一种配位卟啉基星形聚合物及其制备方法与应用

1.本发明涉及聚合物抗菌材料制备技术领域，具体涉及一种配位卟啉基星形聚合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.细菌感染作为公共卫生领域面临的主要挑战之一，严重威胁人类的生命健康。而在抗生素被发现并大规模使用后引起的细菌耐药性的增加是目前亟待解决的主要问题，耐药性细菌的出现使许多疾病的治疗变得困难。开发一种强抗菌活性、低细菌耐药性的新型抗菌剂具有现实意义。
3.活性氧(ros)，包括单线态氧1o2，是一种寿命短、具有杀病毒特性的高氧化性物质，通过光敏剂在特定波长光激发下发生能级跃迁而原位生成，因其非特异性的细胞杀伤潜能被广泛用于光刺激下的癌症靶向治疗。同样的，该治疗手段也可用于抗菌应用中。卟啉因具有长寿命的三重态激发态和较高的单线态氧量子产率而被作为理想的ros产生剂，能够在具有生物组织穿透性的长波长光程照射下激发pdt功能，实现低剂量与低光毒性下的抗菌效果。然而，强共轭π键结构的卟啉在水中往往存在聚集与溶解性差的问题，导致光敏活性的降低。因此，增加卟啉分子的溶解性与避免π-π堆积是充分发挥其pdt能力的有效策略。在聚合物纳米材料应用于肿瘤治疗的研究中，研究者们通常考虑将卟啉类光敏剂作为功能化组分悬挂在聚合物的侧基，通过自组装的方式形成胶束或囊泡等形貌，以达到增加溶解度与避免聚集的效果。
4.本发明在前期研究工作(cn112028900b)的基础上，发现将卟啉设计为星形聚合物的中心结构，能够在实现分散性的同时，相较线性聚合物表现出更低的黏度。其内部黏度只依赖星形聚合物一个臂的分子量，在増加聚合物中的抗菌活性基团的同时不减弱其扩散性，使星形聚合物具有很大的抗菌应用前景。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种配位卟啉基星形聚合物及其制备方法与应用。本发明将包含季铵化类单体的反应单体与四官能度卟啉引发剂通过光控原位溴-碘转换可逆-失活自由基聚合方法合成阳离子化的卟啉基星形聚合物，然后再经过金属化制备得到配位卟啉基星形聚合物，该配位卟啉基星形聚合物表现出高抗菌活性。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
7.本发明第一方面提供了一种配位卟啉基星形聚合物，所述配位卟啉基星形聚合物具有如下结构通式：
[0008][0009]
其中，m、n、p分别选自10-40任一整数；
[0010]
x选自0～4任一整数，y选自1～5任一整数。
[0011]
在本发明的研发过程中，考虑到细菌与细胞存在膜壁结构的差异以及革兰氏阴性菌的活性氧惰性。对此，本发明通过引入具有正电荷组分的单体以制备具有较强正电性的聚合物，从而提高聚合物与带负电的细菌表面的静电相互作用，并通过调整聚合物臂上的亲疏水性基团以调控星形聚合物的亲疏水性，避免聚合物聚集的同时赋予其一定膜透能力，从而破坏细胞的膜结构，使光照下星形聚合物产生的ros可扩散至细菌细胞膜内，实现光动力效果的增强化。
[0012]
本发明第二方面提供了一种第一方面所述的配位卟啉基星形聚合物的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)将包含季铵化类单体的反应单体与四官能度卟啉引发剂在溶剂存在下，进行光照聚合反应，得到卟啉基星形聚合物；
[0014]
(2)将步骤(1)制备的卟啉基星形聚合物与醋酸锌在溶剂存在下，进行金属化反应，得到所述配位卟啉基星形聚合物；
[0015]
所述季铵化类单体的结构如下：
[0016][0017]
其中，r4选自c1-c8烷基、苄基中的一种；
[0018]
所述四官能度卟啉引发剂的结构如下：
[0019][0020]
本发明引入季铵化类单体作为聚合单体，与四官能度卟啉引发剂通过光控bit-rdrp方法制备得到星形聚合物，在该反应体系中无需添加额外的碘金属盐以及有机胺，季铵化类单体作为聚合单体的同时可为聚合反应提供必要的游离碘离子，实现光控聚合的同时有效简化聚合组分。此外，引入季铵化类单体可提高聚合物与带负电荷的细菌表面的静电相互作用，可提高抗菌效果。本发明进一步将制备得到的卟啉基星形聚合物进行金属化，制备得到配位卟啉基星形聚合物，从而使星形聚合物可在光照条件下释放大量的活性氧，进一步提高抗菌效果。
[0021]
进一步地，所述反应单体还包括聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(pegma)和/或甲基丙烯酸苄酯(bnma)。
[0022]
本发明通过在星形聚合物中引入pegma或bnma链段，用以调控星形聚合物的亲水疏水平衡，实现聚合物在水相的良好分散性。除pegma、bnma外，还可引入甲基丙烯酸甲酯(mma)、甲基丙烯酸正丁酯(bma)、甲基丙烯酰胺(mam)、甲基丙烯酸缩水甘油酯等来调控聚合物的亲疏水性，所列举的甲基丙烯酸酯类单体均能在光控bit-rdrp方法下实现可控聚合，且表现出不同程度的亲水疏水性质，因而可用于该聚合体系的构建。
[0023]
在本发明一些优选的实施例中，所述反应单体包括季铵化类单体及聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯时，当所述反应单体包括季铵化类单体及聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯时，所述季铵化类单体与聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的投料摩尔比为1:0.5-2，例如1:0.5、1:0.6、1:0.75、1:0.9、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.7、1:1.8、1:2等，包括但不限于上述列举的投料摩尔比。
[0024]
在本发明一些优选的实施例中，所述反应单体包括季铵化类单体及甲基丙烯酸苄酯时，所述季铵化类单体与甲基丙烯酸苄酯的投料摩尔比为1:0.5-2，例如1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2等，包括但不限于上述列举的投料摩尔比。
[0025]
进一步地，步骤(1)中，所述反应单体与四官能度卟啉引发剂的投料摩尔比为50-200:1，例如50:1、70:1、100:1、120:1、140:1、160:1、170:1、180:1、190:1等，包括但不限于上述列举的投料摩尔比。
[0026]
进一步地，步骤(1)中，所述溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种或多种。
[0027]
进一步地，步骤(1)中，所述光照聚合反应在蓝光照射下进行，更优选在波长为400-500nm的光照下进行。
[0028]
进一步地，步骤(1)中，所述光照聚合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为3-12h。
[0029]
进一步地，所述制备方法还包括对步骤(1)光照聚合反应后的产物进行沉降、抽滤、干燥得到卟啉基星形聚合物的过程，其中采用体积比为1-9:1的石油醚/乙醇的混合溶液对产物进行沉降处理。
[0030]
进一步地，步骤(2)中，所述卟啉基星形聚合物与醋酸锌的投料摩尔比为1:5-10。
[0031]
进一步地，步骤(2)中，所述金属化反应的反应温度为15-30℃，反应时间为8-12h。
[0032]
进一步地，所述制备方法还包括对步骤(2)金属化反应后的产物进行沉降处理的过程，其中采用无水乙醚对产物进行沉降处理。
[0033]
本发明第三方面提供了一种第一方面所述的配位卟啉基星形聚合物在制备用于抑制和/或杀灭细菌的抗菌材料方面的应用。
[0034]
进一步地，所述细菌包括革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌，以及革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。
[0035]
与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0036]
1.本发明提供了一种新型配位卟啉基星形聚合物，将含碘离子的季铵化类单体作为反应单体或反应单体之一，与四官能度卟啉引发剂通过光控bit-rdrp方法制备得到卟啉基星形聚合物，然后经金属化后得到配位卟啉基星形聚合物。其中将含碘离子的季铵化类单体作为反应单体具有以下优点：(1)含碘离子的季铵化类单体可为上述聚合体系提供必要的游离碘离子，替代经典光控bit-rdrp方法中的碘金属盐成分，简化聚合组分，同时降低副反应的发生；(2)含碘离子的季铵化类单体的引入可提高聚合物的正电性，从而提高聚合物与带负电的细菌表面的静电相互作用；同时季铵化类单体上携带的长烷基链对细菌膜的插入作用为后续ros扩散至细菌细胞膜内提供前提，从而增强聚合物对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的光动力杀菌效果。此外，通过对卟啉基星形聚合物进行金属化处理得到配位卟啉基星形聚合物，提高聚合物在550-600nm光源条件下的单线态氧产率，以进一步提高聚合物在光照条件下的杀菌活性。
[0037]
2.本发明制备的配位卟啉基星形聚合物可通过静电相互作用吸附细菌，且聚合物携带的长烷基链可通过扦插作用破坏细菌的细胞膜，同时在光照条件下聚合物释放单线态氧，进一步破坏细菌结构，在上述协同作用下，能够实现低浓度聚合物对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的高效灭菌作用，最低抑菌浓度仅为0.82μm，最低杀菌浓度仅为1.0μm。另外，通过细胞试验结果可知，配位卟啉基星形聚合物的细胞毒性低，且在工作光源的照射下存在光解行为，即配位卟啉基星形聚合物在含菌水溶液中达到灭菌目的同时，体系中残留的星形聚合物可以忽略不计，不会对环境与生物体造成毒性。
附图说明
[0038]
图1实施例1制备单体qdmaema(c8)的核磁氢谱；
[0039]
图2为实施例2制备的配位卟啉基星形聚合物zn@p1的核磁氢谱；
[0040]
图3为实施例2制备的配位卟啉基星形聚合物zn@p2的核磁氢谱；
[0041]
图4为实施例2制备的配位卟啉基星形聚合物zn@p3的核磁氢谱；
[0042]
图5为实施例2制备的配位卟啉基星形聚合物zn@p2在zn
2+
配位前后的紫外-可见吸收光谱；
[0043]
图6为实施例2制备的配位前后卟啉基星形聚合物p2、zn@p2在570nm光源照射下产生的单线态氧被9,10-二甲基蒽(dma)捕获后引起dma的吸收随照射时间变化的图；
[0044]
图7为实施例2制备的配位卟啉基星形聚合物zn@p1、zn@p2、zn@p3在570nm光源照射下产生的单线态氧被9,10-二甲基蒽(dma)捕获后引起dma的吸收随照射时间变化的图；
[0045]
图8为实施例2制备的配位卟啉基星形聚合物zn@p1、zn@p2、zn@p3对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的涂板结果；
[0046]
图9为实施例2制备的zn@p2对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的时间杀灭实验结果；
[0047]
图10为实施例2制备的zn@p2与金黄色葡萄球菌与大肠杆菌作用后的zeta电位；
[0048]
图11为实施例2制备的zn@p2在570nm光源照射下不同时间后水相混合液的紫外-可见吸收光谱；
[0049]
图12为实施例2制备的zn@p2的细胞毒性。
具体实施方式
[0050]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0051]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0052]
实施例1
[0053]
本实施例涉及一种季铵化类单体qdmaema(c8)的制备，具体操作如下：
[0054]
将5.6ml(32.90mmol)甲基丙烯酸二甲氨乙酯(dmaema)、8.0ml(43.42mmol)1-碘辛烷以及0.13g(0.65mmol)吩噻嗪置于一个装有磁力搅拌子的50ml三口烧瓶中，并加入6.0ml乙腈混合均匀，接回流装置，通入氩气鼓泡30分钟，以去除反应装置中的氧气。将三口烧瓶置于70℃油浴中反应过夜。反应结束后用冰水冷却反应液，加入50ml无水乙醚共混，减压抽滤，用50ml无水乙醚洗涤滤渣，收集白色滤饼，真空干燥至恒重，得到白色固体粉末qdmaema(c8)。
[0055]
图1为qdmaema(c8)的核磁氢谱，从图1中可以看出产物的核磁特征峰的化学位移均与qdmaema(c8)的理论结构相对应。
[0056]
实施例2
[0057]
本实施例涉及三种配位卟啉基星形聚合物zn@p1、zn@p2以及zn@p3的制备，具体过程如下：
[0058]
(1)卟啉基星形聚合物p1、p2、p3的制备
[0059]
p1的制备：以初始摩尔比[qdmaema(c8)]0:[thpp-4br]0＝100:1向洁净的2ml安瓿瓶中依次投入0.433g qdmaema(c8)、20.0mg thpp-4br、0.6ml dmf以及一颗磁力搅拌子，混合均匀。通过三次冷冻抽气-解冻充气的循环过程尽可能除去安瓿瓶中的空气，同时向安瓿
瓶中注入氩气。待最后一组冷冻抽气-解冻充气操作完成后，迅速用火焰密封安瓿瓶瓶口，将密封好的安瓿瓶转移至配有光源与风扇的搅拌器上，开启搅拌、光源及风扇。待聚合反应达到预设时间后，将安瓿瓶转移至黑暗环境中静置片刻，破管后加入2.0ml丙酮稀释反应液，将混合均匀的反应液滴加到200ml石油醚/乙醇混合液中，静置8小时以上。减压抽滤去除上清液，得到的聚合物滤饼真空干燥过夜，得到紫色片状固体thpp-4p(qdmaema(c8))，即p1。
[0060]
图2为p1的核磁氢谱，从图2中可以看出产物的核磁特征峰的化学位移均与p1的理论结构相对应。
[0061]
p2的制备：以初始摩尔比[pegma
300
]0:[qdmaema(c8)]0:[thpp-4br]0＝120:70:1向洁净的2ml安瓿瓶中依次投入0.379g qdmaema(c8)、0.462ml pegma
300
、20.0mg thpp-4br、0.4ml dmf以及一颗磁力搅拌子，混合均匀。通过三次冷冻抽气-解冻充气的循环过程尽可能除去安瓿瓶中的空气，同时向安瓿瓶中注入氩气。待最后一组冷冻抽气-解冻充气操作完成后，迅速用火焰密封安瓿瓶瓶口，将密封好的安瓿瓶转移至配有光源与风扇的搅拌器上，开启搅拌、光源及风扇。待聚合反应达到预设时间后，将安瓿瓶转移至黑暗环境中静置片刻，破管后加入2.0ml丙酮稀释反应液，将混合均匀的反应液滴加到200ml石油醚/乙醇混合液中，静置8小时以上。减压抽滤去除上清液，得到紫色粘稠固体thpp-4p(qdmaema(c8)-co-pegma)，即p2。
[0062]
图3为p2的核磁氢谱，从图3中可以看出产物的核磁特征峰的化学位移均与p2的理论结构相对应。
[0063]
p3的制备：以初始摩尔比[bnma]0:[qdmaema(c8)]0:[thpp-4br]0＝120:60:1向洁净的2ml安瓿瓶中依次投入0.325g qdmaema(c8)、0.288ml bnma、20.0mg thpp-4br、0.6ml dmf以及一颗磁力搅拌子，混合均匀。通过三次冷冻抽气-解冻充气的循环过程尽可能除去安瓿瓶中的空气，同时向安瓿瓶中注入氩气。待最后一组冷冻抽气-解冻充气操作完成后，迅速用火焰密封安瓿瓶瓶口，将密封好的安瓿瓶转移至配有光源与风扇的搅拌器上，开启搅拌、光源及风扇。待聚合反应达到预设时间后，将安瓿瓶转移至黑暗环境中静置片刻，破管后加入2.0ml丙酮稀释反应液，将混合均匀的反应液滴加到200ml石油醚/乙醇混合液中，静置8小时以上。减压抽滤去除上清液，得到紫色固体thpp-4p(qdmaema(c8)-co-bnma)，即p3。
[0064]
图4为p3的核磁氢谱，从图4中可以看出产物的核磁特征峰的化学位移均与p3的理论结构相对应。
[0065]
上述制备得到的p1～p3的相关参数汇总于下表1中：
[0066]
表1
[0067][0068]
其中，聚合物的理论分子量与单体转化率通过1h nmr计算；br代表qdmaema(c8)与共聚单体(pegma或bnma)的物质的量之比。
[0069]
(2)配位卟啉基星形聚合物zn@p1、zn@p2、zn@p3的制备
[0070]
zn@p1的制备：将20.0mg p1溶解于5.0ml dcm；另称取2.0mg无水醋酸锌(zn(oac)2)，溶解于1.0ml甲醇中并充分混合，合并上述溶液并在常温下搅拌12小时。反应结束后，将混合液缓慢滴加到无水乙醚中，-20℃条件下静置8小时以上，通过离心得到沉淀物，用无水乙醚洗涤沉淀物，真空干燥至恒重，得到zn
2+
配位的卟啉基星形聚合物，即zn@p1。
[0071]
zn@p2的制备：制备方法与zn@p1相同，仅将反应物p1置换为等量的p2。
[0072]
zn@p3的制备：制备方法与zn@p1相同，仅将反应物p1置换为等量的p3。
[0073]
以上述制备的zn@p2为例，研究thpp-4br、p2以及zn@p2的紫外-可见吸收光谱的变化，如图5所示，将卟啉设计为聚合引发剂并引发聚合所得的聚合物在吸收峰数目上未发生明显变化，而zn
2+
配位后聚合物的q带吸收峰集中在了550～650nm的两个吸收。
[0074]
性能测试及应用
[0075]
1.单线态氧的测定
[0076]
利用9,10-二甲基蒽(dma)测定配位卟啉基星形聚合物在光照下释放单线态氧的能力(pdt能力)。具体测试过程如下：
[0077]
将1.0mg dma溶解于1.0ml dmf中得到1.0mg/ml的dma母液。在避光条件下，将dma母液加入到2.0ml含配位卟啉基星形聚合物或卟啉基星形聚合物的dmf溶液中，将混合液中的dma浓度控制在30μg/ml。将样品置于最大吸收波长为570nm，光功率密度为6.0mw/cm2的黄色led灯带下照射，达到不同预设时间后用紫外分光光度计测定混合液的紫外-可见吸收光谱，记录a380 nm处的数值变化，根据dma的紫外工作曲线将吸光度换算为浓度，绘制dma浓度-time曲线。
[0078]
(1)金属配位对卟啉基星形聚合物的单线态氧产率的影响
[0079]
以实施例2制备的zn@p2为例，测试p2及zn@p2的单线态氧产率，测试结果如图6所示，图中绝对值用以说明单线态氧产率，值越大说明单线态氧产率越高。由图可知，配位卟啉基星形聚合物(zn@p2)的单线态氧产率高于未金属配位前的卟啉基星形聚合物(p2)。
[0080]
(2)不同亲疏水平衡的配位卟啉基星形聚合物的单线态氧产率
[0081]
如图7所示，当体系中的聚合物维持在同一浓度时，zn@p1表现出相对高的单线态氧产率，zn@p3次之，zn@p2最低。
[0082]
2.抗菌活性的测定
[0083]
(1)最低抑菌浓度(mic90)的测定
[0084]
采用标准的二倍浓度稀释法测定配位卟啉基星形聚合物的最低抑菌浓度(mic90)。具体测定过程如下：
[0085]
分别挑取s.aureus和e.coli的单克隆菌落，将其接种至1.0ml lb培养基中，在37℃下振荡培养。将金属化卟啉基星形聚合物溶解于100μldmso中并用pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)稀释至1024μg/ml，接着通过二倍稀释法配制成不同浓度的混合液(256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml)，取不同浓度的混合液各100μl铺于无菌96孔板中，相应孔中加入100μl稀释好的菌液，阳性对照无聚合物，阴性对照无菌落，所有浓度设置三组平行实验。将96孔板放置在37℃恒温培养箱中光照/黑暗条件下培养22小时后，通
过多功能酶标仪测定孔板中混合液在600nm处的光密度(od)值。
[0086]
抑菌率的计算公式如下：
[0087]
抑菌率(％)＝(阳性对照od值-样品od值)/(阳性对照od值-阴性对照od值)
×
100％。
[0088]
i:不同聚合度(分子量)及聚合单体侧链长度对配位卟啉基星形聚合物的抑菌活性的影响
[0089]
测试具有不同侧链长度c＝3、6、8以及不同分子量mn＝9800、5800、14600的卟啉基星形聚合物形成的配位卟啉基星形聚合物(制备方法参考实施例1、2)的抑菌活性。其中侧链长度c＝3、分子量为7800g/mol卟啉基星形聚合物命名为p1-c3-mn(7800)，以此类推，得到5种具有不同侧链长度或分子量的卟啉基星形聚合物，经金属化处理后得到以下5种配位卟啉基星形聚合物。上述不同配位卟啉基星形聚合物抑菌活性的测试结果如下表2所示：
[0090]
表2
[0091][0092]
其中，mic90表示聚合物对细菌造成90％抑菌率时对应的最低浓度。由表2可知，zn@p1-c3-mn(7800)、zn@p1-c6-mn(8800)、zn@p1-c8-mn(9800)三种聚合物的聚合度相近(n为20-21)，随着参与聚合的qdmaema(cx)单体的侧链碳数由三个碳增加至八个碳，聚合物的mic90值随之下降，以八个碳的qdmaema的抗菌效果最优。而对于单体具有相同侧链碳数的聚合物zn@p1-c8-mn(9800)、zn@p1-c8-mn(5800)、zn@p1-c8-mn(14600)，当聚合物中单体聚合度为20左右时，即zn@p1-c8-mn(9800)表现出最优的抑菌效果。
[0093]
ii:不同亲疏水平衡对配位卟啉基星形聚合物的抑菌活性的影响
[0094]
测试由不同聚合单体制备得到的配位卟啉基星形聚合物的抑菌活性，测试结果如下表3所示：
[0095]
表3
[0096][0097]
由表3可知，光照条件可降低星形聚合物对细菌的mic90值，相较于zn@p1，zn@p2、zn@p3用于杀灭s.aureus菌、e.coli菌的mic90值更高，推测是由于共聚亲水单体pegma或疏水单体bnma的引入使得聚合物的分子量更大，相同质量浓度的星形聚合物，zn@p1产生的单线态氧更多。
[0098]
(2)最低杀菌浓度(mbc)的测定
[0099]
将s.aureus和e.coli的单克隆菌落接种至1.0ml lb培养基中，在37℃下振荡培养后，用lb培养基稀释至合适的浓度。配制一系列不同浓度的金属化卟啉基星形聚合物的pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)，各个浓度取300μl铺于无菌48孔板中，接着每孔加入300μl菌液，设置阳性与阴性对照，所有浓度设置三组平行实验。混合均匀后将48孔板放置在37℃恒温培养箱中光照/黑暗条件下培养4小时。吸取稀释后的混合液10μl分三次滴加在固体琼脂培养基上，用三角涂布棒涂布均匀，将涂有混合液的琼脂培养基倒扣放置在37℃恒温培养箱中培养20小时。培养结束后对每个固体琼脂培养基进行拍照，菌落计数，无菌落生长的培养基所对应的聚合物浓度为最小杀菌浓度(mbc)。
[0100]
从图8的涂板结果可以看出，对于s.aureus，在光照条件下聚合物zn@p1、zn@p2和zn@p3的mbc分别为1.0μm、1.5μm和2.0μm，相对于黑暗条件下的mbc分别减小了2倍、4倍和4倍，光照条件能够有效提高金属化卟啉基星形聚合物对于s.aureus的抗菌活性。当实验模型更换为e.coli时，聚合物zn@p1、zn@p2和zn@p3在光照条件下的mbc分别为8.0μm、2.0μm以及6.0μm，相对于黑暗条件下的mbc值仅减小了1.25～2倍不等，推测是革兰氏阴性菌对单线态氧的敏感性较低的原因。
[0101]
在以e.coli为模型细菌的涂板结果中，zn@p2的mbc值明显低于zn@p1、zn@p3。由该实验结果可知，聚合物的亲疏水平衡在针对e.coli的抗菌过程中发挥着不可忽略的作用，聚合物中的亲水组分提供了必要的“平衡”来对抗疏水的聚合物内核，聚合物能够在水溶液中更好的分散，增加与细菌的接触几率，使聚合物对细菌的吸附及膜透化能够顺利进行，因此倾向于表现出更优的抗菌活性。
[0102]
(3)时间杀灭(time-killing)实验
[0103]
时间杀灭实验遵循美国实验与材料协会(astm)标准e2315-16。以zn@p2为例，研究该配位卟啉基星形聚合物对细菌的杀伤作用随时间的变化关系，具体操作如下：
[0104]
将s.aureus和e.coli的单克隆菌落接种至1.0ml lb培养基中，在37℃下振荡培养后，用pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)稀释至合适的浓度，稀释倍数在20倍及以上，确保混合液中的养分含量低于5％。配制合适浓度zn@p2的pbs缓冲液(ph＝7.2～7.4)，取无菌96孔板，每孔加入100μl聚合物混合液和100μl菌液，设置阳性与阴性对照，每个样品组设置两组平
行实验。混合均匀后将96孔板放置在37℃恒温培养箱中光照/黑暗条件下培养不同的时间(0min,10min,20min,30min)后，取样稀释，吸取10μl分三次滴加在固体琼脂培养基上，用涂布棒涂布均匀，该涂布实验每孔样品平行两份。将涂有混合液的琼脂培养基倒扣放置在37℃恒温培养箱中培养20小时。培养结束后对每个固体培养基进行拍照，菌落计数。
[0105]
结果如图9所示，zn@p2在光照条件下对s.aureus的杀伤效果表现出时间相关性，光照30分钟后细菌数量发生了显著的下降，减少了约2.5个log10值(杀菌效率约为99.6％)，可以理解为单线态氧对s.aureus发挥主要杀伤作用，光照时间的增长引起的单线态氧累计释放量的增加，从而破坏更多数量的细菌。对于e.coli，zn@p2的时间杀菌结果中显示在聚合物与细菌共培育30分钟后，溶液中的细菌数量仅下降0.3个log10值，杀菌效率约为46.3％，光照的加入对材料的杀菌效果未带来明显变化。考虑到革兰氏阴性菌对单线态氧的耐性，zn@p2对的破坏作用主要依靠正离子的静电吸附与烷基链的膜插入与裂解作用。
[0106]
3.zeta电位测定
[0107]
以zn@p2为例，测试配位卟啉基星形聚合物以及不同细菌的zeta电位，以及观察配位卟啉基星形聚合物与细菌混合后的zeta电位变化，具体操作如下：
[0108]
将s.aureus和e.coli的单克隆菌落接种至lb培养基中，在37℃下振荡培养。然后使用lb培养基稀释至工作浓度。将适宜浓度的金属化卟啉基星形聚合物与稀释后的细菌悬浮液加入到24孔板中，培养2小时。取出的混合液离心，倒掉上清液后沉淀物用去离子水清洗三次，最后重悬在去离子水中，测试混合液的zeta电位。对照组为未加聚合物的细菌与未加细菌的聚合物溶液。
[0109]
测试结果如图10所示，s.aureus的表面电位为-30.5mv，e.coli的表面电位为-35.3mv，聚合物溶液的电位为+23.0mv。将聚合物溶液加入s.aureus和e.coli菌液中共培育后，两种细菌的表面电位发生了明显的上升，分别增加至-5.43mv和-11.47mv，可以认为聚合物通过静电作用吸附到细菌表面，以便于后续与细菌发生进一步作用。
[0110]
4.光解能力测定
[0111]
以zn@p2为例，测定配位卟啉基星形聚合物的光解能力，具体操作如下：
[0112]
将zn@p2溶解于dmso中，用pbs缓冲液稀释至合适的浓度，在黄光(λ
max
＝570nm,w＝6.0mw/cm2)照射下，在不同时间点取样(0h,4h,8h,12h,22h)，用紫外分光光度计测定混合液的紫外可见光谱。
[0113]
测试结果如图11所示，卟啉结构的特征吸收峰(423nm)强度随着光照时间的延长逐渐减小，当光照22小时后，强度减小了74.3％，这也表明配位卟啉基星形聚合物随着光照时间的延长发生分解。因此，该聚合物在成细菌杀伤后，残余的聚合物基本不会对环境与生物体造成毒性。
[0114]
5.细胞毒性测定
[0115]
以zn@p2为例，通过cck-8法评估抗zn@p2的细胞毒性。具体操作如下：
[0116]
将小鼠成纤维细胞(l929)消化离心后重悬在培养基中，使用细胞计数板对细胞进行计数，根据稀释倍数计算总细胞数。接着将细胞接种到96孔板中(每孔约2
×
104个细胞)，待细胞贴壁生长后，加入含不同浓度zn@p2的培养基，每个浓度设置六个平行组。将96孔板转移至恒温培养箱(37℃，5％co2)中培育24小时。移除孔内培养基，加入100μl新的培养基，
并加入10μl cck-8，孵育2小时后测定450nm处的吸光值，计算细胞存活率＝(加样组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)
×
100％。
[0117]
图12的细胞毒性结果显示，zn@p2在浓度2.0μm以下，与聚合物共培养的细胞仍能维持接近100％的存活率，表现出低细胞毒性。
[0118]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

技术特征：
1.一种配位卟啉基星形聚合物，其特征在于，所述配位卟啉基星形聚合物具有如下结构通式：其中，m、n、p分别选自10-40任一整数；x选自0～4任一整数，y选自1～5任一整数。2.一种权利要求1所述的配位卟啉基星形聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将包含季铵化类单体的反应单体与四官能度卟啉引发剂在溶剂存在下，进行光照聚合反应，得到卟啉基星形聚合物；(2)将步骤(1)制备的卟啉基星形聚合物与醋酸锌在溶剂存在下，进行金属化反应，得到所述配位卟啉基星形聚合物；所述季铵化类单体的结构如下：其中，r4选自c1-c8烷基、苄基中的一种；所述四官能度卟啉引发剂的结构如下：3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应单体还包括聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸苄酯。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述反应单体包括季铵化类单体及聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯时，所述季铵化类单体与聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯的投料摩尔比为1:0.5-2；当所述反应单体包括季铵化类单体及甲基丙烯酸苄酯时，所述季铵化类单体与甲基丙烯酸苄酯的料摩尔比为1:0.5-2。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应单体与四官能度卟啉引发剂的投料摩尔比为50-200:1。6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮中的一种或多种；所述光照聚合反应在蓝光照射下进行；所述光照聚合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为3-12h。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述卟啉基星形聚合物与醋酸锌的投料摩尔比为1:5-10。8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述金属化反应的反应温度为15-30℃，反应时间为8-12h。9.一种权利要求1所述的配位卟啉基星形聚合物在制备用于抑制和/或杀灭细菌的抗菌材料方面的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

技术总结
本发明公开了一种配位卟啉基星形聚合物及其制备方法与应用，所述配位卟啉基星形聚合物的制备方法包括以下步骤：(1)将包含季铵化类单体的反应单体与四官能度卟啉引发剂在溶剂存在下，进行光照聚合反应，得到卟啉基星形聚合物；(2)将步骤(1)制备的卟啉基星形聚合物与醋酸锌在溶剂存在下，进行金属化反应，得到所述配位卟啉基星形聚合物。由上述制备方法制备得到的配位卟啉基星形聚合物对细菌具有强静电吸附作用，且携带的长烷基链可通过扦插作用破坏细菌的细胞膜，并在光照条件下可释放单线态氧，通过以上协同作用可实现低浓度下的高效灭菌活性。效灭菌活性。效灭菌活性。


技术研发人员：张丽芬 任姝稣 程振平 徐想 赵海涛 张顺虎
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/9/5