一种透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒及其制备方法

聚乙烯亚胺溶液；
9.(2)用枸橼酸盐缓冲液配制edc/nhs溶液，将低分子量透明质酸溶解于edc/nhs溶液中并活化，得到低分子量透明质酸溶液；
10.(3)低分子量透明质酸溶液与富勒烯-聚乙烯亚胺溶液反应，产物溶液经透析、冻干后得到透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒；
11.所述的低分子量透明质酸的分子量为5-10kda；透明质酸的分子量过高，将影响其血管生成活性。
12.富勒烯为具有缺电子性质的空心球笼状结构分子，其表面含有大量的共价双键，极易与游离基团发生反应，但富勒烯的水溶性差制约了其进一步在生物医药领域的应用，本发明利用界面反应，共价连接富勒烯与聚乙酰亚胺，随后通过氨基与羧基的缩合反应，共价修饰低分子量透明质酸，制备得到透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒。
13.低分子量透明质酸是高分子量透明质酸由透明质酸酶催化分解而成，具有诱导内皮细胞相关基因表达水平的提高，从而促进血管内皮细胞增殖与分化的功能；氨基化富勒烯经低分子量透明质酸修饰后，能显著改善其水溶性，同时有效避免了因过量蓄积而引发的不良反应，如细胞毒性；此外，低分子量透明质酸与pei的氨基共价结合后，其稳定性相对延长，避免在体内过早分解。
14.优选的，所述的富勒烯为c
60
、c
70
、c
72
、c
76
或c
84
，所述的聚乙烯亚胺的分子量为300-1800da，富勒烯与聚乙烯亚胺的质量比为1:2-50。聚乙烯亚胺pei分子量过高时，其对人体细胞的毒性会大大增加，并且对富勒烯分子表面覆盖增加，导致富勒烯清除自由基能力大幅降低，因此聚乙烯亚胺pei的分子量优选为300-1800da。
15.优选的，混合溶剂体系中包括无水甲苯和去离子水。
16.优选的，步骤(1)中，反应温度为70-100℃，反应时间为12-48h。
17.步骤(1)中，反应结束后，将反应后的溶液后处理，得到富勒烯-聚乙烯亚胺溶液；所述的后处理步骤包括：通过旋蒸浓缩反应产物，再将浓缩后的反应产物溶于去离子水中，过滤除去固体杂质，真空干燥浓缩后透析，得到所述的富勒烯-聚乙烯亚胺溶液。
18.优选的，步骤(1)中，所述的旋蒸温度为60-80℃，所述的旋蒸时间为10-60min。
19.优选的，步骤(1)中，透析时间为24-48h，所用透析袋的截留分子量为3.5kda；透析以除去未参与反应的聚乙烯亚胺底物，防止其残余对下一步反应中的透明质酸上羧基的交联位点发生竞争，导致终产物的产率降低，同时能够保留所需要的中间产物氨基化富勒烯。
20.优选的，所述的枸橼酸盐缓冲液为枸橼酸钠缓冲液，浓度为0.005-0.2mol/l，ph为5-6。
21.edc/nhs溶液中，edc和nhs的浓度分别为2-10mmol/l；edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)是没有毒性、具有优越生物相容性的交联剂，可促进氨基羧基偶联，用于活化低分子量透明质酸的羧基与氨基化富勒烯发生缩合反应。
22.进一步优选的，活化时间为4-12h。
23.优选的，步骤(3)中，所述的低分子量透明质酸溶液的浓度为0.5-1g/l。
24.优选的，步骤(3)中，低分子量透明质酸溶液与富勒烯-聚乙烯亚胺溶液的体积比为1:0.5-2，反应时间为4-12h。
25.进一步优选的，步骤(3)中，透析时间为24-48h，所用透析袋的截留分子量为3.5kda。
26.本发明还提供了所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法制得的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒。
27.优选的，所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的粒径为80-100nm。
28.本发明还提供了所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒在抗菌领域中的应用，特别是作为抗菌剂抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的应用。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
30.(1)本发明利用界面反应，共价连接富勒烯与聚乙酰亚胺，随后通过氨基与羧基的缩合反应，共价修饰低分子量透明质酸，得到粒径均匀(80-100nm)、分散性好的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒。
31.(2)本发明制得的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒能够应用于抗菌领域，可通过表面的大量氨基与细菌的细胞膜静电结合，致使细菌膜表面的阴离子分布不均，细菌膜发生变形、物理性破裂，细菌内蛋白泄露，最终达到抑菌、杀菌的效果；且由于低分子量透明质酸的添加，该复合纳米颗粒无细胞毒性，生物相容性好，对人成纤维细胞的增殖具有一定的促进作用。
32.(3)本发明方法工艺简单高效，反应条件温和，易于对富勒烯进行改性，为富勒烯衍生物在抗菌材料的合成及创面的创伤修复领域的应用提供新的思路。
附图说明
33.图1中的a为c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的结构示意图；b为对比例1中的c
70-pei复合纳米颗粒的tem图，c和d为实施例1中的c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的tem图。
34.图2为不同浓度c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理后金黄色葡萄球菌(a)和大肠杆菌(b)的生长曲线图，其中，control表示对照组，cpl3表示浓度为300μg/ml的复合纳米颗粒实验组，cpl4表示浓度为150μg/ml的复合纳米颗粒实验组，cpl5表示浓度为75μg/ml的复合纳米颗粒实验组，cpl6示浓度为37.5μg/ml的复合纳米颗粒实验组。
35.图3为c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理前后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的sem形貌图，其中a-1为c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理前的大肠杆菌，a-2为c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理后的大肠杆菌，b-1为c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理前的金黄色葡萄球菌，b-2为c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理后的金黄色葡萄球菌。
36.图4为不同浓度c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒处理不同时间后，对人成纤维细胞的细胞毒性影响，其中，control表示对照组，cpl5表示浓度为75μg/ml的复合纳米颗粒实验组，cpl6示浓度为37.5μg/ml的复合纳米颗粒实验组。
具体实施方式
37.下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
38.实施例中采用的低分子量透明质酸购买于华熙生物科技股份有限公司。
39.对比例1
40.(1)称取50mg c
70
富勒烯，将其溶于10ml无水甲苯中，称取500mg聚乙烯亚胺(pei，分子量为600)，溶于10ml去离子水中，然后将c
70
的甲苯溶液和pei的水溶液加入到三颈烧瓶中；向反应装置中通入氮气，70℃油浴，磁力搅拌反应24h后，将反应后的液体倒入旋蒸烧瓶中，75℃旋蒸20min，然后将浓缩后的反应产物溶于去离子水中，过滤除去固体残渣，将滤液放入真空干燥箱中室温下真空干燥浓缩6h后，进一步利用3500d的透析袋透析48h，制备得到富勒烯-聚乙烯亚胺(c
70-pei)溶液，冷冻干燥后制得c
70-pei复合纳米颗粒。
41.实施例1
42.(1)称取50mg c
70
富勒烯，将其溶于10ml无水甲苯中，称取500mg聚乙烯亚胺(pei，分子量为600)，溶于10ml去离子水中，然后将c
70
的甲苯溶液和pei的水溶液加入到三颈烧瓶中；向反应装置中通入氮气，70℃油浴，磁力搅拌反应24h后，将反应后的液体倒入旋蒸烧瓶中，75℃旋蒸20min，然后将浓缩后的反应产物溶于去离子水中，过滤除去固体残渣，将滤液放入真空干燥箱中室温下真空干燥浓缩6h后，进一步利用3500d的透析袋透析，制备得到富勒烯-聚乙烯亚胺(c
70-pei)溶液；
43.(2)取10ml ph为5.35的0.1mol/l枸橼酸钠缓冲液，加入edc和nhs，配制edc/nhs溶液(edc/nhs溶液中，edc的浓度为6mmol/l，nhs的浓度为6mmol/l)，充分溶解后，再加入7.62mg低分子量透明质酸(lmwha，分子量为5-10kda)，在摇床上室温活化6h；
44.(3)将lmwha溶液活化后，按体积比1:1与步骤(1)制得的c
70-pei溶液均匀混合，再将混合后的溶液固定在125rpm摇速的摇床上室温反应6h；最后使用3500d的透析袋透析一次，得到c
70-pei-lmwha溶液，冷冻干燥后得到所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒。
45.本实施例中的c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的结构示意图如图1中a所示。c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒由c
70
、pei、lmwha分子结合而成，其中c
70
分子结构中的—c＝c—与pei分子结构中的—nh—(仲胺)发生加成反应结合，形成碳氮单键连接；pei分子结构中的—nh2与lmwha分子结构中的—cooh发生缩聚反应，形成酰胺键连接。
46.利用透射电镜观察对比例1制得的c
70-pei复合纳米颗粒和c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的形貌，结果分别如图1中的b-d所示，c
70-pei复合纳米颗粒团聚在一起，粒径范围变化较大(10～100nm)，而c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒为球形，直径约为80～100nm，更加均匀，分散性有所改善。
47.实施例2
48.本实施例中透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法与实施例1中的制备方法区别仅在于，使用的富勒烯为c
76
，聚乙烯亚胺的分子量为1800da，富勒烯与聚乙烯亚胺的质量比为1：30。
49.实施例3
50.本实施例中透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法与实施例1中的制备方法区别仅在于，edc/nhs溶液中，edc和nhs的浓度均为7.5mmol/l，活化时间为12h。
51.实施例4
52.本实施例中透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法与实施例1中的制备方法区别仅在于，低分子量透明质酸溶液的浓度为0.95g/l，低分子量透明质酸溶液与富勒烯-聚乙烯亚胺溶液的体积比为1:0.5。
53.实施例5
54.测试实施例1制得的c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的体外抗菌活性：
55.将大肠杆菌atcc25922和金黄色葡萄球菌atcc25923分别复苏培养至对数期，用无菌去离子水将菌液稀释至od
600
为0.1；设置对照组和梯度浓度的c
70-pei-lmwha溶液实验组，分别记为control、cpl3(浓度为300μg/ml)、cpl4(浓度为150μg/ml)、cpl5(浓度为75μg/ml)、cpl6(浓度为37.5μg/ml)；37℃恒温培养箱中培养，测试c
70-pei-lmwha溶液对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用，每隔1小时测量波长为600nm时的od值，并记录分析。
56.实验结果如图2中的a和b所示，可以看出c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌效果。且对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌效果强于大肠杆菌，2h后细菌基本不再增殖。对于大肠杆菌，从6小时后，开始出现明显的抗菌效果。c
70-pei-lmwha纳米颗粒浓度越高，抗菌效果越强。在低浓度时(cpl5、cpl6)仍具有较高的抗菌活性。
57.实施例6
58.测试实施例1制得的c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的体外杀菌效果；将大肠杆菌cmcc(b)44102和金黄色葡萄球菌ccmc(b)26003分别复苏培养至对数期(od
600
为0.5)，然后稀释至od600为0.1；在菌液中分别加入80μl实施例1制备得到的c
70-pei-lmwha溶液并混匀，37℃静置孵育2h，孵育完成后，将溶液室温下4000rpm离心5min，洗涤，再分别加入戊二醛缓冲液，4℃隔夜固定，洗涤后用乙醇梯度脱水，干燥，用扫描电子显微镜进行观察并记录分析。
59.实验结果如图3所示，当不添加c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒时，大肠杆菌(图3中的a-1)与金黄色葡萄球菌(图3中的b-1)都处于正常状态，细胞膜完整光滑无破损。当添加c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒后，可以观察到大肠杆菌细胞膜破损，细菌皱缩变为絮状，无正常杆状形态，且有内溶物流出(图3中的a-2)。对于金黄色葡萄球菌而言，可观察到几乎在每个细菌的球状结构中，都有孔洞，表明细胞膜被破坏，并可以观察到大量内溶物流出(图3中的b-2)。以上结果表明c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒通过破坏金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的细胞膜，从而达到杀菌的效果。
60.实施例7
61.利用cck-8实验测试实施例1制得的c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的对人成纤维细胞体外细胞活性的影响，实验结果如图4所示，c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒具有良好的细胞相容性，且随着c
70-pei-lmwha复合纳米颗粒的浓度下降，该复合纳米颗粒的细胞毒性逐渐减弱。当该纳米颗粒浓度为cpl6(浓度为75μg/ml)和cpl7(浓度为37.5μg/ml)梯度时，与人成纤维细胞共培养1、3、5和7天时，细胞活力几乎均可达到100％，并对成纤维细胞的增殖具有一定的促进作用。
62.以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将富勒烯和聚乙烯亚胺在混合溶剂体系中发生反应，反应结束后得到富勒烯-聚乙烯亚胺溶液；(2)用枸橼酸盐缓冲液配制edc/nhs溶液，将低分子量透明质酸溶解于edc/nhs溶液中并活化，得到低分子量透明质酸溶液；(3)低分子量透明质酸溶液与富勒烯-聚乙烯亚胺溶液反应，产物溶液经透析、冻干后得到透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒；所述的低分子量透明质酸的分子量为5-10kda。2.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的富勒烯为c
60
、c
70
、c
72
、c
76
或c
84
，所述的聚乙烯亚胺的分子量为300-1800da；富勒烯与聚乙烯亚胺的质量比为1:2-50。3.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应温度为70-100℃，反应时间为12-48h。4.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应结束后，将反应后的溶液后处理，得到富勒烯-聚乙烯亚胺溶液；所述的后处理步骤包括：通过旋蒸浓缩反应产物，再将浓缩后的反应产物溶于去离子水中，过滤除去固体杂质，真空干燥浓缩后透析，得到所述的富勒烯-聚乙烯亚胺溶液。5.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，edc/nhs溶液中，edc和nhs的浓度均为2-10mmol/l。6.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，活化时间为4-12h。7.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的低分子量透明质酸溶液的浓度为0.5-1g/l。8.根据权利要求1所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，低分子量透明质酸溶液与富勒烯-聚乙烯亚胺溶液的体积比为1:0.5-2，反应时间为4-12h。9.根据权利要求1-8任一所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒的制备方法制得的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒。10.根据权利要求9所述的透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒在抗菌领域中的应用。

技术总结
本发明公开了一种透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒及其制备方法，属于纳米材料技术领域，方法包括以下步骤：(1)将富勒烯和聚乙烯亚胺在混合溶剂体系中发生反应，反应结束后得到富勒烯-聚乙烯亚胺溶液；(2)将低分子量透明质酸溶解于EDC/NHS溶液中并活化，得到低分子量透明质酸溶液；进一步与富勒烯-聚乙烯亚胺溶液反应，产物溶液经透析、冻干后得到透明质酸修饰的富勒烯-聚乙酰亚胺复合纳米颗粒。本发明利用界面反应，共价连接富勒烯与聚乙酰亚胺，随后通过氨基与羧基的缩合反应，共价修饰低分子量透明质酸，得到分散性好的复合纳米颗粒，解决阳离子态氨基化富勒烯对组织细胞的抑制作用。组织细胞的抑制作用。组织细胞的抑制作用。


技术研发人员：沈傲 王巧虹 侯文佳 胡昊 竺亚斌
受保护的技术使用者：宁波大学
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/9/5