一种靶向光敏剂FA-BAT-NPs及其制备方法与应用

一种靶向光敏剂fa-bat-nps及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及纳米制剂技术领域，特别涉及一种靶向光敏剂fa-bat-nps的制备方法。


背景技术：

2.经过数十年的研究，临床工作者对于乳腺癌(breast cancer，bc)的治疗已经取得了不错的进展。光动力疗法(photodynamic therapy，pdt)是一种结合了光敏剂、激光以及分子氧三者，进而产生活性氧(reactive oxygen species，ros)来诱导目标细胞死亡的治疗方法。与传统的手术、化疗、放射等治疗方法相比，pdt用于乳腺癌治疗具有安全、时空可选择、疗效良好、广谱反应以及没有瘢痕形成等优点。虽然pdt对化疗耐药肿瘤的治疗潜力仍然不清楚，但这种治疗方式已经被很多人认为是对抗肿瘤多药耐药现象的一种潜在解决办法。
3.氧分子是光敏剂产生ros过程中的必备原料，故肿瘤组织由于细胞增殖失控、血管灌注异常等引起的缺氧，会大大减少ros的产生数目，从而降低pdt的疗效；同时，正常组织中过多地产生ros则会导致各种毒副作用。所以，设计一种新型光敏剂，使其在正常组织中“零释放”，以提高其生物安全性是很有必要的。此外，ros只能作用于其生成部位周围(小于20nm)，这远小于我们的细胞尺寸，此外它的半衰期较短(约15s)，故这也是提高pdt疗效的一个关键限制因素。对于以上问题，近年来已经有团队尝试过自给自足氧分子、光催化分解水产氧等策略，但这些方法都存在一定局限性。
4.随着我们对于肿瘤微环境的认识逐渐加深，肿瘤组织的低氧微环境已被发现与药物疗效的降低、肿瘤的复发与转移、免疫细胞浸润的限制等有关，这在之前的研究中经常被研究者们所忽略，因此，纠正肿瘤组织的缺氧微环境或许是根除肿瘤的首要任务。近年来部分研究者已经在这方面取得了一定进展，现有的改善肿瘤微环境缺氧的策略主要包括：将氧气直接输送到缺氧环境中，然而低载氧量、过早的氧泄漏以及较高的间质压等因素严重限制了氧气的输送效率；或是分解肿瘤内的过氧化氢(h2o2)来生成氧，但由于可利用的h2o2含量很低，导致氧气的生产量远远不能满足治疗要求。因此，单方面促进供氧并不能很好对抗肿瘤的缺氧微环境，寻求一种新的解决方案是非常有必要的。
5.作为细胞的“能量工厂”以及细胞凋亡的主要调节者，线粒体是细胞内消耗氧气最多的细胞器，已有报道称肿瘤组织缺氧主要是线粒体相关氧化磷酸化过程导致过度消耗氧气导致的。因此，优先破坏肿瘤细胞的线粒体可抑制其内源性耗氧。值得一提的是，由于线粒体对ros较为敏感，过量的外源性ros会引起线粒体通透性的改变、变形、去极化以及细胞色素c的释放，最终诱导细胞的凋亡。因此，鉴于ros的有效时长短、有效范围小，线粒体对ros的敏感性以及破坏线粒体能够改善肿瘤微环境缺氧，有必要研发一种具有线粒体靶向功能的光敏剂。


技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种靶向光敏剂fa-bat-nps及其制备方法，使用本发明的制备方法制备得到的靶向光敏剂fa-bat-nps具备较好的水溶性与体内缓释能力，对乳腺癌产生较好的抑制作用，并几乎不会对机体产生任何毒副作用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.在本发明的第一方面，提供了一种光敏剂bat的制备方法，所述方法包括：以5-ala为原料通过酰胺反应引入boc基团得到boc-ala；后将所述boc-ala与tpp通过酰胺反应进行偶联获得boc-ala-tpp，简称bat。
9.在本发明的第二方面，提供了采用所述方法制备得到的光敏剂bat。
10.在本发明的第三方面，提供了一种靶向光敏剂fa-bat-nps，所述靶向光敏剂fa-bat-nps为核壳结构，所述核壳结构由外壳包裹于内核而成，所述内核为权利要求4所述的光敏剂bat，所述外壳为叶酸修饰的bsa载体，其中所述叶酸修饰的bsa载体中叶酸与bsa通过peg桥接。
11.进一步地，以质量分数计，所述靶向光敏剂fa-bat-nps包括：1～3％光敏剂bat，97～99％叶酸修饰的bsa载体；其中，所述叶酸修饰的bsa载体包括10～13％bsa载体和86～87％peg-叶酸，使得叶酸修饰的bsa载体的质量分数为97～99％。
12.在本发明的第四方面，提供了所述的靶向光敏剂fa-bat-nps的制备方法，所述方法包括：
13.将所述bat通过乳化分散法获得bat-nps纳米粒；
14.以peg为连接链，将fa通过酰胺反应修饰于所述bat-nps纳米粒表面，获得靶向光敏剂fa-bat-nps。
15.在本发明的第五方面，提供了所述的光敏剂bat或所述的靶向光敏剂fa-bat-nps在制备抗乳腺癌药物中的应用。
16.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
17.1、本发明提供的光敏剂bat，通过化学键链接光敏剂5-ala与线粒体靶向基团tpp，并修饰boc基团以增大脂溶性，制备出新型线粒体靶向光敏剂bat，经后续细胞增殖抑制实验以及体内药效实验证明光敏剂bat药效明显优于5-ala。bat的抗癌效果明显强于单独的5-ala、diboc以及tpp，这很可能是5-ala通过tpp与boc基团的修饰后，具备了线粒体靶向功能以及能够穿透生物膜的脂溶性，相比单独使用5-ala治疗乳腺癌，明显增强了药效。
18.2、本发明制备了一种新型药物递送系统fa-bat-nps，并发现fa-bat-nps能显著提高对乳腺癌的治疗效率，并对实验小鼠几乎没有毒性。通过乳化分散法，制备了bat-nps，再利用化学合成，制备出fa-bat-nps并证明其能够显著提高mcf-7细胞的凋亡率和细胞摄取量。mtt实验与细胞凋亡实验的结果显示，与bat相比，fa-bat-nps增强了mcf-7细胞受到的生长抑制作用，并能诱导mcf-7细胞凋亡，bat、bat-nps及fa-bat-nps对mcfv7以及mcf-10a乳腺癌细胞的增殖抑制作用表现出剂量依赖性。在体内药效学实验中，bat、bat-nps及fa-bat-nps对乳腺癌荷瘤的抑制作用均表现出了时间依赖性。此外，通过血常规以及相关脏器检测，fa-bat-nps对受试小鼠没有显示出毒性，以上各实验证明其具有被开发为临床所使用抗癌药物的巨大潜力。
19.3、本发明成功合成光敏剂5-ala的衍生化合物bat，并研制出一种新型靶向光敏剂
fa-bat-nps，后续的体内外实验结果表明：1)我们通过化学反应，以功能性peg为连接链，将fa连接到纳米粒表面，再通过细胞摄取、细胞凋亡实验等体外实验以及动物药效实验等体内实验，证明fa明显提升了目标递药系统对于肿瘤组织的靶向性及抑制效果，即fa增强了乳腺癌细胞对药物的摄取；2)在相同条件下，bat的体外抗肿瘤作用明显强于5-ala，此外，对比bat和bat-nps，fa-bat-nps的体外抗肿瘤作用明显更强；3)与bat相比，bat-nps与fa-bat-nps明显延长了药物的半衰期，说明fa-bat-nps具备较好的体内缓释能力，提高了药物的生物利用度；4)fa-bat-nps具有较好的肿瘤靶向性，同时对机体的毒性也很小；5)在同等药物浓度时，bat的对乳腺癌的抑制效果明显强于5-ala，而fa-bat-nps的抑制作用又要明显好于bat。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
21.图1为目标递药系统fa-bat-nps的作用示意图。用纳米粒装载光敏剂bat，并将fa修饰于纳米粒表面得到fa-bat-nps，其中fa可被乳腺癌细胞表面的相关受体识别，bat可富集于线粒体并通过相关反应产生ros。
22.图2为boc-ala-tpp的结构表征。boc-ala-tpp的(a)核磁共振氢谱图与(b)核磁共振碳谱图。
23.图3为红外光谱分析结果。(a)bat、nps、bat-nps、bat与nps的物理混合物相比较，(b)fa、fa-bat-nps、bat-nps与fa的物理混合物相比较。
24.图4为fa-bat-nps体外表征结果。(a)粒径分布图，(b)透射电镜图，比例尺100nm，(c)体外释放结果，在37℃，ph 7.4的pbs介质中检测bat、bat-nps、fa-bat-nps的累积释放量。结果表示为平均值
±
标准偏差(n＝3)。
25.图5为fa-bat-nps的体外细胞增殖抑制实验。将mcf-10a细胞与各浓度的fa-nps、bat、bat-nps、fa-bat-nps溶液共同孵育(a)24h、(c)48h、(e)72h；mcf-7细胞同等条件下孵育(b)24h、(d)48h、(f)72h；(g)mcf-10a和(h)mcf-7细胞与150μg/ml的tpp、5-ala、diboc、5-fu、fa-nps、bat、bat-nps、fa-bat-nps溶液共同孵育48h(5-fu为阳性对照组)。在两种细胞与各组药物孵育不同时间后，检测癌细胞的存活率(n＝5)，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001用于各给药组之间比较统计学差异；
#
p＜0.05，
##
p＜0.01，
###
p＜0.001，
####
p＜0.0001用于各给药组与bat组之间的统计学差异比较。
26.图6为fa-bat-nps在细胞中的摄取结果。在mcf-10a细胞中的摄取情况：(a)共聚焦激光扫描检测，(c)半定量分析。在mcf-7细胞中的摄取情况：(b)共聚焦激光扫描检测，(d)半定量分析。通过coumarin 6对bat-nps、fa-bat-nps进行荧光标记并处理细胞，用激光共聚焦显微镜对细胞进行绿色荧光检测。比例尺：25μm。通过image j软件对图片进行平均荧光强度分析，并采用2-way anova(
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001)评价差异的显著性。各组数据以平均值
±
标准差表示(n＝3)。
27.图7为mcf-7细胞线粒体膜电位测量结果。mcf-7细胞线粒体膜电位测量的(a)共聚
焦激光扫描结果，(b)半定量分析。比例尺：10μm。通过image j软件对图片进行平均荧光强度分析，采用2-way anova(
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001)评价差异的显著性。各组数据以平均值
±
标准差表示(n＝3)。
28.图8为mcf-7细胞ros含量测定结果。mcf-7细胞ros含量测定的(a)共聚焦激光扫描结果，(b)半定量分析。比例尺：10μm。通过image j软件对图片进行平均荧光强度分析，采用2-way anova(
****
p＜0.0001)评价差异的显著性。各组数据以平均值
±
标准差表示(n＝3)。
29.图9为细胞凋亡结果。mcf-7细胞经各组制剂处理后，通过流式细胞仪检测annexin v/pi结合的散点图所显示的早期凋亡、晚期凋亡、坏死象限所占百分比。
30.图10为细胞周期结果。mcf-7细胞被各组制剂处理48h后，用碘化丙啶染色，(a)用流式细胞仪检测细胞周期以及(b)定量分析。
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001。
31.图11为血浆中bat、bat-nps以及fa-bat-nps的药物代谢动力学曲线。经尾静脉给药后，balb/c裸鼠血浆中的药物随时间变化的曲线图，结果表示为mean
±
sd(n＝3)。
32.图12为各组药物在不同时间的组织分布结果。bat、bat-nps以及fa-bat-nps于1h、3h、8h、12h在mcf-7荷瘤裸鼠体内的组织分布结果。
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001评估差异的显著性。各组数据以平均值
±
sd表示(n＝3)。
33.图13为各组药物在裸鼠体内的荧光成像结果。(a)尾静脉给药后，于3h、8h以及12h各组药物的体内荧光分布情况；(b)于12h解剖出裸鼠的心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织后，通过活体成像系统拍照观察。通过image软件对(c)裸鼠活体及(d)组织荧光强度进行半定量分析。结果表示为mean
±
sd(n＝3)。
*
p＜0.1，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，
****
p＜0.0001用来评估各组间的统计学差异。
34.图14为fa-bat-nps的体内抗肿瘤结果。各组mcf-7荷瘤裸鼠在接种后第10d开始接受治疗，具体方式为分别尾静脉注射：saline、fa-nps、tpp、diboc、5-ala、bat、bat-nps、fa-bat-nps和5-fu，并于给药后4h给予635nm(25mw/cm2)的激光照射肿瘤部位5min。(a)在第一次治疗后每2d监测一次肿瘤体积；(b)各组裸鼠的肿瘤重量；(c)各组裸鼠的代表性肿瘤组织。
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，
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p＜0.001，
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p＜0.0001用于各给药之间比较统计学差异；
#
p＜0.05，
##
p＜0.01，
###
p＜0.001，
####
p＜0.0001用于各组药物与生理盐水组之间比较统计学差异。
35.图15为fa-bat-nps(
×
400)的抗肿瘤机制分析。肿瘤切片，固定，脱蜡，分别检测细胞增殖标志ki-67，血管内皮细胞标志cd31、vegfr，h&e染色检测坏死率，tunel法检测细胞凋亡。比例尺：40μm。
36.图16为组织病理学h&e结果(
×
400)。小鼠经生理盐水、fa-nps、5-ala、tpp、diboc、bat、5-fu、bat-nps、fa-bat-nps治疗两周后，其心脏、肝、肺、肾脏的h&e染色。比例尺：50μm。
具体实施方式
37.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
38.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领
域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
39.下面将结合实施例、对比例及实验数据对本技术进行详细说明。本发明实施例的fa-peg-nh2为市售产品，西安瑞禧生物科技有限公司，r-1009-2k-3。
40.实施例1、靶向光敏剂fa-bat-nps的制备方法
41.本发明实施例提供了一种靶向光敏剂fa-bat-nps的制备方法，包括以下步骤：
42.步骤s1、光敏剂bat的合成，合成路线如下图：
[0043][0044]
(1)boc-ala的合成
[0045]
取1.00g(5.96mmol)5-氨基乙酰丙酸盐酸盐、1.30g(5.96mmol)二碳酸二叔丁酯(diboc，di-tert-butyl dicarbonate)和5.01g(35.80mmol)碳酸氢钠置于50ml单口圆底烧瓶中，加入20ml甲醇后置于室温搅拌6h。过滤除去固体，将溶剂旋蒸后得到油状残留物，加入适量超纯水溶解。用浓度为1mol/l的盐酸将溶液ph值调至2，立即用乙酸乙酯萃取。将有机层用适量饱和食盐水洗涤三次后，再经无水硫酸镁干燥，最后通过旋蒸除去剩余有机液，静置结晶得到浅黄色固体boc-ala。
[0046]
boc-ala化合物的核磁数据为：1h nmr(400mhz，cdcl3)δ5.24(s，1h)，4.05(s，2h)，2.69(s，4h)，1.43(s，9h).
13
c nmr(101mhz，cdcl3)δ204.39(s)，177.13(s)，155.96(s)，80.27(s)，77.54(s)，77.22(s)，76.90(s)，50.45(s)，34.34(s)，28.50(s)，27.69(s).hrms(esi)calcd for c
10h18
no5，[m+h]
+
：m/z 232.3361，found：232.1557.productivity：78％.证实了boc-ala样品的合成。
[0047]
(2)tpp-nh2的合成
[0048]
将1.31g(5.00mmol)三苯基膦和1.10g(5.00mmol)3-溴丙胺氢溴酸盐置于50ml单口圆底烧瓶中，加入20ml无水乙腈，于90℃冷凝回流12h。待反应液温度降至室温，再利用旋蒸除去乙腈，所得浓缩物用50ml乙腈∶正己烷∶异丙醇∶乙醚(v/v＝1∶3∶10∶5)的有机混合液于-20℃冰箱过夜待重结晶。过滤后真空干燥12h得到白色粉末tpp-nh2。
[0049]
化合物tpp-nh2的核磁数据为：1h nmr(400mhz，d2o)δ7.96-7.60(m，15h)，3.41(t，j
＝15.0hz，2h)，3.14(t，j＝7.5hz，2h)，2.06(d，j＝7.3hz，2h).
13
c nmr(101mhz，dmso)δ135.22(d，j＝2.8hz)，133.73(d，j＝10.3hz)，130.49(d，j＝12.5hz)，118.57(s)，117.71(s)，40.23(s)，40.02(s)，39.81(s)，39.60(s)，39.39(s)，39.18(s)，38.97(s)，20.18(s)，18.66(s)，18.13(s).hrms(esi)calcd for c
21h24
np
+
，[m-br+h]
2+
：m/z 321.1629，found：321.2254.productivity：92％.证实了tpp-nh2样品的合成。
[0050]
(3)boc-ala-tpp的合成
[0051]
将0.48ml(2.75mmol)n，n-二异丙基乙胺、0.206g(0.55mmol)苯并三氮唑-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸盐、0.127g(0.55mmol)boc-ala加入到12ml二氯甲烷中，室温搅拌15min。再加入0.8g(1.66mmol)tpp-nh2、2.7mg(0.02mmol)4-二甲氨基吡啶，继续搅拌5h。过滤反应液，并用二氯甲烷洗涤，将滤液旋蒸至干。浓缩物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和食盐水、5％碳酸氢钠溶液、1mol/l盐酸洗涤，最后将有机相旋蒸浓缩，用正己烷重结晶，得到油状物后真空干燥12h得到浅黄色粉末boc-ala-tpp，简称bat。
[0052]
化合物boc-ala-tpp的1h nmr、
13
c nmr谱图如图2所示，证实了boc-ala-tpp样品的合成。boc-ala-tpp的特征峰出现在(j)。其核磁数据为：1h nmr(400mhz，dmso)δ7.92-7.75(m，15h)，7.01(s，1h)，6.00(s，1h)，3.52(ddd，j＝39.7，23.3，7.9hz，4h)，3.29-3.11(m，2h)，3.02(s，2h)，2.35-2.19(m，2h)，1.80(dt，j＝15.7，7.8hz，2h)，1.34(s，9h).
13
c nmr(101mhz，dmso)δ156.07(s)，135.08(s)，133.53(dd，j＝32.2，14.8hz)，131.10-130.17(m)，129.36-128.78(m)，118.97(s)，118.11(s)，90.93(s)，78.12(s)，45.41(s)，40.23(s)，40.02(s)，39.81(s)，39.60(s)，39.39(s)，39.18(s)，38.97(s)，30.97(s)，29.35(s)，28.26(s)，21.52(s).hrms(esi)calcd for c
31h39
n2o4p
+
，[m+h]
2+
：m/z 534.2637，found：534.8617.productivity：58％.证实了boc-ala-tpp样品的合成。
[0053]
步骤s2、制备载药的bat-nps纳米粒；本实验采用乳化分散法制备bat纳米粒(即载bat纳米粒，简称bat-nps)。分别称取卵磷脂25.11mg，胆固醇25.11mg及bat 3.62mg，共同溶解于2ml氯仿的有机溶剂中形成载药油相，将bsa溶于超纯水得到bsa浓度为2％的水相。将油相和水相混合，用超声破碎仪进行超声破碎12min，得到乳化液。将其迅速转移至圆底烧瓶中，减压，旋转蒸发除去有机溶剂，即得bat-nps。为了后续方便对照，不加bat，其他步骤与上述相同得到纳米粒，简称nps。
[0054]
步骤s3、fa-bat-nps的制备；称取bat-nps(7.9mg，0.012mmol)溶于3ml超纯水，向其中加入nhs(1.4mg，0.0122mmol)，搅拌15min后，加入edc(4.29mg，0.0224mmol)，强力搅拌3min，称取fa-peg-nh2(0.01mmol，mr＝2，000)20mg，并用1ml的超纯水溶解，再将其加入到bat-nps反应液中，避光搅拌，室温反应24h，3，000
×
g离心12min分离得到纯化的fa-bat-nps(经叶酸修饰的载bat纳米粒)。
[0055]
实验例1、fa-bat-nps纳米粒的性质表征以及光敏剂bat的性能测定
[0056]
(1)靶向光敏剂fa-bat-nps的粒径、pdi、zeta电位的测定
[0057]
将适量的fa-bat-nps溶液缓慢注入样品池以避免气泡，并用超纯水稀释到适宜浓度，将样品放入样品槽，利用马尔文激光粒度仪测定粒径、粒径分布多分散系数(polydispersity index，pdi)以及zeta电位，至其停止。结果如表1所示。
[0058]
表1.纳米粒的表征结果(n＝3)
[0059][0060]
由表1可知，比较nps与bat-nps的粒径大小，可以看出未载药纳米粒粒径比载药后纳米粒的粒径更小，根据粒径大小的比较，可以初步证明bat被成功包载于牛血清白蛋白纳米粒中，该结果与图4a一致。
[0061]
(2)红外光谱分析
[0062]
分别取适量bat、nps、bat-nps、bat和nps的物理混合物；fa、fa-bat-nps、fa和bat-nps的物理混合物，分别进行红外光谱扫描。以验证bat是否成功包载于纳米粒中以及配体fa是否连接成功。结果如图3a所示，bat中具有苯环骨架结构特征峰(υ
c＝c
：1601cm-1
)，bat和nps物理混合的结果中可发现此处有一个肩峰出现，而bat-nps中看不出此特征峰，其结果和nps没有明显差异，可说明通过本实验的方法可成功将bat包载于牛血清白蛋白纳米粒中。如图3b所示，fa-bat-nps与bat-nps和fa物理混合物的结果比较，fa-bat-nps中具有明显的酰胺基团特征峰(υ
c＝o
：1662cm-1
，δ
n-h
：1638cm-1
)，证明配体叶酸被成功修饰于载药纳米粒表面。
[0063]
(3)bat纳米粒包封率和载药量的测定
[0064]
将制备好的纳米粒混悬液3000
×
g离心10min后，精密量取上清液0.5ml，定容至5ml后进行5min的破乳处理，用0.22μm微孔滤膜过滤后，上样检测(色谱条件：色谱柱：agilent zorbaxsb-c18柱(4.6*250mm,5μm)；流动相∶乙腈∶15mmol/l kh2po4＝80∶20；检测波长：243nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl。)，记录bat的色谱峰面积，经计算得到纳米粒中bat的含量(m
loaded
)。
[0065]
精密吸取0.5ml纳米粒混悬液于5ml容量瓶，用甲醇定容后进行5min的破乳处理，用0.22μm微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件上样检测，根据bat的峰面积，计算后可得到投入bat的总药量(m
total
)。
[0066]
根据bat纳米粒中药物含量和投入的总药量，可计算包封率(encapsulation efficiency，ee％)。公式(1)如下：
[0067]
ee(％)＝m
loaded
/m
total
×
100％
……
(1)
[0068]
载药量(drug loading capacity，dl％)按照以下方法进行测定：制备好的纳米粒混悬液经冷冻干燥后得到纳米粒粉末。取一定量的粉末(此为纳米粒的总质量，m
nanoparticles
)，用pbs复溶后，在3000
×
g条件下离心10min，精密吸取上层清液0.5ml，用甲醇于5ml容量瓶中定容后进行5min超声破乳处理，用0.22μm微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件上样检测，记录bat的色谱峰面积，经计算得到纳米粒中的药物含量(m
loaded
)。公式(2)如下：
[0069]
dl(％)＝m
loaded
/m
nanoparticles
×
100％
……
(2)
[0070]
bat-nps的包封率为(94.82
±
0.80)％，载药量为(7.85
±
0.65)％；fa-bat-nps的包封率为(92.27
±
0.39)％，载药量为(6.25
±
0.34)％。由此结果可以看出，bat-nps和fa-bat-nps的包封率都较高，结果见表1。
[0071]
(4)bat纳米粒形貌特征的测定
[0072]
采用透射电子显微镜观察nps、bat-nps和fa-bat-nps的表面形态，使用如下方法：用蒸馏水将适量待检样品稀释100倍后，滴加适量稀释液于专用铜网上，经放置10min后，再
除去剩余的稀释液，再在3min染色后用滤纸将多余的染液吸去，待其晾干后用透射电镜jeol jem-1400观察，并拍摄纳米粒的形态图片。从图4b可以看出，纳米粒呈球形。bat-nps和fa-bat-nps的粒径比nps稍大，故根据tem结果，也可以初步判定药物bat被成功包载于牛血清白蛋白纳米粒中。
[0073]
(5)bat纳米粒的体外释放
[0074]
分别取bat、bat-nps和fa-bat-nps各4ml于截留分子量为3.0kd的透析袋中并密封，然后放入到50ml的含0.3％吐温-80的溶出介质中(ph＝7.4的pbs)，恒温(37℃)恒速搅拌。每种制剂准备3份平行样品。分别于以下时间点取样(0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h)，每次取1ml后马上加入1ml的溶出介质。用甲醇将样品定容至2ml，用0.22μm微孔滤膜过滤后，按上述色谱条件进行hplc检测，记录bat的色谱峰面积，经标准曲线计算得到释药量。
[0075]
由图4c可知，bat组的药物在24h时已基本完全释放，在24h后其药物的累计释放率没有明显增加；与bat组不同，bat-nps和fa-bat-nps组的累积释放率则都是在96h内缓慢增加，两组在24h时的累计释放率分别约(50.73
±
1.70)％和(49.02
±
0.20)％，96h时的累计释放率分别约(64.87
±
2.17)％和(63.92
±
2.11)％，说明将bat制备成为纳米粒后具备了缓慢释放的特点。
[0076]
(6)bat纳米粒的溶解度测定
[0077]
取过量bat粉末分别溶于5ml的去离子水、无水乙醇以及ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，经超声20min后，3,000
×
g离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤后，取滤液用甲醇稀释后按上述色谱条件进行hplc检测，记录bat的色谱峰面积，通过标准曲线计算得到平衡溶解度。按同样方法处理bat-nps、fa-bat-nps的冻干粉末，记录bat的色谱峰面积，通过标准曲线计算得到平衡溶解度。
[0078]
表2.样品在不同溶液中的溶解度(n＝5)
[0079][0080]
由表2可知，相比于bat，bat-nps(载bat纳米粒)与fa-bat-nps(经叶酸修饰的载bat纳米粒)在三种溶液中的溶解性明显得到了提升，这说明bat被包封于纳米粒后，能极大提升其溶解性能，从而克服bat水溶性差的缺点。
[0081]
实验例2、fa-bat-nps纳米粒的体外研究
[0082]
一、细胞增殖抑制实验
[0083]
(1)本研究以mcf-10a、mcf-7细胞为模型细胞，利用mtt实验评定bat、tpp、diboc、5-fu、bat、fa-nps、bat-nps以及fa-bat-nps对乳腺癌细胞的抑制作用。取适量正常生长的细胞，用dmem完全培养基配制得到均匀的细胞悬液，利用自动细胞计数仪调整细胞浓度为3.5
×
104cells/ml，将每100μl的上述细胞混悬液接种于96孔板，并将适量的pbs加入到96孔板外围，以防止在培养时原有液体蒸发过多而影响细胞生长，最后将板放于5％co2培养箱培养过夜，待细胞贴壁。
[0084]
(2)去掉原有培养基并分别加入不同浓度的bat、fa-nps、bat-nps、fa-bat-nps，以
及原料药5-ala、tpp、diboc和阳性对照5-fu(每组设五个复孔)，并于细胞培养箱中继续培养，并分别于12h、36h以及60h用635nm(25mw/cm2)的激光照射细胞5min。
[0085]
(3)分别于24h、48h以及72h后，在96孔板的每孔中加入浓度为5mg/ml的mtt液20μl，继续培养4h后缓慢吸弃孔内的液体，每孔分别加入dmso 100μl，并振荡10min，使孔内结晶充分溶解后，通过酶联仪于570nm处测量吸光度，重复测量3次。
[0086]
计算各组乳腺癌细胞的存活率，评价其对乳腺癌细胞的抑制作用。
[0087]
cell viability(％)＝(a
samp1e-a
blank
)/(a
control-a
blank
)
×
100
……
(3)
[0088]
结果如图5所示，本实验采用mtt法来检测各组药物与mcf-10a、mcf-7细胞共同孵育24h、48h、72h后，对细胞产生的抑制作用；在150μg/ml、200μg/ml浓度的药物表现出更好的肿瘤细胞抑制作用。如图5a所示，与150μg/ml、200μg/ml的各组药物共同孵育24h后，bat-nps组mcf-10a细胞的存活率分别为(83.700
±
2.771)％、(70.566
±
4.260)％；fa-bat-nps组的细胞存活率为(80.564
±
1.731)％、(71.962
±
3.368)％；不同制剂与mcf-7细胞孵育24h后(图5b)，药物浓度为150μg/ml、200μg/ml的bat-nps组细胞存活率为(80.408
±
1.611)％、(72.460
±
4.063)％；fa-bat-nps组的细胞存活率为(63.424
±
3.411)％、(47.504
±
2.795)％；对于mcf-7细胞，与相同浓度的bat组比较，fa-bat-nps组的细胞存活率明显降低(
####
p＜0.0001)，表明其对mcf-7细胞具有较强的抑制作用，而人乳腺上皮细胞mcf-10a受到的抑制作用则明显更小。
[0089]
如图5c所示，mcf-10a细胞在孵育48h后，药物浓度为150μg/ml、200μg/ml时，bat-nps组的细胞存活率分别为(71.074
±
4.027)％、(59.110
±
3.805)％，fa-bat-nps组的细胞存活率分别为(68.532
±
2.520)％、(56.972
±
4.203)％；不同制剂与mcf-7细胞孵育48h后(图5d)，药物浓度为150μg/ml、200μg/ml时，bat-nps组的细胞存活率分别为(66.458
±
5.551)％、(62.190
±
4.655)％，fa-bat-nps组的细胞存活率分别为(36.970
±
4.438)％、(32.266
±
1.945)％。对于mcf-7细胞，与相同浓度的bat组比较，150μg/ml的fa-bat-nps能更加明显地降低细胞存活率(
####
p＜0.0001)，其增强了对癌细胞的抑制作用，fa-bat-nps表现出了更好的体外抑癌活性。
[0090]
如图5e所示，mcf-10a细胞在孵育72h后，药物浓度为150μg/ml、200μg/ml时，bat-nps组的细胞存活率依次为(67.690
±
2.344)％、(56.794
±
1.774)％，fa-bat-nps组的细胞存活率为(64.754
±
4.423)％、(55.236
±
4.723)％，150μg/ml的fa-bat-nps对mcf-10a细胞存活率与相同浓度的bat组并无明显差异；不同药物与mcf-7细胞共同孵育72h后(图5f)，药物浓度在150μg/ml、200μg/ml时bat-nps组的细胞存活率为(66.438
±
2.589)％、(51.146
±
2.636)％，fa-bat-nps组的细胞存活率为(25.822
±
2.742)％、(24.210
±
5.024)％，与相同浓度的bat组比较，200μg/ml的fa-bat-nps显著降低了mcf-7细胞存活率(
####
p＜0.0001)，其增强了对癌细胞的抑制作用。
[0091]
各药物组分别作用于mcf-10a、mcf-7细胞24h、48h、72h后，所得结果表明bat、bat-nps和fa-bat-nps制剂组对于mcf-10a、mcf-7细胞都有一定的增殖抑制效果，与mcf-10a细胞相比，mcf-7细胞受到的增殖抑制作用明显更强，这一差异表明目标载药系统fa-bat-nps对乳腺癌细胞的抑制作用良好，同时对正常乳腺细胞的毒性较小。根据48h时的实验结果，除5-fu(阳性对照组)外，fa-bat-nps组(200μg/ml)的癌细胞存活率最低，其抑制率达到67.734％，表明fa-bat-nps对癌细胞的增殖抑制作用最明显，表现出了不错的体外抑癌活
性。同时，阳性对照组5-fu作用于mcf-10a和mcf-7细胞时(图5h)，与bat组相比明显降低了癌细胞的活力(
####
p＜0.0001)，增强了对于肿瘤细胞的抑制作用。细胞孵育48h后，150μg/ml的bat、5-ala、tpp以及diboc组的细胞存活率分别为(62.654
±
4.493)％、(81.302
±
2.201)％、(91.964
±
3.133)％、(93.940
±
4.438)％，这进一步表明本课题合成的药物bat对比于单独的5-ala、tpp以及diboc，对肿瘤细胞的增殖抑制作用更强。
[0092]
二、细胞摄取实验
[0093]
fa-bat-nps纳米粒将药物输送至靶细胞内的能力是评价其靶向性的重要指标。以mcf-7、mcf-10a细胞作为模型，为了考察细胞对bat-nps和fa-bat-nps的摄取情况，用coumarin 6制得具绿色荧光的bat-nps和fa-bat-nps。
[0094]
取适量正常生长的mcf-7、mcf-10a细胞，用dmem完全培养基配制得到浓度为3
×
105cells/ml的细胞悬液，在24孔培养板的每孔放入1片细胞爬片，并加入1ml的上述细胞混悬液，每组设3个复孔，放于细胞培养箱培养24h。待细胞贴壁后吸去原有培养基，分别加入上述bat-nps和fa-bat-nps稀释液1ml，分别培养1h、2h、4h后弃去原有培养液，pbs洗涤3次后固定30min(4％多聚甲醛)，随后通过pbs洗涤2次，dapi染色液进行5min染色，吸除染液后通过pbs洗涤2次。小心取出板内的细胞爬片，盖于载玻片上并封片(50％丙三醇)，注意低温、避光保存。通过激光共聚焦显微镜检测乳腺癌细胞内绿色荧光的分布情况，并利用image j软件对细胞图片进行半定量分析。
[0095]
如图6所示，随着时间的推移，细胞中的绿色荧光逐渐增强，这表明细胞内化依赖于孵育时间。mcf-7细胞的荧光信号明显强于mcf-10a，这可能是由于mcf-7细胞膜表面的叶酸受体表达更高所致。更有趣的是，来自fa-bat-nps的细胞内绿色荧光远强于来自bat-nps的绿色荧光，这表明目标递药系统可以促进mcf-7细胞对治疗药物的内化。这种显著的差异可能与bat组装成纳米药物后的溶解性、内吞作用的改善有关，这也证明了fa-bat-nps的活性靶向能力。
[0096]
三、线粒体膜电位测定实验
[0097]
bat作为具有线粒体靶向作用的新型光敏剂，其对于肿瘤细胞线粒体的损害作用是评价fa-bat-nps对细胞线粒体靶向性的重要指标。在以上实验基础上，本实验选择mcf-7细胞作为实验细胞模型，利用荧光剂rhodamine 123检测肿瘤细胞线粒体的受损情况，从而反应各组药物对线粒体的靶向情况。
[0098]
取适量正常生长的mcf-7细胞，用dmem完全培养基配制得到浓度为3
×
105cells/ml的细胞悬液，在24孔培养板的每孔放入1片细胞爬片，并加入1ml的上述细胞混悬液，每组设3个复孔，放于细胞培养箱培养24h。待细胞贴壁后吸去原有培养基，分别加入空白溶液、tpp、diboc、5-ala、bat、fa-nps、bat-nps和fa-bat-nps稀释液1ml，置于培养箱培养12h。用635nm(25mw/cm2)的激光照射细胞5min，吸去培养液，并用pbs充分洗涤2次，然后用0.2ml的rhodamine 123(2μm)染色20min，再用无血清培养基洗涤细胞2次。小心取出板内的细胞爬片，盖于载玻片上并封片(50％丙三醇)，注意低温、避光保存。通过激光共聚焦显微镜检测乳腺癌细胞内的荧光分布情况，并利用image j软件对细胞图片进行半定量分析。
[0099]
结果如图7所示，本实验采用rhodamine 123考察不同制剂组与mcf-7细胞共同孵育12h后的细胞线粒体受损程度。在用tpp、diboc、fa-nps、5-ala处理或未经任何处理的细胞中发现了亮绿色荧光，这意味着其线粒体功能没有受到损害。而经bat以及bat-nps处理
的细胞中绿色荧光明显比前者更弱，这说明bat具有线粒体靶向功能，能集聚在线粒体周围并产生具破坏作用的ros，进而导致线粒体膜电位降低。而fa-bat-nps组由于fa主动靶向能够更多的进入癌细胞使得其呈现的荧光强度最弱。
[0100]
四、ros含量测定实验
[0101]
fa-bat-nps纳米粒作为光敏剂，其产生ros数量的多少是评价其对于肿瘤细胞产生治疗作用强弱的重要参考数值。在以上实验基础上，本实验选择mcf-7细胞作为实验细胞模型，用dcfh-da作为荧光染料，检测肿瘤细胞内ros水平。
[0102]
取适量正常生长的mcf-7细胞，用dmem完全培养基配制得到浓度为3
×
105cells/ml的细胞悬液，在24孔培养板的每孔放入1片细胞爬片，并加入1ml的上述细胞混悬液，每组设3个复孔，放于细胞培养箱培养24h。待细胞贴壁后吸去原有培养基，分别加入空白、tpp、diboc、5-ala、bat、fa-nps、bat-nps和fa-bat-nps稀释液1ml，孵育12h。除去原有培养液，用pbs充分洗涤，用dcfh-da(1mm)再孵育2h。最后用635nm(25mw/cm2)的激光照射细胞5min，除去培养液，用pbs充分洗涤2次。小心取出板内的细胞爬片，盖于载玻片上并封片(50％丙三醇)，注意低温、避光保存。通过激光共聚焦显微镜检测乳腺癌细胞内的荧光分布情况，并利用image j软件对细胞图片进行半定量分析。
[0103]
我们使用dcfh-da作为荧光染料检测细胞内ros的产生情况(图8)。跟空白组细胞一样，经过tpp、diboc、fa-nps处理的mcf-7细胞几乎没有表现出任何荧光。而以bat作为光敏剂的相关药物组则表现出明显的绿色荧光，暴露在光线下，细胞会反射出明亮的绿色荧光，说明细胞中大量ros的产生。值得注意的是，5-ala组处理的mcf-7细胞显示的荧光强度要低于bat组，说明其产生ros的能力要弱于bat。这很可能是bat的线粒体靶向作用导致的，这一作用能通过抑制癌细胞的有氧呼吸来缓解肿瘤微环境的缺氧情况，从而生成更多的ros，表明其对解决肿瘤缺氧问题具有很大的潜力。
[0104]
五、细胞凋亡实验
[0105]
在以上实验基础上，本实验选择mcf-7细胞作为实验细胞模型，考察5-ala、bat、bat-nps和fa-bat-nps作用于mcf-7细胞后的细胞凋亡情况。
[0106]
各组药物作用于细胞48h后，按照凋亡试剂盒说明书处理细胞。小心吸取细胞的原有培养液，并暂存于离心管内。通过不含edta的胰酶消化细胞，直至能轻轻用枪头吹打下贴壁细胞后，再加入前面所收集的细胞培养液，并用枪头轻轻吹匀细胞。使用离心机于335
×
g进行5min离心，使细胞沉淀。轻轻吸去上层液，并用1ml预冷过的pbs轻轻重悬细胞，并再次离心沉淀细胞并小心除去上层液。用binding buffer重悬细胞。精密吸取100μl的上述细胞液于管中，加入5μl的annexin v/fitc并混匀，避光孵育5min后再加入pi溶液(5μl)，最后加入pbs(400μl)，注意冰浴避光保存。通过流式细胞仪快速进样，并按公式(4)计算出各组药物对应的细胞凋亡率，每组重复3次取平均值
[30]
。
[0107]
apoptosis rate＝proportion of early apoptotic cells+proportion of late apoptotic cells
…
(4)
[0108]
如图9所示，不同药物与mcf-7细胞作用后，与blank组比较，5-ala、bat、bat-nps和fa-bat-nps明显诱导mcf-7细胞凋亡，其中5-ala诱导的细胞凋亡率为(28.89
±
2.33)％，bat诱导的细胞凋亡率为(41.09
±
2.02)％，bat-nps诱导的细胞凋亡率为(32.58
±
3.43)％，其中fa-bat-nps诱导细胞凋亡最明显，细胞凋亡率为(48.08
±
3.00)％，说明经过
孵育后，fa-bat-nps对mcf-7细胞凋亡的诱导最明显。
[0109]
六、细胞周期实验
[0110]
在以上实验基础上，本实验选择mcf-7细胞作为实验细胞模型，考察5-ala、bat、bat-nps和fa-bat-nps对细胞周期的影响。取适量正常生长的mcf-7细胞，用dmem完全培养基配制得到细胞悬液，并将悬液置于6孔板中。于培养箱中培养，当足够多的细胞贴壁后，将原培养液吸去，再加入5-ala、bat、bat-nps以及fa-bat-nps培养液并于培养箱进行48h的培养，期间于12h、36h用635nm(25mw/cm2)的激光照射细胞5min。完成上述步骤后按照细胞周期试剂盒的操作步骤进行处理：经消化、离心收集细胞后用pbs吹洗细胞1次，670
×
g离心5min使细胞沉淀，再用pbs调整细胞浓度为1
×
106cells/ml。取1ml的细胞悬液，离心后洗除上清液，加入500ml的70％预冷乙醇后混匀，于4℃冰箱固定过夜。吸去固定液并用pbs吹洗1次，离心去上清后向细胞沉淀中加入100μl的rnase a溶液，重悬细胞后于37℃水浴放置30min。再加入400ml的pi染色液并混匀，于4℃避光孵育30min。注意避光保存，尽快进行流式细胞仪检测，测定激发波长488nm处的红色荧光。
[0111]
如图10a&b所示，dmso(0.5％)、5-ala、bat、bat-nps和fa-bat-nps与mcf-7细胞共同孵育48h后，与blank组比较，dmso(0.5％)作为溶剂几乎不影响mcf-7细胞周期，而bat、bat-nps和fa-bat-nps组处于g0/g1期的百分比显著性增加(
****
p＜0.0001)，同时s期的细胞明显减少，有显著性差异(
***
p＜0.001)，证明mcf-7肿瘤细胞周期阻滞在g0/g1期；与bat和bat-nps组比较，fa-bat-nps在g0/g1期的细胞含量更高，而s期细胞含量更低，证明fa-bat-nps相比bat和bat-nps能更大程度地将细胞的周期阻滞在g0/g1期，证明fa-bat-nps对细胞周期的阻滞具有较强影响。
[0112]
实验例3、fa-bat-nps纳米粒的体内分布研究
[0113]
1、乳腺癌模型的建立及确认
[0114]
在经过动物伦理委员会的批准后，建立了裸鼠异位移植瘤疾病模型，正式实验前将雌性balb/c裸鼠(3-4周龄)置于spf级室内环境适应性饲养。适应性饲养7d后，取对数生长期并且生长状态良好的mcf-7细胞，用pbs配制成细胞混悬液后进行接种。接种细胞浓度为9
×
107cells/ml，每只balb/c裸鼠接种量为0.15ml。接种前对裸鼠皮肤进行碘酒消毒，再抽取上述细胞悬液一次性注射到裸鼠皮下，后续观察是否成功构建所需的裸鼠乳腺癌模型。
[0115]
2、fa-bat-nps纳米粒的体内分布及靶向性研究
[0116]
(1)fa-bat-nps纳米粒的药代动力学研究
[0117]
对已造模的雌性balb/c裸鼠开展药代动力学考察，给药方式为尾静脉注射(25mg/kg)。随机分为3组，实验前让裸鼠禁食不禁水12h：
[0118]
bat组；bat-nps纳米粒组；fa-bat-nps纳米粒组分别给药后，分别于0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h时对裸鼠心脏取血0.3ml，迅速将全血转移，离心机(2012
×
g)进行5min离心，得到上层血浆后按上述的“生物样品处理方法”处理，并通过hplc进样，通过峰面积计算得到各组ppix的药物浓度。通过graphpad 6.01软件画图。利用das ver.2.1.1软件计算出bat、bat-nps、fa-bat-nps给药后动物血浆的时量曲线下面积auc
0-t
(mg/l*h)、药峰浓度c
max
(mg/l)、半衰期t
1/2
z(h)等药物代谢动力学参数。
[0119]
图11所示的药动学曲线表明，在已造模的balb/c裸鼠体内，bat-nps和fa-bat-nps
组比bat组的药物作用时间更持久，这一结果与体外释放实验所得结果趋势一致，再次说明通过纳米粒装载的药物递送系统fa-bat-nps具有缓释、长效作用的优点。此外，通过表10所示的各药动学参数可以看出，fa-bat-nps组的体内驻留时间、半衰期较bat-nps组都有所延长，药动学曲线也显示fa-bat-nps组明显延长了药物的体内吸收过程，具备更高的生物利用度。
[0120]
(2)hplc法考察纳米粒的组织分布
[0121]
取36只已造模的雌性balb/c裸鼠，并随机分成三个大组，每大组12只。通过尾静脉注射给药到每只裸鼠，给药剂量为25mg/kg。按以下方案给药：第一大组为bat组，共4个小组，3只/小组。第二大组为bat-nps组，共4个小组，3只/小组，第三大组为fa-bat-nps组，共4个小组，3只/小组。分别于上述三个大组于给药后1h、3h、8h、12h解剖出裸鼠的心脏、肝脏、脾、肺、肾脏及肿瘤组织，根据上述“生物样品处理方法”进行处理，进行hplc进样，通过记录ppix的峰面积计算各样品的药物浓度。最后通过软件graphpad 6.01画图。
[0122]
如图12所示，在3h之前，bat-nps和fa-bat-nps组在血液中的浓度低于bat组，在8h～12h之间，bat-nps和fa-bat-nps组的血药浓度明显比bat组高(
****
p＜0.0001)，这说明bat被nps包载制成载药纳米粒后，能够较大程度地延长药物的血液循环时间。在1h(图12a)、3h(图12b)、8h(图12c)以及12h(图12d)时间点，bat-nps和fa-bat-nps组的药物在血液、肝脏、肾脏及肿瘤组织中分布较多，且在肿瘤组织中的药物含量均高于bat组(
****
p＜0.0001)，其中fa-bat-nps的药物浓度明显高于bat-nps组，此结果表明fa-bat-nps对肿瘤组织具有一定的靶向性。
[0123]
(3)荧光标记法考察fa-bat-nps给药系统体内分布
[0124]
采用活体成像技术研究fa-bat-nps纳米粒的体内分布及其靶向性。先将dir标记在纳米粒中，分为正常组、saline组、dir组、dir-bat-nps组以及fa-dir-bat-nps组，然后通过尾静脉注射到乳腺癌模型裸鼠体内，利用ivis成像系统检测，并拍摄。分别在3h、8h以及12h时观察荧光分布情况。
[0125]
待上述实验操作完毕后，立即对动物进行心脏取血，并处死，全血通过离心机(1509
×
g)进行5min离心，吸取上层血浆于ep管中备用。快速解剖各组裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏以及肿瘤组织，将上述12h的脏器、肿瘤组织通过ivis成像系统进行荧光强度分析，并照相记录。
[0126]
如图13a所示，在裸鼠体内，装载了荧光探针dir的dir-bat-nps和fa-dir-bat-nps组在3h、8h以及12h的荧光强度均强于正常组与生理盐水组，在3h时，肿瘤组织周围的荧光强度明显增强。于12h拍摄完毕后解剖出dir、dir-bat-nps以及fa-dir-bat-nps组裸鼠的心脏、肝脏、脾、肺、肾脏以及肿瘤组织，并照相，通过image j软件对图片进行平均荧光强度分析。根据图13b&d所示结果，在肿瘤组织中fa-dir-bat-nps组的平均荧光强度明显高于dir、dir-bat-nps组(
****
p＜0.0001)；此外，各组在肝脏与肾脏中的荧光强度较高，相比于dir-bat-nps组，fa-dir-bat-nps组在肾脏中的荧光强度更低。结合本实验与上述药动学实验结果不难得出，纳米粒载体经fa修饰后，不仅能延长药物bat的半衰期、改善药物体内过程，还能使目标给药系统具备不错的肿瘤靶向能力。
[0127]
实验例4、fa-bat-nps纳米粒的体内药效学
[0128]
一、实验分组
[0129]
按上述乳腺癌模型的建立及确认方法建立裸鼠乳腺癌模型。将45只已造模的雌性balb/c裸鼠随机分为9组：生理盐水组(saline)，空白纳米粒组(fa-nps)，5-氨基乙酰丙酸组(5-ala)，三苯基膦组(tpp)，diboc组，游离药物组(bat)，阳性对照组(5-fu)，载药纳米粒组(bat-nps)及fa修饰的载药纳米粒组(fa-bat-nps)。每天通过尾静脉注射给药一次(25mg/kg)，每次给药4h后用635nm(25mw/cm2)的激光照射肿瘤部位5min，连续给药14d。
[0130]
二、药效学评价
[0131]
本实验的疾病模型为乳腺癌mcf-7细胞异位移植乳腺癌模型，肿瘤接种10d后，记录各组裸鼠肿瘤的体积，这些裸鼠每天给药一次，并于给药后4h给予635nm(25mw/cm2)的激光照射肿瘤部位5min。在治疗开始后每2d测量一次，直至裸鼠牺牲。在给药前，对模型鼠进行体重和肿瘤体积测量，肿瘤体积的具体测量方法为使用游标卡尺测量出每只裸鼠肿瘤的最长轴(l)以及最短轴(w)，再根据公式(6)计算结果。各实验组的抗肿瘤作用通过肿瘤生长抑制(tumor growth，tgi)来表示，tgi是第14d治疗组(tg)相对于生理盐水组(cg)的平均肿瘤重量(mtw)，根据公式(5)可计算出平均肿瘤重量(mtw)。
[0132]
mtw(％)＝(mtw
tg-mtw
cg
)/mtw
cg
×
100
……
(5)
[0133]
v＝l
×
w2……
(6)
[0134]
在接种肿瘤后第25d将mcf-7荷瘤裸鼠处死。图14展示出了各组药物对mcf-7荷瘤裸鼠的肿瘤抑制情况。图14a表明，与生理盐水组相比，bat、fa-bat-nps组裸鼠的肿瘤体积明显减小(
****
p＜0.0001)，表明其肿瘤抑制作用很好。其中，fa-bat-nps组的肿瘤抑制作用要明显强于bat组。由图14c可知，其他药物组的肿瘤大小与生理盐水组相比，均有不同程度的变化。图14b显示了各组裸鼠的平均肿瘤重量差异，tpp、diboc、5-ala、bat、bat-nps、fa-bat-nps和5-fu肿瘤抑制率是(11.33
±
2.61)％，(27.11
±
4.65)％，(49.62
±
4.95)％，(70.08
±
3.35)％，(61.75
±
5.03)％，(82.81
±
2.30)％，(84.69
±
4.05)％。与saline组比较，5-ala组和bat组的肿瘤重量明显下降，有显著性差异(
####
p＜0.0001)，对肿瘤的抑制率明显提高，其中，bat组肿瘤重量比5-ala组更小，且抑制率更低，证明了本实验合成的bat提高了5-ala的乳腺癌抑制作用。与bat组和bat-nps组肿瘤重量比较，fa-bat-nps组有显著性降低(
****
p＜0.0001)，通过比较三组制剂的肿瘤抑制率也证明了fa-bat-nps组明显增强了对肿瘤的抑制作用。目标载药系统fa-bat-nps组和阳性对照组5-fu之间没有显著性差异，两组都表现出了良好的体内肿瘤抑制作用，此结果可作为进一步研究fa-bat-nps对化药耐药肿瘤疗效的基础。以上结果表明，目标递药系统fa-bat-nps对mcf-7异种移植瘤具有良好的抑制效果。
[0135]
此外，对肿瘤组织进行病理组织学分析，处死所有裸鼠后，取其肿瘤组织。对肿瘤组织进行tunel分析、h&e染色，为了研究fa-bat-nps是否能影响肿瘤细胞增殖，我们还检测了肿瘤中ki-67、cd31、vegfr的组织表达。
[0136]
我们采用h&e染色对裸鼠的肿瘤组织进行了病理分析，从而进一步证实fa-bat-nps的抗肿瘤活性。图15显示，在用5-ala、tpp、diboc、bat、5-fu、bat-nps、fa-bat-nps治疗的裸鼠肿瘤中，可见不同程度的肿瘤细胞坏死与凋亡。与生理盐水对照组相比，目标载药系统fa-bat-nps组与5-fu阳性对照组细胞群的平均凋亡率、平均坏死率最高，所有实验组肿瘤的平均凋亡率、平均坏死率结果所呈现的趋势与上述体内肿瘤抑制作用的结果基本符合，这证明目标给药系统fa-bat-nps可抑制裸鼠体内肿瘤的生长，并诱导肿瘤细胞的凋亡
与坏死。tunel分析显示，与生理盐水对照组相比，5-ala、bat、bat-nps和fa-bat-nps组裸鼠的肿瘤组织中出现明显的细胞凋亡情况，其中fa-bat-nps组与5-fu阳性对照组处理的肿瘤中平均细胞凋亡率最高，分别为44.88％、44.67％。
[0137]
我们检测了各组裸鼠肿瘤中ki-67、cd31以及vegfr的组织表达水平，从而研究fa-bat-nps能否抑制肿瘤细胞的增殖。如图15所示，与生理盐水对照组相比，5-ala、tpp、diboc、bat、5-fu、bat-nps、fa-bat-nps组裸鼠肿瘤组织的免疫组化分析结果显示，ki-67、cd31以及vegfr的阳性细胞群所占比例均有不同程度的降低，其中目标载药系统fa-bat-nps以及5-fu阳性对照组的下降情况最明显。这说明5-fu和fa-bat-nps制剂组对裸鼠肿瘤的抑制作用最强、治疗效果最好。
[0138]
三、体内安全性研究
[0139]
为测定fa-bat-nps的体内潜在毒性，从而指导体内抗肿瘤药效学分析。本实验的实验动物模型为昆明白小鼠，适应性喂养小白鼠7d后，将其随机分为9组，每组5只，包括：saline，fa-nps，5-ala，tpp，diboc，bat，5-fu，bat-nps，fa-bat-nps组。所有动物通过尾静脉注射给药(25mg/kg)，过后进入每天监测阶段。试验过程中，每天监测所有小鼠的毒性反应和死亡率，记录所有动物的活力、尿液、粪便等常规变化。治疗第15d，处死所有小白鼠，并通过心脏取血，血液通过离心机进行10min离心(1,000
×
g)，收集血清。通过自动化生化分析仪检测各实验组血清中的天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、血尿素氮(bun)、肌酐(cr)以及丙氨酸氨基转移酶(alt)水平。
[0140]
1、小鼠体重和脏器指数
[0141]
我们检测了昆明小白鼠对fa-bat-nps表现的体内毒性情况。首先，经尾静脉注射生理盐水、fa-nps、5-ala、tpp、diboc、bat、5-fu、bat-nps和fa-bat-nps，随后每天观察小白鼠的生长状况。在整个实验过程中除5-fu组外的其余各组小白鼠均未见明显体重下降、中毒症状、异常行为以及死亡等情况，所有小白鼠的饮食、活动及发色等均保持正常。
[0142]
表3.小白鼠生存率与体重变化情况
[0143][0144]
results were presented as mean
±
sd(n＝3).
*
p＜0.05，
****
p＜0.0001
[0145]
由表3可见，与生理盐水对照组相比，经5-fu作用的小白鼠体重平均下降了2.65％，(
****
p＜0.0001)，diboc治疗组平均体重略有下降，剩余7个组的小白鼠体重均有不同程度的增长，第15d的体重增幅在0.4％-9％范围内，其余8个小组的小白鼠体重差异不显著(
*
p＞0.05)，以上结果表明除5-fu外，其他药物组对正常小白鼠几乎没有毒性。
[0146]
此外，处死小鼠后立即收集其心脏、肝脏、肺、肾，生理盐水冲洗后通过福尔马林(10％)称重固定，最后进行h&e病理分析。通过公式(7)评估内脏指数：
[0147]
organ index(％)＝organ weight/body weight
×
100％
……
(7)
[0148]
所有实验结果的比较和分析都采用graphpad prism 8软件，其中计数资料通过数字或百分比表示、计量资料通过均数与标准差表示。不同给药组之间的平均值差异分析用1way或2way anova多重比较。p＜0.05代表其具有统计学意义。
[0149]
各组小白鼠的脏器指数情况，结果如表4所示。示。可见bat和fa-bat-nps处理后的心脏、肝脏、肺、肾脏的脏器指数与生理盐水组相比均无显著变化(p＞0.05)。但经5-fu处理的小白鼠肝脏指数显著升高(9.25
±
0.773)％，与生理盐水组(7.46
±
0.304)％比较，两者差异有统计学意义。与5-fu比较，在fa-bat-nps治疗下，对小白鼠无毒性作用。以上结果表明，bat和fa-bat-nps对小白鼠无毒性作用，而经5-fu处理过的肝脏指数较生理盐水组显著升高(p＜0.05)，说明5-fu可能对小白鼠具有毒性。
[0150]
表4.各组小白鼠的脏器指数情况
[0151][0152]
results were presented as mean
±
sd(n＝3).
****
p＜0.0001
[0153]
2、血清生化分析
[0154]
我们还对各组小白鼠进行了血清生化分析，检测指标包括ast、alt、cr以及bun，以检测bat、fa-bat-nps对肝脏、肾脏的潜在毒性作用。所得结果见表5，除5-fu组的小白鼠以外，其余各组处理后的小白鼠血清生化分析的4个指标都处于正常水平内，且并未观察到显著性差异。5-fu组的ast、alt均显著性高于生理盐水组(p＜0.05)，而其他各组的cr、bun结果均显示正常，且与生理盐水组相比无显著性差异(p＞0.05)，以上结果表明所有制剂几乎不会对小白鼠的肾脏产生毒性作用。
[0155]
表5.各组小白鼠的血清生化指标
[0156][0157]
results were presented as mean
±
sd(n＝3).
****
p＜0.0001
[0158]
3、脏器h&e染色
[0159]
如图16所示，给药14d后收集的心脏、肝脏、肺以及肾脏的组织学变化。经光镜观察，本实验动物部分肝脏组织、肝细胞轻微或轻度空泡样变性，可能为解剖时动物禁食不够，肝脏内肝糖原含量过高导致。saline、5-fu、bat-nps、fa-bat-nps处理组的肺组织轻度或中度出血，可能为解剖时放血不足，考虑与本实验用药无关。综上所述，所有给药组的心脏、肝脏、肺和肾脏基本未见与本实验药物处理有关的病理性损伤，这进一步证明了fa-bat-nps的低毒性。
[0160]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0161]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.一种光敏剂bat的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以5-ala为原料通过酰胺反应引入boc基团得到boc-ala；后将所述boc-ala与tpp通过酰胺反应进行偶联获得boc-ala-tpp，简称bat。2.根据权利要求1所述的一种光敏剂bat的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：将5-ala和二碳酸二叔丁酯于甲醇中进行酰胺反应，反应完全后通过后处理，获得boc-ala；将tpp和3-溴丙胺氢溴酸盐于无水乙腈中进行回流反应，反应完全后通过后处理，获得tpp-nh2；将所述boc-ala、tpp-nh2、n,n-二异丙基乙胺、苯并三氮唑-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸盐、4-二甲氨基吡啶于二氯甲烷中进行偶联反应，获得bat。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述5-ala、二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1∶1-6；所述tpp和3-溴丙胺氢溴酸盐的摩尔比为1∶1-3；将n,n-二异丙基乙胺、苯并三氮唑-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸盐、boc-ala、tpp-nh2、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为5∶1∶1∶3∶0.036。4.一种采用权利要求1-3任一项所述方法制备得到的光敏剂bat。5.一种靶向光敏剂fa-bat-nps，其特征在于，所述靶向光敏剂fa-bat-nps为核壳结构，所述核壳结构由外壳包裹于内核而成，所述内核为权利要求4所述的光敏剂bat，所述外壳为叶酸修饰的bsa载体，其中所述叶酸修饰的bsa载体中叶酸与bsa通过peg桥接。6.根据权利要求5所述的一种靶向光敏剂fa-bat-nps，其特征在于，以质量分数计，所述靶向光敏剂fa-bat-nps包括：1～3％光敏剂bat，97～99％叶酸修饰的bsa载体；其中，所述叶酸修饰的bsa载体包括10～13％bsa载体和86～87％peg-叶酸。7.一种权利要求5或6所述的靶向光敏剂fa-bat-nps的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将所述bat通过乳化分散法获得bat-nps纳米粒；以peg为连接链，通过酰胺反应将fa修饰于所述bat-nps纳米粒表面，获得靶向光敏剂fa-bat-nps。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述bat通过乳化分散法获得bat-nps纳米粒，包括：将卵磷脂、胆固醇和bat共同溶解于氯仿中形成载药油相；将bsa溶于超纯水得到水相；将所述油相和水相混合超声破碎，得到乳化液；将所述乳化液通过减压旋转蒸发除去有机溶剂，获得bat-nps纳米粒。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述以peg为连接链，将fa通过酰胺反应修饰于所述bat-nps纳米粒表面，获得靶向光敏剂fa-bat-nps，具体包括：将所述bat-nps纳米粒溶于水中加入nhs和edc搅匀，后加入fa-peg-nh2反应，获得靶向光敏剂fa-bat-nps。10.权利要求4所述的光敏剂bat或权利要求5或6所述的靶向光敏剂fa-bat-nps在制备抗乳腺癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种靶向光敏剂FA-BAT-NPs及其制备方法与应用。首先，本发明通过化学键链接光敏剂5-ALA与线粒体靶向基团TPP，并修饰Boc基团以增大脂溶性，制备出新型线粒体靶向光敏剂BAT；后通过乳化分散法将所述BAT制成BAT-NPs纳米粒；最后，以PEG为连接链，通过酰胺反应将FA修饰于所述BAT-NPs纳米粒表面，获得靶向光敏剂FA-BAT-NPs。靶向光敏剂FA-BAT-NPs具备较好的水溶性与体内缓释能力，对乳腺癌产生较好的抑制作用，并几乎不会对机体产生毒副作用。作用。作用。


技术研发人员：钟志容 林燕 刘中兵 景沛 柏孝生 周美玲 孙小端
受保护的技术使用者：西南医科大学
技术研发日：2023.05.04
技术公布日：2023/9/5