一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇及其制备方法和应用

1.本发明属于响应型药物递送材料及复合纳米簇制备技术领域，具体涉及一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来纳米载体受到了极大的关注，有望解决传统药物递送过程中水溶性差、靶向能力不足和全身毒性高的问题。然而，纳米载体在疾病组织尤其是肿瘤深层的渗透和内化效率低，极大地限制了药物的递送效率，进而削弱了治疗效果。研究表明，纳米载体的尺寸和表面电荷是影响体内药物递送过程的重要因素，小尺寸带正电荷的纳米载体有利于提高肿瘤的渗透和内化效果，然而这与易于循环和富集的纳米载体形貌(大尺寸、负电)相矛盾。因此，设计尺寸/表面电荷双转换的纳米载体在改善渗透和内化效果方面具有明显的优势。相对于合成高分子，天然高分子具有生物相容性好、成本低等优点，而且其分子结构中的如羟基、羧基、氨基等易于进行功能化修饰，在开发药物递送纳米载体方面具有巨大的潜力。
3.明胶可被肿瘤组织中高表达的基质金属蛋白酶(mmp-2)降解成低分子多肽和氨基酸。有机硅纳米颗粒具有尺寸可调、可设计成中空结构高效负载药物、生物相容性好、表面易功能化修饰等优点。硫化铜纳米颗粒具有光热和光动力抗肿瘤的效果，同时可以被设计成中空结构负载药物。通过静电、氢键、主客体等作用可以将小尺寸的纳米颗粒和高分子进行组装，获得纳米颗粒基的复合纳米簇，且组装作用力可以在一定的内外源刺激下去除，释放纳米颗粒。
4.现有文献报道了一种键合抗肿瘤药物的两亲性聚合物，自组装得到了约80nm的集束化纳米药物载体。该载体有助于延长药物在血液中的循环和肿瘤组织富集，而且在肿瘤微酸环境下快速崩解为小于10nm的颗粒，具有较强的肿瘤组织渗透和积累能力，从而将更多的药物输送到肿瘤细胞内。但是载体单一的结构特性转换不能满足输送过程中每一步的要求，例如通过尺寸减小来增强肿瘤组织渗透能力的纳米颗粒在细胞内化时受到表面peg分子或者负电荷影响，同样地通过表面电荷转换来促进细胞内化的纳米颗粒经血液循环后因尺寸过大而限制了其在组织的渗透。(li h-j,du j-z,liu j,et al.smart superstructures with ultrahigh ph-sensitivity for targeting acidic tumor microenvironment:instantaneous size switching and improved tumor penetration[j].acs nano,2016,10(7):6753-61.)


技术实现要素：

[0005]
为了克服现有技术存在的载体单一的结构不能满足输送过程中每一步的要求，本发明的目的是提供一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇及其制备方法和应用。
[0006]
本发明采用对肿瘤微酸和酶双响应的改性明胶和对药物高负载的中空介孔有机硅或硫化铜纳米颗粒，通过静电组装构建纳米颗粒-明胶复合纳米簇。该纳米簇可响应肿瘤环境中的微酸和酶刺激实现尺寸和电荷转换，从而增强肿瘤组织的渗透和抗肿瘤治疗效果。
[0007]
本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0008]
本发明提供一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)将明胶与靶向配体反应，透析冻干后再与酸酐类化合物在碱性条件下反应，透析冻干得到改性明胶，或将明胶与酸酐类化合物在碱性条件下反应，透析冻干得到改性明胶；
[0010]
(2)通过溶胶凝胶法制备带正电的载药有机硅纳米颗粒或通过纳米沉淀法制备带正电的载药硫化铜纳米颗粒；
[0011]
(3)将步骤(1)制备得到的改性明胶配制成改性明胶溶液，将步骤(2)制备得到的纳米颗粒配制成纳米颗粒分散液，再将改性明胶溶液与纳米颗粒分散液混合，通过静电作用得到尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0012]
优选的，步骤(1)所述明胶与靶向配体反应的温度为20℃～80℃，明胶与靶向配体反应的时间为2-24h。
[0013]
优选的，步骤(1)所述明胶与酸酐类化合物反应的温度为20℃～80℃，明胶与酸酐类化合物反应的时间为2-24h。
[0014]
优选的，步骤(1)所述碱性条件皆为ph7.4～10.0。
[0015]
优选的，步骤(1)所述靶向配体为叶酸、透明质酸中的一种以上。
[0016]
优选的，步骤(1)所述酸酐类化合物为马来酸酐、甲基马来酸酐、二甲基马来酸酐中的一种以上。
[0017]
优选的，步骤(1)所述改性明胶为马来酸酐改性明胶、甲基马来酸酐改性明胶、二甲基马来酸酐改性明胶、马来酸酐叶酸改性明胶、甲基马来酸酐叶酸改性明胶、二甲基甲基马来酸酐叶酸改性明胶、马来酸酐透明质酸改性明胶、甲基马来酸酐透明质酸改性明胶或二甲基甲基马来酸酐透明质酸改性明胶。
[0018]
优选的，步骤(1)中，所述靶向配体与明胶的质量比为(1:15)～(1:1)。
[0019]
优选的，步骤(1)中，所述酸酐类化合物与明胶的质量比皆为(1:25)～(1:9)。
[0020]
优选的，马来酸酐、甲基马来酸酐或二甲基马来酸酐与叶酸改性明胶的质量比为(1:25)～(1:9)。
[0021]
优选的，步骤(2)中所述溶胶凝胶法的具体步骤为：取1～5g的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，加入10～40g去离子水，然后加入0.2～2g三乙醇胺(tea)的水溶液(三乙醇胺与水的体积比为1:9)，60～120℃搅拌均匀后加入1～5ml的正硅酸乙酯(teos)，反应1～8h后得到介孔二氧化硅纳米颗粒内核(msn)。继续加入1～5ml的teos和0.1～5ml的双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物(btds)的混合液，反应2～8h后离心，用去离子水和乙醇清洗可得到包覆了介孔有机硅的纳米颗粒(mon@msn)。随后在60～120℃的乙醇和盐酸的混合溶液(乙醇和盐酸的体积比为10:1)中回流去除ctac，重新分散在100～800ml的去离子水中，加入2～10ml的浓度为25％的氨水(nh3·
h2o)，超声分散后在60～120℃下搅拌2～8h，离心后
用去离子水和乙醇清洗，冷冻干燥得到中空介孔有机硅纳米颗粒hmon。将50～300mg的hmon分散在20～200ml的无水乙醇中，加入1～6ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在80℃冷凝回流5～24h，冷冻干燥得到氨基化中空介孔有机硅纳米颗粒(hmon-nh2)。载药后，得到载药氨基化中空介孔有机硅纳米颗粒。
[0022]
优选的，步骤(2)中所述溶胶凝胶法的具体步骤为：取1～5g的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，加入10～40g去离子水，然后加入0.2～2g三乙醇胺(tea)的水溶液(三乙醇胺与水的体积比为1:9)，60～120℃搅拌均匀后加入1～5ml的正硅酸乙酯(teos)，反应1～8h后得到介孔二氧化硅纳米颗粒内核(msn)。继续加入1～5ml的teos和0.1～5ml的双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物(btds)的混合液，反应2～8h后离心，用去离子水和乙醇清洗可得到包覆了介孔有机硅的纳米颗粒。随后在60～120℃的乙醇和盐酸的混合溶液(乙醇和盐酸的体积比为10:1)中回流去除ctac，冷冻干燥得到介孔有机硅纳米颗粒mon。将50～300mg的mon分散在20～200ml的无水乙醇中，加入1～6ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在80℃冷凝回流5～24h，冷冻干燥得到氨基化介孔有机硅纳米颗粒(mon-nh2)。载药后，得到载药氨基化介孔有机硅纳米颗粒。
[0023]
优选的，步骤(2)中所述纳米沉淀法的具体步骤为：在转速为200～1500rpm的搅拌条件下将0.2～5ml醋酸加入10～50ml甲醇中，保持在20～60℃下10～60min。在搅拌下加入1～5mmol一水合醋酸铜，等醋酸铜完全溶解后加入1～5mmol硫脲，在20～60℃持续搅拌8～48h。之后转移至25～100ml聚四氟乙烯高压反应釜中，并在80～200℃保持2～12h。反应结束后离心清洗并真空干燥得到硫化铜(cus)纳米颗粒。载药后，得到载药硫化铜(cus)纳米颗粒。
[0024]
优选的，步骤(2)所述有机硅纳米颗粒为介孔有机硅纳米颗粒或中空介孔有机硅纳米颗粒
[0025]
优选的，步骤(2)中，所述载药后的中空介孔有机硅纳米颗粒的尺寸为10～100nm，电位为+5mv～+40mv。
[0026]
优选的，步骤(3)中，所述改性明胶溶液的质量百分比浓度为2％～20％，所述纳米颗粒分散液的质量百分比浓度为2％～20％，配制的改性明胶溶液与配制的纳米颗粒分散液混合前的ph为7.4～10.0，改性明胶溶液与纳米颗粒分散液混合的体积比例为(1:9)～(9:1)。
[0027]
本发明提供上述任一项制备方法制备得到的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0028]
优选的，所述尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的尺寸为40～400nm，电位为-10mv～-50mv。
[0029]
优选的，所述尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇在微酸和酶作用下尺寸从大到小、电荷从负到正转换。
[0030]
更优选的，所述微酸是指ph＝6.5，所述酶是基质金属蛋白酶(mmp-2)。
[0031]
本发明还提供所述尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇在药物递送中的应用。
[0032]
优选的，所述尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇作为药物的纳米载体，促进药物在肿瘤、关节炎、生物被膜等的渗透和内化过程。
[0033]
本发明的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备，先对明胶进行靶向配体反应，再进行酸酐类化合物改性，或对明胶进行酸酐类化合物修饰，使其具有从中性到弱酸ph下由负向正的电荷转换特性；通过溶胶凝胶法制备带正电载药的有机硅纳米颗粒或通过纳米沉淀法制备带正电的载药硫化铜纳米颗粒；最后通过静电组装得到纳米颗粒-明胶复合纳米簇。具体包括以下步骤：
[0034]
(1)将明胶以1％的质量百分比浓度加热溶解在去离子水中，加入靶向配体和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)，在20℃～80℃反应2-24h小时，透析冻干得到靶向修饰的明胶，将靶向修饰的明胶溶解在去离子水中，调节ph为7.4～10.0，加入酸酐类化合物在20℃～80℃反应2-24h，透析冻干得到改性明胶；或将明胶以1％的质量百分比浓度加热溶解在去离子水中，调节ph为7.4～10.0。加入酸酐类化合物在20℃～80℃反应2-24h，透析冻干得到改性明胶。
[0035]
(2)将三乙醇胺、十六烷基三甲基氯化铵、正硅酸乙酯溶于去离子水，于60～120℃反应1～8h，继续加入正硅酸乙酯和双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物的混合液，反应2～8h，通过萃取、刻蚀、离心干燥得到中空介孔有机硅纳米颗粒，载药后，得到载药中空介孔有机硅纳米颗粒；或将三乙胺、十六烷基三甲基氯化铵、正硅酸乙酯溶于去离子水，于60～120℃反应1～8h，继续加入正硅酸乙酯和双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物的混合液，反应2～8h，通过萃取离心干燥得到介孔有机硅纳米颗粒，载药后，得到载药介孔有机硅纳米颗粒；或将醋酸铜加入到醋酸和甲醇溶液中，之后加入硫脲搅拌8～48h，在80～200℃水热2～12h，经离心洗涤可得中空硫化铜纳米颗粒。载药后，得到载药硫化铜(cus)纳米颗粒。
[0036]
(3)将载药纳米颗粒超声分散在去离子水中，配置成质量百分比浓度为2％-20％的分散液，调ph至7.4-10.0。将改性明胶溶解至ph 7.4-10.0的去离子水中，配置质量百分比浓度为2％-20％的溶液。搅拌条件下，将改性明胶溶液缓慢加入载药纳米颗粒分散液中。室温下搅拌24h，之后透析、冷冻干燥得到纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0037]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
[0038]
(1)明胶具有酶可降解性能。
[0039]
(2)明胶的氨基易于修饰，具有从中性到弱酸ph下由负向正的电荷转换特性。
[0040]
(3)小尺寸中空结构的纳米颗粒，易于负载药物，修饰后成正电，可与负电材料组装。
[0041]
(4)本发明制备的尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇利用了改性明胶对疾病微环境中的ph和酶双重响应性，能够在ph、酶作用下降解释放正电的纳米颗粒，实现尺寸和电荷的双重转换。
[0042]
(5)本发明制备的尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇在疾病组织中具有优异的渗透和内化效果，可广泛应用于肿瘤、炎症、细菌生物被膜等领域的药物递送。
附图说明
[0043]
图1中的a为负载药物为阿霉素(dox)的尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)的制备，肿瘤ph和mmp-2对其尺寸收缩和电荷反转的影响，以及谷胱甘肽(gsh)的降解和dox释放的示意图；图1中的b为dox
‑‑
icluster对肿瘤微环境的渗透、内化和dox释放行为的示意图。
[0044]
图2为实施例1制备得到的hmon-nh2负载dox后得到的dox-hmon-nh2的制备示意图和对应的透射电镜(tem)图像。
[0045]
图3为实施例1中的hmon、实施例1中的hmon-nh2和实施例1制备得到的hmon-nh2负载dox得到的dox-hmon-nh2的zeta电位图。
[0046]
图4为实施例1制备得到的hmon-nh2的dox负载率图。
[0047]
图5为实施例1改性明胶的制备流程图。
[0048]
图6中a和a1为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图；图6中的b和b1为实施例2制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图；图6中的c和c1为实施例2制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图。
[0049]
图7中的a为实施例1-3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的粒径分布图；图7中的b为实施例1-3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的zeta电位图；图7中的c为实施例1-3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的dox负载率图。
[0050]
图8中的a为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4的磷酸盐缓冲液中的tem图；图8中的b为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在含有浓度为0.25μg/mlmmp-2的ph 6.5的磷酸盐缓冲液中tem图。
[0051]
图9为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液的24h尺寸和电位稳定性图。
[0052]
图10为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4磷酸盐缓冲液、含有浓度为0.25μg/mlmmp-2的ph 6.5磷酸盐缓冲液和含有浓度为10mm的谷胱甘肽(gsh)的ph 5.0醋酸盐缓冲液的粒径分布(dls)图。
[0053]
图11为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4、含有浓度为0.25μg/mlmmp-2的ph 6.5和含有浓度为10mm的谷胱甘肽(gsh)的ph 5.0醋酸盐缓冲液的zeta电位图。
[0054]
图12中的a为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在不同条件下的药物释放曲线图；图12中的b为实施例2制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在不同条件下的药物释放曲线图；图12中的c为实施例3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇载药后在不同条件下的药物释放曲线图。
[0055]
图13为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇作用于肿瘤细胞第一天和第三天的存活率图。
[0056]
图14为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4的磷酸盐缓冲液、ph为6.5的醋酸盐缓冲液、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的醋酸盐缓冲液条件下作用于肿瘤细胞对应的肿瘤球不同深度切面图。
[0057]
图15为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4的磷酸盐缓冲液、ph为6.5的醋酸盐缓冲液、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的醋酸盐缓冲液条件下作用于肿瘤细胞对应的肿瘤球不同深度层图像的荧光强度定量结
果图。
[0058]
图16为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4的磷酸盐缓冲液、ph为6.5的磷酸盐缓冲液、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5磷酸盐缓冲液的条件下作用于肿瘤细胞对应的肿瘤球的正交图。
[0059]
图17为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在不同条件下处理的4t1肿瘤球生长图。
[0060]
图18为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在不同条件下处理的4t1肿瘤球的相对体积变化图。
[0061]
图19为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph为7.4的磷酸盐缓冲液、ph为6.5的磷酸盐缓冲液、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5磷酸盐缓冲液的条件下处理的4t1肿瘤球倒塌或收缩示意图。
[0062]
图20为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox得到的dox-cus的制备示意图。
[0063]
图21中a为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒tem图像；图21中b为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox得到dox-cus的tem图像。
[0064]
图22为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒和实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox得到dox-cus的zeta电位图。
[0065]
图23为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒的dox负载率图。
[0066]
图24为实施例5制备得到的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇的粒径分布和tem图。
[0067]
图25中a为实施例5制备得到的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇作用于肿瘤细胞加入双氧水的存活率图；图25中b为实施例5制备得到的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇作用于肿瘤细胞不加双氧水的存活率图。
[0068]
图26为单纯的用激光照射含100μm双氧水的细胞组(h2o2+nir)与空白对照组细胞存活率的对比图。
[0069]
图27为实施例5制备得到的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇作用于肿瘤细胞加入双氧水和不加双氧水对应的活死染色图。
具体实施方式
[0070]
以下结合具体实施例及附图对本发明技术方案作进一步详细说明，但本发明实施例及保护范围不限于此。
[0071]
以下实施例调ph均使用naoh或hcl溶液。
[0072]
实施例1
[0073]
(1)将1.0g明胶在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，得到明胶溶液，将0.067g的叶酸(fa)溶解在10ml的无水二甲基亚砜(dmso)中，得到fa溶液。搅拌条件下将fa溶液以20～60滴/分钟滴加到明胶溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)(edc)活化，20℃反应2h。随后经去离子水透析，冷冻干燥得到叶酸修饰明胶(fa-gel)；将1.0g的fa-gel在20℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，调ph至7.4，加入0.11g二甲基马来酸酐(dma)，保持ph 7.4在20℃反应2h，用ph 7.4的去离子水(用naoh/hcl调节去离子水的ph)透析，冷冻
干燥得到叶酸修饰二甲基马来酸酐改性明胶(fa-geldma)。
[0074]
(2)取2g的十六烷基三甲基氯化铵(ctac)，加入18g去离子水，然后加入0.8g三乙醇胺(tea)的水溶液(三乙醇胺与水的体积比为1:9)，95℃搅拌均匀后加入1ml的正硅酸乙酯(teos)，反应1h后得到介孔二氧化硅纳米颗粒内核(msn)。继续加入1ml的teos和0.6ml的双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物(btds)的混合液，反应4h后离心，用去离子水和乙醇清洗可得到包覆了介孔有机硅的纳米颗粒(mon@msn)。随后在78℃的乙醇和盐酸的混合溶液(乙醇和盐酸的体积比为10:1)中回流去除ctac，重新分散在400ml的去离子水中，加入8ml的质量百分比浓度为25％的氨水(nh3·
h2o)，超声分散后在95℃下搅拌3h，离心后用去离子水和乙醇清洗，冷冻干燥得到中空介孔有机硅纳米颗粒(hmon)。将100mg的hmon分散在80ml的无水乙醇中，加入1.2ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，在80℃冷凝回流12h，冷冻干燥得到氨基化中空介孔有机硅纳米颗粒(hmon-nh2)。载药后，得到载药hmon-nh2。
[0075]
(3)配置质量百分比浓度为2％的载药hmon-nh2水分散液5ml，调ph至7.4，配置质量百分比浓度为2％的fa-geldma水溶液5ml，调节ph为7.4；在转速为800rpm的搅拌条件下将fa-geldma溶液逐滴加入载药hmon-nh2的水分散液中，室温搅拌24h，透析得到尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇(icluster)。
[0076]
实施例1改性明胶的制备流程如图5所示。
[0077]
实施例2
[0078]
(1)将1.0g明胶在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，得到明胶溶液，将0.133g的fa溶解在10ml的dmso中，得到fa溶液。搅拌条件下将fa溶液以20～60滴/分钟滴加到明胶溶液中，加入edc活化，50℃反应12h。随后经去离子水透析，冷冻干燥得到fa-gel；将1.0g的fa-gel在50℃加热条件下溶解在100ml水中，调ph至8.5，加入0.08g的甲基马来酸酐(ca)，保持ph 8.5在50℃反应12h，用ph 8.5的去离子水(用naoh/hcl调节去离子水的ph)透析，冷冻干燥得到叶酸修饰甲基马来酸酐改性明胶(fa-gelca)。
[0079]
(2)取2g的ctac，加入18g去离子水，然后加入0.8g三乙醇胺(tea)的水溶液(三乙醇胺与水的体积比为1:9)，95℃搅拌均匀后以20～60滴/分钟加入1ml的teos，反应1h之后得到介孔二氧化硅纳米颗粒内核。继续加入1ml的teos和0.6ml的btds的混合液，反应4h后离心，用去离子水和乙醇清洗可得到包覆了介孔有机硅的纳米颗粒。将100mg介孔有机硅纳米颗粒分散在80ml的无水乙醇中，加入1.2ml的aptes，在80℃冷凝回流12h，冷冻干燥得到氨基化介孔有机硅纳米颗粒(mon-nh2)。载药后，得到载药mon-nh2。
[0080]
(3)配置质量百分比浓度为20％的载药mon-nh2水分散液4.5ml，调ph至8.5，配置质量百分比浓度为10％的fa-gelca水溶液0.5ml，调ph至8.5；在转速为800rpm的搅拌条件下将fa-gelca溶液逐滴加入载药mon-nh2的水分散液中，室温搅拌24h，透析得到尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0081]
实施例3
[0082]
(1)将1.0g明胶在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，得到明胶溶液，将1g的fa溶解在10ml的dmso中，得到fa溶液。搅拌条件下将fa溶液以20～60滴/分钟滴加到明胶溶液中，加入edc活化，80℃反应24h。随后经去离子水透析，冷冻干燥得到fa-gel；将1.0g的fa-gel在80℃加热条件下溶解在100ml水中，调ph至10，加入0.04g的马来酸酐(ma)，保持ph 10在80℃反应24h，用ph 10的去离子水(用naoh/hcl调节去离子水的ph)透析，冷冻干燥得
到叶酸修饰马来酸酐改性明胶(fa-gelma)。
[0083]
(2)取2g的ctac，加入18g去离子水，然后加入0.8g三乙醇胺(tea)的水溶液(三乙醇胺与水的体积比为1:9)，95℃搅拌均匀后缓慢加入1ml的teos，反应1h之后得到介孔二氧化硅纳米颗粒内核(msn)。继续加入1ml的teos和0.6ml的btds的混合液，反应4h后离心，用水和乙醇清洗可得到包覆了介孔有机硅的纳米颗粒(mon@msn)。随后在78℃的乙醇和盐酸的混合溶液(乙醇和盐酸的体积比为10:1)中回流去除ctac，重新分散在400ml的水中，加入8ml质量百分比浓度为25％的氨水(nh3·
h2o)，超声分散后在95℃下搅拌3h，离心后用水和乙醇清洗，冷冻干燥得到中空介孔有机硅纳米颗粒hmon。将100mg的hmon分散在80ml的无水乙醇中，加入6ml的aptes，在80℃冷凝回流12h，冷冻干燥得到氨基化中空介孔有机硅纳米颗粒(hmon-nh2)。载药后，得到载药hmon-nh2。
[0084]
(3)配置质量百分比浓度为10％的载药hmon-nh2水分散液0.5ml，调ph至10.0，配置质量百分比浓度为20％的gelma水分散液4.5ml，调ph至10.0；在转速为800rpm的搅拌条件下将gelma溶液逐滴加入载药hmon-nh2的水分散液中，室温搅拌24h，透析得到尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0085]
实施例4
[0086]
(1)将1.0g明胶在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，得到明胶溶液。将0.1g透明质酸(ha)溶解在40ml的磷酸盐缓冲溶液(pbs)中，得到ha溶液。搅拌条件下将ha溶液以20～60滴/分钟滴加到明胶溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)(edc)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化，在50℃反应24h。随后经去离子水透析，冷冻干燥得到透明质酸修饰明胶(ha-gel)；将1.0g的ha-gel在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，调ph至8.5，加入0.11g的二甲基马来酸酐(dma)，保持ph 8.5在50℃反应24h，用ph 8.5的去离子水(用naoh/hcl调节去离子水的ph)透析，冷冻干燥得到透明质酸修饰二甲基马来酸酐改性明胶(ha-geldma)。
[0087]
(2)在转速为800rpm的搅拌条件下将0.8ml醋酸加入30ml甲醇中，保持30℃持续搅拌30min。在转速为800rpm的搅拌条件下加入1.24mmol一水合醋酸铜，等醋酸铜完全溶解后加入1.24mmol硫脲，在25℃持续搅拌24h。之后转移至50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，并保持100℃反应6h。反应结束后离心清洗并真空干燥得到硫化铜(cus)纳米颗粒。载药后，得到载药cus纳米颗粒。
[0088]
(3)配置质量百分比浓度为2％的载药cus纳米颗粒水分散液5ml，调ph至8.5，配置质量百分比浓度为2％的ha-geldma水溶液5ml，调ph至8.5；在转速为800rpm的搅拌条件下将ha-geldma溶液逐滴加入载药cus纳米颗粒的水分散液中，室温搅拌24h，透析得到尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0089]
实施例5
[0090]
(1)将1.0g明胶在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，得到明胶溶液，将0.33g ha溶解在40ml的磷酸盐缓冲溶液(pbs)中，得到ha溶液。搅拌条件下将ha溶液以20～60滴/分钟滴加到明胶溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)(edc)n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化，在50℃反应24h。随后经去离子水透析，冷冻干燥得到透明质酸修饰明胶(ha-gel)；将1.0g的ha-gel在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，调ph至8.5，加入0.08g的ca，保持ph 8.5在50℃反应24h，用ph 8.5的去离子水(用naoh/hcl调节去离子水的ph)透
析，冷冻干燥得到透明质酸修饰甲基马来酸酐改性明胶(ha-gelca)。
[0091]
(2)在转速为800rpm的搅拌条件下将0.8ml醋酸加入30ml甲醇中，保持30℃持续搅拌30min。在转速为800rpm的搅拌条件下加入1.24mmol一水合醋酸铜，等醋酸铜完全溶解后加入1.24mmol硫脲，在25℃持续搅拌24h。之后转移至50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，并保持100℃反应8h。反应结束后离心清洗并真空干燥得到cus纳米颗粒。载药后，得到载药cus纳米颗粒。
[0092]
(3)配置质量百分比浓度为20％的载药cus纳米颗粒的水分散液4.5ml，调ph至7.4，配置质量百分比浓度为10％的ha-gelca水溶液0.5ml，调ph至7.4；在转速为800rpm的搅拌条件下将ha-gelca溶液逐滴加入载药cus纳米颗粒的水分散液中，室温搅拌24h，透析得到尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0093]
实施例6
[0094]
(1)将1.0g的明胶在50℃加热条件下溶解在100ml去离子水中，调ph至8.5，加入0.04g的ma，保持ph 8.5在50℃反应24h，用ph 8.5的去离子水(用naoh/hcl调节去离子水的ph)透析，冷冻干燥得到马来酸酐改性明胶(gelma)。
[0095]
(2)在转速为800rpm的搅拌条件下将0.8ml醋酸加入30ml甲醇中，保持30℃持续搅拌30min。在转速为800rpm的搅拌条件下加入1.24mmol一水合醋酸铜，等醋酸铜完全溶解后加入1.24mmol硫脲，在25℃持续搅拌24h。之后转移至50ml聚四氟乙烯高压反应釜中，并保持100℃反应6h。反应结束后离心清洗并真空干燥得到cus纳米颗粒。载药后，得到载药cus纳米颗粒。
[0096]
(3)配置质量百分比浓度为10％的载药cus纳米颗粒的水分散液5ml，调ph至10.0，配置质量百分比浓度为20％的gelca水溶液0.5ml，调ph至10.0；在转速为800rpm的搅拌条件下将gelma溶液逐滴加入载药cus纳米颗粒的水分散液中，室温搅拌24h，透析得到尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇。
[0097]
效果评价
[0098]
一、药物负载实验
[0099]
将制备的10mg实施例1和实施例3的步骤(2)中得到的氨基化中空介孔有机硅纳米颗粒(hmon-nh2)分别分散在5ml pbs溶液(ph 7.4)中，20～60滴/分钟加入dox(阿霉素)水溶液(浓度为1mg/ml)，获得阿霉素与hmon-nh2质量比值不同的一系列溶液，避光搅拌24h，离心并冷冻干燥可得载药纳米颗粒(dox-hmon-nh2)。从图2中msn、msn@mon、hmon、hmon-nh2和dox-hmon-nh2的tem图像可知首先合成了约20nm的msn，然后在msn上涂覆了约20nm的介孔有机硅层(命名为msn@mon)，并选择性地蚀刻了msn核心，得到了约40nm的中空介孔有机硅纳米颗粒(hmon)。氨基修饰后，hmon-nh2的形态没有改变，尺寸增大到45nm左右。dox加载后，纳米颗粒表面变得光滑，说明dox被成功加载在hmon-nh2中。图3为实施例1中的hmon、实施例1中的hmon-nh2和实施例1制备得到的hmon-nh2负载dox后得到的dox-hmon-nh2(即实施例1步骤(2)所述的载药hmon-nh2)的zeta电位图，由图3可知hmon、hmon-nh2和dox-hmon-nh2的平均zeta电位分别为-41.8
±
7.6、-3.3
±
3.1和+30.2
±
1.0mv，这是因为氨基的修饰可以抵消hmon的部分负电荷，后续的dox加载进一步增强了正电荷。从图4中可知，制备的纳米颗粒的药物负载率在m(dox)：m(hmon-nh2)＝90％时可达32.6％。
[0100]
实施例2的步骤(2)的载药纳米颗粒的制备方法同上。
[0101]
图1为改性明胶和载药中空介孔有机硅纳米颗粒之间的静电吸引形成尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)的制备示意图。以改性明胶为叶酸修饰二甲基马来酸酐改性明胶(fa-geldma)、载药为阿霉素(dox)为例。在肿瘤微环境中，改性明胶的2，3-二甲基马来酸酰胺键(dma键)断裂，明胶被mmp-2降解，释放小尺寸带正电荷的载药中空介孔有机硅纳米颗粒利于渗透和内化过程(图1中的b中的i和图1中的b中的ii)。内化到肿瘤细胞中的载药中空介孔有机硅纳米颗粒可被细胞中高表达的gsh降解，从而释放dox(图1中的b中的iii)。
[0102]
图6为实施例1-3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图(图6的a和a1为实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图；图6的b和b1为实施例2制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图；图6的c和c1为实施例3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的tem图)。由图6可知得到的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的粒径分别为213.7
±
18.6、269.2
±
40.5、199.1
±
30.0nm。
[0103]
图7为实施例1-3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的粒径分布图、zeta电位图和dox负载率图。由图7知实施例1-3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的电位分别为-29.7
±
1.3mv、-39.4
±
1.8mv、-36.7
±
0.6mv，实施例3制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的dox负载率高于实施例2和实施例1。当dox与hmon-nh2、mon-nh2的质量比达到90％时，药物负载率可达21.9
±
5.1％。
[0104]
硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox的制备方法除了将上述dox-hmon-nh2制备方法中的hmon-nh2替换为实施例4-6步骤(2)得到的硫化铜(cus)纳米颗粒外，其余步骤和条件同上述dox-hmon-nh2的制备方法。取实施例4-6步骤(2)得到的硫化铜(cus)纳米颗粒，分别制备得对应的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox(即载药cus纳米颗粒)。
[0105]
图21为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒和实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox得到dox-cus的tem图像。由图21知负载dox后的硫化铜(cus)纳米颗粒的颜色更深，内部的中空结构被dox填充。
[0106]
图22为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒和实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox得到dox-cus的zeta电位。由图22知硫化铜(cus)纳米颗粒带负电(-52.3mv)，负载dox后电位变为正电(14.2mv)。
[0107]
图23为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒的dox负载率图。由图23可知随着dox和硫化铜(cus)纳米颗粒的质量比的增加，dox的负载率逐渐升高，当质量比达到220％时，最大负载率为70％。
[0108]
图20为实施例5制备的硫化铜(cus)纳米颗粒负载dox得到的dox-cus的制备示意图。
[0109]
图24为实施例5制备得到的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇的粒径分布和tem图。由图24知cus外围包裹一层高分子明胶，尺寸进一步增加。
[0110]
二、粒径和电位表征
[0111]
动态光散射(dls)和zeta电位通过马尔文(malvern)的zetasizer nano zsu3200进行测定，在25℃下测量三次取平均值。形貌通过透射电镜(tem)jem-2100测定，加速电压
为200kv。从图2和图18以看出载药中空介孔有机硅纳米颗粒(dox-hmon-nh2纳米颗粒)和载药cus纳米颗粒(dox-cus纳米颗粒)的平均尺寸分别为47.5nm，175.3nm。从图6以看出，实施例1到实施例3的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的平均尺寸分别为213.7nm，269.2nm和199.1nm。从图24看出，实施例5的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇的平均尺寸为227.7nm。
[0112]
三、尺寸和电荷转换
[0113]
将100μl实施例1制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇分散至5ml含有mmp-2的醋酸盐缓冲溶液中(ph为6.5，0.25μg/ml的mmp-2)搅拌24h，取样进行tem，如图8所示。从图中可以看出，在弱酸性和酶环境下，本发明所制备的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇能够发生响应降解，释放出小尺寸的纳米颗粒。通过在pbs(ph 7.4)中浸泡24h监测尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的尺寸和电位来测定其稳定性。如图9所示，在醋酸盐缓冲溶液(ph 7.4)中，尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇的尺寸和zeta电位在24h内基本保持不变，表明其具有良好的稳定性，有利于体内长循环。将实施例1的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇分散至5ml含有mmp-2的水溶液中(naoh/盐酸调节ph为6.5，0.25μg/ml的mmp-2)搅拌24h，然后进行尺寸和zeta电位测量。从图10知，在弱酸性和酶环境下尺寸缩小到73.3
±
15.2nm。从图11可以看出复合纳米簇的电荷由负电向正电转变。
[0114]
四、复合纳米簇的体外药物释放行为
[0115]
取1.6ml实施例1-3制备得到的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)置于透析袋(mwco＝14000da)中，分别在体积为8ml的不同ph缓冲溶液中(ph为7.4的磷酸盐缓冲溶液、ph为6.5的磷酸盐缓冲溶液、ph为5.0的醋酸盐缓冲溶液、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的磷酸盐缓冲溶液、含有浓度为10mm谷胱甘肽gsh的ph为5.0的醋酸盐缓冲溶液)中透析，温度37℃，摇床转速100r/min。在不同的时间点(1、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120、144、168h)收集0.4ml透析的缓冲液样品，并用对应的0.4ml缓冲液替换，通过荧光酶标仪测量缓冲液样品中药物含量，从而计算药物的释放过程。从图12可知，肿瘤组织的弱酸性条件和富含基质金属蛋白酶和谷胱甘肽的环境有利于药物的释放。
[0116]
五、复合纳米簇载药后对小鼠乳腺癌(4t1)肿瘤细胞的毒性
[0117]
将4t1细胞以1
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在150μl培养基中。在37℃和体积分数为5％ co2条件下培养24h，待细胞完全贴壁后，移除旧培养基，用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗2次，添加150μl实施例1对应的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)(dox浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/ml)，对照组1使用实施例1得到的空载的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇(icluster)，对照组2使用dox水溶液(dox浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/ml)，在新鲜培养基孵育24h和72h，通过presto blue测试细胞存活率，结果如图13(图13中的a是孵育24h后的存活率图；图13的b是孵育72h后的存活率图)所示。从图13可知，孵育24h和72h后，尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶复合纳米簇对4t1细胞的抑制作用分别为24.9％和51.4％，半抑制浓度(ic
50
)值分别为14.18
±
2.64μg/ml和4.66
±
0.79μg/ml。
[0118]
将4t1细胞以1
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在150μl培养基中。在37
℃和体积分数为5％ co2条件下培养24h，待细胞完全贴壁后，移除旧培养基，用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗2次，添加150μl实施例5对应的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)(dox浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/ml)，对照组1使用实施例5得到的空载的尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇(icluster)，对照组2使用dox水溶液(dox浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5μg/ml)，在新鲜培养基孵育24h。同时对比了添加h2o2的影响，将10μl h2o2加入到10ml培养基中，从中取100μl继续用培养基稀释至10ml，配制成100μm的含h2o2的培养基，不加双氧水组作为对照，通过presto blue测试细胞存活率，结果如图25(图25中的a为加入双氧水h2o2；图26中的b为不加双氧水h2o2)所示。从图中可知，孵育24h后，尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)在dox浓度为1μg/ml时，不添加h2o2和添加h2o2对4t1细胞的抑制率分别为51.7％和89.2％。也对比了激光光照的影响，激光光照(激光功率为2.0w/cm2)1分钟，不光照组作为对照，通过presto blue测试细胞存活率，结果如图25所示。表明尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇(dox-icluster)具有较好的化疗/光热/光动力效果。
[0119]
将4t1细胞以1
×
104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在150μl培养基中。在37℃和体积分数为5％ co2条件下培养24h，待细胞完全贴壁后，移除旧培养基，用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗2次，添加150μl含100μm h2o2的新鲜培养基孵育2h，然后激光光照(nir)1min，再继续培养22h，通过presto blue测试细胞存活率。图26为h2o2+nir与空白对照组细胞存活率的对比图。由图26可知单纯h2o2+nir组对细胞生长影响较小。
[0120]
图27为图25对应的活死染色图，由图27可知尺寸/电荷双转换的cus纳米颗粒-明胶复合纳米簇具有较好的化疗/光热/光动力效果。
[0121]
六、复合纳米簇对三维肿瘤球的渗透
[0122]
将4t1细胞用不同的培养基(ph为7.4的培养基、ph为6.5的培养基、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的培养基)以2000个细胞/10μl的密度滴10μl在48孔板的盖子上，每孔内加入200μl的pbs(ph 7.4)，于37℃和体积分数为5％ co2培养箱中悬滴培养4天，建立并选取形态规整致密的肿瘤球模型。每个肿瘤球模型分别加入1μl浓度为100μg/ml的dox溶液、1μl浓度为100μg/ml实施例1制备得到的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶纳米簇(dox-icluster)水分散液，并在不同条件下培养(ph为7.4的培养基、ph为6.5的培养基、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的培养基)，使dox浓度为10μg/ml)，在37℃下孵育3h。采用激光共聚焦显微镜断层扫描不同深度的肿瘤球切面，观察肿瘤球摄取药物情况并采集图像。从图14、图15和图16中可知，肿瘤组织的弱酸性条件和富含基质金属蛋白酶的环境使得尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶纳米簇(dox-icluster)对三维肿瘤球有更好的渗透效果。
[0123]
七、纳米簇对三维肿瘤球的生长抑制效果
[0124]
取培养的形态规整、大小合适的4t1肿瘤球，一组加入1μl浓度为100μg/ml的dox溶液，另一组加入1μl(dox浓度为100μg/ml)的实施例1制备得到的尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶纳米簇(dox-icluster)的培养基分散液，最后得到的溶液中dox浓度均为10μg/ml，并在不同条件下培养(ph为7.4的培养基、ph为6.5的培养基、含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的培养基)，通过倒置显微镜测量肿瘤球的体积变化。从图17中可知，肿瘤组织的弱酸性条件和富含mmp-2的环境使得尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶纳米
簇对三维肿瘤球有更好的抑制效果。图18的结果表明，含有浓度为0.25μg/ml mmp-2的ph为6.5的培养基条件下，肿瘤球的生长显著下降至原始体积的15.1％，伴随着细胞脱落。基于上述结果，推测出的肿瘤球生长抑制机制如图19所示，肿瘤球经尺寸/电荷双转换的有机硅纳米颗粒-明胶纳米簇处理后，响应ph和mmp-2释放出载药中空介孔有机硅纳米颗粒并渗透到肿瘤球内部，导致外围细胞逐渐崩溃和凋亡，导致体积缩小。
[0125]
以上所述，仅是本发明的较优实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将明胶与靶向配体反应，透析冻干后再与酸酐类化合物在碱性条件下反应，透析冻干得到改性明胶，或将明胶与酸酐类化合物在碱性条件下反应，透析冻干得到改性明胶；(2)通过溶胶凝胶法制备带正电的载药有机硅纳米颗粒或通过纳米沉淀法制备带正电的载药硫化铜纳米颗粒；(3)将步骤(1)制备得到的改性明胶配制成改性明胶溶液，将步骤(2)制备得到的纳米颗粒配制成纳米颗粒分散液，再将改性明胶溶液与纳米颗粒分散液混合，通过静电作用得到尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇。2.根据权利要求1所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述靶向配体为叶酸、透明质酸中的一种以上；步骤(1)所述明胶与靶向配体反应的温度为20℃～80℃，明胶与靶向配体反应的时间为2-24h，所述碱性条件为ph7.4～10.0；步骤(1)所述明胶与酸酐类化合物反应的温度为20℃～80℃，明胶与酸酐类化合物反应的时间为2-24h；步骤(1)所述碱性条件皆为ph7.4～10.0；步骤(1)所述酸酐类化合物为马来酸酐、甲基马来酸酐、二甲基马来酸酐中的一种以上。3.根据权利要求1所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述靶向配体与明胶的质量比为(1:15)～(1:1)。4.根据权利要求1所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酸酐类化合物与明胶的质量比皆为(1:25)～(1:9)。5.根据权利要求1所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述有机硅纳米颗粒为介孔有机硅纳米颗粒或中空介孔有机硅纳米颗粒。6.根据权利要求1所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述改性明胶溶液的质量百分比浓度为2％～20％，所述纳米颗粒分散液的质量百分比浓度为2％～20％，配制的改性明胶溶液与配制的纳米颗粒分散液混合前的ph为7.4～10.0，改性明胶溶液与纳米颗粒分散液混合的体积比例为(1:9)～(9:1)。7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇。8.根据权利要求7所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇，其特征在于，所述一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇的尺寸为40～400nm，电位为-10mv～-50mv。9.权利要求7所述的尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇在ph＝6.5和酶作用下尺寸从大到小、电荷从负到正转换。10.权利要求7所述的一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇在药物递送中的应用。

技术总结
本发明公开了一种尺寸/电荷双转换的纳米颗粒-明胶复合纳米簇及其制备方法和应用。制备方法为：先对明胶进行靶向配体、酸酐类化合物修饰或明胶进行酸酐类化合物修饰，使其具有从中性到弱酸pH下由负向正的电荷转换特性；通过溶胶凝胶法或纳米沉淀法制备带正电载药的纳米颗粒；最后将改性明胶和纳米颗粒通过静电组装得到纳米颗粒-明胶复合纳米簇。该复合纳米簇利用了改性明胶对疾病微环境中的pH和酶双重响应性，能够在pH、酶作用下降解释放正电的纳米颗粒，实现尺寸和电荷的双重转换。本发明制备的复合纳米簇在疾病组织中具有优异的渗透和内化效果，可广泛应用于肿瘤、炎症、细菌生物被膜等领域的药物递送。生物被膜等领域的药物递送。生物被膜等领域的药物递送。


技术研发人员：李晓云 肖人华 王小英 樊超然 温禹铭 周广颖 谢科键
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/9/5