一种甲酸脱氢酶突变体、重组基因工程菌及其应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种甲酸脱氢酶突变体、重组基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.自工业革命以来，热力发电、交通运输等各行各业排放了大量的co2，从而导致气候变化和全球变暖。为了降低大气co2水平，不仅实施了《巴黎气候协定》等全球法规，而且开发了包括co2捕获、储存和利用在内的新技术。另一方面，co2是一种廉价、丰富且可再生的碳原料(大气中的碳含量为7500亿吨)，可用于燃料和化学品(如甲酸、甲醇、乙醇等)合成。因此，将co2转化为燃料和化学品为缓解全球变暖和促进可再生能源利用提供了一种双赢的战略。
3.在过去的几十年里，人们对co2的转化进行了深入的研究，包括化学转化、电化学转化和光化学转化。然而，这些方法都存在各自的缺陷，阻碍了大规模的应用。化学转化通常在高温高压等条件下进行，需要使用价格昂贵的催化剂，进而导致高能源消耗和高成本。光化学转化需要光敏剂长时间光照，具有不稳定和下游产物难分离的问题。电化学转化通常存在选择性低、产物种类多、电流密度低、效率低的问题。与上述方法相比，酶法转化co2是一种很有前途的解决方案，其可以在温和、环保的条件下实现高选择性和高效率的co2还原。酶法co2转化是利用甲酸脱氢酶(fdh)、甲醛脱氢酶(falddh)和醇脱氢酶(adh)等多酶级联反应生产一些重要的化学品和燃料，co2伴随着nadh的氧化分别还原为甲酸、甲醛和甲醇。然而，目前已报道的甲酸脱氢酶仍存在酶活性低、转化效率低等问题。


技术实现要素：

4.本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体、编码该甲酸脱氢酶突变体的基因、包含所述基因的重组基因工程菌以及所述基因工程菌在全细胞催化二氧化碳转化为甲酸盐中的应用。
5.本发明借助基因工程技术手段，根据来自clostridium ljungdahlii dsm 13528菌株的甲酸脱氢酶探针clfdh，从各基因组数据中搜索未鉴定的假定的甲酸脱氢酶序列中，挖掘到了一个新型甲酸脱氢酶基因(pbfdh)，并通过理性设计手段将该甲酸脱氢酶的底物结合口袋区域的三个关键氨基酸残基突变为侧链基团较小的非极性氨基酸残基，经筛选得到一个具有高催化活性的甲酸脱氢酶突变体。
6.具体地，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体与双发酵副梭菌(paraclostridium bifermentans)野生型甲酸脱氢酶相比，含有第173位甘氨酸突变为丙氨酸、第297位甘氨酸突变为丙氨酸和第408位天冬氨酸突变为缬氨酸的突变。
8.优选地，本发明所述的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.seq id no.1：
[0010][0011][0012]
以上所述的甲酸脱氢酶突变体具有高催化活性，能够高效催化二氧化碳转化为甲酸盐。
[0013]
本发明提供编码以上所述的甲酸脱氢酶突变体的基因。
[0014]
根据以上所述的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码所述甲酸脱氢酶突变体基因的核苷酸序列。基于密码子的简并性，所述基因的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码所述甲酸脱氢酶突变体的基因均在本发明的保护范围内。
[0015]
优选地，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0016]
本发明提供包含以上所述的基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
[0017]
其中，所述表达盒为将所述基因与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组基因。
[0018]
所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等。所述质粒载体包括表达载体、克隆载体。
[0019]
所述宿主细胞包括微生物细胞，优选为埃希氏菌属细菌，更优选为大肠杆菌。
[0020]
在本发明的一些实施方式中，所述生物材料为含有编码所述甲酸脱氢酶突变体的基因的表达载体pet32a-pbfdhm。
[0021]
在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为含有表达载体pet32a-pbfdhm的大肠杆菌bl21(de3)。
[0022]
本发明通过将含有编码所述甲酸脱氢酶突变体的基因的表达载体转入细菌中，成功构建了能够表达甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌，进一步利用全细胞催化实现了二氧化碳的生物转化。
[0023]
本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌表达以上所述的甲酸脱氢酶突变体，或者包含以上所述的基因，或者携带包含以上所述的基因的载体。
[0024]
优选地，所述重组基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。
[0025]
本发明提供所述的甲酸脱氢酶突变体或所述基因或所述生物材料或所述重组基因工程菌的以下任意一种应用：
[0026]
(1)在构建用于转化二氧化碳生产甲酸盐的工程菌中的应用；
[0027]
(2)在生物催化二氧化碳转化为甲酸盐中的应用；
[0028]
(3)在利用二氧化碳生产甲酸盐中的应用。
[0029]
上述(1)中，所述工程菌优选为大肠杆菌工程菌。
[0030]
本发明提供一种生物催化二氧化碳转化为甲酸盐的方法，所述方法包括：将碳酸氢盐与以上所述的重组基因工程菌在氢气存在条件下孵育。
[0031]
优选地，所述孵育为在30-37℃、搅拌条件下进行。
[0032]
优选地，上述生物催化二氧化碳转化为甲酸盐的方法为全细胞生物催化二氧化碳转化为甲酸盐的方法。
[0033]
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：将所述重组基因工程菌的湿菌体用磷酸盐缓冲液重悬混匀至菌体浓度为0.3-0.7g/ml，以0.1-0.4m的碳酸氢钠作为二氧化碳的来源，与重悬后的重组基因工程菌混合，将h2吹扫入上述混合物中，在35-37℃下孵育，并使用磁力搅拌器在混合物底部搅拌，反应1-24h。
[0034]
本发明的有益效果在于：本发明提供的甲酸脱氢酶突变体具有较高的催化活性(经大肠杆菌表达系统表达后，甲酸脱氢酶突变体的比酶活达到974mu/mg，是clostridium ljungdahlii的甲酸脱氢酶比酶活的55.6倍，是突变前甲酸脱氢酶pbfdh比酶活的2.2倍)，能够高效催化二氧化碳转化为甲酸盐。
[0035]
利用表达本发明的甲酸脱氢酶突变体的重组工程菌可进行全细胞生物催化二氧化碳转化为甲酸盐，无需添加辅酶，可以在温和条件下高效催化二氧化碳转化为甲酸盐(反应5小时后，甲酸钠浓度可达到47mm)，极大地降低了生产成本，具有良好的产业化前景，为缓解全球变暖和促进可再生能源利用提供了有效的方法。
附图说明
[0036]
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0037]
图1为本发明实施例1中涉及的假定的甲酸脱氢酶的进化树；其中，cdfdh-来源于clostridium drakei的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_084572129.1)，csfdh-来源于clostridium scatologenes的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_082085143.1)，csp001fdh-来源于clostridium sp.001的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_217302185.1)，clfdh-来源于clostridium ljungdahlii dsm 13528的甲酸脱氢酶(ncbi登录号adk13769.1)，cafdh-来源于clostridium aciditolerans的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_211141100.1)，rlfdh-来源于romboutsia lituseburensis的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_092726785.1)，pbefdh-来
源于paraclostridium benzoelyticum的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_084822034.1)，pbfdh-来源于paraclostridium bifermentans的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_082435282.1)，cspfdh-来源于clostridium sp.pl3的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_218320114.1)，csefdh-来源于clostridium senegalense的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_081496306.1)，dafdh-来源于desulfosporosinus acididurans的甲酸脱氢酶(ncbi登录号wp_083996037.1)，方框里的为探针(clfdh)和本发明筛选出的3个酶(csfdh，pbfdh和dafdh)。
[0038]
图2为本发明实施例4中甲酸脱氢酶突变体(pbfdhm)的sds-page图谱；其中，m：pageruler预染蛋白分子量标准，1：bl21/pet32a，2：bl21/pet32a-pbfdhm裂解液沉淀，3：bl21/pet32a-pbfdhm裂解液上清，4：bl21/pet32a-pbfdhm纯化后蛋白。
[0039]
图3为本发明实施例5中利用本发明的重组工程菌bl21/pet32a-pbfdhm全细胞生物催化二氧化碳转化为甲酸钠的进程曲线。
具体实施方式
[0040]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0041]
本发明的大致研发过程如下：本发明借助基因组克隆技术，以当前研究比较透彻的clostridium ljungdahlii来源的甲酸脱氢酶clfdh的蛋白序列为探针，在各基因组数据中进行blast分析，从查询的结果中找出一系列基因组信息来源的且未经表达鉴定、假定的甲酸脱氢酶蛋白。对这些序列进行进化树的构建和分析，然后选取代表性的基因序列。选定基因经过密码子优化后进行全基因合成，并进行表达筛选。其中从paraclostridium bifermentans的基因组中挖掘到了一个新型高活性的甲酸脱氢酶(pbfdh)，以该甲酸脱氢酶(pbfdh)为亲本进行计算机辅助的理性设计。首先通过alphafold 2预测出亲本甲酸脱氢酶(pbfdh)的三维结构，通过autodock4.2软件对该蛋白(pbfdh)和底物、辅酶进行半柔性分子对接模拟，利用pymol和discovery studio软件对获得的复合体的三维结构进行分析，找出该酶与底物、辅酶相互作用的氨基酸残基，并将其中第173位甘氨酸(gly)、第297位甘氨酸(gly)和第408位天冬氨酸(asp)分别突变为丙氨酸(ala)、丙氨酸(ala)和缬氨酸(val)，突变通过改进的全质粒扩增技术实现，最终成功获得了含有突变体(pbfdhm)的重组质粒pet32a-pbfdhm，并利用该重组质粒成功构建了能够高效表达甲酸脱氢酶突变体(pbfdhm)的基因工程菌，并进一步进行了全细胞催化二氧化碳转化为甲酸盐的应用。
[0042]
其中，重组基因工程菌的构建包括如下步骤：(1)将筛选出的高活性甲酸脱氢酶pbfdh连接pet32a表达载体得到pet32a-pbfdh；(2)以重组载体pet32a-pbfdh为模板，通过改进的全质粒扩增技术，得到表达甲酸脱氢酶突变体的重组载体pet32a-pbfdhm；(3)将表达甲酸脱氢酶突变体的重组载体pet32a-pbfdhm热激转化入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，加入500μl lb液体培养基于37℃、200rpm缓慢震荡培养1h，取适量菌液涂布至与目标质粒抗性相应的lb平板中，37℃倒置培养12-16h，获得单克隆重组基因工程菌；(4)从转化平板上挑取5-10个单菌落，进行菌液pcr验证，将阳性菌落转接至5ml含50μg/ml氨苄青霉素
r5
’‑
cataccgccagttgtttaccc-3’[0051]
实施例3：表达甲酸脱氢酶突变体的重组基因工程菌的构建
[0052]
1、重组载体pet32a-pbfdhm转化入宿主细胞：将重组载体pet32a-pbfdhm利用热激转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，添加0.5ml lb液体培养基，在37℃、200rpm下孵育1h后，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的lb固体平板上，在37℃下培养12～16h，得到单克隆菌落；
[0053]
2、重组菌的筛选与鉴定：挑取单克隆菌落至5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，在37℃、220rpm下培养过夜，次日菌液pcr鉴定，并提取质粒利用bamh i和xho i进行双酶切鉴定，根据电泳结果判断含有与目的基因大小一致的基因片段，初步鉴定该克隆为阳性克隆；然后将阳性克隆送至上海生工进行序列测定，测序结果进一步表明该克隆菌落即是目的基因工程菌。
[0054]
实施例4：甲酸脱氢酶突变体的诱导表达及分析
[0055]
1、诱导表达：挑选实施例3获得的经鉴定的重组基因工程菌单菌落接种至5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，在37℃、220rpm下培养过夜；将过夜培养的产物用移液器按2％的接种量接种到100ml的lb液体培养基中；然后，置于37℃下、200rpm培养2.5h，最后加入终浓度为0.1mmol/l的iptg诱导，置于16℃下、220rpm培养20h，得到经诱导表达的菌液(发酵液)。
[0056]
将上述经诱导表达的菌液分装入50ml的离心管中，于8000rpm、4℃离心5min，收集菌体，各用50ml去离子水水洗两次，同样条件下收集菌体。将上述每种菌体用100ml裂解缓冲液(pbs缓冲液，ph 7.0)悬浮，使用高压均质机4℃、900bar下破碎细胞3分钟。12000rpm、4℃离心15min，分别收集上清液和沉淀，上清液经过ni-agarose介质亲和层析纯化，sds-page分析目的蛋白的表达形态(如图2所示)。
[0057]
2、酶性能测定：
[0058]
(1)酶活测定：对裂解液测定甲酸脱氢酶用于还原二氧化碳的活性，酶活测定的方法如下：用紫外分光光度计在340nm处测定nadh的吸光值的改变(εnadh,340nm＝6.22mm-1
cm-1
)。通过加入甲酸脱氢酶引发反应，并监测1分钟。酶活测定的反应体系为1ml：包含0.1mm nadh，100mm碳酸氢钠，100mm pbs缓冲液，ph 7.0，将酶液稀释适当倍数后取100μl加入于30℃保温2min的上述反应体系。在340nm下测定1min内吸光度的变化值。在该条件下，每分钟消耗1μmol nadh所需的酶量定义为1u。酶活：u＝ew
·v·
1000/6220
·
l＝ew/6.22。ew：1min下od
340
的变化值，v：反应液的体积(ml)，6220：摩尔消光系数(l*mol-1
*cm-1
)，l：光程距离(cm)。
[0059]
(2)酶的纯化：利用镍柱将重组甲酸脱氢酶进行亲和层析，然后测定纯酶的比活。甲酸脱氢酶突变体pbfdhm纯酶的比活达到974mu/mg，为探针(17.5mu/mg)的55.6倍。
[0060]
同时以突变前的甲酸脱氢酶pbfdh(编码基因序列如seq id no.3所示，重组载体pet32a-pbfdh的构建如实施例1中所述)作为对照，结果显示，突变前的甲酸脱氢酶pbfdh的比活为435mu/mg，甲酸脱氢酶突变体pbfdhm的比活(974mu/mg)为突变前甲酸脱氢酶pbfdh的2.2倍。
[0061]
实施例5：甲酸钠的生物合成
[0062]
将0.25m的碳酸氢钠作为二氧化碳的来源，将实施例3获得的重组工程菌的湿菌体
称重，并用50mm、ph 7.0的磷酸盐缓冲液重悬混匀，最终菌体浓度为0.5g/ml。将h2吹扫入上述混合物中，在37℃下孵育，并使用磁力搅拌器在混合物底部轻轻搅拌，反应1-5h，反应过程中用hplc法检测甲酸钠的生成量，反应5小时后，甲酸钠浓度可达到47mm(如图3所示)。
[0063]
本发明的重组工程菌用于生物催化二氧化碳转化为甲酸盐，具有良好的应用前景，为缓解全球变暖和促进可再生能源利用提供了一种双赢的战略。
[0064]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体与双发酵副梭菌(paraclostridium bifermentans)野生型甲酸脱氢酶相比，含有第173位甘氨酸突变为丙氨酸、第297位甘氨酸突变为丙氨酸和第408位天冬氨酸突变为缬氨酸的突变。2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。3.编码权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求3或4所述的基因；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。6.一种重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌表达权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体，或者包含权利要求3或4所述的基因，或者携带包含权利要求3或4所述的基因的载体。7.根据权利要求6所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌为重组大肠杆菌基因工程菌。8.权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体或权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的生物材料或权利要求6或7所述的重组基因工程菌的以下任意一种应用：(1)在构建用于转化二氧化碳生产甲酸盐的工程菌中的应用；(2)在生物催化二氧化碳转化为甲酸盐中的应用；(3)在利用二氧化碳生产甲酸盐中的应用。9.一种生物催化二氧化碳转化为甲酸盐的方法，其特征在于，所述方法包括：将碳酸氢盐与权利要求6或7所述的重组基因工程菌在氢气存在条件下孵育。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述孵育为在搅拌条件下进行。

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种甲酸脱氢酶突变体、重组基因工程菌及其应用。本发明的甲酸脱氢酶突变体与Paraclostridium bifermentans野生型甲酸脱氢酶相比，含有第173位甘氨酸突变为丙氨酸、第297位甘氨酸突变为丙氨酸和第408位天冬氨酸突变为缬氨酸的突变。该甲酸脱氢酶突变体具有较高的催化活性，能够高效催化二氧化碳转化为甲酸盐。利用表达该甲酸脱氢酶突变体的重组工程菌可进行全细胞生物催化二氧化碳转化为甲酸盐，无需添加辅酶，可以在温和条件下实现高效的生物转化，极大地降低了生产成本，具有良好的产业化前景。好的产业化前景。


技术研发人员：薛闯 史红玲 唐存多
受保护的技术使用者：南阳师范学院
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/9/5