碳酸酐酶嵌合体、多聚碳酸酐酶、制备方法及应用与流程

1.本技术涉及生物酶技术领域，具体涉及一种碳酸酐酶嵌合体、多聚碳酸酐酶、制备方法及应用。


背景技术：

2.co2占全球温室气体排放量的70％，因此如何高效捕获、利用及储存co2(ccus，co
2 capture,utilization,and storage)是一个需要长期探索的课题。截止目前，co2的捕获方式包括：物理吸附、化学吸收、o2燃烧法、膜分离等。其中，工业上广泛应用有机胺(如：乙醇胺，mea；n-甲基二乙醇胺，mdea)进行化学吸收以实现co2的净化，但是这种方法受限于有机胺对co2的吸收速率较慢、有机胺的回收利用困难等限制，因此亟需寻找一种绿色环保生物法高效捕集co2方法。
3.碳酸酐酶(carbonic anhydrase，ca)是一种具有co2水合活性的含zn
2+
金属酶，根据氨基酸序列相似性，ca被分成α、β、γ、λ、δ、ξ五种类型，其中α-ca存在14种以上同工酶，而caⅱ是目前研究发现催化co2水合反应速率最快的酶，caⅱ水合速率常数约为co2自发水合速率常数的107倍，ca的应用将大大加速ccus。酶制剂高催化活性、良好的稳定性以及储存性是工业应用ca吸收co2需要面对的问题，因此寻找一种可高效捕集co2的ca具有重要意义。此外，ca还在药物筛选(治疗高血压，水肿，肥胖和癫痫等疾病)、传感器制备等方面有重要应用价值。
4.现有技术中通过酶的固定化或者基因工程手段提高酶的稳定性或活性，但是现有技术的步骤复杂，且固定化后的酶的活性和稳定性有待进一步提高。


技术实现要素：

5.本技术的目的在于提供一种碳酸酐酶嵌合体、多聚碳酸酐酶、制备方法及应用。本技术通过在碳酸酐酶一端连接自发性多聚标签，最终表达的碳酸酐酶嵌合体为非水溶性蛋白，具有成本低、用时短、可大量制备、操作设备简单等优点。本技术的碳酸酐酶嵌合体的稳定性且催化活性得到了进一步提高。
6.本技术第一方面提供了一种碳酸酐酶嵌合体，包括碳酸酐酶以及与所述碳酸酐酶连接的自发性多聚标签，所述碳酸酐酶包括如seq id no.1所示的氨基酸序列，或所述碳酸酐酶包括如seq id no.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述自发性多聚标签包括如seq id no.3所示的氨基酸序列，或所述自发性多聚标签包括如seq id no.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
7.在一些实施例中，所述碳酸酐酶通过柔性连接段与所述自发性多聚标签连接，所述柔性连接段包括如seq id no.5所示的氨基酸序列，或所述柔性连接段包括如seq id no.6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
8.本技术第二方面提供了上述的碳酸酐酶嵌合体的制备方法，包括以下步骤：将seq id no.2所示的核苷酸片段、seq id no.4所示的核苷酸片段导入表达载体，得到重组质粒，
将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，诱导表达，提取表达蛋白，得到碳酸酐酶嵌合体。
9.本技术第三方面提供了一种多聚碳酸酐酶，所述多聚碳酸酐酶由上述的碳酸酐酶嵌合体制备而成。
10.在一些实施例中，所述多聚碳酸酐酶通过以下方法制备：
11.(i)将所述碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合，得到所述多聚碳酸酐酶，所述第一溶液包括非离子表面活性剂。
12.在一些实施例中，所述多聚碳酸酐酶通过以下方法制备：
13.将所述碳酸酐酶嵌合体与第二溶液混合，恒温溶解或超声处理，得到所述多聚碳酸酐酶。
14.在一些实施例中，所述非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯醚类表面活性剂和/或聚山梨酯类表面活性剂。
15.在一些实施例中，所述聚氧乙烯醚类表面活性剂包括曲拉通。
16.在一些实施例中，所述聚山梨酯类表面活性剂包括吐温60或吐温80中的至少一种。
17.在一些实施例中，所述第二溶液包括缓冲溶液。
18.本技术第四方面提供了一种多聚碳酸酐酶的制备方法，包括以下步骤：
19.(ⅰ)将所述碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合，得到多聚碳酸酐酶，所述第一溶液包括非离子表面活性剂；或
20.(ⅱ)将所述碳酸酐酶嵌合体与第二溶液混合，恒温溶解或超声处理，得到多聚碳酸酐酶。
21.本技术第五方面提供了上述的碳酸酐酶嵌合体，上述制备方法制备的碳酸酐酶嵌合体，上述的多聚碳酸酐酶，或上述制备方法制备的多聚碳酸酐酶在二氧化碳捕集、药物筛选和传感器中的应用。
22.本技术的有益效果在于：本技术提供了一种碳酸酐酶嵌合体，包括碳酸酐酶以及与碳酸酐酶连接的自发性多聚标签，碳酸酐酶包括如seq id no.1所示的氨基酸序列，或碳酸酐酶包括如seq id no.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；自发性多聚标签包括如seq id no.3所示的氨基酸序列，或自发性多聚标签包括如seq id no.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。本技术通过在碳酸酐酶一端连接自发性多聚标签，最终表达的碳酸酐酶嵌合体为非水溶性蛋白，具有成本低、用时短、可大量制备、操作设备简单等优点。本技术的碳酸酐酶嵌合体的稳定性且催化活性得到了进一步提高。
附图说明
23.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为ca嵌合体的质粒图谱；
25.图2为ca嵌合体的蛋白电泳图。泳道m：marker；泳道1：微米级ca；
26.图3为实施例1～5制备的ca的水合活性测试结果；
27.图4为实施例1制备的ca沉淀的透射电镜图；
28.图5为实施例5中经超声处理制备的纳米级多聚ca的透射电镜图；
29.图6为实施例2制备的纳米级多聚ca的热稳定性的测试结果；
30.图7为实施例3制备的纳米级多聚ca的热稳定性的测试结果；
31.图8为实施例4制备的纳米级多聚ca的热稳定性的测试结果；
32.图9为实施例5制备的纳米级多聚ca的热稳定性的测试结果。
具体实施方式
33.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。另外，在本技术的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。用语第一、第二、第三等仅仅作为标示使用，并没有强加数字要求或建立顺序。本技术的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本技术范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
34.针对ca制备复杂，价格昂贵，活性和稳定性不高的问题，本技术通过将碳酸酐酶与自发性多聚标签连接，得到了碳酸酐酶嵌合体，碳酸酐酶包括如seq id no.1所示的氨基酸序列，或碳酸酐酶包括如seq id no.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；自发性多聚标签包括如seq id no.3所示的氨基酸序列，或自发性多聚标签包括如seq id no.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
35.本技术的制备的碳酸酐酶嵌合体为微米级或纳米级的碳酸酐酶，本技术碳酸酐酶嵌合体同时具有了碳酸酐酶的催化活性，此外，碳酸酐酶嵌合体的重复使用性相较于碳酸酐酶得到了提高。
36.在一些实施例中，碳酸酐酶通过柔性连接段与自发性多聚标签连接。柔性连接段为一端氨基酸序列，在一种具体实施方式中，柔性连接段包括如seq id no.5所示的氨基酸序列，或柔性连接段包括如seq id no.6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
37.在一些实施中，碳酸酐酶嵌合体的平均粒径为0.1～1μm，如在一些实施例中，碳酸酐酶嵌合体的平均粒径为0.4μm、0.5μm或0.6μm中的任意值或者任意两值组成的范围。
38.在一些实施例中，本技术的碳酸酐酶嵌合体通过以下方法制备：将seq id no.2所示的核苷酸片段、seq id no.4所示的核苷酸片段导入表达载体，得到重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，诱导表达，提取表达蛋白，得到碳酸酐酶嵌合体。
39.在一些实施方式中，表达载体为大肠杆菌表达载体。在一些具体实施方式中，表达载体为pet-28a(+)。
40.在一些实施方式中，将碳酸酐酶嵌合体制备多聚碳酸酐酶。本技术用碳酸酐酶嵌合体制备成多聚碳酸酐酶。在一些实施例中，多聚碳酸酐酶为纳米级多聚碳酸酐酶，相较于
碳酸酐酶嵌合体，微米级ca向纳米级ca的转变大大增加了酶与底物的接触面积，提高了酶的耐受性，进而提高了酶的稳定性。
41.在一些实施例中，微米级ca向纳米级ca的转变，提高了酶的催化活性。
42.在一些实施例中，多聚碳酸酐酶的平均粒径为10-15nm。
43.在一些实施方式中，多聚碳酸酐酶通过以下方法制备：
44.将碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合，得到多聚碳酸酐酶，第一溶液中含有非离子表面活性剂。
45.一些实施方式中，多聚碳酸酐酶通过以下方法制备：
46.将碳酸酐酶嵌合体与第二溶液混合，恒温溶解或超声处理，得到多聚碳酸酐酶。
47.在一些实施方式中，非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯醚类表面活性剂和/或聚山梨酯类表面活性剂。
48.在一些实施方式中，聚氧乙烯醚类表面活性剂包括曲拉通。
49.在一些实施方式中，聚山梨酯类表面活性剂包括吐温60或吐温80中的至少一种。
50.在一些实施方式中，第二溶液包括缓冲溶液。
51.在一些实施方式中，非离子型表面活性剂在第一溶液中的质量百分浓度为0.1～1％，优选为0.2～0.5％，如非离子型表面活性剂在第一溶液中的质量百分浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％中的任意值或者任意两值组成的范围。
52.在一些实施方式中，非离子型表面活性剂为triton x-100。
53.在一些实施方式中，碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合的时间为6～24h，如混合10～16h，如碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合的时间(h)为：6、7、8、9、10、15、16、18、20、22、24中的任意值或者任意两值组成的范围。
54.在一些实施方式中，第二溶液为缓冲溶液，缓冲溶液为ph＝8.0的tris/hcl缓冲液。
55.在一些实施方式中，恒温溶解为在40-50℃温度下溶解6～24h。
56.在一些实施方式中，超声的条件为：用超声波破碎仪处理ca沉淀，设定功率70～80％，开2s，关2s，超声10～30min。
57.在一些实施方式中，多聚碳酸酐酶的制备方法，包括以下步骤：
58.将碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合，得到多聚碳酸酐酶，第一溶液中含有非离子表面活性剂。
59.在一些实施方式中，多聚碳酸酐酶的制备方法，包括以下步骤：
60.将碳酸酐酶嵌合体与第二溶液混合，恒温溶解或超声处理，得到多聚碳酸酐酶。
61.本技术进一步提供了碳酸酐酶嵌合体或多聚碳酸酐酶在二氧化碳捕集、药物筛选和传感器中的应用。
62.实施例1
63.(1)构建重组质粒
64.将目的基因序列碳酸酐酶(slca)、自发性多聚标签(self-polymerization tag)的基因序列送往南京金斯瑞合成，选取pet-28a(+)为表达载体，选择ncoi和ecori双酶切位点，利用酶切酶连技术，将目的片段导入表达载体，经测序验证后，将重组质粒转入大肠杆
菌bl21(de3)感受态细胞。图1为ca嵌合体的重组质粒图。
65.(2)重组蛋白的表达与纯化
66.①
菌种活化：用移液枪分别吸取100μl实验室保存的甘油菌(大肠杆菌转化菌种)和10μl 100mg/ml的氨苄青霉素溶液，并将二者充分混合于10ml的lb液体培养基中，在恒温摇床中37℃，200rpm，过夜培养；
67.②
菌种扩大：将灭菌后的磷酸盐缓冲液与tb缓冲液按照1:9(v/v)的比例加入到lb培养基中，再用移液枪分别吸取2ml活化后菌液和200μl 100mg/ml的氨苄青霉素溶液，并将二者充分混合于200ml的液体培养基中，在37℃恒温摇床中，200rpm，培养至od600＝0.6～0.8；
68.③
重组蛋白的诱导与表达：向扩大菌液中加入终浓度为0.5mm的iptg溶液，18℃，180rpm，培养20h。
69.(3)获取ca沉淀
70.收集培养好的菌液，并于4000rpm离心20min，弃去上清，用提前预冷的ph＝8.0的tris/hcl缓冲液重悬菌体沉淀，用超声波破碎仪破碎细胞，功率80％，开2s，关2s，超声20min，用滤纸或200mm滤膜过滤杂质和沉淀，经超纯水洗涤两次后的沉淀即为微米级的ca嵌合体，图2的电泳图显示，微米级ca嵌合体蛋白的分子量约为50kda。以上结果与通过protparam(https://www.expasy.org/resources/protparam)计算的理论分子量49.4kda基本吻合。
71.微米级的ca嵌合体的透射电镜图分别如图4所示，从图4的结果可以看出，微米级的ca嵌合体的平均粒径为500nm左右。
72.实施例2：纳米级多聚ca的制备
73.将质量百分浓度为0.2％的triton x-100与实施例1制备的终浓度为10mg/ml的微米级的ca嵌合体(ph＝8.0的tris/hcl缓冲液)在混匀仪中室温处理12h，结果显示，12h后，微米级的ca嵌合体全部转化为纳米级多聚ca，纳米级多聚ca的水合活性(960wau/mg)，约为ca嵌合体水合活性的90％。
74.实施例3：纳米级多聚ca的制备
75.将0.5％质量分数的增溶剂tween-80与10mg/ml的ca沉淀在混匀仪中室温处理12h，结果显示12h ca嵌合体沉淀全部溶解，且溶解后得到的纳米级多聚ca还能保持90％以上的水合活性(980wau/mg)。
76.实施例4：纳米级多聚ca的制备
77.加入少量ph＝8.0的tris/hcl缓冲液，将5mg/ml的ca嵌合体沉淀在水浴锅中恒温溶解12h，12h后ca嵌合沉淀全部转化为纳米级多聚ca，转化率为100％，且此时ca的水合活性增加了50％(1500wau/mg)。
78.实施例5：纳米级多聚ca的制备
79.加入少量ph＝8.0的tris/hcl缓冲液，用超声波破碎仪处理10mg/ml的ca沉淀，设定功率80％，开2s，关2s，超声20min，经超声处理后，ca沉淀溶解并成功全部转化为纳米级ca，转化率为100％，制备的纳米级ca的平均粒径为12nm左右，且此时ca的水合活性增加了2.25倍(2250wau/mg)。
80.测试方法
81.水合活性的测定：将2ml预冷的25mm，ph＝8.3的tris-hcl缓冲液，20μl具有相同分子浓度的酶和0.2ml 0.05％溴甲酚蓝(btb)染料被加入4ml的玻璃比色皿中并充分混合。再加入1ml预冷的饱和co2水溶液，并在0℃的冰水混合物中进行反应。用计时器记录颜色从蓝色(ph＝8.3)变为黄色(ph＝6.3)的时间。根据wilbur anderson的方法定义酶活性，wilbur anderson单位(wau)被定义为(tc-te)/te，其中tc是空白溶液的变色时间(秒)，te是含有酶溶液的变色时间(秒)。
82.热稳定性测试方法：60℃条件下孵育相同浓度的实施例1制备的微米级的ca嵌合体7天，实施例2～5制备的纳米级多聚ca 30天，进行水合活性测定。
83.测试结果：
84.如图3所示，实施例1～5制备的ca酶在最适温度下测试的水合活性结果。实施例1～5的测试温度为55℃。从图3的结果可以看出，本技术实施例1～5制备的ca酶保持了高效的水合活性。
85.本技术进一步测试实施例1～5制备的ca酶的热稳定性，测试结果如表1所示。
86.表1实施例1～5制备的ca的热稳定性测试结果
[0087][0088][0089]
从表1的结果可以看出，与微米级的ca嵌合体相比，纳米级多聚ca的热稳定显著提升：其中，实施例1制备的微米级的ca嵌合体在60℃的初始活性为900wau/mg，在60℃孵育7天后，水合活性为450wau/mg，占初始活性的50％。实施例2制备的纳米级多聚ca在60℃的初始活性为862wau/mg，约为ca嵌合体水合活性的90％；在60℃孵育30天后，水合活性为560.3wau/mg，占初始活性的65％。实施例3制备的纳米级多聚ca在60℃的初始活性为885wau/mg，实施例3制备的纳米级多聚ca还能保持90％以上的水合活性，在60℃孵育30天后，水合活性为601.8wau/mg，占初始活性的68％。实施例4制备的纳米级多聚ca在60℃的初始活性为1406wau/mg，纳米级ca的水合活性增加了50％，在60℃孵育30天后，水合活性为984.2wau/mg，占初始活性的70％。实施例5制备的纳米级多聚ca在60℃的初始活性为2152wau/mg，水合活性增加了2.25倍。在60℃孵育30天后，水合活性为1506.4wau/mg，占初始活性的70％。
[0090]
如图6所示，实施例2制备的纳米ca在55℃孵育90天，活力基本保持不变；在65℃孵育60天，还能维持初始水合活性的55.6％，该纳米酶热稳定性良好。
[0091]
如图7所示，实施例3制备的纳米级多聚ca在55℃孵育90天，活力基本保持不变；在65℃孵育60天，还能维持初水合始活性的50.7％。该纳米酶热稳定性良好。
[0092]
如图8所示，实施例4制备的纳米级多聚ca在55℃孵育90天，水合能力基本保持不变；在65℃孵育60天，还能维持初始活性的64％，该纳米酶热稳定性良好。
[0093]
如图9所示，实施例5制备的纳米ca在55℃孵育90天，水合能力基本保持不变；在65℃孵育60天，还能维持54.3％的水合活性，该纳米酶热稳定性良好。
[0094]
从以上结果可以看出，本技术得到的纳米级多聚ca的催化活性或稳定性都有了显著改善。
[0095]
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
[0096]
以上对本技术实施例所提供的一种碳酸酐酶嵌合体、多聚碳酸酐酶、制备方法及应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。

技术特征：
1.一种碳酸酐酶嵌合体，其特征在于，所述碳酸酐酶嵌合体包括碳酸酐酶以及与所述碳酸酐酶连接的自发性多聚标签，所述碳酸酐酶包括如seq id no.1所示的氨基酸序列，或所述碳酸酐酶包括如seq id no.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；所述自发性多聚标签包括如seq id no.3所示的氨基酸序列，或所述自发性多聚标签包括如seq id no.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的碳酸酐酶嵌合体，其特征在于，所述碳酸酐酶通过柔性连接段与所述自发性多聚标签连接，所述柔性连接段包括如seq id no.5所示的氨基酸序列，或所述柔性连接段包括如seq id no.6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的碳酸酐酶嵌合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将seq id no.2所示的核苷酸片段、seq id no.4所示的核苷酸片段导入表达载体，得到重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，诱导表达，提取表达蛋白，得到碳酸酐酶嵌合体。4.一种多聚碳酸酐酶，其特征在于，所述多聚碳酸酐酶由权利要求1～2任一所述的碳酸酐酶嵌合体制备而成。5.根据权利要求4所述的多聚碳酸酐酶，其特征在于，所述多聚碳酸酐酶通过以下任意一种方法制备：(i)将所述碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合，得到所述多聚碳酸酐酶，所述第一溶液包括非离子表面活性剂；或，(ii)将所述碳酸酐酶嵌合体与第二溶液混合，恒温溶解或超声处理，得到所述多聚碳酸酐酶。6.根据权利要求5所述的多聚碳酸酐酶，其特征在于，所述非离子型表面活性剂包括聚氧乙烯醚类表面活性剂和/或聚山梨酯类表面活性剂。7.根据权利要求6所述的多聚碳酸酐酶，其特征在于，所述聚氧乙烯醚类表面活性剂包括曲拉通；和/或，所述聚山梨酯类表面活性剂包括吐温60或吐温80中的至少一种。8.根据权利要求5所述的多聚碳酸酐酶，其特征在于，所述第二溶液为水溶液；或所述第二溶液中包含有缓冲溶液。9.一种如权利要求4所述的多聚碳酸酐酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(ⅰ)将所述碳酸酐酶嵌合体与第一溶液混合，得到多聚碳酸酐酶，所述第一溶液包括非离子表面活性剂；或，(ⅱ)将所述碳酸酐酶嵌合体与第二溶液混合，恒温溶解或超声处理，得到多聚碳酸酐酶。10.一种如权利要求1～2任一所述的碳酸酐酶嵌合体，或如权利要求3所示的制备方法制备的碳酸酐酶嵌合体，或如权利要求4～8所述的多聚碳酸酐酶，或如权利要求9所述的制备方法制备的多聚碳酸酐酶在二氧化碳捕集、药物筛选和传感器中的应用。

技术总结
本申请公开了一种碳酸酐酶嵌合体、多聚碳酸酐酶、制备方法及应用。本申请的碳酸酐酶嵌合体包括碳酸酐酶以及自发性多聚标签，碳酸酐酶包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或碳酸酐酶包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列；自发性多聚标签包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或自发性多聚标签包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。本申请的碳酸酐酶嵌合体为非水溶性蛋白，该蛋白制备的成本低、用时短、可大量制备。此外，本申请制备的多聚碳酸酐酶的稳定性和催化活性均有所提高。化活性均有所提高。化活性均有所提高。


技术研发人员：李晓波 周蕊 李珂 杨浩然 何志军
受保护的技术使用者：中国船舶集团有限公司第七一一研究所
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/9/5