一种抗菌肽@ZIF-8纳米复合体及其制备方法和应用与流程

一种抗菌肽@zif-8纳米复合体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及药物制备技术领域，尤其涉及一种抗菌肽@zif-8纳米复合体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.天蚕素肽(cecs)是昆虫来源的两亲肽，具有多种药理作用，包括抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性。天蚕素通过破坏磷脂膜的完整性诱导肿瘤细胞死亡。然而，非特异性细胞毒性和体内快速降解限制了天蚕素的临床应用。纳米技术为肿瘤根除提供了新的策略，包括纳米载体可以精确地将化疗药物靶向到肿瘤组织。
3.金属有机框架(metal-organic frameworks，mofs)是一种通过金属离子或金属簇和有机配体组装连接而成的，具有典型的高结晶和多孔可降解性能的固体材料。因为mofs制备简单，孔隙率高，比表面积大，降解特性良好和易于功能化，被广泛应用于气体分离、催化反应、药物释放和传感器等领域。zifs作为mofs的子类，是由zn
2+
、co
2+
等二价金属离子和咪唑或咪唑衍生物配体在溶剂中自组装形成，其中zif-8最具代表性。zif-8是锌基mofs，具有低毒性的特点，它是由金属zn
2+
与配体甲基咪唑酯的n原子相连形成的znn4的四面体结构单元。由于其不但具有mofs本身的特性，还有更高的热稳定性、化学稳定性、更高的孔隙率、更好的载药能力和良好的生物相容性，被认为是zif中最具代表性的一类。zif-8在有机溶液中进行合成可得到尺寸均一，形貌规整的纳米颗粒；然而有机溶剂造价较贵，并且有毒、对环境有潜在危害。更重要的是，有些负载的药物不便储存于有机试剂中(例如蛋白，多肽核酸等)。
4.因此，研究得到一种提高药物稳定性和生理活性，成本低的抗菌肽@zif-8纳米复合体，具有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于为了克服现有技术的不足而提供一种抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体及其制备方法和应用，本发明的抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体能够提升多肽的稳定性和活性，纳米复合体的药效显著提高。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种抗菌肽@zif-8纳米复合体，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体包含zif-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽。
8.作为优选，所述zif-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽的质量比为1：0.08～0.16。
9.作为优选，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体为纳米级晶体。
10.作为优选，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体的粒径为100～200nm。
11.本发明还提供了所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体的制备方法，将抗菌肽溶液、锌溶液和咪唑配体溶液混合，原位合成zif-8沸石咪唑酯骨架负载抗菌肽的抗菌肽@zif-8纳米复合体。
12.作为优选，所述锌溶液为六水合硝酸锌溶液；抗菌肽溶液为抗菌肽和保护多肽的混合液；抗菌肽的纯度≥97％。
13.作为优选，所述混合得到的混合液中，抗菌肽和锌离子的质量比为20～30：1；咪唑配体和锌离子的摩尔比为7～9：1。
14.作为优选，所述混合的温度为20～30℃，混合的转速为900～1100rpm。
15.本发明还提供了所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
16.本发明的有益效果包括：
17.1)抗菌肽(cec)有抗菌、抗肿瘤等多种药理作用，可通过诱导细胞凋亡，细胞骨架损伤，胞膜溶解以及调节caspase、ca
2+
浓度、死亡受体、细胞外基质的表达，对多类肿瘤细胞、转化细胞以及实体瘤的生长具有显著的抑制作用。但是，其易受蛋白酶体攻击，半衰期短等，严重限制了其在临床上的发展和应用。zif-8沸石咪唑酯骨架(zif-8)具有优良的ph敏感性，在弱酸性的肿瘤组织中(ph为5.5～6.0)崩塌裂解，但是在血液和正常组织中(ph为7.4)稳定存在，这种特性使得zif-8作为ph响应性载体在抗肿瘤药物的靶向递送、肿瘤部位的特异性释放和药物递送方面得到了广泛应用。
18.2)本发明利用zif-8包裹cec多肽，通过框架结构有效保护cec多肽，提升cec多肽的半衰期和稳定性，使其在体液环境或制备运输过程中不易失活，提升cec多肽的生理活性，增强抗肿瘤活性。
附图说明
19.图1为实施例1制备得到的cec@zif-8纳米复合体的扫描电镜图；
20.图2为实施例1制备得到的cec@zif-8纳米复合体的透射电镜图；
21.图3为实施例1制备得到的cec@zif-8纳米复合体和zif-8nps的热重曲线图；
22.图4为实施例1制备得到的cec@zif-8纳米复合体、zif-8nps和游离cec的ftir图；
23.图5为实施例1制备得到的cec@zif-8纳米复合体和zif-8nps的zeta电位图；
24.图6为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、zif-8nps和游离cec对人宫颈癌hela细胞的活度；
25.图7为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、zif-8nps和游离cec对人宫颈鳞癌siha细胞的活度；
26.图8为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、游离cec和zif-8nps的克隆数目；
27.图9为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、游离cec、zif-8nps、cisplatin和control组用于人宫颈癌hela细胞的凋亡率、坏死率；
28.图10为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、游离cec、zif-8nps、cisplatin和control组用于人宫颈鳞癌siha细胞的凋亡率、坏死率；
29.图11为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、游离cec、zif-8nps和control组用于人宫颈癌hela细胞的细胞周期分布图；
30.图12为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、游离cec用于hela细胞的cdk2、cyclin d和β-actin蛋白在2h、4h、8h的表达情况；
31.图13为实施例1的cec@zif-8纳米复合体、游离cec用于hela细胞的蛋白水平结果；
32.图14为control组、cisplatin组、zif-8nps组、实施例1的cec@zif-8纳米复合体组
和游离cec组中小鼠肿瘤体积与时间的关系图；
33.图15为control组、cisplatin组、zif-8nps组、实施例1的cec@zif-8纳米复合体组和游离cec组中小鼠体重与时间的关系图；
34.图16为control组、cisplatin组、zif-8nps组、实施例1的cec@zif-8纳米复合体组和游离cec组中肿瘤体积、肿瘤重量比较；
35.图17为control组、zif-8nps组、实施例1的cec@zif-8纳米复合体组、游离cec组用于小鼠的肝、肾、肿瘤组织中的结构变化；
36.图18为实施例1的cec@zif-8纳米复合体的小鼠血液生化评价。
具体实施方式
37.本发明提供了一种抗菌肽@zif-8纳米复合体，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体包含zif-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽。
38.本发明的抗菌肽@zif-8纳米复合体中，所述zif-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽的质量比优选为1：0.08～0.16，进一步优选为1：0.10～0.14，更优选为1：0.12～0.13。
39.本发明中，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体优选为纳米级晶体，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体的粒径优选为100～200nm，进一步优选为120～180nm，更优选为140～160nm。
40.本发明还提供了所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体的制备方法，将抗菌肽溶液、锌溶液和咪唑配体溶液混合，原位合成zif-8沸石咪唑酯骨架负载抗菌肽的抗菌肽@zif-8纳米复合体。
41.本发明的抗菌肽@zif-8纳米复合体中，优选为zif-8沸石咪唑酯骨架包裹抗菌肽；抗菌肽优选为cec多肽。
42.本发明中，所述锌溶液优选为六水合硝酸锌溶液；锌溶液的溶剂为水，锌溶液中，硝酸锌的质量浓度优选为12～18μg/ml，进一步优选为15～16μg/ml。
43.本发明中，抗菌肽溶液优选为抗菌肽和保护多肽的混合液；抗菌肽的纯度优选≥97％，进一步优选≥98％；抗菌肽和保护多肽的质量比优选为1：190～210，进一步优选为1：200；咪唑配体溶液中，溶剂为水，咪唑配体的质量浓度优选为145～165μg/ml，进一步优选为150～160μg/ml，更优选为156.25μg/ml。
44.本发明所述混合得到的混合液中，抗菌肽和锌离子的质量比优选为20～30：1，进一步优选为22～28：1，更优选为24～26：1；咪唑配体和锌离子的摩尔比优选为7～9：1，进一步优选为7.5～8.5：1，更优选为8：1。
45.本发明中，咪唑配体优选为2-甲基咪唑。
46.本发明中，所述混合的温度优选为20～30℃，进一步优选为22～28℃，更优选为24～26℃；混合在搅拌条件下进行，混合的转速优选为900～1100rpm，进一步优选为950～1050rpm，更优选为1000rpm。
47.本发明中，所述混合优选为抗菌肽溶液和锌溶液混合均匀后，再与咪唑配体溶液混合形成混浊液；混浊液优选进行后处理，得到zif-8沸石咪唑酯骨架负载抗菌肽的抗菌肽@zif-8纳米复合体；后处理包含顺次进行的离心、重悬冻干，所述离心的转速优选为13000rpm～15000rpm，进一步优选为14000rpm；离心的时间优选为8～12min，进一步优选为10min；离心的温度优选为2～6℃，进一步优选为4～5℃；重悬冻干的温度优选为-65～-55
℃，进一步优选为-60℃；重悬冻干的时间优选为45～55h，进一步优选为48～50h。
48.本发明还提供了所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体在制备抗肿瘤药物中的应用。
49.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
50.实施例中，抗菌肽为抗菌肽(cec，序列为
51.wrkifkkwekmwrmirdgi-nh2)
52.实施例1
53.2-甲基咪唑溶液中，溶剂为水，2-甲基咪唑的浓度为156.25μg/ml；锌溶液的溶剂为水，硝酸锌在锌溶液中的质量浓度为15μg/ml；抗菌肽溶液为抗菌肽(cec)和保护多肽的混合液，抗菌肽(cec)和保护多肽的质量比为1：200，抗菌肽(cec)的纯度为98％。
54.将抗菌肽(cec)溶液和六水合硝酸锌溶液在25℃、1000rpm转速下搅拌均匀，得到的混合物再与2-甲基咪唑溶液在25℃、1000rpm转速下搅拌均匀进行原位合成，抗菌肽和锌离子的质量比为25：1，2-甲基咪唑和锌离子的摩尔比为8：1；形成zif-8沸石咪唑酯骨架包裹抗菌肽的混浊液，混浊液在14000rpm、4℃下离心10min，然后在-60℃下重悬冻干48h，得到抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体。
55.本实施例制备得到的cec@zif-8纳米复合体的扫描电镜图、透射电镜图如图1、图2所示。
56.本实施例制备得到的cec@zif-8纳米复合体的热重曲线图如图3所示，ftir图如图4所示，zeta电位图如图5所示；由图3、4、5可知，抗菌肽(cec)成功包裹在zif-8纳米中形成cec@zif-8纳米复合体，并且具有热稳定性。
57.本实施例得到的抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体为纳米级晶体，粒径为150nm。
58.实施例2
59.2-甲基咪唑溶液中，溶剂为水，2-甲基咪唑的浓度为150μg/ml；锌溶液的溶剂为水，硝酸锌在锌溶液中的质量浓度为15μg/ml；抗菌肽溶液为抗菌肽(cec)和保护多肽的混合液，抗菌肽(cec)和保护多肽的质量比为1：195，抗菌肽(cec)的纯度为97.5％。
60.将抗菌肽(cec)溶液和六水合硝酸锌溶液在22℃、980rpm转速下搅拌均匀，得到的混合物再与2-甲基咪唑溶液在22℃、980rpm转速下搅拌均匀进行原位合成，抗菌肽和锌离子的质量比为22：1，2-甲基咪唑和锌离子的摩尔比为7.5：1；形成zif-8沸石咪唑酯骨架包裹抗菌肽的混浊液，混浊液在13500rpm、3℃下离心9min，然后在-58℃下重悬冻干50h，得到抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体。
61.本实施例得到的抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体为纳米级晶体，粒径为120nm。
62.实施例3
63.2-甲基咪唑溶液中，溶剂为水，2-甲基咪唑的浓度为152μg/ml；锌溶液的溶剂为水，硝酸锌在锌溶液中的质量浓度为15μg/ml；抗菌肽溶液为抗菌肽(cec)和保护多肽的混合液，抗菌肽(cec)和保护多肽的质量比为1：205，抗菌肽(cec)的纯度为97.5％。
64.将抗菌肽(cec)溶液和六水合硝酸锌溶液在28℃、1030rpm转速下搅拌均匀，得到的混合物再与2-甲基咪唑溶液在28℃、1030rpm转速下搅拌均匀进行原位合成，抗菌肽和锌离子的质量比为28：1，2-甲基咪唑和锌离子的摩尔比为8.5：1；形成zif-8沸石咪唑酯骨架包裹抗菌肽的混浊液，混浊液在14500rpm、5℃下离心11min，然后在-62℃下重悬冻干46h，
得到抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体。
65.本实施例得到的抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体为纳米级晶体，粒径为180nm。
66.以下应用例中，抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体均为实施例1的抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体。纳米材料均配置在无菌pbs溶液中，mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)购买于sigma公司。
67.应用例1抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体的细胞毒性实验
68.采用mtt方法评价实验组、对照组和空白组对人宫颈癌hela细胞和人宫颈鳞癌siha细胞的增殖影响。
69.对人宫颈癌hela细胞的增殖影响
70.实验组：将人宫颈癌hela细胞用1640培养基制成100000个/ml的悬液，悬液以100μl/孔接种于96孔板中，37℃，5％co2培养箱中孵育24h。然后移去原有的1640培养基，分别加入含有不同浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、35μg/ml)cec@zif-8纳米复合体的1640培养基100μl。将96孔板置于37℃，5％co2培养箱中孵育24h。孵育完毕后，加入20μl的5mg/ml mtt溶液(溶剂为磷酸缓冲液)继续孵育3h。随后以1200rpm离心7min，弃去原培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)，置于振荡器摇晃至颜色均匀(10min)，使用酶标仪测定各孔490nm处的吸光度，并通过公式(1)计算得到细胞活度。
[0071][0072]
其中，对照组为只含zif-8，不含cec(zif与实验组中纳米复合体浓度等量)的1640培养基；空白组为不含cec和zif-8，与实验组中等量的1640培养基。
[0073]
同样条件下，用zif-8、游离cec分别替换cec@zif-8纳米复合体，zif-8浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、35μg/ml；游离cec浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、35μg/ml，其他条件和实验组相同。加入cec@zif-8纳米复合体、zif-8和游离cec后的细胞活度如图6所示。由图6可知，zif-8的浓度为10～35μg/ml时，hela细胞的存活度没有明显降低，说明zif-8材料对生物的细胞毒性低，生物相容性高。浓度相同的cec@zif-8纳米复合体的细胞毒性明显强于zif-8和游离cec，说明zif-8载体提高了抗菌肽的毒性作用。
[0074]
对人宫颈鳞癌siha细胞的增殖影响
[0075]
实验组：将人宫颈鳞癌siha细胞用1640培养基制成100000个/ml的悬液，悬液以100μl/孔接种于96孔板中，37℃，5％co2培养箱中孵育24h。然后移去原有的1640培养基，分别加入含有不同浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml)cec@zif-8纳米复合体的1640培养基100μl。将96孔板置于37℃，5％co2培养箱中孵育24h。孵育完毕后，加入20μl的5mg/mlmtt溶液继续孵育3h。随后以1200rpm离心7min，弃去原培养基，每孔加入150μl dmso，置于振荡器摇晃至颜色均匀(10min)，使用酶标仪测定各孔490nm处的吸光度，并通过公式(1)计算得到细胞活度。
[0076]
同样条件下，用zif-8nps(zif-8)、游离cec分别替换cec@zif-8纳米复合体，zif-8浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml；游离cec浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml，其他条件和实验组相同。加入cec@zif-8纳米复合体、zif-8和游离cec后的细胞活度如图7所示。由图7可知，zif-8的浓度为10～50μg/ml时，siha细胞的存活度没有明显降低，说明zif-8材料对生物的细胞毒性低，生物相容性高。浓度相
同的cec@zif-8纳米复合体的细胞毒性明显强于zif-8和游离cec，说明zif-8载体提高了抗菌肽的毒性作用。
[0077]
应用例2抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体的克隆形成试验
[0078]
实验组：将人宫颈癌hela细胞用1640培养基制成500个/ml的悬液，悬液以2ml/孔接种于6孔板中，37℃，5％co2培养箱中连续培养14天，每隔三天替换含药(游离cec、cec@zif-8纳米复合体)的新鲜的1640培养基。移去原有的培养基，分别加入2ml 1640培养基，1640培养基中分别含有不同浓度(30μg/ml、35μg/ml)cec@zif-8纳米复合体，35μg/ml游离cec以及350μg/ml zif-8nps。克隆数长至50终止，pbs清洗后，4％多聚甲醛固定10min。0.5％结晶紫染色，结果如图8所示。由图8可知，cec@zif-8纳米复合体克隆数目显著降低，明显比游离cec克隆数目少，说明zif-8载体提高了抗菌肽的毒性作用。
[0079]
应用例3抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体对癌细胞的凋亡实验
[0080]
人宫颈癌hela细胞的凋亡实验
[0081]
以1
×
105个细胞/孔的hela细胞接种在6孔板中，孵育24h。替换2ml1640培养基，1640培养基中分别含有不同浓度的(30μg/ml、35μg/ml)cec@zif-8纳米复合体，35μg/ml游离cec以及350μg/ml zif-8nps，在37℃条件下孵育24h。去掉培养基后pbs清洗细胞，加入annexinv-fitc/pi染液(1：2)10μl，室温条件下孵育20min后，铜网过滤，利用流式细胞分析仪检测细胞凋亡。
[0082]
细胞凋亡结果如图9所示，cec@zif-8纳米复合体处理hela细胞的凋亡率、坏死率与control组、zif-8组和游离cec组相比显著增加。表明cec@zif-8纳米复合体能够提升游离cec诱导hela细胞凋亡的能力。
[0083]
人宫颈鳞癌siha细胞的凋亡实验
[0084]
以1
×
105个细胞/孔的siha细胞接种在6孔板中，孵育24h。替换2ml1640培养基，1640培养基中分别含有不同浓度的(40μg/ml、50μg/ml)cec@zif-8纳米复合体，50μg/ml游离cec以及500μg/ml zif-8nps，在37℃条件下孵育24h。去掉培养基后pbs清洗细胞，加入annexinv-fitc/pi染液(1：2)10μl，室温条件下孵育20min后，铜网过滤，利用流式细胞分析仪检测细胞凋亡。
[0085]
细胞凋亡结果如图10所示，cec@zif-8纳米复合体处理siha细胞的凋亡率、坏死率与control组，zif-8组和游离cec组相比显著增加。表明cec@zif-8纳米复合体能够提升游离cec诱导siha细胞凋亡的能力。
[0086]
应用例4抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体的细胞周期阻滞实验
[0087]
以1
×
105个细胞/孔的hela细胞接种在6孔板中，孵育24h。替换2ml1640培养基，1640培养基中分别含有不同浓度的(20μg/ml、30μg/ml、35μg/ml)cec@zif-8纳米复合体，35μg/ml游离cec以及350μg/mlzif-8nps，在37℃条件下孵育24h。去掉培养基后pbs清洗细胞，70％预冷乙醇在4℃下固定过夜，pbs复水后加入pi/rnase孵育30min，fasc检测，modfit lt 3.0软件分析细胞周期的分布。
[0088]
细胞周期的分布结果如图11所示，cec@zif-8纳米复合体处理hela细胞24h后，g0/g1期细胞数量显著增加，s期比例显著减少，阻滞hela细胞周期在g0/g1期。
[0089]
应用例5蛋白质印记(wb)实验
[0090]
mtt确定cec@zif-8纳米复合体的最大作用浓度(35μg/ml)与含有相同含量的cec
为对比，作用细胞2h、4h和8h，提取蛋白，进行wb检测。不同时间段处理的hela细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的ripa强裂解液(裂解液的体积为hela细胞的1000倍)置于4℃裂解20min，12000rpm离心10min，bca法测蛋白质浓度。采用sds-page电泳，30v转移到pvdf膜，pbst(pbs中加入0.05％tween-20)洗涤3次，5％脱脂奶粉于常温孵育2h后，用稀释1000倍的一抗4℃孵育过夜，pbst洗3次后，用hrp标记的二抗于37℃封闭1h，最后用ecl检测试剂盒检测靶蛋白表达变化。
[0091]
采用western blot检测g0/g1期相关蛋白表达水平，如图12、图13所示。由图12、图13可知，cec@zif-8纳米复合体处理后，hela细胞cyclin d蛋白水平下调。上述结果表明cec@zif-8纳米复合体能够通过阻滞蛋白水平表达抑制hela生长。
[0092]
应用例6抗菌肽(cec)@zif-8纳米复合体的体内实验
[0093]
将1
×
105的tc-1细胞皮下注射到c57bl/6小鼠(雌性)右背后侧。7d后，肿瘤小鼠被随机分成5组(每组4只)，分别为：control组、cisplatin组、zif-8nps组、cec@zif-8纳米复合体(40mg/kg)组，游离cec(4mg/kg)组。建立tc-1荷瘤小鼠模型评价体内cec@zif-8纳米复合体抑制tc-1细胞生长的效果。待到肿瘤生长到可触及的大小时(第7天)开始通过尾静脉注射药物进行治疗，并且从第7天开始每隔1天对荷瘤小鼠测量肿瘤体积和称重，绘制小鼠肿瘤体积与时间曲线(图14)和小鼠体重与时间曲线(图15)。根据如下公式统计肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝(长
×
宽2)/2。由图14可知，与control组和zif-8nps组相比，cec@zif-8纳米复合体处理组及cisplatin组显著抑制了小鼠肿瘤生长。
[0094]
由图15可知，cec@zif-8纳米复合体共治疗9次，与control组(对照组)相比，cisplatin组治疗3次后，小鼠体重显著降低，表明cisplatin对小鼠具有较大毒副作用，而cec@zif-8纳米复合体组小鼠体重与对照组无显著差异，表明cec@zif-8纳米复合体对宫颈癌小鼠无明显毒副作用。
[0095]
由图16可知，在整个治疗周期中，control组和zif-8nps组的肿瘤迅速增大，cisplatin组、cec@zif-8纳米复合体组，游离cec组的肿瘤生长都明显低于control组和zif-8nps组，且游离cec组与control组相比，肿瘤体积显著减小，显著(*p《0.05)降低了肿瘤生长，而cec@zif-8纳米复合体组肿瘤体积和重量显著低于control组(*p《0.001)和游离cec组。上述结果表明cec@zif-8纳米复合体可以显著抑制肿瘤体内生长且抑制作用强于游离cec组(无显著差异)。
[0096]
应用例7he染色结果
[0097]
固定于4％多聚甲醛的各组应用处理(control组，zif-8组，cec@zif-8纳米复合体组和游离cec组)的肿瘤肝脏和肾脏组织，蒸馏水流动冲洗1h，用体积浓度分别为30％、50％、70％、80％、85％、95％的乙醇和无水乙醇进行梯度脱水，后将组织浸泡于体积比为1:1的无水乙醇与二甲苯混合溶液中30min。再于二甲苯中浸泡2次，分别为1h和40min；最后将组织放置于二甲苯中30min，蜡中60min。石蜡凝固，包埋组织并进行修整。载玻片上涂适量粘片剂，放置蜡块，滴加蒸馏水，35℃过夜。切片放置于二甲苯中脱蜡10min；再移入体积比为1:1的二甲苯和无水乙醇混合液中5min；体积浓度为100％、95％、85％、70％的乙醇梯度脱水，各处理5min后冲洗。苏木精染液染色10min；盐酸酒精(0.5％)分色；显微镜下观察到清晰的染色质与核；流水洗30min，再用蒸馏水继续冲洗；0.5％伊红染液染色5min，顺次用不同体积浓度乙醇(70％、85％、95％、100％)梯度脱水，每次3min；继续用二甲苯透明2次，
每次10min；滴加中性树胶，盖玻片封固；显微镜下观察组织结构变化。
[0098]
小鼠脱颈处死后，将部分肝、肾、肿瘤组织进行切片he染色，200倍镜下进行病理组织学检测，zif-8nps组、cec@zif-8纳米复合体组，游离cec组的组织结构如图17所示。由图17可知，cec@zif-8纳米复合体组的肿瘤组织出现多处不同程度的坏死区域，肝脏组织结构正常，肝细胞边缘清晰，无变性坏死，无充血、出血以及炎症现象。control组与各治疗组(zif-8nps组、cec@zif-8纳米复合体组，游离cec组)小鼠的肾脏组织结构中，细胞无变性坏死，肾间质无充血、出血现象，各小鼠肾组织形态的结构正常，无病理改变。
[0099]
应用例8小鼠的血液生化评价纳米复合体的生物安全性
[0100]
control组、cec@zif-8纳米复合体组、游离cec组和zf-8组的小鼠通过摘眼球采集血液，放入含抗凝血剂的离心管中，准备抗凝血。以及另存离心管分离血清，先将其在4℃放置2h，后在37℃放置0.5h，3000g离心15min，收集上清液(血清)。流式法测定抗凝血试验中白细胞(wbc)计数、红细胞(rbc)计数、血红蛋白(hgb)、红细胞压积(hct)、平均红细胞体积(mcv)计数、平均血红细胞和血红蛋白浓度，测定红细胞的平均血红蛋白的含量(mchc)和血小板计数(plt)以及血清中的丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、尿酸(ua)和血肌酐(crea)的各项肝功指标和肾功指标。将其检测的结果再加以统计和分析，与对照组结果进行综合分析和对比，以此来评估cec@zif-8纳米复合体用于健康机体中的安全性，结果如图18所示。检测结果显示，与对照组相比，cec@zif-8纳米复合体组和游离cec组的小鼠alt、ast、bun和crea等指标均无显著差异，其他血液指标无明显差异。白细胞指数表明，游离的抗菌肽引起一定的炎症反应，但被zf-8包裹之后，白细胞数量有所下降，表明了cec@zif-8纳米复合体除了增效之外还可以降毒。同时，红细胞指标表明，游离cec没有溶血作用，与体外溶血试验的结果相互印证。以上结果表明cec@zif-8纳米复合体可以安全有效地用于体内抗肿瘤治疗，且具有良好的抗癌作用。
[0101]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种抗菌肽@zif-8纳米复合体，其特征在于，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体包含zif-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽。2.根据权利要求1所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体，其特征在于，所述zif-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽的质量比为1：0.08～0.16。3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体，其特征在于，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体为纳米级晶体。4.根据权利要求3所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体，其特征在于，所述抗菌肽@zif-8纳米复合体的粒径为100～200nm。5.权利要求1～4任一项所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体的制备方法，其特征在于，将抗菌肽溶液、锌溶液和咪唑配体溶液混合，原位合成zif-8沸石咪唑酯负载抗菌肽的抗菌肽@zif-8纳米复合体。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述锌溶液为六水合硝酸锌溶液；抗菌肽溶液为抗菌肽和保护多肽的混合液；抗菌肽的纯度≥97％。7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述混合得到的混合液中，抗菌肽和锌离子的质量比为20～30：1；咪唑配体和锌离子的摩尔比为7～9：1。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述混合的温度为20～30℃，混合的转速为900～1100rpm。9.权利要求1～4任一项所述的抗菌肽@zif-8纳米复合体在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明属于药物制备技术领域，本发明提供了一种抗菌肽@ZIF-8纳米复合体，所述抗菌肽@ZIF-8纳米复合体包含ZIF-8沸石咪唑酯骨架和抗菌肽；本发明还提供了一种抗菌肽@ZIF-8纳米复合体的制备方法和应用。本发明利用ZIF-8包裹CEC多肽，通过框架结构有效保护CEC多肽，提升CEC多肽的半衰期和稳定性，使其在体液环境或制备运输过程中不易失活，提升CEC多肽的生理活性，增强抗肿瘤活性。增强抗肿瘤活性。增强抗肿瘤活性。


技术研发人员：夏丽洁 马荣斌 李金耀 蒋静雯
受保护的技术使用者：新疆前进荣耀投资有限公司
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/9/5