基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法

1.本发明涉及异烟肼分析检测技术领域，尤其涉及基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法。


背景技术：

2.异烟肼(isonicotinyl hydrazide，inh)是目前预防和治疗人类结核病最重要的抗生素之一，但过量使用inh可能会引起肝毒性等副作用，危害人体健康。因此，建立经济、便捷和准确的检测方法不仅可用于药物制剂质量监控，对进一步研究inh在体内详尽的生理学过程也具有重要意义。现如今，已经报道了一系列测定inh的分析方法，主要有电化学法、高效液相色谱-质谱法、胶束电动毛细管色谱法、流动注射化学发光法等，但这些方法大多需要复杂的样品前处理，且检测过程较为耗时。荧光分析法具有高灵敏度、低检出限、操作简单、取样量少等优势，受到了广泛的关注。
3.碳量子点(carbon quantum dots，cqds)是一种零维发光纳米材料，发现于2004年。相较于传统的荧光有机小分子与量子点，cqds具有优异的光学性能、低毒性、耐光漂白能力以及优良的生物兼容性，其作为荧光探针目前已广泛应用于生物成像、细胞标记、分析检测和光催化等各个领域。其中，cqds荧光探针也应用于异烟肼的分析测定中。ma等人以六宝茶和乙二胺为原料，一步合成了λ
em
＝440nm的氮掺杂碳量子点(n-cqds)，基于mno2与n-cqds间的内滤效应和inh存在下的荧光恢复，构建了“关-开”型荧光探针。shekarbeygi等人合成了铜掺杂西黄芪胶/壳聚糖cqds，基于cqds-fe
3+
电子转移过程荧光猝灭和fe
3+-inh氧化还原反应荧光恢复，测定了废水和血清环境下inh的含量。但这些方法仅通过单一发射峰的强度进行定量分析，这使得测定结果可能受到光源强度不稳定、测定微环境变换等多方面因素的干扰，为inh的准确测量带来诸多不确定因素。


技术实现要素：

4.针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，通过响应信号与参比信号的比例进行定量分析，消除外界干扰，从而实现inh的准确检测。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
6.基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
7.s1：使用对氨基苯甲酸和邻苯二胺合成双发射碳量子点pdecqds；
8.s2：在比色管中依次加入缓冲溶液、pdecqds工作液、mno
4-溶液和不同浓度的异烟肼inh溶液，用超纯水定容、摇匀，室温下静放；
9.s3：在单一激发λ
ex
＝315nm处，测定步骤s2中得到的混合体系在λ
em
＝347nm和λ
em
＝555nm处的荧光强度，分别记为f
347
和f
555
，计算体系荧光强度比值f
347
/f
555
与inh浓度之间的关系；
10.s4：基于体系荧光强度比值f
347
/f
555
随inh浓度线性变化，构建“关-开”比率型pdecqds-mno
4-荧光探针，用于测定异烟肼的浓度。
11.进一步的，步骤s1的具体操作包括以下步骤，
12.s101：称取0.0681g对氨基苯甲酸和0.0540g邻苯二胺，加入到10ml超纯水中，超声30min形成淡黄色透明溶液；
13.s102：将步骤s101中得到的淡黄色透明溶液转移到高压水热反应釜中，180℃加热保温4h；
14.s103：待反应釜冷却至室温后，经滤纸、0.22μm的微孔滤膜过滤，除去大颗粒，然后定容至100ml容量瓶中，得到亮橙色的pdecqds原液；
15.s104：将pdecqds原液稀释5倍得到pdecqds工作液，于4℃下冷藏保存备用。
16.进一步的，步骤s2中所述的缓冲溶液采用ph＝7.00的br缓冲溶液。
17.进一步的，步骤s2中mno
4-溶液采用浓度为5.0
×
10-4
mol/l的kmno4溶液
18.进一步的，步骤s2中br缓冲溶液、pdecqds工作液和kmno4溶液的体积比为2.5:1.5:0.2。
19.进一步的，步骤s3中所述的体系荧光强度比值f
347
/f
555
与inh浓度之间的关系具体为：inh浓度在8.0
×
10-7
～1.8
×
10-5
mol/l范围内与f
347
/f
555
呈良好线性关系，线性方程为线性方程为f
347
/f
555
＝3.927+0.06644c(10-6
mol/l)，相关系数r＝0.9832。
20.本发明的有益效果是：
21.本发明以有机试剂对氨基苯甲酸和邻苯二胺为原料，通过简单的一步水热法即可合成在315nm激发波长下，发射347nm与555nm两个荧光峰的双发射碳量子点pdecqds。在ph＝7.00的br缓冲介质中，于pdecqds溶液中加入kmno4，其于347nm处荧光强度f
347
发生一定程度的猝灭，而555nm处荧光强度f
555
基本不变；于上述荧光“关闭”后的pdecqds-mno
4-体系中加入inh，347nm处荧光信号重新“打开”。因此，以347nm处荧光信号作为响应信号，555nm处荧光信号作为参考信号，基于荧光强度比f
347
/f
555
随inh浓度线性变化可构建“关-开”比率型pdecqds-mno
4-荧光探针，最终实现inh的准确检测；而且该方法具有较强的选择性，可用于inh药片以及复杂的细胞培养基中inh的分析检测，为inh的准确检测提供新方法。
附图说明
22.图1为本发明中pdecqds的tem图、粒径分布图、ftir光谱和uv-vis吸收光谱图。
23.图2为本发明中不同激发波长下的pdecqds的荧光发射图谱。
24.图3为本发明中不同体系和添加8.0
×
10-7
～1.8
×
10-5
mol/l inh后pdecqds-mno
4-的荧光光谱。
25.图4为本发明中pdecqds-mno
4-和mno
4-‑
inh体系的uv-vis吸收光谱图。
26.图5为本发明中pdecqds比率型荧光传感器作用的机理图。
27.图6为本发明中激发波长对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响结果。
28.图7为本发明中ph、缓冲溶液种类和br缓冲溶液用量对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响。
29.图8为本发明中pdecqds的用量对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响。
30.图9为本发明中mno
4-用量对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响。
31.图10为本发明中反应温度对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响。
32.图11为本发明中反应时间对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响。
33.图12为本发明中离子强度对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响。
34.图13为本发明中f
347
/f
555
与inh浓度的线性关系图。
具体实施方式
35.为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
36.1实验部分
37.1.1试剂与仪器
38.inh标准溶液(1.0
×
10-3
mol/l)：准确称取0.0137g inh标准品(阿拉丁)，加超纯水溶解，稀释定容至100ml容量瓶中，4℃下低温冷藏、避光保存，使用时成比例稀释。
39.kmno4溶液(5.0
×
10-3
mol/l)：称取0.1975g kmno4固体，搅拌溶解于适量超纯水中，盖上表面皿，加热至沸并保持微沸状态1h，冷却至室温后，用玻璃漏斗过滤至250ml棕色容量瓶中，定容摇匀，室温下放置3天后备用，使用时逐级稀释。
40.britton-robinson(br)缓冲溶液(ph＝7.00)：在h3po4、ch3cooh、h3bo3三种酸(浓度均为0.04mol/l)的混合溶液中，加入0.2mol/l naoh溶液调配制成ph值为7.00的br缓冲溶液。
41.主要试剂，对氨基苯甲酸购自天津市福晨化学试剂厂，邻苯二胺购自阿拉丁。实验中所用水为超纯水，电阻率为18.25mω
·
cm。所用试剂均为分析纯且无需进一步提纯处理。
42.1.2实验方法
43.(1)pdecqds的合成
44.首先，称量0.0681g对氨基苯甲酸和0.0540g邻苯二胺加入到10ml超纯水中，将上述混合液超声30min形成淡黄色透明溶液。其次，将得到的溶液转移到50ml聚四氟乙烯内衬的高压水热反应釜中，于烘箱中180℃加热保温4h，待反应釜冷却至室温，经滤纸、0.22μm的微孔滤膜过滤微孔滤膜依次过滤以除去大颗粒，定容至100ml容量瓶，得到亮橙色pdecqds原液。最后，将pdecqds原液稀释5倍得pdecqds工作液，于4℃下冷藏保存以备进一步使用。
45.(2)基于pdecqds荧光探针的inh测定
46.向一系列10ml的比色管中依次加入2.50ml ph＝7.00的br缓冲溶液、1.50ml pdecqds工作液、kmno4溶液(5.0
×
10-4
mol/l)0.20ml以及不同浓度的inh溶液，用超纯水定容，摇匀，室温静放10min，测定其在单一激发λ
ex
＝315nm下，λ
em
＝347nm与λ
em
＝555nm处的荧光强度f
347
与f
555
。计算体系荧光强度比值f
347
/f
555
与inh浓度之间的关系，激发和发射狭缝宽度均为5nm，扫描速度1200nm/min，pmt电压为700v，响应0.004s。
47.2结果与讨论
48.2.1pdecqds的形貌与结构表征
49.pdecqds的形貌与结构表征结果包括tem图、粒径分布图、ftir光谱图和uv-vis吸收光谱图，结果如附图1所示，其中，a为pdecqds的的tem图，b为pdecqds的粒径分布图，c为pdecqds的ftir光谱图，d为pdecqds的uv-vis吸收光谱图。
50.透射电镜(tem)具有0.1～0.2nm的高分辨率，可用于样品的超微结构鉴定。首先，
使用tem表征了pdecqds的形貌与粒径，结果如附图1中a和b所示，pdecqds呈规则的球状，平均粒径为2.7nm左右，且分散均匀、无成团现象。高分辨tem图像显示，pdecqds具有明显的晶格特征，出现了0.21nm的晶格间距，这对应于石墨碳的(100)晶面，说明本发明中合成的pdecqds属于碳化为石墨内核的石墨态碳点。
51.随后，使用傅里叶变换红外光谱(ftir)表征了pdecqds的表面官能团。由附图1中c可知，位于3360cm-1
处的吸收带是o－h和n－h的伸缩振动峰，2950cm-1
附近的吸收峰属于c－h的伸缩振动，1640cm-1
处是c＝o的特征吸收峰，1460cm-1
、1290cm-1
和1140cm-1
处的吸收峰分别对应于c＝c、c－nh和c－o的特征吸收，900～650cm-1
吸收峰为苯环的面外弯曲振动。由此表明：本发明中合成的pdecqds表面含有羧基、羟基和氨基等大量亲水性基团，极大地提高了pdecqds的水溶性，使其作为荧光探针应用于溶液介质中成为可能。
52.pdecqds的紫外-可见吸收光谱如附图1中d所示，pdecqds在260nm波长处有一强吸收峰，在415nm波长处有一弱吸收峰。其中小于300nm的吸收可能来源于sp2共轭c＝c基团的π-π
*
跃迁，大于300nm的吸收对应于pdecqds表面丰富的c＝o基团的n-π
*
跃迁。
53.2.2pdecqds的发光性能
54.在290～340nm激发波长范围内，每隔5nm扫描一次pdecqds的荧光发射光谱，结果如附图2所示。很明显，当激发光波长从290nm增加到340nm时，pdecqds发射峰的荧光强度随之显著降低。不同于cqds激发波长依赖性，本发明中合成的pdecqds发射峰位置(λ
em
＝347nm、λ
em
＝555nm)不依赖激发波长的变化而变化，表现出激发独立性，这可能与其均匀的粒径分布及表面结构有关。
55.荧光受光源照射后发出的光子数与其吸收的光子数之比值称为荧光量子产率(qy)，其大小取决于荧光发射过程与非辐射跃迁过程的竞争结果。本发明以硫酸奎宁(qs)为标准物质，依据pdecqds每个单峰的最佳激发，测定了积分荧光强度和吸光度，相关数据如下表1所示。从表1中可以看出，该pdecqds的双峰qy分别为4.2％和1.3％。
56.表1荧光量子产率数据
[0057][0058]
2.3比率荧光法测定inh的原理及机理
[0059]
(1)测定inh的原理
[0060]
如附图3中a为315nm激发波长下不同体系的荧光光谱图。在该激发条件下，inh、mno
4-及mno
4-‑
inh不存在荧光，故实验没有背景影响。如图观察到pdecqds于347nm和555nm两处呈现出可分辨的荧光双发射峰，mno
4-溶液的加入，使得f
347
被猝灭，荧光信号“关闭”，再加入自身不具有荧光的inh，其使得f
347
被猝灭的荧光恢复，荧光信号重新“打开”，而f
555
一直保持不变。
[0061]
在pdecqds-mno
4-体系中加入8.0
×
10-7
～1.8
×
10-5
mol/l inh后，荧光光谱如附图
3中b所示，从附图3中b可以看出，随着inh浓度的变化，pdecqds-mno
4-体系位于347nm处的荧光信号呈现规律性恢复，而555nm处的荧光信号不变。据此，可基于pdecqds-mno
4-荧光探针的“关-开”建立inh的比率荧光检测方法。
[0062]
(2)机理探讨
[0063]
以uv-vis吸收光谱的变化及温度对k
sv
的影响探讨了mno
4-与pdecqds之间的荧光猝灭机理。首先对347nm荧光峰进行了温度对k
sv
的影响实验，以f0/f～[q]作图，可以得到298、308、318k下的k
sv
，结果如下表2所示，由表2可知，k
sv
随温度的升高而明显减小，这是静态猝灭机制，表明mno
4-与pdecqds之间是以静态猝灭的方式相互作用形成了无荧光的基态络合物，随着温度的升高阻碍了基态络合物的形成或降低了其稳定性，进而影响了静态猝灭的效率。
[0064]
表2温度对猝灭常数的影响
[0065][0066]
其次，扫描了pdecqds、mno
4-和pdecqds-mno
4-的uv-vis吸收光谱。如附图4中a所示，由附图4中a所示，pdecqds在260nm和415nm处有吸收峰，mno
4-在506nm、525nm和545nm处有吸收峰。比较发现，pdecqds-mno
4-体系的吸光度不等同于pdecqds与mno
4-二者吸光度加和，且加入mno
4-后，pdecqds位于260nm处的吸收峰红移至265nm，415nm处吸收峰消失，并于325nm处出现了新的吸收峰，吸收光谱发生明显变化，鉴于基态络合物的形成可改变pdecqds的uv-vis谱图，由此得出mno
4-与pdecqds之间是以静态猝灭的方式相互作用的，这与温度对stern-volmer猝灭常数的影响试验结果一致。
[0067]
附图4中b为inh、mno
4-以及mno
4-‑
inh体系的uv-vis谱图。如图所示，inh在262nm处有吸收峰，当inh加入到mno
4-溶液中，mno
4-的长波长处的特征吸收峰消失，并于268nm和307nm处出现了新的吸收峰，吸收光谱发生了变化，且inh-mno
4-体系的吸光度明显区别于inh与mno
4-二者吸光度加和，表明inh与mno
4-发生了反应，有新物质的生成。
[0068]
综上所述，推测反应机理如下：强氧化性的mno
4-与pdecqds表面基团发生相互作用，结合于pdecqds表面，形成一种无荧光或弱荧光的基态复合物，使得pdecqds的激发跃迁受阻，荧光发生猝灭。当pdecqds-mno
4-体系中加入inh后，由于inh的强还原性，inh更易夺取结合于pdecqds表面的mno
4-并将其还原为mn
2+
，从而引起pdecqds荧光的重新恢复，反应的可能机理如附图5所示。
[0069]
2.4测定条件的优化
[0070]
为了达到最佳检测性能，优化测试了激发波长、pdecqds用量、ph、缓冲溶液种类及其用量、mno
4-用量和反应温度对该体系的影响。由于该pdecqds-mno
4-‑
inh体系是基于f
347
增强和f
555
信号不变进行inh检测，同时考虑扣除猝灭体系pdecqds-mno
4-背景值的影响，选择以fs/fb作为最佳条件纵坐标(fs/fb为pdecqds-mno
4-‑
inh体系溶液荧光强度比值(fs＝f
347
/f
555
)与pdecqds-mno
4-溶液荧光强度比值(fb＝f
347
/f
555
)之比)。
[0071]
(1)激发波长的选择
[0072]
本发明中不同激发波长只改变pdecqds荧光峰的发射强度，对于发射峰的位置并无影响。在290～340nm波长范围内，每隔5nm记录一次pdecqds-mno
4-‑
inh体系的fs/fb，结果如附图6所示，在290～315nm范围内，随着激发波长的增大fs/fb增加，于λ
ex
＝315nm时fs/fb达到最大值，继续增大激发波长至340nm，fs/fb呈现下降趋势。因此，本发明选择315nm作为实验体系的最佳激发波长。
[0073]
(2)ph、缓冲溶液种类及用量的影响
[0074]
由于pdecqds的发光特性依赖于其表面性质，而其表面性质与酸度紧密相关。试验了不同酸度对pdecqds-mno
4-‑
inh体系fs/fb的影响，结果如附图7中a所示，fs/fb在ph为5.00～7.00范围内，随酸度降低而增大，在ph＝7.00时达到最大，继续降低酸度fs/fb基本保持不变，直到ph大于9.00时开始出现下降趋势，因此，本发明选择酸度为7.00。此外，考察了na2hpo
4-柠檬酸、na2hpo
4-nah2po4、kh2po
4-naoh、br和tris-hcl等缓冲介质种类对体系fs/fb的影响，结果如附图7中b所示，最终选择br溶液作为体系的缓冲介质。
[0075]
本发明中还进一步优化了br缓冲液的用量，如附图7中c所示，结果表明，br缓冲液的用量在0.50～3.00ml范围内fs/fb基本不变，即br溶液的用量在该范围内对实验影响很小，因此，本发明确定br溶液的用量为2.50ml。综上所述：加入2.50ml ph＝7.00的br缓冲溶液时fs/fb最佳。
[0076]
(3)pdecqds的用量选择
[0077]
pdecqds溶液的浓度对荧光强度有很大影响。于10ml比色管中，分别量取pdecqds工作液0.10ml、0.20ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml，测定其对体系fs/fb的影响，结果如附图8所示，从附图8中可以看出，在0.10～1.50ml范围内，随着pdecqds溶液用量的增加，fs/fb逐渐升高，在1.50ml时达到最大值，而后继续增加pdecqds溶液用量，fs/fb不升反降。因此，本发明确定pdecqds溶液的最佳用量为1.50ml。
[0078]
(4)mno
4-的用量选择
[0079]
作为pdecqds-mno
4-‑
inh体系中重要组成之一的猝灭剂，mno
4-的用量影响inh检测的背景值和线性范围。实验发现若mno
4-的加入量少时，仅对pdecqds的荧光强度有微弱猝灭，致使检测inh的线性范围变窄；但若mno
4-的加入量过多时，inh会率先与过量的mno
4-反应，导致荧光恢复程度降低，影响荧光恢复的效率。本发明中试验了mno
4-溶液(5.0
×
10-4
mol/l)不同用量(0.00ml、0.05ml、0.10ml、0.20ml、0.50ml和1.00ml)对pdecqds-mno
4-‑
inh体系fs/fb的影响，结果如附图9所示，当mno
4-溶液用量为0.20ml时fs/fb最优，因此，本发明选择mno
4-溶液用量为0.20ml(5.0
×
10-4
mol/l)。
[0080]
(5)反应温度的影响
[0081]
本发明中还考察了不同温度(20℃、40℃、60℃、80℃、100℃)对pdecqds-mno
4-‑
inh体系fs/fb的影响，结果如附图10所示，从附图10中可以看出，随着温度的升高，kmno4溶液对pdecqds猝灭程度加强，但加入等浓度量的inh溶液并未使猝灭后的荧光恢复程度加强，反而使得fs/fb降低，即加热有利于荧光的猝灭，但是对荧光强度的恢复不利。因此，本发明选择室温下不加热。
[0082]
(6)体系的稳定性
[0083]
本发明中试验了不同的反应时间(3～240min)对pdecqds-mno
4-‑
inh体系fs/fb的影响，结果如附图11所示，从附图11中可以看出，在室温下反应10min后fs/fb趋于最大，且在
240min内基本保持稳定，这表明pdecqds-mno
4-‑
inh体系随着时间的推移是稳定的。
[0084]
(7)离子强度的影响
[0085]
本发明中还考察了nacl浓度对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响，结果如附图12所示，从附图12中可以看出，在pdecqds-mno
4-‑
inh混合溶液中nacl浓度从0增加到2.0
×
10-2
mol/l时，fs/fb基本保持不变，表明该pdecqds对inh的比率荧光检测在高离子强度环境下仍能保持一定的稳定性，具有耐受性。
[0086]
2.5检出限及线性范围
[0087]
在最佳的实验优化条件下，分析测定了不同浓度的inh溶液，以确定该方法对inh的检测性能，结果如附图13所示，从附图13中可以看出，inh浓度在8.0
×
10-7
～1.8
×
10-5
mol/l范围内与pdecqds位于两发射波长处的荧光强度值f
347
/f
555
呈良好线性关系，线性方程为f
347
/f
555
＝3.927+0.06644c(10-6
mol/l)，相关系数r＝0.9832。根据3σ/k理论计算，得出该方法检出限(lod)为7.5
×
10-8
mol/l。
[0088]
2.6共存物质的影响
[0089]
通过在pdecqds-mno
4-‑
inh体系中加入一系列实际样品中可能存在的干扰物质，包括金属阳离子、阴离子和药剂辅料等，评测了该分析方法的特异性。在优化的实验条件下，控制相对误差在
±
5％范围内，选择1.0
×
10-5
mol/l的inh溶液进行测定，结果如下表3所示。则1000倍的葡萄糖、d-果糖、蔗糖、淀粉、h2o2、so
32-、no
3-、f-、s
2-、clo
4-、so
42-、i-、ni
2+
、k
+
、ca
2+
、mg
2+
、br-，500倍的co
32-、ba
2+
，100倍的乳糖、草酸、zn
2+
、mn
2+
、pb
2+
、co
2+
、al
3+
、cu
2+
、ag
+
，10倍的fe
3+
，5倍的hg
2+
等不影响inh的检测，说明方法具有较好的特异性。
[0090]
表3干扰物质对pdecqds-mno
4-‑
inh体系的影响
[0091][0092]
2.7样品分析
[0093]
随机选取同一批次的异烟肼片10片(规格：100mg)，研磨成粉，准确称取相当于0.0137g inh的粉末，加超纯水溶解定容至100ml容量瓶中，摇匀、静置、过滤。准确移取滤液
适量，按照1.2中的实验方法进行测定，计算异烟肼片含量。另于样品溶液中分别加入2.0
×
10-6
mol/l、4.0
×
10-6
mol/l、8.0
×
10-6
mol/l的标准样品，反应10min后，依次对各个样品的3组混合液进行荧光测定，每组平行测定5次，结果如下表4所示，根据工作曲线计算，其加标回收率为98.86％～101.9％，方法的rsd小于2.8％，取得了较为满意的结果。
[0094]
表4片剂中inh测定及回收率实验(n＝5)
[0095][0096]
随后，在细胞培养基中进行了inh的测定。在荧光分析前，将dmem细胞培养基(gibco)稀释100倍，过滤，备用。向一系列10ml的比色管中依次加入1.50ml pdceqds溶液、2.50ml ph＝7.00的br缓冲溶液、0.20ml kmno4(5
×
10-4
mol/l)溶液和1.00ml dmem细胞培养基稀释液，以超纯水定容，摇匀，室温静放10min，测定其在激发λ
ex
＝315nm下，λ
em
＝347nm与λem＝555nm处的荧光强度f
347
与f
555
，实验发现1.00ml dmem细胞培养基稀释液的加入对pdecqds荧光强度没有影响，未从中检测到inh。同时另于dmem细胞培养基中分别加入2.0
×
10-6
mol/l、4.0
×
10-6
mol/l、8.0
×
10-6
mol/l的inh标准品，采用标准加入法测定inh的含量，结果如下表5所示，从表5中可以看出，检测到的inh结果与最初的加标值基本一致，加标回收率为98.20％～101.5％，方法的rsd小于2.7％，表明该荧光分析方法准确可靠。
[0097]
表5细胞培养基样品中inh的测定(n＝5)
[0098][0099]
3结论
[0100]
本发明中以对氨基苯甲酸和邻苯二胺为原料，一步水热法即可制备具有双波长的pdecqds。基于inh仅可使被mno
4-猝灭的347nm处荧光信号重新打开的现象，以555nm处荧光信号作为参考信号，设计了具有特定inh响应的“关-开”型比率pdecqds-mno
4-荧光探针，为inh的准确测定提供了新方法，检出限为7.5
×
10-8
mol/l。已用于药物片剂和细胞培养基中inh的定量检测，具有良好的回收率(分别为98.86％～101.9％和98.20％～101.5％)，该方法有望用于inh药物质量监控以及复杂生物样品中inh的药代动力学研究。
[0101]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于，包括以下步骤，s1：使用对氨基苯甲酸和邻苯二胺合成双发射碳量子点pdecqds工作液；s2：在比色管中依次加入缓冲溶液、pdecqds工作液、mno
4-溶液和不同浓度的异烟肼inh溶液，用超纯水定容、摇匀，室温下静放；s3：在单一激发λ
ex
＝315nm处，测定步骤s2中得到的混合体系在λ
em
＝347nm和λ
em
＝555nm处的荧光强度，分别记为f
347
和f
555
，计算体系荧光强度比值f
347
/f
555
与inh浓度之间的关系；s4：基于体系荧光强度比值f
347
/f
555
随inh浓度线性变化，构建“关-开”比率型pdecqds-mno
4-荧光探针，用于测定异烟肼的浓度。2.根据权利要求1所述的基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于，步骤s1的具体操作包括以下步骤，s101：称取0.0681g对氨基苯甲酸和0.0540g邻苯二胺，加入到10ml超纯水中，超声30min形成淡黄色透明溶液；s102：将步骤s101中得到的淡黄色透明溶液转移到高压水热反应釜中，180℃加热保温4h；s103：待反应釜冷却至室温后，经滤纸、0.22μm的微孔滤膜过滤，除去大颗粒，然后定容至100ml容量瓶中，得到亮橙色的pdecqds原液；s104：将pdecqds原液稀释5倍得到pdecqds工作液，于4℃下冷藏保存备用。3.根据权利要求2所述的基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于：步骤s2中所述的缓冲溶液采用ph＝7.00的br缓冲溶液。4.根据权利要求3所述的基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于：步骤s2中mno
4-溶液采用浓度为5.0
×
10-4
mol/l的kmno4溶液。5.根据权利要求4所述的基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于：步骤s2中br缓冲溶液、pdecqds工作液和kmno4溶液的体积比为2.5:1.5:0.2。6.根据权利要求5所述的基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，其特征在于：步骤s3中所述的体系荧光强度比值f
347
/f
555
与inh浓度之间的关系具体为：inh浓度在8.0
×
10-7
～1.8
×
10-5
mol/l范围内与f
347
/f
555
呈良好线性关系，线性方程为f
347
/f
555
＝3.927+0.06644c(10-6
mol/l)，相关系数r＝0.9832。

技术总结
本发明公开了基于双发射碳量子点比率荧光探针测定异烟肼的检测方法，属于异烟肼分析检测技术领域。本发明通过合成双发射碳量子点pDECQDs并构建比率型荧光探针，从而实现异烟肼INH更加准确的分析检测。以对氨基苯甲酸和邻苯二胺为原料，使用水热法合成在347nm与555nm处拥有两个荧光发射峰的双发射碳量子点pDECQDs。在pH 7.00的中性介质中，KMnO4可有效猝灭pDECQDs于347nm处荧光强度，而保持555nm处荧光强度F


技术研发人员：孙凌波 张越诚 马红燕 张洁
受保护的技术使用者：延安大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/9/5