无成瘤性MDCK基因工程细胞株及其制备方法和应用

无成瘤性mdck基因工程细胞株及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及无成瘤性mdck基因工程细胞株及其制备方法和应用。


背景技术：

2.流感病毒是一种传播速度快且极易变异的急性呼吸道传染病病毒，接种流感疫苗是目前预防流感的最佳方法。mdck细胞对流感病毒敏感性较高且倍增时间较短，已成为流感病毒相关研究的首选细胞株。不过现有研究表明，将mdck活细胞注入balb/c裸鼠体内会形成肿瘤，即mdck细胞具有成瘤性，故在一定程度上限制了其应用。近年来发现mirna作为非编码rna，与mrna互作，参与肿瘤等多种疾病的发生发展，但mirna是否参与mdck细胞成瘤表型的调控，未见相关报道。因此，探索mirna对mdck细胞成瘤性的调节作用及其分子机制，靶向干预，有助于提高mdck细胞基质生产流感疫苗的应用安全性。


技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了无成瘤性mdck基因工程细胞株及其制备方法和应用。
4.本发明提供无成瘤性mdck基因工程细胞株，所述mdck基因工程细胞株为mir-2779-x过表达稳转mdck细胞株。
5.作为优选，所述mir-2779-x的核苷酸序列为：uccggcucgaaggaccau。
6.本发明还提供上述的无成瘤性mdck基因工程细胞株的构建方法，设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体，转染mdck成瘤性细胞，经嘌呤霉素筛选后获得mir-2779-x过表达稳转细胞株。
7.作为优选，所述设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体具体为：将mir-2779-x和gv369载体通过agei/nhei酶切位点进行连接，连接产物转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑选阳性克隆转化子进行质粒抽提，获得mir-2779过表达质粒，将mir-2779过表达质粒和慢病毒包装辅助质粒共转染至293t细胞中，收集细胞上清液进行纯化，得到mir-2779-x过表达慢病毒载体。
8.作为优选，所述转染mdck成瘤性细胞时，转染moi值为100，于37℃，5％co2条件下培养。
9.本发明还提供上述的无成瘤性mdck基因工程细胞株在流感病毒增殖培养或制备流感病毒疫苗中的应用。
10.作为优选，所述无成瘤性mdck基因工程细胞株作为细胞基质用于流感疫苗生产。
11.作为优选，将mdck基因工程细胞株接种动物后，所述mdck基因工程细胞株对接种动物不成瘤。
12.本发明首先对引进的具有成瘤性的mdck细胞株和无成瘤性单克隆细胞株进行mirna高通量测序和生物信息学分析，得到了35个显著差异表达的mirnas。利用rnahybrid+svm-light,miranda和targetscan软件对mirna靶基因进行预测，获得了如bak1、pik3r1、
wnt9b、mtor、braf和il2等与肿瘤发生发展相关的功能基因。通过go和kegg对靶基因注释，差异表达基因显著富集的前20个通路中，其中与成瘤性相关的通路有：rap1信号通路、notch通路、mapk通路、vegf信号通路等肿瘤相关经典通路。构建了参与mdck细胞成瘤表型的mirna-mrna互作网络，获得了mir-2779-x，mir-424-x，mir-236-y等6个关键mirnas。利用qrt-pcr对差异表达的mirna进行验证，结果发现mir-2779-x组内平行性较好，组间差异最显著。通过western blot方法检测不同成瘤性mdck细胞中bak1蛋白表达，结果发现与高成瘤mdck细胞相比，(mdck-cb057)细胞中bak1蛋白的表达水平显著降低，且与mir-2779-x表达呈负向调控关系，初步确定mirna-2779及bak1可能是调控mdck细胞成瘤性的关键mirna和靶基因。
13.利用双荧光素酶基因报告载体验证bak13'utr与mir-2779-x的结合关系，结果发现在bak1野生型转染细胞中，mir-2779-x模拟物处理组的荧光素酶活性显著下降至对照组的80％(p＜0.05)；在bak1突变型转染细胞中，mir-2779-x模拟物处理组的荧光素酶活性显著上升为对照组的1.12倍(p＞0.05)。
14.设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体，转染mdck成瘤性细胞，经嘌呤霉素筛选10代后获得mir-2779-x过表达稳转细胞株，与对照组相比mir-2779-x过表达mdck细胞mir-2779-x表达水平显著上调，bak1表达水平显著下调(p＜0.05)。参照中华人民共和国药典三部(2020年版)规定进行裸鼠荷瘤试验，结果，mir-2779-x过表达细胞株成瘤性显著降低，且裸鼠体重增长速度显著高于对照组(p＜0.05)。荷瘤试验后，提取mdck细胞、mdck细胞注射部位形成瘤体和裸鼠部分组织器官dna，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定瘤体种属来源，结果发现裸鼠瘤体可扩增出cox1片段(犬源基因)，而裸鼠其他器官未出现犬源基因表达。结论：mir-2779-x可通过抑制bak1的表达，参与调节mdck细胞成瘤表型；同时，实验构建了mir-2779-x过表达稳转细胞株，为建立低成瘤性mdck基因工程细胞株提供了新思路。
附图说明
15.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
16.图1中，图a为上调和下调表达的差异mirna的数量，图b为各组中差异表达mirna的热图分析，图c为ht01 vs.nt01和ht02 vs.nt02比较组的韦恩图，mir-2779-x是两组中唯一交集mirna。
17.图2中，图a为排名前20位的差异表达mirna靶基因的go条目，图b为排名前20位的差异表达mirna靶基因的kegg分析。
18.图3中，图a为与成瘤性相关的mirna及其靶基因的网络互作图，在该网络图中，深灰色为mirna，浅灰色为mrna。图b为mir-2779-x的全部靶基因，其中，靶基因为灰白色，与致瘤性相关的靶基因为灰色，与靶基因相关的信号分子和相互作用为深灰色，与细胞生长和死亡相关的靶基因为浅灰色。图c为通过qpcr检测mir-2779-x在mdck-ht01、mdck-ht01、mdck-nt01和mdck-nt02细胞中的表达水平。
19.图4中，图a为miranda预测mir-2779-x与bak13'utr之间的结合位点(cfa为犬属canis lupus familiars的简称)；图b为c-bak1-wt和c-bak1-mut测序结果。突变位点显示在标记的红色区域中；图c为c-bak1-wt和c-bak1-mut与mir-2779-x模拟物共同转化到293t
细胞的荧光表达水平。
20.图5中，图a为将mir-2779-x慢病毒质粒和对照质粒转染mdck细胞，荧光效率达到95％以上。图b为mir-2779-x在lv-mir-2779-x和lv-control中的相对表达量。图c为mir-2779-x靶蛋白bak1的相对表达水平。
21.图6中，图a为lv-mir-2779-x和lv-control的克隆形成率；图b为各组细胞体内成瘤检查结果；图c为各组裸鼠肿瘤体积和体重生长速率。
22.图7中，图a为正常裸鼠皮下组织切片(40
×
)。图b为裸鼠皮下肿瘤组织切片(40
×
)。图c为正常裸鼠皮下组织局部放大(400
×
)。图d和图e为裸鼠皮下肿瘤局部放大(400倍)。
23.图8中，图a-c依次为lv-control、lv-mir-2779-x、未经处理mdck细胞组(图中为“mdck-m”)心肌结构，图d-f依次为lv-control、lv-mir-2779-x、未经处理mdck细胞组肺脏组织结构，图g-i依次为lv-control、lv-mir-2779-x、未经处理mdck细胞组肾脏组织结构。
24.图9中，m为dnamarker，泳道2、3为未注射mdck细胞裸鼠组织组；泳道4、5为mdck细胞组；泳道6-13依次为注射mdck细胞后裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、皮肤、皮下淋巴结组织组；泳道14-16为mdck细胞注射裸鼠瘤体组。
具体实施方式
25.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
26.实施例1
27.1方法
28.1.1细胞培养及测序分析
29.mdck贴壁型细胞系自美国典型培养物保藏中心(atcc)引进，编号为ccl-34
tm
，批号：60245139，引进时代次为55代。引进后建立三级细胞库(原始库、主库和工作库)，前期试验证明其具有成瘤性。通过单细胞克隆自制获得到克隆细胞株，经过核型鉴定、平板克隆试验、软琼脂克隆、裸鼠成瘤等多重筛选，获得无成瘤性的mdck单克隆细胞株(mdck-ca005和mdck-cb057)。在含10％fbs(cellmax，beijing china)的dmem中，5％co2，37℃培养条件下传代培养，每36h可传代一次，传代比例为1:4。在已建立的mdck三级细胞库中提取两株主库细胞mdck-m01(ht-01)、mdck-m02(ht-02)和无成瘤性的单克隆细胞株mdck-ca005(简称“nt-01”)和mdck-cb057(简称“nt-02”)的rna。检测rna纯度符合要求后，使用illuminahiseq tm 2500进行测序。small rna-seq在广州基迪奥生物科技有限公司完成。
30.1.2smallrna-seq差异表达分析
31.低质量数据经过fastq过滤，使用blastall 2.2.25(blastn)软件将所有clean tags与genebank数据库(release 209.0)中的小rna进行比对，识别并去除rrna、scrna、snorna、snrna和trna。total mirna包括已存在mirna、已知mirna和新mirna，对每个样本中的total mirna表达量进行计算，并将表达量以tpm进行标准化。本文中显著差异表达mirnas筛选条件设定为差异倍数大于2，p《0.05的mirnas。
32.1.3mirna靶基因预测和信号通路分析
33.基于已存在mirnas、已知mirnas和新mirnas的序列信息，对候选mirnas靶基因使用rnahybrid(version 2.1.2)+svm-light(version 6.01)，miranda(version 3.3a)和targetscan(version 7.0)进行联合分析，选择预测结果的交集作为预测的mirnas靶基因。通过fdr校正之后，以修正后的p值≤0.05为阈值，将候选基因映射至go数据库，统计go功能的基因列表及基因数目；利用kegg和超几何检验找出在候选基因中显著性富集的pathway。利用cytoscape软件构建显著差异表达mirnas与成瘤性相关靶基因的互作关系网络。
34.1.4双荧光素酶报告基因试验
35.含10％fbs dmem培养基培养贴壁mdck细胞(编号为mdck-ht02)，0.25％胰蛋白酶消化后使用原培养基重悬为细胞悬液，经10000rpm离心1min，去上清液，按照tianamp genomic dnakit说明书提取dna。根据ncbi中bak1基因3’utr序列设计并合成pcr扩增引物，引物序列如表1中no.1和no.2。以mdck细胞dna为模板，pcr扩增合成3’utr序列片段，使用限制性内切酶分别对pcr产物和载体pmir-rb-report
tm
(广州锐博，中国广东)的xhol和notl酶切位点双酶切，酶切位点引物序列如表1中no.3和no.4，37℃过夜，2％琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段，产物于16℃进行连接反应后转化dh5α感受态细胞，挑选阳性菌落pcr及测序鉴定。将含有目的序列的野生型质粒命名为c-bak1-wt，突变型质粒命名为c-bak1-mut。
36.表1双荧光素酶试验质粒序列
[0037][0038]
含10％fbs的dmem培养基37℃，5％co2的条件培养293t细胞。待细胞培养至对数生长期时，以每孔1.0
×
104细胞接种于96孔板中，每孔总体积100μl，37℃培养。取5μlopti-mem培养基分别稀释mirna-2779-x mimics(mirna-2779-x增强剂，提供mirna-2779-x核酸序列后可由公司合成，具备转染后瞬时过表达mirna的功能)，c-bak1-wt，c-bak1-mut；5μl opti-mem培养基稀释0.25μl lipo6000
tm
转染试剂，二者混合摇匀，室温静置5min。每孔加入90μl含293t细胞的培养基，再加入上述混合液10μl，最终每孔总体积100μl。试验分为4组，c-bak1-wt+nc(野生型质粒+空载体)、c-bak1-wt+mir-2779-x(野生型质粒+mir-2779-x增强剂)、c-bak1-mut+nc(突变型质粒+空载体)和c-bak1-mut+mir-2779-x(突变型质粒+mir-2779-x增强剂)。每组设置3个重复，转染6h后更换培养液。按照luciferaseassay system试剂盒说明书进行操作，转染48h后吸出培养液，以35μl/孔加入pbs，并加入luciferase reagent 35μl/孔，振荡10min，转移至lumitrac
tm
20096孔白色细胞培养板中，测定萤火虫荧光素酶活性荧光值。加入30μl stop reagent，振荡10min，测定海肾荧光素酶活性荧光值。
[0039]
1.5mir-2779-x过表达载体构建
[0040]
mir-2779-x序列为uccggcucgaaggaccau，设计mir-2779-x引物序列，mir-2779-x-f:gaggatccccgggtaccggtctggaggcttgctgaaggc，mir-2779-x-r:cacacattccacaggctagcgggccatttgttccatgtg。pcr反应扩增microrna，反应体系如表2所示，pcr反应条件为：98℃5min，98℃10s，55℃10s，72℃30s，共30个循环；72℃8min。选用gv369载体(吉凯基因，中国上海)。载体元件顺序为ubi-mcs-sv40-egfp-ires-puromycin，克隆位点为agei/nhei。pcr
获取目的片段后与酶切后载体进行交换反应，反应体系如表3所示。
[0041]
将10μl交换反应产物加入到100μl dh5α感受态细胞中，轻弹管壁置于冰上30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500ul lb培养基中，置于37℃摇床振荡培养1h，取适量菌液涂布于含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h后挑选阳性克隆转化子及测序鉴定。对测序结果与目的基因序列进行比对分析后进行质粒抽提，建立mir-2779-x过表达质粒。将mir-2779-x过表达质粒，慢病毒包装辅助质粒(helper1.0)和慢病毒包装辅助质粒(helper 2.0)共转染至293t细胞中，收集转染后48h的细胞上清液，经浓缩和纯化后获得mir-2779-x过表达慢病毒溶液，委托上海吉凯公司对慢病毒溶液物理状态检测、无菌检测及病毒滴度检测。
[0042]
表2pcr扩增microrna反应体系
[0043][0044]
表3pcr产物与载体交换反应体系
[0045][0046]
1.6细胞转染
[0047]
取生长状态良好，单层融合率90％的mdck-m02细胞消化计数，调整细胞密度为1
×
104cells/ml，接种至12孔板中，分别将步骤1.5得到的mir-2779-x慢病毒质粒和对照质粒(空载体质粒)转染mdck-m02细胞，转染moi值设为100，根据慢病毒滴度计算各组所需病毒液体积，37℃，5％co2培养12h，弃混合液，加入500μl完全培养基，37℃，5％co2培养36h，荧光倒置显微镜下观察细胞转染效率。0.4μg抗嘌呤霉素10％fbs dmem培养基连续筛选10代，获得稳定转染mir-2779-x细胞系。
[0048]
1.7qrt-pcr
[0049]
trizol-异丙醇法提取细胞总rna，取bulge-loop
tm mirnaprimer(20um)加入150ul rnase free water，配置成bulge-loop
tm mirnaprimer(5um)，200ulpcr管中混匀体系。轻轻吹打7～8次，瞬时离心5～10s，pcr仪设置反转录反应程序为42℃，60min；70℃，10min。5s rrna和mir-2779-x茎环法引物由广州锐博生物技术有限公司设计并合成，按照bulge-loop
tm mirnaqrt-pcr starter kit说明书进行qpcr反应，每组实验重复三次。1.8western blot
[0050]
用细胞刮刀提取细胞，加入ripa&pmsf混合液中(1：100)，提取蛋白。bca法进行蛋白定量。配置12％聚丙烯酰胺分离胶，5％聚丙烯酰胺浓缩胶，甘氨酸电泳缓冲液中进行电泳，上样量为10μl，80v，20min；120v，1h。电泳结束后采用湿转法转膜，200ma，1h，5％脱脂奶粉封闭1h，tbst清洗3次，每次5min。一抗(1：1000)过夜孵育，tbst清洗3次，每次5min。二抗(1：2000)孵育1h，tbst清洗3次，每次5min。避光混匀ecl超敏发光液a液与b液，吹打4-5次混匀，吸取适量混合液滴至pvdf膜上，静置1min，曝光时间设置为2s，拍照并分析图像数据。
[0051]
1.9克隆形成实验
[0052]
取生长良好、对数生长期的mdck细胞，消化成细胞悬液，以500cells/孔的浓度接种入6孔板中，加入完全培养基4ml培养6天。待细胞形成肉眼可见的集落后，弃去培养基，pbs清洗两遍；用100％甲醇进行固定，室温30min，弃掉各孔中的甲醇；每孔加入2ml结晶紫溶液，室温染色30min；弃去结晶紫，用自来水冲洗干净，室温晾干后置于倒置显微镜下观察并计数(10倍物镜下随机选择五个视野，分别计数)。只有包含50个细胞以上的集落才能被计入总数。本实验至少重复三次。
[0053]
1.10裸鼠成瘤试验
[0054]
4～6周龄雌性balb/c裸鼠30只，购买自北京维通利华，环境温度23
±
2℃，光照条件为12h光照：12h黑暗，自由饮食饮水。实验前随机将其分为阳性对照组(注射hela细胞)和阴性对照组(注射mrc-5细胞)，空载体对照组(注射lv-control细胞)，过表达mir-2779-x组(注射lv-mir-2779-x细胞)，每组10只。取单层细胞融合率达到90％的慢病毒转染后mdck细胞，制备细胞悬液。在裸鼠肩胛骨部皮下接种0.2ml细胞悬液，即1
×
107个细胞，注射完成后每五天记录裸鼠体重变化与注射部位形成瘤体体积变化，30天后处死并剖检小鼠，分离裸鼠瘤体及心、肺、肝、脾、肾等组织器官于4％甲醛中保存。
[0055]
1.11种属鉴定
[0056]
设计并合成犬属cox1引物，cox1-f：atccgagccgaactaggtcagc，cox1-f：aggatggaggaaggagtcagaagc。取-80℃保存的mdck-ht02细胞、皮下肿瘤和裸鼠正常组织，分别提取组织与细胞基因组dna。检测浓度和纯度后，进行pcr反应，取2μl pcr产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，反应条件为120v，45min，紫外检测仪下观察电泳结果并拍照。
[0057]
1.12 he染色
[0058]
取固定于多聚甲醛中的组织块，流水冲洗组织块6h；设置脱水与透明程序：70％(24h)
→
80％(24h)
→
95％(2h)
→
95％(12h)
→
100％(1h)
→
100％(1h)
→
苯酒精(1:1,5min)
→
二甲苯i(5s)
→
二甲苯ⅱ(5s)
→
苯蜡(1:1m，1h)
→
石蜡i(52-56℃，30min)
→
石蜡ⅱ(56-58℃,1h)
→
石蜡iii(58-60℃,1h)，自动包埋机包埋组织，蜡块连续切片，厚度切片4μm，捞片固定于载玻片后，58℃烤片。石蜡切片二甲苯中脱蜡2次每次5-10min。系列乙醇(100％、95％、85％、75％)复水，每梯度3min。蒸馏水2min。苏木素染液染色2-20min，蒸馏水洗去浮色。分化液分化3min，自来水冲洗2次，每次2min。置伊红染液30s-2min，蒸馏水稍洗2-3s，快速脱水。75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和100％乙醇(i)各浸洗2-3s。100％乙醇(ⅱ)浸洗1min，二甲苯透明两次，每次1min，中性树胶封片，镜下观察。
[0059]
1.13流感病毒敏感性试验
[0060]
将lv-mir-2779-x和lv-control细胞铺至6孔板中，12h左右细胞生长至80％-90％，用无ca
2+
、mg
2+
的pbs清洗2遍，在dmem培养基(不含血清)下，以0.001病毒感染复数
(moi)接种a/california/7/2009x-179a(h1n1)流感病毒毒株，并按1:1000(v:v)的比例添加2.5mg/ml tpck胰蛋白酶，在34℃，5％co2培养箱中培养，分别在接毒后24h、48h、72h，收取病毒液，于1.5ml离心管中存-80冰箱。
[0061]
tcid
50
的检测：在倒置显微镜下对mdck主库细胞进行观察，待t75瓶中的贴壁细胞达到80％-90％的致密程度后，以200μl/孔加至96孔板中，置于37℃的co2培养箱中培养。观察到孔内的mdck贴壁细胞长成单片80％-90％后，弃去细胞板内的培养基，用pbs缓冲溶液洗涤2次。除去培养基内的残留血清后，加细胞维持液(dmem含tpck胰酶)100μl/孔(四周边孔200μl/孔)。
[0062]
用不含血清的细胞维持液(dmem含tpck胰酶2.5μg/ml)梯度稀释样品。病毒样品经系列稀释后的最终浓度分别达到10-1
lgtcid
50
/ml、10-2
lgtcid
50
/ml、10-3
lgtcid
50
/ml、10-4
lgtcid
50
/ml、10-5
lgtcid
50
/ml、10-6
lgtcid
50
/ml、10-7
lgtcid
50
/ml、10-8
lgtcid
50
/ml、10-9
lgtcid
50
/ml。根据实验选择合适的病毒液浓度进行接种。为排除边缘效应对实验结果的干扰，边缘孔均作为空白对照不添加病毒样品。吸取100μl经系列稀释后的病毒液样品到96孔板，每个病毒样品梯度做6个复孔。样品从低稀释度
→
高稀释度接种，100μl/孔，6孔/样，每板留一列只加维持液(dmem含tpck胰酶)做阴性对照(200μl/孔)。将96板置于34℃的恒co2培养箱中培养1-2h，待病毒完全吸附后，加入100μl病毒维持液后继续置于培养箱中培养72h后观察细胞病变情况。
[0063]
1.14数据统计
[0064]
所有统计评估均采用graphpad prism 8.0.2进行组间差异分析，p＜0.05表明差异显著，每组实验重复三次，利用t检验比较组间差异。
[0065]
2结果
[0066]
2.1不同成瘤性mdck细胞mirnas表达及靶基因预测
[0067]
通过mirna-seq共得到了14597969～16523140的clean tags，4个样本中共发现256个犬中已存在mirnas，这些mirnas属于204个mirnas家族；602个已知mirnas和新mirnas 991个。ht vs.nt共发现35个显著差异表达mirnas，包括21个上调和14个下调mirnas(如图1a和图1b)。组间差异表达mirnas维恩图如图1c所示，mir-2779-x是唯一的组间差异表达mirna。
[0068]
图1中，图a为上调和下调表达的差异mirna的数量，图b为各组中差异表达mirna的热图分析，图c为ht01 vs.nt01和ht02 vs.nt02比较组的韦恩图，mir-2779-x是两组中唯一交集mirna。
[0069]
通过rnahybrid(v2.1.2)+svm_light(v6.01)，miranda(v3.3a)，targetscan(version:7.0)三种方法对测序数据中1849个已存在的mirna和新的mirna进行靶基因预测，总共获得26641个靶基因，其中de mirnas对应的靶基因数目为18331个。分析获得了肿瘤进程相关的功能基于如pik3r1、wnt9b、mtor、braf、il2、bak1等，这些mirnas可能是调控成瘤性的关键分子。
[0070]
2.2差异表达mirnas的靶基因分析
[0071]
mirnas通常通过与靶基因结合调控靶基因所在信号通路相关因子，从而参与生物学进程。使用gene ontology(go)数据库分析靶基因功能，如图2所示，发现结合、代谢过程、生物调节、催化活性和蛋白结合被biological process(bp)富集到，这提示我们这些生物
进程可能与细胞的成瘤性相关进程，多数靶基因富集在cell surface receptor signaling pathway，localization，regulation ofbiological quality，establishment oflocalization。molecular function(mf)在富集结合和粘附方面，细胞质膜和细胞外周被cellular component(cc)富集，说明靶基因可能在这些区域发挥生物学功能。
[0072]
图2中，图a为排名前20位的差异表达mirna靶基因的go条目，图b为排名前20位的差异表达mirna靶基因的kegg分析。
[0073]
通路分析富集到排名前20位的与成瘤性相关的通路有：rap1信号通路，癌症中的microrna，pi3k-akt信号通路，癌症中的信号通路等。mdck接种新生裸鼠后所形成的结节组织化学染色后发现，其组织特征与腺癌类似，且具有一定的组织迁移能力，可以形成肺转移和脊髓转移，且肿瘤细胞都具有高度的增殖性，故在寻找与成瘤性相关的富集通路时也应考虑其与持续的血管生成，组织侵袭和转移，增殖有关的通路。与持续的血管生成有关的通路为vegf信号通路，mapk信号通路，jak-stat信号通路，pi3k-akt信号通路，m-tor信号通路，notch信号通路，hif1信号通路；与组织侵袭和迁移有关的信号通路为wnt信号通路。
[0074]
2.3建立成瘤性相关mirna-mrna互作网络
[0075]
根据差异表达mirna与靶基因的互作关系，使用cytoscape软件构建调控网络；根据基因功能和所在通路调取其中与成瘤相关的数据建立成瘤性相关mirna-mrna互作网络(图3a&图3b)。其中，mir-2779-x是唯一的分组间差异表达mirna，其靶基因包括多个与肿瘤进程相关的基因，如：bak1(bcl2家族蛋白成员)是其靶基因中的一个，bcl2家族蛋白在细胞凋亡、肿瘤发生和抗癌治疗中具有重要作用。qpcr方法检测各测序细胞中mir-2779-x的表达水平，结果显示，mir-2779-x组内平行性较好，组间差异最显著；无成瘤的单克隆细胞(nt01和nt02)中mir-2779-x表达水平显著高于主库细胞ht-01和ht-02(图3c)。因此，我们选取mir-2779-x进行后续研究。
[0076]
图3中，图a为与成瘤性相关的mirna及其靶基因的网络互作图，在该网络图中，深灰色为mirna，浅灰色为mrna。图b为mir-2779-x的全部靶基因，其中，靶基因为灰白色，与致瘤性相关的靶基因为灰色，与靶基因相关的信号分子和相互作用为深灰色，与细胞生长和死亡相关的靶基因为浅灰色。图c为通过qpcr检测mir-2779-x在mdck-ht01、mdck-ht01、mdck-nt01和mdck-nt02细胞中的表达水平。
[0077]
2.4mir-2779-x与bak13’utr具有靶向结合关系
[0078]
miranda软件预测mir-2799-x种子区域与bak13
’‑
非编码区域结合关系，结果发现mir-2779-x种子区域与bak13’非编码区域理论上存在一个结合区域，结合区域位于1006-1012bp处，共7个碱基，结合自由能为-17.25kcal/mol，如图4a所示。针对mir-2779与bak1预测的结合位点(5
’‑3’
)突变位点末端设计反向引物，其序列为5
’‑
aatgcggccgcgccggcctctacgtaaaacttcgagccagtatcgagggggcaag tgggccgagctgccccttctacc-3’，c-bak1-wt重组质粒成功导入了长度为695bp的bak13’utr区域，从而获得突变型重组质粒c-bak1-mut。c-bak1-mut重组质粒测序结果表明bak13’utr区域与mir-2779-x的结合区域gagccgg成功突变为ctcggcc，c-bak1-mut重组质粒构建成功(图4b)。
[0079]
将c-bak1-wt重组质粒和c-bak1-mut重组质粒分别与mir-2779mimics共转293t细胞后检测荧光强度，校正荧光强度后分析数据，结果发现，与nc相比，转染mir-2779mimics后，c-bak1-wt的萤光表达水平显著下调(p＜0.05，如图4c所示)；c-bak1-mut萤光表达水平
稍有上调，但是无显著差异(p＞0.05，如图4c所示)。该结果表明，mir-2779-x可与bak1的3’utr靶向结合，从而抑制bak1转录活性，bak1的3’utr位点突变则抑制mir-2779-x结合。
[0080]
图4中，图a为miranda预测mir-2779-x与bak13'utr之间的结合位点(cfa为犬属canis lupus familiars的简称)；图b为c-bak1-wt和c-bak1-mut测序结果。突变位点显示在标记的红色区域中；图c为c-bak1-wt和c-bak1-mut与mir-2779-x模拟物共同转化到293t细胞的荧光表达水平。
[0081]
2.5稳定过表达mir-2779-x的mdck细胞株的建立
[0082]
mir-2779-x序列为uccggcucgaaggaccau，设计引物序列设计mir-2779-x-f:gaggatccccgggtaccggtctggaggcttgctgaaggc，mir-2779-x-r:cacacat tccacaggctagcgggccatttgttccatgtg。双酶切实验将mir-2779-x连接至慢病毒质粒上，挑选阳性克隆进行测序。菌液测序结果为：菌液测序结果为：
[0083][0084]
其中，加粗部分为插入的目标序列，下划线部分为引物的反向互补序列。
[0085]
我们成功构建了携带mir-2779-x序列的慢病毒质粒，可进行后续实验。将携带mir-2779-x的质粒与转染辅助质粒共转染293t细胞后，倒置荧光显微镜观察发现感染效率可达90％以上。支原体、衣原体、细菌、真菌检测均为阴性，内毒素含量小于50eu/ml，慢病毒滴度为3
×
108tu/ml。
[0086]
分别转染mir-2779-x慢病毒质粒和对照质粒至mdck细胞，嘌呤霉素传代筛选10代。倒置荧光显微镜观察荧光效率可达95％以上，如图5a所示。经传代10代后，与对照质粒转染的细胞相比相比，转染组mir-2779-x表达水平显著上调2.9倍(p＜0.05，图5b)，mir-2779-x靶基因bak1 mrna和蛋白表达水平显著下调(p＜0.05，图5c)。因此，将该mdck细胞命名为lv-mir-2779-x，转染对照质粒的mdck细胞命名为lv-control。
[0087]
图5中，图a为将mir-2779-x慢病毒质粒和对照质粒转染mdck细胞，荧光效率达到95％以上。图b为mir-2779-x在lv-mir-2779-x和lv-control中的相对表达量。图c为mir-2779-x靶蛋白bak1的相对表达水平。
[0088]
2.6mir-2779-x能够抑制mdck细胞成瘤性
[0089]
平板克隆试验有助于体外判断细胞成瘤特性。本研究中，每组接种细胞500个，常规培养6天。结果显示，lv-mir-2779-x组的集落形成率低于对照组(p《0.05)，图6a。
[0090]
将mir-2779-x过表达mdck细胞(lv-mir-2779-x)、mir-2779-x过表达对照细胞(lv-control)、hela细胞(阳性对照)以及mrc-5细胞(阴性对照)注射裸鼠后，hela细胞所形成的的瘤体呈现表面结节较多的实体瘤，成瘤率为100％，mdck细胞所形成的瘤体边界清晰，大多为内含液体的中空瘤体，形态如图6b所示，统计结果如表4所示。
[0091]
图6中，图a为lv-mir-2779-x和lv-control的克隆形成率；图b为各组细胞体内成瘤检查结果；图c为各组裸鼠肿瘤体积和体重生长速率。
[0092]
表4裸鼠荷瘤试验成瘤率统计
[0093][0094]
2.7mdck细胞形成瘤体组织结构观察
[0095]
对lv-mir-2779-x mdck细胞注射裸鼠肩胛骨部位形成瘤体进行he染色，对瘤体组织与裸鼠正常皮肤组织结构进行比较(如图7所示)。瘤体组织中可见明显的腺体组织，与周围组织边界清晰，未发现明显浸润或黏连。lv-mir-2779-x组心肌纤维连接紧密，可见粗大的长条状心肌细胞，与对照组组织相比未发现明显异常；肺脏组织肺泡完整，肺泡周围炎性细胞浸润，肺泡壁增厚；肾脏组织可见呈椭圆形且与肾间质边界清晰的肾小球，未发现明显炎性细胞浸润现象。综上，lv-mir-2779-x mdck细胞注射裸鼠所形成瘤体未在裸鼠心、肺、肾发生明显转移。裸鼠心、肺、肾组织结构如图8所示。
[0096]
图7中，图a为正常裸鼠皮下组织切片(40
×
)。图b为裸鼠皮下肿瘤组织切片(40
×
)。图c为正常裸鼠皮下组织局部放大(400
×
)。图d和图e为裸鼠皮下肿瘤局部放大(400倍)。
[0097]
图8中，图a-c依次为lv-control、lv-mir-2779-x、未经处理mdck细胞组(图中为“mdck-m”)心肌结构，图d-f依次为lv-control、lv-mir-2779-x、未经处理mdck细胞组肺脏组织结构，图g-i依次为lv-control、lv-mir-2779-x、未经处理mdck细胞组肾脏组织结构。
[0098]
2.8种属鉴定
[0099]
设计犬属cox1特异性引物，利用pcr技术扩增mdck-ht02细胞、皮下肿瘤和裸鼠正常组织中cox1片段，琼脂糖凝胶检测cox1表达情况，mdck细胞注射裸鼠形成瘤体与组织表达情况如图9所示，mdck细胞与瘤体基因组dna中均检测到cox1较高表达，但裸鼠正常组织未检测到cox1表达。
[0100]
图9中，m为dnamarker，泳道2、3为未注射mdck细胞裸鼠组织组；泳道4、5为mdck细胞组；泳道6-13依次为注射mdck细胞后裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、皮肤、皮下淋巴结组织组；泳道14-16为mdck细胞注射裸鼠瘤体组。
[0101]
2.9无成瘤性基因工程细胞株对流感病毒敏感性的测试
[0102]
reed-muench两氏法：距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)，lgtcid
50
＝距离比例
×
稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数。结果表明，使用lv-control、lv-mir-2779接种a/california/7/2009x-179a(h1n1)流感病毒毒株48h的tcid
50
分别为10-5
/0.1ml、10-5.334
/0.1ml，(含义：将该病毒稀释105、10-5.334
接种100μl可使50％的细胞发生病变)。与原有毒株在mdck贴壁细胞的tcid
50
无显著差异，因此，该无成瘤性基因工程细胞株对流感病毒敏感性较高，适用于流感病毒的复制和流感疫苗的生产。
[0103]
表5 lv-control和lv-mir-2779细胞接毒后48h的tcid
50
[0104][0105]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.无成瘤性mdck基因工程细胞株，其特征在于：所述mdck基因工程细胞株为mir-2779-x过表达稳转mdck细胞株。2.根据权利要求1所述的无成瘤性mdck基因工程细胞株，其特征在于：所述mir-2779-x的核苷酸序列为：uccggcucgaaggaccau。3.权利要求1或2所述的无成瘤性mdck基因工程细胞株的构建方法，其特征在于：设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体，转染mdck成瘤性细胞，经嘌呤霉素筛选后获得mir-2779-x过表达稳转细胞株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述设计并构建mir-2779-x过表达慢病毒载体具体为：将mir-2779-x和gv369载体通过agei/nhei酶切位点进行连接，连接产物转化入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑选阳性克隆转化子进行质粒抽提，获得mir-2779过表达质粒，将mir-2779过表达质粒和慢病毒包装辅助质粒共转染至293t细胞中，收集细胞上清液进行纯化，得到mir-2779-x过表达慢病毒载体。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述转染mdck成瘤性细胞时，转染moi值为100，于37℃，5％co2条件下培养。6.权利要求1或2所述的无成瘤性mdck基因工程细胞株在流感病毒增殖培养或制备流感病毒疫苗中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述无成瘤性mdck基因工程细胞株作为细胞基质用于流感疫苗生产。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将mdck基因工程细胞株接种动物后，所述mdck基因工程细胞株对接种动物不成瘤。

技术总结
本发明提供无成瘤性MDCK基因工程细胞株，所述MDCK基因工程细胞株为miR-2779-x过表达稳转MDCK细胞株。miR-2779-x可通过抑制Bak1的表达，参与调节MDCK细胞成瘤表型。本发明构建了miR-2779-x过表达稳转细胞株，为建立低成瘤性MDCK基因工程细胞株提供了新思路。性MDCK基因工程细胞株提供了新思路。性MDCK基因工程细胞株提供了新思路。


技术研发人员：乔自林 杨迪 石嘉琛 王家敏 刘振斌
受保护的技术使用者：西北民族大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/9/5