][0161]
*抑制率：-,《10％；+,10-30％；++,30-60％；+++,》60％
[0162]
*增长率：-,《10％；+,10-50％；++,50-100％；+++,》100％
[0163]
作为表8至10中的测试结果，确定了对树突细胞的炎症反应抑制作用根据乳酸菌的类型而不同。特别是在双歧杆菌属乳酸菌和乳杆菌属乳酸菌的情况下，发现炎症反应抑制效果不仅取决于种属，而且还取决于菌株，即使这些菌株是同一种属。特别地，一部分菌株显示出il-12表达增加的结果。另一方面，大多数菌株显示出il-10表达降低的结果。在这些菌株中，在长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的情况下，鉴定出nf-κb活化抑制率和il-12表达抑制率最高，同时il-10表达增长率最高。
[0164]
此外，在壳聚糖、菊粉和柑橘果胶作为益生元的情况下，发现与其他益生元相比，nf-κb活化抑制率、il-12表达抑制率和il-10表达增长率是优异的。
[0165]
从上述实施例2可知，各种乳酸菌中，长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76显示出最优异的炎症反应抑制效果。此外，在各种益生元中，发现壳聚糖、菊粉和柑橘果胶显示出优异的炎症反应抑制作用。
[0166]
实施例3评估乳酸菌的免疫调节作用
[0167]
(1)细胞分化率
[0168]
为了控制、预防、缓解或治疗过敏性疾病，特别是由1型超敏反应引起的疾病，在针对过敏原的免疫反应中，重要的是减少ige抗体的产生并增加释放il-10的调节性t细胞(treg细胞)的产生。众所周知，过敏反应不仅通过肥大细胞、嗜碱性粒细胞等产生的介质变
得更加复杂，而且通过这些细胞分泌的细胞因子的作用，以及作为由这些细胞因子的作用产生的过敏反应的一部分症状变得更加复杂。在肥大细胞中产生细胞因子如tnf-α、il-4、il-5、il-6、il-13等，这些细胞因子在召集嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞中起作用。此外，从肥大细胞分泌的il-4和il-13激活b细胞以产生ige抗体，并且il-5在召集和激活嗜酸性粒细胞中起作用。细胞因子如il-4和il-5通常被分类为th2细胞因子，因为许多这些细胞因子是从th2细胞分泌的，并且从肥大细胞和th2细胞分泌的细胞因子与各自的受体结合，因此起到诱导细胞之间相互作用并放大过敏反应的作用。此外，当tnf-α(一种代表性促炎细胞因子)在过敏状态下系统地大量产生时，可能发生过敏性休克症状。
[0169]
因此，为了评价从排泄物或白菜泡菜中分离的乳酸菌的免疫调节作用，通过测量分化成分泌所述细胞因子的细胞的抑制率和分化成treg细胞的增长率来检测乳酸菌对脾细胞免疫反应的作用。
[0170]
特别地，从c56bl/6j小鼠中分离脾脏，然后压碎，接着悬浮在含有10％fcs的rpmi 1640培养基中，然后通过使用cd4 t细胞分离试剂盒(默天旎生物技术，贝吉施格拉德巴赫，德国)分离cd4 t细胞。将分离的cd4 t细胞以每孔5
×
105个细胞分入12孔板。之后，在每个孔中培养细胞，加入抗cd3、抗cd28、il-2和il-12以诱导t细胞分化为th1细胞；加入抗cd3、抗cd28、il-2和il-4以诱导t细胞分化为th2细胞；加入抗cd3、抗cd28、il-6和tgf-β以诱导t细胞分化为th17细胞；加入抗cd3和抗cd28以诱导t细胞分化为treg细胞，以每孔1
×
105cfu加入试验材料即乳酸菌，培养4天。另外，为了比较乳酸菌的效果，使用各种益生元作为试验材料。
[0171]
之后，检测从脾中分离的t细胞分化为th1、th2、th17和treg细胞的潜能。特别地，培养液中的细胞用抗foxp3或抗il-17a抗体染色，之后通过facs(荧光激活细胞分选)装置(c6流式细胞仪系统，圣何塞，加州，美国)分析th1、th2、th17和treg细胞的分布，其结果显示在下表11至13中。在下表11至13中，乳酸菌没有显示种属名称，且给出由本发明人指定的菌株名称。
[0172]
表11
[0173]
[0174][0175]
表12
[0176][0177][0178]
表13
[0179][0180]
*抑制率：-,《10％；+,10-30％；++,30-60％；+++,》60％
[0181]
*增长率：-,《10％；+,10-50％；++,50-100％；+++,》100％
[0182]
*p1：菊粉；p2：柑橘果胶；p3：卡拉胶；p4：海藻糖；p5：乳果糖；p6：环糊精；p7：羧甲基纤维素；p8：明胶；p9：壳聚糖；p10：海藻酸；p11：低聚果糖；p12：脱脂大豆蛋白；p13：苹果果胶；p14：阿拉伯半乳聚糖；和p15：木聚糖
[0183]
作为表11至13中的实验结果，鉴定出t细胞的分化率根据乳酸菌的类型而不同。特别是在双歧杆菌属乳酸菌的情况下，分化为th1、th2和th17细胞的抑制率和分化为treg细胞的增长率根据乳酸菌的种类而不同，并且一部分乳酸菌显示出以下结果，其中th2细胞抑制率和treg细胞增长率与其他乳酸菌相反。在这些乳酸菌中，鉴定出长双歧杆菌im55对th1、th2和th17细胞的分化抑制率最高，同时分化为treg细胞的增长率最高。还有，乳酸杆菌属乳酸菌显示类似于双歧杆菌属乳酸菌的结果，其中细胞分化的抑制和增长率根据乳酸菌的类型而不同。在这些乳酸菌中，鉴定出植物乳杆菌im76的分化为th1、th2和th17细胞的抑制率和分化为treg细胞的增长率最高。
[0184]
(2)细胞因子表达率
[0185]
此外，检测从脾t细胞分化的th1、th2、th17和treg细胞的细胞因子和转录因子的表达率。特别地，通过qrt-pcr分别分析以下因子的表达水平：来自培养液中的用于诱导th1细胞分化的t-bet、ifn-γ和il-12；来自培养液的用于诱导th2细胞分化的gata3和il-5；来
自培养液的用于诱导th17细胞分化的rorγt和il-17；来自培养液的用于诱导treg细胞分化的foxp3和il-10。下表14以这样的方式显示结果，即用于qrt-pcr的引物序列对应于扩增目标的序列。此外，从脾t细胞分化的th1、th2、th17和treg细胞的细胞因子和转录因子的表达率的测量结果显示在下表15和16中。在下表15和16中，乳酸菌没有显示其种属名称，并给出本发明人指定的菌株名称。
[0186]
表14
[0187][0188]
表15
[0189][0190]
表16
[0191]
[0192][0193]
*抑制率：-,《10％；+,10-30％；++,30-60％；+++,》60％
[0194]
*增长率：-,《10％；+,10-50％；++,50-100％；+++,》100％
[0195]
作为表15和16中的测量结果，确定细胞因子表达的变化率根据乳酸菌的类型而不同。特别是在双歧杆菌属乳酸菌的情况下，一部分乳酸菌显示出以下结果，其中gata3和il-5表达的抑制率与其他乳酸菌的抑制率相反。在这些乳酸菌中，鉴定出长双歧杆菌im55对t-bet、ifn-γ、gata3、il-5、rorγt和il-17表达的抑制率最高，并且同时对foxp3和il-10表达的增长率最高。此外，在乳酸杆菌属乳酸菌的情况下，一部分乳酸菌的显示类似于双歧杆菌属乳酸菌的结果，其中细胞因子表达的变化率也不同。在这些乳酸菌中，鉴定出植物乳杆菌im76对t-bet、ifn-γ、gata3、il-5、rorγt和il-17表达的抑制率最高，并且同时对foxp3和il-10表达的增长率最高。
[0196]
实施例4.测试im55或im76的炎症反应抑制作用
[0197]
在上述实施例1中分离的乳酸菌中，对长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的炎症反应抑制作用进行了试验。
[0198]
(1)测试im55或im76对巨噬细胞的炎症反应抑制作用
[0199]
从raonbio有限公司购买7周龄balb/c雌性小鼠(20-22g)，并在实验前适应7天。将2ml的4％巯基乙酸盐腹腔内给予小鼠，然后在96小时后处死。用10毫升rpmi 1640收集腹腔液，在300
×
g的条件下离心10分钟，然后用rpmi 1640洗涤。将细胞以0.5
×
106个细胞/孔接种到12孔微孔板中，接着在含有1％抗生素-抗真菌剂和10％fbs的rpmi 1640培养基中在37℃下培养20小时，然后洗涤3次。附着的细胞用作巨噬细胞。为了测量im55或im76对细胞因子表达的影响，用1
×
105cfu/ml的乳酸菌以及炎症反应诱导剂(即lps)处理1
×
106细胞/孔的巨噬细胞20小时。通过与上述实施例2(1)相同的elisa试剂盒测量每种细胞因子的表达水平。作为测量的结果，确定施用im55或im76，il-10的表达增加并且il-12的表达被抑制(图1和2)。
[0200]
(2)测试im55或im76对树突细胞的炎症反应抑制作用
[0201]
根据已知方法(免疫药理学与免疫毒理学(immunopharmacol.immunotoxicol.),2016,38,447-454)，用rpmi 1640从7周龄balb/c雌性小鼠(20-22g)收集小鼠骨髓细胞。将2
×
106个收集的细胞接种到12孔板中，并在含有20ng/ml rgm-csf，10％fbs，1％抗生素-抗真菌剂和庆大霉素(150μg/ml)的rpmi 1640培养基中培养。
[0202]
为了测量im55或im76对细胞因子表达的影响，在培养的第3天和第6天用条件培养基替换所述细胞的培养基，以从中除去粒细胞，然后在培养第8天用1
×
105cfu/ml的乳酸菌和100ng/ml lps处理。通过与上述实施例2(2)相同的elisa试剂盒测量每种细胞因子的表达水平。作为测量的结果，确定施用im55或im76，il-10的表达增加并且tnf-α的表达被抑制(图3和4)。
[0203]
从上述实施例4的结果可以看出，新型乳酸菌即长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76显示出优异的炎症反应抑制效果，因此显示出对预防、缓解和治疗炎性疾病的优异效果。
[0204]
实施例5评估im55或im76的免疫调节作用
[0205]
通过与上述实施例3类似的方法分析t细胞分化率，以评价从上述实施例1中分离的乳酸菌中的长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的免疫调节作用。
[0206]
特别地，从7周龄balb/c雌性小鼠(20-22g)中无菌分离脾脏，随后适当压碎，然后用三缓冲氯化铵处理。将得到的细胞悬浮于含有10％fcs的rpmi 1640培养基中，然后使用pan t细胞分离试剂盒ⅱ从细胞悬浮液中分离t细胞。分别在以下条件培养细胞：加入抗cd28(1μg/ml)、抗cd3(1μg/ml)，ril-4(10μg/ml)和ril-2(10μg/ml)诱导分离的t细胞(1
×
105个细胞/孔)分化为th2细胞；加入抗cd28(1μg/ml)和抗cd3(1μg/ml)诱导t细胞(1
×
105细胞/孔)分化为treg细胞。以每孔1
×
105cfu/ml加入im55或im76各自培养细胞四天。从这些细胞中分离rna，然后通过进行qrt-pcr分析il-10、gata3、foxp3和il-5的表达水平。进行与上述实施例3相同的qrt-pcr，并使用与上述表14中相同的引物。
[0207]
作为分析的结果，确定用im55或im76处理，gata3和il-5的表达水平降低从而抑制分化成th2细胞(图5和6)，而foxp3和il-10的表达水平增加从而促进分化成treg细胞(图7和8)。
[0208]
从上述实施例5的结果可以看出，新型乳酸菌即长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76显示出优异的免疫调节作用，因此显示出对预防、减轻和治疗免疫疾病的优异效果。
[0209]
实施例6评价乳酸菌对鼻炎和哮喘的缓解作用(1)
[0210]
与支气管内窥镜检查一起进行的支气管肺泡灌洗(bal)已被广泛用于从上皮粘膜层收集细胞和其他可溶性成分，其覆盖呼吸道和肺泡。支气管肺泡灌洗液(balf)不仅包括血流中的各种蛋白质，还包括从包括上皮细胞和炎性细胞的各种细胞类型分泌的蛋白质。balf通常用于诊断支气管哮喘、支气管炎或肺病，或分析其病理状况。因此，为了确定缓解鼻炎和哮喘的效果，从血清和肺组织以及balf分析了与抗鼻炎和抗哮喘作用相关的指标。
[0211]
(1)实验方法
[0212]
将7周龄balb/c雌性小鼠(21-23g)在湿度为50％，温度为25℃，光照/黑暗循环为12:12小时的受控环境条件下适应一周。之后，将20μg诱导过敏的卵清蛋白(ova)和2mg氢氧化铝(明矾)悬浮于0.2ml磷酸盐缓冲盐水(pbs：ph 7.4)中，并在实验第1天和第14天腹腔注射到每只小鼠。然后，将100μg的ova溶解在10μl蒸馏水中，并在实验的第26天、第27天和第28天鼻内涂抹于每只小鼠以诱导过敏性鼻炎和哮喘。同时，在实验的第26天至第30天，每天一次口服给予每只小鼠试验药物，即乳酸菌，共5天。另外，用作阳性对照药物代替乳酸菌的地塞米松以1mg/kg体重的剂量腹腔内给药。此外，在正常组小鼠的情况下，未诱导过敏性鼻炎和哮喘，但是仅口服施用磷酸盐缓冲盐水(pbs：ph7.4)代替ova和试验药物。此外，在对照组小鼠的情况下，由此诱导过敏性鼻炎和哮喘，并且仅将磷酸盐缓冲盐水(pbs：ph7.4)作为试验药物口服给药。在实验结束后，将小鼠麻醉，然后从中收集血液、肺组织和balf。从通过离心收集的血液中分离血清，并用作测定样品。
[0213]
通过使用各种分析方法从血清、balf和肺组织分析与抗鼻炎和抗哮喘作用相关的指标。所用分析的每种分析方法和指标如下。
[0214]
*酶联免疫吸附试验(elisa)：il-10、il-5、il-6、il-4、ige等。
[0215]
*facs(荧光激活细胞分选)：t细胞的分布(th1：cd4
+
/ifn-γ
+
；th2：cd4
+
/il-4
+
；treg：cd4
+
/foxp3
+
；th17：cd4
+
/il-17
+
)，嗜酸性粒细胞的分布(cd11b
+
，siglec-f
+
)
[0216]
(2)实验结果
[0217]
作为实验的结果，确定在给予im55或im76的组的血清中与鼻炎和哮喘相关的指标il-5、ige和il-4的表达被显著抑制(表17和图9-11)。此外，还发现，在balf中，与鼻炎和哮喘相关的指标il-5和il-4的量显著降低，th2细胞和嗜酸性粒细胞的比例也显著降低(表18和图12-15)。此外，确定了balf中与预防和治疗鼻炎和哮喘的效果相关的il-10的表达增加，并且treg细胞的比例增加(表18和图16-17)。
[0218]
表17
[0219][0220]
表18
[0221][0222]
*抑制率:-,《10％；+,10-30％；++,30-60％；+++,》60％
[0223]
*增长率：-,《10％；+,10-50％；++,50-100％；+++,》100％
[0224]
实施例7评估乳酸菌对鼻炎和哮喘的缓解作用(2)
[0225]
(1)实验方法
[0226]
参考已知方法(oh等，免疫药理学与免疫毒理学,2013,35,678-686)制备ova诱导的过敏性鼻炎模型。特别地，将小鼠随机分成6组(每组n＝8)。对于5个组，在实验的第1天和第14天，将用硫酸铝钾溶液稀释的ova(20μg)腹腔内注射到小鼠中。并在实验的第26天，第27天和第28天将100μg的ova溶于10μl蒸馏水中，鼻内涂抹于每只所述小鼠以诱导过敏性鼻炎和哮喘。同时，从实验的第26天到第30天，每天一次给小鼠施用测试材料(im55(1
×
109cfu/小鼠)、im76(1
×
109cfu/小鼠)、地塞米松(1mg/kg)或盐水溶液)，共5天。在正常组小鼠的情况下，未诱导过敏性鼻炎和哮喘，但给其施用盐水溶液。通过向两鼻腔内给予ova(10μl/鼻孔，溶于10mg/ml生理盐水溶液)使其小鼠受到刺激，然后在实验的第31天对打喷嚏和揉鼻行为(鼻炎症状评分)的次数进行计数，计数时长为10分钟。
[0227]
分离肺和鼻腔组织用于活组织检查，然后用4％中性缓冲福尔马林固定，然后冷冻。通过使用低温恒温器，将所述冷冻组织切成10μm横截面，并用苏木精和曙红(h&e)和高碘酸希夫反应(pas)染色。
[0228]
此外，通过使用上述实施例3的各种分析方法，从鼻腔、血清、balf和肺组织分析了与抗鼻炎和抗哮喘作用相关的指标。特别是，通过elisa试剂盒测量鼻腔和血清的指标，通过qrt-pcr，使用上表14的引物，测量balf和肺组织的与鼻炎和哮喘有关的指标。
[0229]
(2)实验结果
[0230]
当用ova处理小鼠时，鼻炎症状评分(打喷嚏和揉鼻行为的数量)和过敏性鼻炎症状(包括鼻腔中il-4和il-5的表达)显著增加。然而，在用im55或im76治疗后，由ova引起的过敏性鼻炎症状和鼻腔中的il-4和il-5水平显著降低(图18至20)。此外，在用im55或im76治疗的情况下，由ova引起的鼻腔破坏得到缓解，并且鼻腔中上皮细胞的扩张得到缓解(图21)。
[0231]
此外，作为组织学检查的结果，在具有诱导性鼻炎的动物模型的情况下，诱导肺部炎症和水肿；il-5和gata3的表达增加，并且il-10和foxp3的表达降低。然而，在用im55或im76治疗后，由ova引起的肺组织破坏和上皮细胞的扩张被抑制，gata3和il-5的表达受到抑制，并且foxp3和il-10的表达增加(图22至26)。
[0232]
实施例8评价混合乳酸菌对鼻炎和哮喘的缓解作用(3)
[0233]
不仅评估im55或im76单独的作用，而且评估im55和im76混合物对缓解鼻炎和哮喘
的作用。特别地，通过与上述实施例3中相同的方法分析鼻炎症状评分、balf中嗜酸性粒细胞的分布率(％)和血液中细胞因子的表达水平。
[0234]
结果，发现以1：1、1：3和1：9的比例给予im55和im76混合物的组，用打喷嚏和揉鼻行为的数量检查的炎症症状评分降低，并且鼻腔中il-5的表达水平降低(图27)。此外，确定血清中il-5的表达水平降低(图28)。
[0235]
从上述实施例6至8中的诱导性鼻炎模型的实验可以看出，长双歧杆菌im55和植物乳杆菌im76的混合物显示出预防、缓解和治疗哮喘和鼻炎的效果。
[0236]
实施例9肠道微生物正常化和结肠炎减轻的效果
[0237]
最近报道，肠道微生物对过敏性疾病的发生和恶化具有影响，是过敏性疾病发生的重要因素。因此，为了鉴定根据新型乳酸菌的施用的结肠中微生物的变化，针对上述实施例7的过敏性鼻炎模型分析了结肠中细胞因子的表达和肠微生物的变化。
[0238]
特别地，通过使用takara热循环仪和sybr预混物从所述动物模型的结肠组织中分离出2μg rna。通过所述rna进行qpcr，用于qpcr的引物与上表14中所示的相同。
[0239]
作为分析的结果，在用ova处理后，结肠中il-4和il-5的表达增加并且il-10的表达降低。然而，在用im55、im76或其混合物处理后，发现il-4和il-5的表达降低并且il-10的表达增加(图29)。
[0240]
此外，在从所述动物模型中分离结肠后，通过使用takara热循环仪和syber预混物从所述动物模型的结肠液中分离100ng总dna。通过所述dna进行qpcr，用于qpcr的引物与下表19中所示的相同。
[0241]
表19
[0242][0243]
作为分析的结果，在用ova处理后，厚壁菌门、变形菌门和tm7的菌群增加，并且拟杆菌和放线菌的菌群减少，因此厚壁菌门/拟杆菌(f/b)和变形菌门/拟杆菌(p/b)的比例增加。然而，在用im55、im76或其混合物处理后，发现由ova增加的变形菌门菌群被显著抑制，并且恢复了由于鼻炎的发生而减少的拟杆菌和放线菌门菌群(图30)。
[0244]
从结果可以看出，im55、im76及其混合物不仅使改变的肠道微生物正常化，而且还显示出控制、预防、缓解和治疗结肠炎的效果。
[0245]
实施例10含有乳酸菌等的药物组合物的制备
[0246]
在制备以下药物组合物时，长双歧杆菌im55培养产物可以用长双歧杆菌im55菌株本身、其粉碎产物或其提取物代替。此外，在制备以下药物组合物时，长双歧杆菌im55培养产物可以用植物乳杆菌im76菌株本身、其粉碎产物或其提取物代替。此外，以下药物组合物可进一步包含壳聚糖。
[0247]
《10-1》粉末的制备
[0248]
长双歧杆菌im55培养产物20mg
[0249]
乳糖100mg
[0250]
滑石粉10mg
[0251]
将所述组分混合并装入气密包装中以制备粉末。
[0252]
《10-2》片剂的制备
[0253]
长双歧杆菌im55培养产物10mg
[0254]
玉米淀粉100mg
[0255]
乳糖100mg
[0256]
硬脂酸镁2mg
[0257]
根据制备片剂的常规方法将所述组分混合并压制以制备片剂。
[0258]
《10-3》胶囊制剂的制备
[0259]
长双歧杆菌im55培养产物10mg
[0260]
结晶纤维素3mg
[0261]
乳糖15mg
[0262]
硬脂酸镁0.2mg
[0263]
根据制备胶囊制剂的常规方法将所述组分混合，然后填充到明胶胶囊中以制备胶囊制剂。
[0264]
《10-4》药丸的准备
[0265]
长双歧杆菌im55培养产物10mg
[0266]
乳糖150mg
[0267]
甘油100mg
[0268]
木糖醇50mg
[0269]
根据常规方法将所述组分混合并制成丸剂，每丸剂为4g。
[0270]
《10-5》颗粒的制备
[0271]
长双歧杆菌im55培养产物15mg
[0272]
大豆提取物50mg
[0273]
葡萄糖200mg
[0274]
淀粉600mg
[0275]
将所述组分混合，接着向其中加入100mg 30％乙醇，随后在60℃下干燥，然后形成颗粒，再装入包装中。
[0276]
《10-6》注射剂的准备
[0277]
长双歧杆菌im55培养产物10mg
[0278]
焦亚硫酸钠3.0mg
[0279]
对羟基苯甲酸甲酯0.8mg
[0280]
对羟基苯甲酸丙酯0.1mg
[0281]
适量注射用无菌蒸馏水
[0282]
将所述组分混合，将2ml混合物装入安培瓶，之后灭菌，然后制备成注射剂。
[0283]
实施例11含有乳酸菌等的保健功能食品的制备
[0284]
在制备以下保健功能食品时，长双歧杆菌im55培养产物可以用长双歧杆菌im55菌株本身、其粉碎产物或其提取物代替。此外，在制备以下保健功能食品时，长双歧杆菌im55培养产物可以用植物乳杆菌im76菌株本身、其粉碎产物或其提取物代替。此外，以下保健功能食品还可含有壳聚糖。
[0285]
《11-1》面粉食品的准备
[0286]
将0.5重量份长双歧杆菌im55培养产物加入100重量份面粉中，然后将所得混合物用于制备面包、蛋糕、曲奇、饼干和面条。
[0287]
《11-2》乳制品的制备
[0288]
将0.5重量份长双歧杆菌im55培养产物加入100重量份的乳中，然后将所述乳用于制备各种乳制品，例如黄油和冰淇淋。
[0289]
《11-3》混合谷物粉末的制备
[0290]
将通过已知方法预糊化和干燥的糙米、大麦、糯米和薏仁进行烘烤，然后用研磨机制备成60目粒径的粉末。
[0291]
通过已知方法蒸煮和干燥的黑豆、黑芝麻和紫苏籽也被烘烤，然后用研磨机制成60目粒径的粉末。
[0292]
将所述制备的谷物、种子和坚果以及长双歧杆菌im55培养产物以下列比例混合以制备混合谷物粉末。
[0293]
谷物(30重量份糙米、17重量份薏仁和20重量份大麦)；
[0294]
种子和坚果(7重量份紫苏籽、8重量份黑豆和7重量份黑芝麻)；
[0295]
长双歧杆菌im55培养产物(1重量份)；
[0296]
灵芝(0.5重量份)；和
[0297]
地黄(0.5重量份)。
[0298]
《11-4》健康饮料的准备
[0299]
少量成分如高果糖玉米糖浆(0.5克)、低聚糖(4克)、糖(2克)、烹饪盐(0.5克)和水(77克)以及1克长双歧杆菌im55培养产物均匀混合，随后进行快速巴氏杀菌，然后装入每个小包装容器如玻璃瓶、pet瓶等中，以制备健康饮料。
[0300]
《11-5》蔬菜汁的制备
[0301]
将2g长双歧杆菌im55培养产物加入1000ml番茄或胡萝卜汁中以制备蔬菜汁。
[0302]
《11-6》果汁的制备
[0303]
将1g长双歧杆菌im55培养产物加入到1000ml苹果汁或葡萄汁中以制备果汁。
[0304]
6.乳酸菌的保藏信息
[0305]
本发明人为专利目的于2017年1月20日向韩国微生物培养中心(一家经认证的保藏机构(地址：韩国首尔西大门区弘济内2号街支路儒林大厦45楼))申请保藏长双歧杆菌im55，并获得了保藏号kccm11961p。此外，本发明人为专利目的于2017年1月20日向韩国微
生物培养中心(一家经认证的保藏机构(地址：韩国首尔西大门区弘济内2号街支路儒林大厦45楼))保藏植物乳杆菌im76，并获得了保藏号kccm11962p。所述乳酸菌的保藏是根据“国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约”进行的。
[0306]
如上所示，已经通过上面的实施例描述了本发明，但是本发明不必限于此，并且可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下进行各种修改。因此，本发明的保护范围应被解释为包括属于本发明所附权利要求范围的所有实施方式。
[0307]
[0308]

技术特征：
1.一种植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)im76 kccm11962p。2.如权利要求1所述的植物乳杆菌im76 kccm11962p，其特征在于，所述植物乳杆菌im76 kccm11962p包含seq id no：2的16s rdna序列。3.如权利要求1所述的植物乳杆菌im76 kccm11962p，其特征在于，所述植物乳杆菌im76 kccm11962p具有调节免疫力，抑制炎症反应或减轻过敏的作用。4.植物乳杆菌im76 kccm11962p的用途，用于制备用于预防或治疗过敏性疾病、免疫疾病或炎性疾病的药物组合物。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述植物乳杆菌im76kccm11962p是其活细胞体、其死细胞体、其培养产物或其粉碎产物。6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述过敏性疾病选自鼻炎、特应症、哮喘、特应性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性中耳炎、荨麻疹和过敏性休克中的至少一种。7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述免疫疾病选自克罗恩病、红斑、类风湿性关节炎、桥本氏甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森氏病、i型糖尿病、狼疮、慢性疲劳综合征、纤维肌痛综合征、甲状腺功能减退和甲状腺功能亢进症、硬皮病、白塞氏病、炎性肠病、多发性硬化症、肌无力、梅尼尔氏综合征、吉兰-巴雷综合征、干燥综合征、白斑、子宫内膜异位症、牛皮癣、粘膜白斑病、系统性硬皮病、哮喘和溃疡性结肠炎中的至少一种。8.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述炎性疾病选自关节炎、痛风、肝炎、肥胖症、角膜炎、胃炎、肠炎、肾炎、糖尿病、结核、支气管炎、胸膜炎、腹膜炎、脊椎炎、胰腺炎、炎性疼痛、尿道炎、膀胱炎、阴道炎、动脉硬化、败血病、烧伤、皮炎、牙周炎、牙龈炎和结肠炎中的至少一种。9.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含选自壳聚糖、菊粉和柑橘果胶中的至少一种。10.一种用于预防或治疗过敏性疾病、免疫疾病或炎性疾病的组合物，包含植物乳杆菌im76 kccm11962p。11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物。

技术总结
根据本发明的特定双歧杆菌属菌株或特定乳酸杆菌菌株分离自人的排泄物或甘蓝泡菜，因此是高度安全的并且具有生理活性，例如免疫调节作用和炎症反应抑制作用。因此，根据本发明的特定双歧杆菌属菌株或特定乳酸杆菌菌株可以用作调节免疫力和抑制炎症反应的材料，并且还可以用作用于预防、缓解或治疗为过敏性疾病的鼻炎、特应症和哮喘的功能性食品和药物材料。料。[转续页]


技术研发人员：金东铉 韩明珠
受保护的技术使用者：株式会社那笔制药
技术研发日：2018.01.31
技术公布日：2023/9/5