一种石房蛤毒素的纳米抗体及其应用

1.本发明属于生物学及免疫学技术领域，具体地，涉及一种石房蛤毒素的纳米抗体及其应用。


背景技术：

2.石房蛤毒素(saxitoxin，stx)是由蓝藻和鞭毛藻产生的一种藻类毒素(海洋或淡水)。它是最具毒性的海洋生物毒素和麻痹性贝类毒素之一。人体主要通过食用受污染的贝类摄入这种致命毒素，可导致腹泻、呕吐、呼吸衰竭等麻痹性贝类毒素中毒症状，甚至会危及生命。这种毒素除了引起的明显的健康危害外，还会对环境和经济造成影响，如导致鱼类死亡、贝类污染，冲击商业渔业。我国食品药品监督管理局认为100g贝类肉中stx含量不宜超过80μg。目前，检测stx的方法主要有小鼠生物测定法、受体检测方法、高效液相色谱及其联用技术、细胞传感和化学传感等方法。小鼠生物测定法是检测stx的标准方法，尽管灵敏可靠，但因其需要使用到活体动物，因而时常受到伦理指责，近年来高效液相色谱方法正逐渐发展取代其成为标准方法。虽然这可以用于stx的官方控制测试。而值得注意的是，高效液相色谱法需使用昂贵的仪器和训练有素的人员来成功操作。因此，一种准确、快速、灵敏的检测方法开发对stx检测、控制及应用非常重要。
3.对于上述方法检测成本高、检测人员技术要求较高的问题。酶联免疫吸附测定方法(elisa)凭借其高灵敏度、低成本和高通量的优势被广泛用于食品，环境监测和医学等领域。然而目前大多数免疫技术通常依赖于单克隆抗体或者多克隆抗体，它们都不能耐受极端环境，例如高温、有机溶剂和强离子。且单克隆抗体在细胞融合时失败率较高，前期的筛选过程冗长且复杂，而多克隆抗体普遍存在特异性差的弊端，这极大地限制了其在分析和研究中的广泛应用。
4.纳米抗体又称单域重链抗体(vhh)是由骆驼类中独特的重链抗体衍生的小抗原结合片段。与传统抗体相比，纳米抗体具有体积小(12-15kda，约为传统抗体的十分之一)、结构域单一、亲和性强、稳定性高(耐高温和极端ph条件)、深入组织渗透、缺乏糖基化和fc介导的免疫激活、原核生产量大、成本低等特点。尽管它们的尺寸很小，但纳米抗体能够以高亲和力和选择性结合抗原。它们的结合主要由三个高变量环决定，称为互补决定区域或cdr区。迄今为止，针对不同的分子靶标已经产生了广泛的纳米体，应用范围涵盖基础研究、诊断和治疗。然而，目前针对stx的纳米抗体尚未见报道，因此针对stx高亲和力、高特异性、高稳定性的纳米抗体的开发，有望填补石房蛤毒素纳米抗体在免疫学中的空白，并有利于扩宽实际场景中stx免疫检测应用，降低石房蛤毒素对环境和经济造成的影响。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供一种石房蛤毒素纳米抗体及其应用，填补目前尚无石房蛤毒素纳米抗体的空白，解决现有技术中的抗体对石房蛤毒素特异的识别和结合能力弱、不易于表达和表达效率低的问题。
6.本发明的第一目的是提供一种石房蛤毒素的纳米抗体。
7.本发明的第二目的是提供一种石房蛤毒素的纳米抗体的编码基因。
8.本发明的第三目的是提供一种重组载体。
9.本发明的第四目的是提供一种重组细胞。
10.本发明的第五目的是提供所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体、和/或所述重组细胞中的一种或几种在制备石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒中的应用。。
11.本发明的第六目的是提供一种非诊断目的检测的方法。
12.本发明的第七目的是提供一种石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒。
13.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
14.本发明通过购买自深圳康体生命科技有限公司的纳米抗体天然文库kt-006，采用噬菌体展示技术，将检测抗原固相包被于酶标板上，投入纳米抗体天然文库kt-006进行亲和淘筛，获得一种抗石房蛤毒素特异性结合的纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其具有亲和力高，特异性强、稳定性好的优点。并应用于石房蛤毒素的免疫学检测分析，通过此免疫检验分析建立了一种快速、灵敏并且稳定的石房蛤毒素的检测方法，同时评估了抗石房蛤毒素的纳米抗体在检测应用中的稳定性。
15.本发明要求保护一种石房蛤毒素的纳米抗体，所述纳米抗体包括框架区fr和互补决定区cdr，所述框架区fr为：氨基酸序列如seq id no：2所示的fr1，氨基酸序列如seq id no：3所示的fr2，氨基酸序列如seq id no：4所示的fr3和氨基酸序列如seq id no：5所示的fr4；所述互补决定区cdr为：氨基酸序列为grnfngla所示的cdr1，氨基酸序列为irygiphy的cdr2和seq id no：6所示的cdr3。
16.具体地：
17.抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr1的氨基酸如seq id no.2所示：
18.avqlvesggglvqaggsmrlscets；
19.抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr2的氨基酸如seq id no.3所示：
20.wfrqapgkerelvaa；
21.抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr3的氨基酸如seq id no.4所示：
22.adsvkgrftisrdngkatidlqmnnlkpddtavyyc；
23.抗石房蛤毒素的纳米抗体框架区fr4的氨基酸如seq id no.5所示：
24.wgpgtqvtvs；
25.抗石房蛤毒素的纳米抗体互补决定区cdr3的氨基酸如seq id no.6所示：
26.ttsdtgwnvqtyty。
27.优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no：1所示。
28.具体地，seq id no.1：
29.avqlvesggglvqaggsmrlscetsgrnfnglawfrqapgkerelvaairygiphyadsv kgrftisrdngkatidlqmnnlkpddtavyycttsdtgwnvqtytywgpgtqvtvs。
30.本发明还要求保护一种石房蛤毒素的纳米抗体的编码基因，所述编码基因编码所述纳米抗体。
31.优选地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。
32.具体地，seq id no.7：
33.gcggtgcagctggtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctatgcgac
34.tctcctgtgaaacctctggacgcaacttcaatggattggcctggttccgccaggctcca
35.gggaaggagcgtgaacttgttgctgctattaggtatggtattccgcactatgccgactc
36.cgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacggcaaggccacaattgatctgcaa
37.atgaacaacctgaaacctgacgacacggccgtttattactgtgtcgtctcggatacgggttggaatgtccagacatacacttactggggcccggggacccaggtcaccgtctcc。
38.本发明还保护一种重组载体，所述重组载体连接有所述编码基因。
39.本发明还保护一种重组细胞，所述重组细胞含有所述表达载体、或能够表达所述纳米抗体。
40.本发明还保护所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体、和/或所述重组细胞中的一种或几种在制备石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒中的应用。
41.本发明进一步保护一种非诊断目的检测的方法，利用所述纳米抗体。
42.优选地，基于间接elisa(icelisa)方法进行检测，以石房蛤毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的石房蛤毒素完全抗原作为作为检测抗原，用所述纳米抗体作为检测抗体进行检测，所述石房蛤毒素半抗原为膝沟藻毒素-1&-4。
43.更优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(bovine serμm albμmin，bsa)。
44.进一步优选地，包被有检测抗原的固相载体中加入待测样品以及所述纳米抗体，充分反应后弃去液体并洗涤；加入酶标记抗二体充分反应后弃去液体并洗涤，充分反应后弃去液体并洗涤；进行显色反应，终止反应；读450nm od值。
45.更进一步优选地，显色a液与显色b液混合的tmb显色液进行显色反应，10％h2so4(v/v)终止反应。
46.一种石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒，含有所述纳米抗体。
47.优选地，还含有包被有石房蛤毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的石房蛤毒素完全抗原，所述石房蛤毒素半抗原为膝沟藻毒素-1&-4。
48.更优选地，所述固相载体为酶标版。
49.更优选地，还包括酶标二抗、显色剂和终止剂。
50.再更优选地，显色剂为显色液a与显色液b。
51.再更优选地，终止剂为10％ h2so4(v/v)。
52.再更优选地，酶标二抗为anti-vhh-hrp二抗。
53.本发明具有以下有益效果：
54.本发明得到了一个特异性识别石房蛤毒素的纳米抗体，具有独特的可变区序列，其能够特异性识别和结合石房蛤毒素，并且其具有易于表达和表达效率高的优点，使得其可以应用于检测石房蛤毒素的酶联免疫分析方法中，该方法ic
50
为6.56ng/ml，线性范围为0.09-180ng/ml，该方法的检测结果准确、效果好，对石房蛤毒素类似物的交叉反应良好。本发明提供的抗石房蛤毒素的纳米抗体，具有制造简易、表达率高、特异性强、稳定性好和免疫原性低等优点，这填补了石房蛤毒素纳米抗体在免疫学中的空白，并有利于扩宽石房蛤毒素实际场景中免疫检测应用。
附图说明
55.图1是石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa的制备前后紫外图
56.图2是淘选阳性克隆间接elisa鉴定结果。
57.图3是抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3的sds-page图
58.图4是以抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3建立间接elisa方法检测stx的标准曲线。
59.图5是抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3在不同温度下的相对活性结果图。
60.图6是抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3在90℃下储存不同时间的相对活性结果图。
61.图7是抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3在不同ph下的相对活性结果图。
62.图8是抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3在不同浓度有机溶剂下的相对活性结果图。
具体实施方式
63.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
64.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
65.石房蛤毒素半抗原gtx 1&4，购买于national research council canada(加拿大国家研究委员会海洋生物科学研究所)，product code：imb-crm-gtx1/4-e；
66.石房哈毒素类似物gtx 2&3，购买于national research council canada(加拿大国家研究委员会海洋生物科学研究所)，product code：imb-crm-gtx2/3-d；
67.石房哈毒素类似物c1&c2，购买于national research council canada(加拿大国家研究委员会海洋生物科学研究所)，product code：imb-crm-c1/2-c。
68.实施例1石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa的制备
69.一、实验方法
70.石房蛤毒素半抗原gtx 1&4(膝沟藻毒素-1&-4，gonyautoxin-1and-4，为gtx 1(cas号：60748-39-2)和gtx 4(cas号：64296-26-0)的混合物)与牛血清蛋白(bovine serμmalbμmin，bsa)通过甲醛缩合法偶联形成人工检测抗原(石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa)，其反应式如下：
[0071][0072]
具体操作方法如下：取石房蛤毒素半抗原gtx 1&4 200μg，与2ml 2mg/ml bsa的0.01m pbs(ph 7.4)溶液混合，再加入80μl甲醛(v/v，2.5％)，25℃磁力搅拌温育72h，再在0.01m pbs(ph 7.4)溶液中透析3天，稀释至1mg/ml，-20℃下保存备用。偶联后的石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa作为检测抗原。
[0073]
二、实验结果
[0074]
牛血清蛋白、石房蛤毒素半抗原gtx 1&4和石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa具有紫外特征吸收峰，通过对牛血清蛋白、石房蛤毒素半抗原gtx 1&4和石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa进行全波长紫外特征吸收峰扫描，以鉴定人工抗原合成是否成功。
[0075]
半抗原偶联到牛血清蛋白后而制备的人工抗原，可具有半抗原和牛血清蛋白的特征吸收峰，或其最大吸收峰相对于原有牛血清蛋白产生偏移。牛血清蛋白、石房蛤毒素半抗原gtx 1&4和石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa紫外吸收谱如图1，对于所合成的石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa均具有半抗原和牛血清蛋白的特征吸收峰或其吸收峰相对于原有牛血清蛋白产生偏移，表明石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa合成成功。
[0076]
实施例2抗石房蛤毒素的纳米抗体的亲和淘选及鉴定
[0077]
一、纳米抗体的亲和淘选
[0078]
1、实验方法
[0079]
首先，用0.01m pbs(ph 7.4)将石房蛤毒素半抗原gtx 1&4稀释至100μg/ml后加入到96孔酶标板(100μl/孔)，4℃过夜。第二天用0.05％pbst(0.01m pbs ph 7.4，体积比0.05％ tween-20)洗涤3次后，加入200μl封阻缓冲液(5g脱脂奶粉溶解于100ml含1.7g na2co3，2.9g nahco
3 ph为9.6的包被缓冲液)4℃封闭4小时，弃去封阻缓冲液置于37℃烘30min。每孔加入100μl用含3％酪蛋白tbs溶液(0.2m tris、1.37m nacl，ph 7.6，质量比3％酪蛋白)稀释的纳米抗体天然文库kt-006(深圳康体生命科技有限公司)，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用0.01％ tbst(0.2m tbs ph 7.6，体积比0.01％ tween-20)洗板10次，tbs洗板5次。加入100μl的glycine-hcl(0.2m，ph 2.2)洗脱10min后，立即用5μl tris-hcl(1m，ph 9.1)中和后得到一轮洗脱噬菌体100μl。取10μl一轮洗脱噬菌体测定滴度，其余的90μl一轮洗脱噬菌体用于感染大肠杆菌tg1菌株并培养至对数期进行扩增。第三天用沉淀剂(每500ml水溶解有100gpeg8000和73g nacl)沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度，该过程为第一轮淘筛。
[0080]
第二轮淘筛：包板过程如第一轮淘筛所述，再每孔加入100μl用含3％酪蛋白tbs溶
液稀释的第一轮洗脱下来的噬菌体，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用0.01％ tbst洗板10次，tbs洗板5次。加入100μl的9.0μg/ml石房蛤毒素在37℃孵育30min后洗脱得到二轮洗脱噬菌体100μl。取10μl二轮洗脱噬菌体测定滴度，其余的90μl二轮洗脱噬菌体用于感染大肠杆菌tg1菌株并培养至对数期进行扩增。第三天用沉淀剂淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
[0081]
第三轮淘筛：包板过程如第一轮淘筛所述，再每孔加入100μl用含3％酪蛋白tbs溶液稀释的第二轮洗脱下来的噬菌体，37℃孵育1h。弃去未结合的噬菌体，用0.01％ tbst洗板10次，tbs洗板5次。加入100μl的4.5μg/ml石房蛤毒素在37℃孵育30min后洗脱得到三轮洗脱噬菌体100μl。取10μl三轮洗脱噬菌体测定滴度，其余的90μl三轮洗脱噬菌体用于感染大肠杆菌tg1菌株并培养至对数期进行扩增。第三天用沉淀剂沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。
[0082]
测定滴度的具体方法为：将第一、二和三轮淘筛加入和洗脱获得的噬菌体分别用lb液体培养基(1g tryptone，0.5g yeast extract，1g nacl，100ml水)进行倍比稀释，每一个稀释度各取10μl与200μl处于对数生长期的tg1混合，37℃恒温培养箱中静置30min后，涂于lb固体培养基(1g tryptone，0.5g yeast extract，1g nacl，0.5g agar powder，100ml水)，倒置于37℃恒温培养箱中，过夜培养。观察各稀释度对应平板上噬菌斑的生长情况，对噬菌体抗体库滴度进行计算，公式如下:
[0083][0084]
2、实验结果
[0085]
每轮淘选噬菌体富集结果如表1。经过三轮淘选，富集倍数依次由1倍到25倍再到84倍，表明噬菌体都得到了有效富集(表1)。
[0086]
表1以gtx 1&4-bsa为包被原淘选过程中噬菌体的回收率和富集度变化
[0087][0088]
回收率＝噬菌体洗脱量(
cfu/ml
)/噬菌体加入量(
cfu/ml
)
[0089]
二、阳性噬菌体克隆的鉴定
[0090]
1、实验方法
[0091]
从第二轮和第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取96个克隆，进行噬菌体的扩增，采用酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体克隆的鉴定。
[0092]
具体方法为：首先，用0.01m pbs(ph 7.4)将实施例1制备得到的石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa稀释至1.0μg/ml，4℃包被过夜。第二天用0.05％pbst洗涤3次后，加入200μl封阻缓冲液4℃封闭4小时，弃去封阻缓冲液置于37℃烘30min；加入50μl噬菌体扩增液，以0.01m pbs(ph 7.4)作为阴性对照，37℃孵育40min；加入1：5000倍稀释的anti-vhh-hrp
二抗(genscript,a01861-200)100μl，37℃孵育30min；加入100μl tmb底物溶液，避光37℃显色10min；加入50μl终止液(2m h2so4)终止反应；用酶标仪(thermo scientific multiskan fc)测定450nm处的吸收值(od
450nm
)。
[0093][0094]
二、实验结果
[0095]
选取od
450nm
大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆，且具有明显抑制(抑制率＞20％)的克隆，记录其对应孔的编号，共得到4株阳性克隆(附图2所示)，并将母板中对应孔的菌液冻存备用。
[0096]
实施例3抗石房蛤毒素的纳米抗体的编码基因其氨基酸的序列
[0097]
一、实验方法
[0098]
将4株阳性克隆进行dna测序，dna测序结果用snapgene软件对测序结果进行分析。
[0099]
二、实验结果
[0100]
结果显示，4株阳性克隆序列相同，即获得一种抗石房蛤毒素的纳米抗体，命名为抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3。
[0101]
抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3氨基酸序列如seq id no.1所示：avqlvesggglvqaggsmrlscetsgrnfnglawfrqapgkerelvaairygiphyadsv kgrftisrdngkatidlqmnnlkpddtavyycttsdtgwnvqtytywgpgtqvtvs，
[0102]
该纳米抗体包括4个fr框架区和3个cdr互补决定区，其排列顺序为fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4，其中：
[0103]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3框架区fr1氨基酸序列如seq no:2所示：avqlvesggglvqaggsmrlscets；
[0104]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3框架区fr2氨基酸序列如seq no:3所示：wfrqapgkerelvaa；
[0105]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3框架区fr3氨基酸序列如seq no:4所示：adsvkgrftisrdngkatidlqmnnlkpddtavyyc；
[0106]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3框架区fr4氨基酸序列如seq no:5所示：wgpgtqvtvs；
[0107]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3互补决定区cdr1氨基酸序列为：grnfngla；
[0108]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3互补决定区cdr2氨基酸序列为：irygiphy；
[0109]
抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3互补决定区cdr3氨基酸序列如seq no:6所示：ttsdtgwnvqtyty；
[0110]
同时，得到编码所述抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示：
[0111]
gcggtgcagctggtggagtctgggggaggattggtgcaggctgggggctctatgcgac
[0112]
tctcctgtgaaacctctggacgcaacttcaatggattggcctggttccgccaggctcca
[0113]
gggaaggagcgtgaacttgttgctgctattaggtatggtattccgcactatgccgactc
[0114]
cgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacggcaaggccacaattgatctgcaa
[0115]
atgaacaacctgaaacctgacgacacggccgtttattactgtgtcgtctcggatacgggttggaatgt
ccagacatacacttactggggcccggggacccaggtcaccgtctcc。
[0116]
实施例4抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3的制备及鉴定
[0117]
一、实验方法
[0118]
依据实施例3测序结果，使用质粒提取试剂盒提取实施例3得到的阳性克隆，以获取含抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3编码基因(核苷酸序列如seq id no.7所示)的质粒，将其转入大肠杆菌top 10’感受态中。从转化平板上挑一单菌落接种于5ml lb液体培养基中，250r/min振荡下37℃培养过夜，将过夜培养物按体积比1：100接种量接种于750ml的lb/amp培养基中，200r/min振荡下37℃培养；当培养物菌体浓度od600达到0.6-0.8时，向培养物中加入终浓度为0.1mm的iptg 750μl，37℃，200r/min振荡过夜培养；将培养物于4℃，12000rpm，离心20min收集菌体沉淀。称重离心后的细胞，用4ml tes震荡混匀使沉淀溶解，置于-80℃冻融1h，取出再加入按1：5稀释后的11-12ml tes，置于4℃摇床摇1h，将管中的沉淀进行裂解，于室温静置30min后，12000rpm离心20min取上清纯化，即得表达的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3。
[0119]
二、实验结果
[0120]
经12％ sds-page后使用考马斯亮蓝染液染色进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，获得的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3体积大约为15kda左右。说明了是实施例3的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)制备成功。
[0121]
实施例5抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3标准曲线的建立
[0122]
一、实验方法
[0123]
采用icelisa的方法进行灵敏度的鉴定，具体方法为：
[0124]
用0.01m pbs(ph 7.4)将实施例1制备得到的石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa稀释至1.0μg/ml，4℃包被过夜；用pbst洗涤3次后，加入200μl封阻缓冲液，4℃封闭2h，弃去封阻缓冲液37℃烘30min。效价组分别加入50μl抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)和50μl 0.01m pbs(ph 7.4)，抑制组分别加入50μl抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)和0.09ng/ml、0.18ng/ml、0.45ng/ml、1.8ng/ml、9ng/ml、45ng/ml、180ng/ml梯度稀释的石房蛤毒素50μl，37℃孵育40min；再用洗涤3次，加入anti-vhh-hrp二抗100μl，37℃孵育30min；用pbst洗涤6次后，加入100μl tmb底物溶液，避光显色10min，加入50μl 2m h2so4终止液终止反应后，测定吸光度值od
450nm
，绘制标准曲线
[0125]
二、实验结果
[0126]
标准曲线入图4所示，线性范围为0.09-180ng/ml，线性关系为r2＝0.9964，最低检测限为6.56ng/ml，表现出较好的灵敏度。
[0127]
实施例6一种石房蛤毒素的检测方法
[0128]
预包被板：用包被液(0.375g na2co3与0.7325g nahco3加水定容至250ml)将实施例1制备的结构式(ⅰ)所示的石房蛤毒素人工抗原gtx 1&4-bsa稀释至1μg/ml，加入酶标板微孔中，每孔100μl，4℃静置12h后，用稀释20倍的洗液pbst洗板两次后，每孔加入150μl 1％ bsa-pbs(w/v)溶液37℃静置2h。倒出孔内液体，在吸水纸上拍干并在37℃下烘1h备用。
[0129]
标记标准品空白孔b0、标准品和样品孔，进行3孔重复试验。在b0中加入50μl0.01m pbs(ph 7.4)，在各标准品孔中加入50μl不同浓度的标准品溶液，在各样品孔中加入50μl经
过0.01m pbs(ph 7.4)稀释的样品溶液。
[0130]
用0.01m pbs(ph 7.4)将氨基酸序列如seq id no.1所示的抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3稀释至工作浓度10μg/ml，在以上所有孔中加入50μl稀释后的抗体溶液，37℃孵育30min。用稀释20倍后的洗液pbst洗涤微孔5次，在吸水纸上拍干。每孔加入100μl用pbst稀释5000倍的anti-vhh-hrp二抗，37℃孵育30min，用稀释20倍的洗液pbst洗涤微孔5次，在吸水纸上拍干。每孔加入100μl预先用等体积显色a液与显色b液(solarbio，pr1210)混合的tmb显色液，37℃避光孵育10min。每孔加入50μl终止液10％ h2so4(v/v)，在酶标仪上读od
450nm
值。
[0131]
将标准品空白od
450nm
值平均值记为b0，将不同药物浓度下的od
450nm
以及样品待测孔的平均值记为b
x
，计算不同石房蛤毒素药物浓度或样品孔的b
x
/b0比值以及每组平行数据的标准差。以标准品浓度的对数值为横坐标，b
x
/b0比值为纵坐标，绘制标准曲线图。
[0132]
根据样品孔平均吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为stx浓度的对数值，求得反对数即为测定液中石房蛤毒素浓度。由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀释倍数。
[0133]
实施例7一种石房蛤毒素的检测试剂盒
[0134]
一、试剂盒的组成
[0135]
预包被板，其预包被板步骤同实施例6；
[0136]
anti-vhh-hrp二抗酶标试剂(使用时需要使用pbst稀释5000倍)；
[0137]
不同浓度的石房哈毒素(stx)标准品溶液；
[0138]
检测抗体：抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)；
[0139]
抗体与样品的稀释溶剂0.01m pbs(ph 7.4)溶液；
[0140]
标记抗体(anti-vhh-hrp二抗酶标试剂)的稀释液：pbst(0.01m pbs，0.05％tween-20)；
[0141]
显色a液与b液；
[0142]
终止液：10％ h2so4(v/v)；
[0143]
浓缩洗涤液：pbst(0.01m pbs，0.05％ tween-20(v/v))，稀释20倍后用于洗板。
[0144]
二、试剂盒的使用方法
[0145]
预先进行编号，标记标准品空白孔b0、标准品和样品孔，进行3孔重复试验。在b0中加入50μl pbs，在各标准品孔中加入50μl不同浓度的标准品溶液，在各样品孔中加入50μl经过稀释的样品溶液。用0.01m pbs(ph 7.4)将氨基酸序列如seq id no.1所示的抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3稀释至工作浓度10μg/ml，在以上所有孔中加入50μl稀释后的抗体溶液，37℃孵育30min。用稀释20倍的洗液pbst洗涤微孔5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μl酶标记二抗。37℃孵育30min，再用稀释20倍后的洗液pbst洗涤微孔5次，在吸水纸上拍干后每孔加入100μl预先用等体积显色a液与显色b液混合的tmb显色液，37℃避光孵育10min，每孔加入50μl终止液，5min内在酶标仪上读od
450nm
值。
[0146]
三、结果判读
[0147]
将标准品空白od
450nm
值平均值记为b0，将不同stx药物浓度下的od
450nm
以及样品待测孔的平均值记为b
x
，用excel计算不同stx药物浓度或样品孔的b
x
/b0比值以及每组平行数据的标准差。以标准品浓度的对数值为横坐标，b
x
/b0比值为纵坐标，绘制标准曲线图。根据
样品孔平均吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为stx浓度的对数值，求得反对数即为测定液中石房哈毒素(stx)浓度。由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀释倍数。
[0148]
实施例8抗石房蛤毒素纳米抗体的特异性
[0149]
一、实验方法
[0150]
使用实施例7的试剂盒，对其他五种常见的石房哈毒素(stx)类似物：gonyautoxin-2and-3(gtx 2&3)、gonyautoxin-1and-4(gtx 1&4)、n-sulfocarbamoylgonyautoxin-2and-3(c1&c2)、decarbamoyl-neosaxitoxin(dcneo，cas:68683-58-9)、tetrodotoxin(ttx，cas：4368-28-9)进行检测，以上五种常见的石房哈毒素(stx)类似物。
[0151]
按照实施例7的试剂盒检测梯度浓度配制各种stx的类似物的标准品溶液，绘制每一种stx类似物的标准曲线，得出各自的ic
50
值。用以下公式计算各药物与抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3的交叉反应率：
[0152][0153]
二、实验结果
[0154]
结果见表2，抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)能够特异性识别stx，其与gtx 2&3、gtx 1&4、dcneo、ttx均无显著的交叉反应(《17.07％)，表明所淘选抗石房蛤毒素纳米抗体nb 14-3表现出较好的特异性。
[0155]
表2抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3的灵敏度与特异性
[0156][0157]
实施例9抗石房蛤毒素纳米抗体稳定性
[0158]
一、热稳定性
[0159]
1、实验方法
[0160]
将抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)用pbs稀释至10μg/ml，分别置于4，25，37，50，60，70，80，90，100℃水浴5min，恢复到室温后；或分别置于90℃下孵育0，5，10，20，30，40，50，60min，恢复到室温后。随后，将上述不同温度或90℃下孵育不同时间的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3，使用实施例7中的检测试剂盒，抗体与检测抗原的结合能力，评价氨基酸序列如seq id no.1所示的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3对不同温度或同一温度下储存的耐受能力。
[0161]
2、实验结果
[0162]
结果如图5和图6所示，随着温度的升高，抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3的结合相对结合活性没有明显的下降，在100℃加热5min后性能依然稳定在75％，且在90℃加热
20min后活性仍能维持在70％，这表明抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3具有突出的热稳定性。
[0163]
二、在不同ph值下的稳定性
[0164]
1、实验方法
[0165]
用ph为2.0，4.0，6.0，7.4，8.4，10.0，12.0的0.01m pbs作为稀释液稀释抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)到工作浓度(10μg/ml)。随后，使用实施例7中的检测试剂盒，分别测定在不同ph值下，抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)与检测抗原的结合能力，评价氨基酸序列如seq id no.1所示的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3对不同ph值的耐受能力。
[0166]
2、实验结果
[0167]
结果如图7所示，抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3在酸性、中性及弱碱性下相对结合活性均能维持在95％左右，但当ph值为8.4-12时其相对结合活性急剧下降，这表明抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3耐酸性、中性及弱碱性。
[0168]
三、有机溶剂中的稳定性
[0169]
1、实验方法
[0170]
用pbs分别配制0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％共八种不同体积比的甲醇溶液或乙腈溶液。随后，每孔先加入50μl不同体积比有机溶剂配制的溶液，再加入50μl 0.01m pbs(ph 7.4)稀释后的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)溶液。再使用实施例7中的检测试剂盒，分别测定在不同有机溶剂条件下，抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)与检测抗原的结合能力，评价氨基酸序列如seq id no.1所示的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3对不同有机溶剂的耐受能力。
[0171]
2、实验结果
[0172]
结果如图8所示，抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)相对结合活性随着有机溶剂浓度的提升下降，当乙腈浓度为30％时纳米抗体失去40％的抗原结合活性，当有机溶剂混合液中甲醇、乙腈分别比例达到70％时纳米抗议依旧存在30％以上的相对结合活性，这说明氨基酸序列如seq id no.1所示的抗石房蛤毒素的纳米抗体nb 14-3(氨基酸序列如seq id no.1)对甲醇、乙腈这两种在标准方法前处理当中常用的有机溶剂耐受性较好，在实际检测中高浓度有机溶剂对抗体灵敏度产生的影响不大。
[0173]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种石房蛤毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括框架区fr和互补决定区cdr，所述框架区fr为：氨基酸序列如seq id no：2所示的fr1，氨基酸序列如seq id no：3所示的fr2，氨基酸序列如seq id no：4所示的fr3和氨基酸序列如seq id no：5所示的fr4；所述互补决定区cdr为：氨基酸序列为grnfngla所示的cdr1，氨基酸序列为irygiphy的cdr2和seq id no：6所示的cdr3。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no：1所示。3.一种石房蛤毒素的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1或2所述纳米抗体。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：9所示。5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体连接有权利要求3或4所述编码基因。6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述表达载体、或能够表达权利要求1或2所述纳米抗体。7.权利要求1或2所述纳米抗体、权利要求3或4所述编码基因、权利要求5所述重组载体、和/或权利要求6所述重组细胞中的一种或几种在制备石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒中的应用。8.一种非诊断目的检测的方法，其特征在于，利用权利要求1所述纳米抗体。9.一种石房蛤毒素的免疫学检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述纳米抗体。10.根据权利要求9所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，还含有包被有石房蛤毒素半抗原与载体蛋白偶联得到的石房蛤毒素完全抗原，所述石房蛤毒素半抗原为为膝沟藻毒素-1&-4。

技术总结
本发明公开了一种石房蛤毒素的纳米抗体及其应用，本发明得到的特异性识别石房蛤毒素的纳米抗体，具有独特的可变区序列，其能够特异性识别和结合石房蛤毒素，并且其具有易于表达和表达效率高的优点，使得其可以应用于检测石房蛤毒素的酶联免疫分析方法中，该方法IC


技术研发人员：徐振林 韦柳娜 李亚茹 罗林 雷红涛 关甜 沈玉栋
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/9/5