抗茎基腐病蛋白质、生物材料及其培育方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及抗茎基腐病蛋白质、生物材料及其培育方法和应用。


背景技术：

2.小麦是全球广泛种植的粮食作物，也是我国重要的主粮作物。近年来，随着全球气候变暖，极端天气频繁发生，小麦生产受到严重影响。其中，小麦茎基腐病(fusarium crown rot，fcr)是危害我国小麦生产的重要病害之一。小麦茎基腐病主要由禾谷镰刀菌属真菌侵染小麦茎基部引起，是一种典型的土传病害，在小麦各个生育时期都可能感病。病原菌侵染会引起幼苗、根冠、地下茎和茎基部组织腐烂，其表现症状主要为小麦茎基部变褐、变黑甚至腐烂枯死。高水高肥的田间管理方式及秸秆还田耕作措施的推行加剧了小麦茎基腐病的发生，近年来呈现病情逐年加重、发病范围扩大的趋势。小麦茎基腐病也是一种世界性病害，在世界许多小麦主产区都有报道。因此，培育、种植抗茎基腐病小麦品种是减轻病害、确保小麦高产、稳产的重要途径。
3.国内外研究人员进行了大量的小麦种质资源抗病性鉴定，至今未有免疫或高抗小麦品种的报道。遗传分析显示小麦茎基腐病抗性主要由微效多基因控制。同时，环境因素对小麦抗病性的准确评价也有重要影响。这些因素都严重限制了抗病小麦品种的培育。因此，挖掘小麦抗茎基腐病重要基因，进一步利用分子生物学和基因工程手段创制茎基腐病抗性提高的小麦生物材料尤为迫切。相关方法不但能够促进人们对小麦抗病分子机制的理解，对小麦茎基腐病的抗性育种也具有重要的实践意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种抗茎基腐病小麦的培育方法，要解决的技术问题是如何提高小麦对茎基腐病的抗性。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种抗茎基腐病蛋白质，是包括如下任一蛋白质：
6.a1)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；
7.a2)在a1)的n末端或/和c末端连接标签得到的融合蛋白质。
8.所述蛋白质名称为tamb1，上述a1)中的tamb1蛋白质，为与seq id no.2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
9.所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
10.上述a1)中的tamb1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
11.上述a1)中的tamb1蛋白质的编码基因可通过将seq id no.1的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
12.进一步地，本发明还提供了与tamb1蛋白质相关的生物材料，其为下述b1)至b4)中的任一种：
13.b1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
14.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
15.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
16.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物。
17.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
18.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
19.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。
20.进一步地，本发明还提供了编码所述蛋白质的核酸分子，具有如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的dna分子：
21.c1)编码序列(cds)是seq id no.2的dna分子或cdna分子；
22.c2)核苷酸序列是seq id no.1的dna分子或cdna分子；
23.c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码tamb1蛋白质的dna分子或cdna分子；
24.c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码tamb1蛋白质的dna分子或cdna分子。
25.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码tamb1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的tamb1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码tamb1蛋白质且具有tamb1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
26.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
27.同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
28.所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。
29.所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
30.进一步地，本发明提供了一种植物抗病剂，所述植物抗病剂含有上述的蛋白质或上述相关的生物材料或上述核酸分子，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。
31.更进一步地，本发明还提供了上述tamb1蛋白质，或与tamb1蛋白质相关的生物材
料，或编码所述蛋白质的核酸分子的应用，所述应用为下述任一种：
32.d1)在调控植物抗病性或提高植物抗病性中的应用；
33.d2)在制备调控植物抗病性或提高植物抗病性的产品中的应用；
34.d3)在培育抗病植物中的应用；
35.d4)在制备培育抗病植物的产品中的应用；
36.d5)在植物育种中的应用；
37.d1-d3中所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。
38.上述应用中，所述蛋白质来源于小麦。
39.上述应用中，所述植物为单子叶植物；或禾本科植物；或小麦。
40.本文中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质tamb1。
41.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：
42.1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
43.更进一步地，本发明还提供了一种培育抗病植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性或其编码基因的表达量，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性。
44.优选地，提高所述目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性或其编码基因的表达量是通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。
45.本发明中，所述抗茎基腐病植物理解为不仅包含将所述tamb1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗茎基腐病植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
46.实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
47.1、本发明首次将tamb1基因用于小麦茎基腐病抗性的育种，为小麦的茎基腐病抗性育种提供了一个良好的基因资源，为tamb1基因的应用开拓了一个新的领域；
48.2、本发明所得的tamb1过表达的小麦株系的茎基腐病抗性显著提高，转基因受体扬麦16的茎基部褐化严重，而tamb1过表达的转基因株系oe3和oe4的茎基部褐化减轻，病级统计减小，抗病性增强，该发明为小麦抗茎基腐病育种开辟了一条新途径。
附图说明
49.图1为t3代单株分子鉴定的部分结果。其中，m为dna分子量标准，p为载体pwmb110-tamb1，y16为扬麦16，oe3和oe4分别为t3代的部分单株。
50.图2为tamb1基因在t3代转pwmb110-tamb1的扬麦16幼苗茎基部的转录表达水平。
51.图3为转pwmb110-tamb1的扬麦16t3代植株接种茎基腐病30天的病情。
52.图4为转pwmb110-tamb1的扬麦16t3代植株接种茎基腐病级统计。
具体实施方式
53.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
54.实施例一、小麦茎基腐抗性基因tamb1的克隆
55.1、tamb1基因引物设计
56.通过分析病原菌侵染小麦防御反应转录组数据，依据释放的小麦基因组序列设计基因克隆引物，引物序列如下：
57.tamb1-f:acacacagcgccagaggtag，seq id no.3；
58.tamb1-r:actagccgaggagccgatatc，seq id no.4。
59.2、tamb1的克隆
60.以小麦line162的cdna为模板，利用pcr方法克隆tamb1基因，测序确认。
61.实施例二、tamb1转基因小麦的获得
62.1、tamb1植物过表达载体构建
63.植物表达载体pwmb110(generation of marker-free transgenic hexaploid wheat via an agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial chinese wheat varieties.plant biotechnol j15(5):614
–
623)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本技术实验。
64.载体构建采用重组法。用xba i和sal i内切酶线性化载体pwmb110,根据tamb1编码区序列设计引物扩增完整编码区，在引物两端分别引入载体序列，引物序列如下：
65.tamb1-inff：caggtcgactctagaatggggaggtctccttgct，seq id no.5；
66.tamb1-infr：cgatcggggaaattctcaaatctgagacaaactctg，seq id no.6；
67.得到的含有tamb1的重组表达载体pwmb110-tamb1。
68.2、tamb1转基因小麦的获得
69.将重组载体pwmb110-tamb1转化农杆菌eha105，采用农杆菌介导法，阳性农杆菌侵染小麦扬麦16的幼胚，经过组培、筛选、分化得到转基因小麦植株。
70.3、转基因小麦的阳性鉴定
71.利用tamb1特异引物tamb1-transf和转基因载体引物tnos-r检测转基因表达盒，确认阳性植株。引物序列如下：
72.tamb1-transf：catcggaggagtttcagattga，seq id no.7；
73.tnos-r：gataatcatcgcaagaccgg，seq id no.8；
74.结果如图1所示。
75.实施例三、转基因小麦中tamb1的表达量
76.利用引物tamb1-qf:5
’‑
gctcctcggctagtttcttgt-3’，seq id no.9；和引物tamb1-qr:5
’‑
cacccaccaaatgatcagatgcc-3’，seq id no.10；通过实时荧光定量pcr分析t3代tamb1转基因扬麦16植株茎基部tamb1基因的表达水平。内参基因选用taactin(引物taactin-qf：gttccaatctatgagggatacacgc，seq id no.11；taactin-qr：gaacctccactgagaacaacattacc，seq id no.12)。荧光定量实验的mrna取自二叶期的幼苗茎基部。所有样品技术重复两次，去平均值计算。结果如图2所示，转基因株系oe3和oe4植株
tamb1基因的转录水平均显著高于受体扬麦16。
77.实施例四、转基因小麦茎基腐病抗性鉴定
78.1、病原菌扩繁
79.实验所用菌株有江苏农业科学院周淼平研究员提供，具有致病力强的特点。将保存的禾谷丝核菌取出，在pda培养基上活化。室温培养5天后，在培养板边缘挑取生长旺盛的菌块若干，投入到灭菌的麦粒培养基中，摇匀后，室温培养7天。
80.2、病原菌侵染小麦
81.在灭菌培养土中播种小麦，待生长到两叶一心时，取大小均匀、布满菌丝的带菌麦粒，在小麦茎基部接触植株放置。小麦植株在正常条件生长。接菌30天后调查病情。病情划分参照yang等(investigation and genome-wide association study for fusarium crown rot resistance in chinese common wheat.bmc plant biol 19(1):153)的划分标准。转基因株系和受体对照各调查15株，重复3次。图3展示代表性植株的病情图片。病级统计如图4所示。从结果可见，相对于转基因受体小麦，转基因植株的茎基部叶鞘褐化程度减弱，病级减小，可见抗病性增强。
82.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种抗茎基腐病蛋白质，其特征在于，是包括如下任一蛋白质：a1)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；a2)在a1)的n末端或/和c末端连接标签得到的融合蛋白质。2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述b1)至b7)中的任一种：b1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。3.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子，其特征在于，具有如下c1)或c2)或c3)或c4)所示的dna分子：c1)编码序列(cds)是seq id no.2的dna分子或cdna分子；c2)核苷酸序列是seq id no.1的dna分子或cdna分子；c3)与c1)或c2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码tamb1蛋白质的dna分子或cdna分子；c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码tamb1蛋白质的dna分子或cdna分子。4.一种植物抗病剂，其特征在于，所述植物抗病剂含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述相关的生物材料或权利要求3所述核酸分子，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述生物材料或权利要求3所述核酸分子的下述d1-d5中的任一种应用：d1)在调控植物抗病性或提高植物抗病性中的应用；d2)在制备调控植物抗病性或提高植物抗病性的产品中的应用；d3)在培育抗病植物中的应用；d4)在制备培育抗病植物的产品中的应用；d5)在植物育种中的应用；d1-d4中所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述茎基腐病由假禾谷镰孢菌引起。7.一种培育抗病植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性或其编码基因的表达量，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，提高所述目的植物中权利要求1所述蛋白
质的含量和/或活性或其编码基因的表达量是通过将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。

技术总结
本发明公开了抗茎基腐病转TaMB1基因小麦的培育方法及其蛋白、相关生物材料等。本发明所提供的抗茎基腐病转TaMB1基因小麦的培育方法、TaMB1及其编码基因可用于提高植物抗病性，对于培育抗病的植物新品种具有重要意义。对于培育抗病的植物新品种具有重要意义。对于培育抗病的植物新品种具有重要意义。


技术研发人员：魏学宁 李雨嫣 吕玉宝
受保护的技术使用者：中国农业科学院作物科学研究所
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/9/6