生物标志物的检测的制作方法

1.本发明涉及使用光散射，尤其是干涉散射显微镜法或质量光度计法来检测或定量样品中的生物标志物。具体地，本发明涉及诊断与样品中的生物标志物相关的疾病或病症的方法。还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。由于样品可能是复杂的，在存在其他组分的情况下，生物标志物可能作为次要组分存在。因此，生物标志物可能会以低浓度存在。


背景技术：

2.生物标志物的检测或定量已经被广泛用作诊断疾病或病症或者确定个体对某种疾病病症的易感性的工具。生物标志物检测是个性化医疗发展中的一个非常有价值的工具，能够对那些测试出存在或不存在指示性生物标志物或生物标志物组的患者进行有靶向治疗方案。例如，癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病可以通过检测取自体液(诸如血液、csf和尿液)的样品中蛋白或其他生物标志物的异常存在来诊断。这种生物标志物可以是特定蛋白、蛋白亚型、翻译后修饰的存在与否，异常量的蛋白或者蛋白与蛋白/代谢物或蛋白与其他生物分子(例如糖、多糖、核酸)的相对比例的变化。
3.生物标志物包括广谱的细胞、生物化学和/或分子变化，这些变化可以被评估、监测或测量，并且与健康状况、致病过程或对治疗或医学干预的反应相关联。生物标志物通常用于诊断相对晚期的几种疾病，但是它们在治疗或预防措施可能更有效的早期检测中的潜力仍然非常有限，这主要是因为早期疾病生物标志物不丰富并且以非常低的浓度存在。检测低丰度生物标志物的最常见方法包括靶向质谱法或定量质谱法，以及基于适配体的蛋白质组学。
4.随着合适的生物标志物的鉴定的发展，用于检测或定量生物标志物的方法、系统和硬件得到了开发。最常用的方法是基于酶联免疫吸附测定法(elisa)和聚合酶链式反应(pcr)的测试，它们具有高灵敏度，但要么必须针对快速非定量测试进行优化，要么需要30分钟至几个小时才能完成，因此对于在护理点使用来说过于复杂和/或昂贵。
5.已经开发了其他方法(诸如电化学免疫测定法、表面增强拉曼光谱法、流式细胞法或基于荧光的其他技术)来解决elisa的缺点，但是迄今为止没有一种方法达到简单、可负担的仪器与高特异性和灵敏度的理想组合。
6.近年来，干涉散射显微镜法(interferometric scattering microscopy,iscat)，尤其是质量光度计法(mass photometry)已经发展成为用于单分子检测的强大分析技术，为诸如elisa的测定法提供了简单且成本有效的替代方法。iscat提供了关于溶液中不同质量颗粒的相对分布的信息，而无需添加标签。之前已经描述了iscat用于检测经纯化的单一蛋白(cole et al(acs photonics,2017,4(2),pp 211-216and wo2018/011591)，以及用于检测脂蛋白和确定溶液中分子的浓度(wo2019/110977)。质量光度计法尤其已经记载于young et al,science,apr 2018:vol.360,issue 6387,423-427)和li et al,nucleic acids research,august 2020,https://doi.org/10.1093/nar/gkaa632。
7.干涉散射质谱法(interferometric scattering mass spectrometry,iscams)，
在本文中称为质量光度计法(mass photometry,mp)，是用于检测和测量溶液中单种目标及其形成的复合物的质量的方法。随着单种分子非特异性或特异性结合到表面，mp通过光散射来检测该单种分子。每个结合事件引起表面/溶液界面处折射率的变化，这有效地改变了局部光散射，并且可以通过利用散射光和反射光之间的优化干涉来以高精度检测。通过用已知质量的分子进行校准，信号变化的幅度可以转化为分子量，对于多肽，质量精度约为2％且质量分辨率高达20kda。因此，散射信号与分子质量成正比，使得用光称量单种分子成为可能。然而，这种技术不能简单地应用于其中一种分子可能一低丰度存在的复杂溶液。因此，尽管事实上该低丰度的分子可以非特异性地结合到表面并允许质量的检测，但是可能存在太多的混杂成分而不能准确确定质量，从而确定识别该分子。这使得所述分子的识别变得复杂，并且浓度的确定变得困难。因此，该技术在样品中低丰度生物标志物的应用受到了限制。
8.质量光度计法的独特之处在于它精确测量溶液中单种分子在自然状态下的质量而无需标签的能力。
9.光散射长期以来用于生物化学分析，诸如利用与穿过样品的入射光成一定角度的光强度来测量溶液中的光散射物质，称为“浊度法”。存在依赖于光散射原理的其他更精细的方法，诸如动态光散射(dls)(测量颗粒的大小和大小分布)、电泳光散射(els)(测量电泳迁移率和ζ电势)和小角激光光散射(lalls)(能够测量样品中聚合物的分子量分布)。然而，所有这些都不同于本发明中使用的光散射方法和设备，因为所使用的技术能够直接测量表面处的单分子(目标)的质量。值得注意的是，依赖于光散射原理的技术，诸如表面等离子体共振完全取决于多个颗粒的结合以在测定中引起折射率的整体变化，这不能提供确定复杂溶液中生物标志物的存在、浓度和单个质量所需的细节水平。
10.用于疾病进展、疾病消退或潜在候选药物的快速临床筛选的生物标志物的检测中仍然缺乏灵敏性和特异性。举例来说，最常见的生物标志物之一是c-反应蛋白(crp)，但是该生物标志物是非特异性的，并且可以指示各种不同的病症和疾病。对常规可获得的更特定生物标志物的分析进行改进将是常规诊断中的转折点。此外，神经系统疾病和癌症的生物标志物通常存在于疾病早期阶段的体液中，但是它们的浓度可能太低而不能被护理点可用的常规技术准确检测到。为了适合护理点环境，进一步需要在保持准确性的同时，降低获得化验结果所需的成本、时间和技能。
11.因此，仍然需要一种特定且灵敏的方法，该方法能够定量检测包括碎片或大聚集体(例如生物样品)的肮脏环境中非常低丰度的生物标志物，并且该方法还适用于护理点环境。


技术实现要素：

12.本发明人已经令人惊讶地确定了一种方法，该方法能够使用光散射来特异性检测生物标志物，尤其在样品中以低丰度存在的那些生物标志物，如本文所限定。本发明人已经表明，能够检测复杂样品中的低丰度生物标志物，而无需冗长的纯化程序。本发明人开发的方法尤其适用于检测生物样品中的生物标志物，例如用于疾病或病症的诊断。它还尤其适用于监测工业和农业样品中的生物标志物，诸如监测例如食品生产系统中的病原体或污水中的病毒疾病的爆发。
13.鉴于干涉光散射显微镜法和实际上的质量光度计法能够简单地通过分子与表面的非特异性结合来确定溶液中该分子的质量和浓度，发明人已经开发了一种反直觉的方法，该方法依赖于通过生物标志物利用捕获剂与表面的特异性结合。然而，本发明人没有测量这种结合(其对于这种确定是常规)，而是确定这种测量没有产生足够准确或定量的结果，尤其是如果样品中存在其他组分且因此低丰度物质将仅代表大量非特异性结合事件背景中非常少的结合事件。因此，他们意识到，通过有效地确定目标在部分或全部释放(作为颗粒)之前和之后在表面处的质量，能够间接测量颗粒的质量—独立于样品中丰富得多的物质的非特异性结合。鉴于准确的检测方法，本发明可用于在生物标志物从捕获剂释放的情况，或者捕获剂或其一部分确实与捕获剂一起释放的情况。这使得在选择捕获剂和实际释放剂时具有灵活性。
14.由于生物标志物可能以低丰度存在，并且还存在样品的其他组分，因此目前不可能经由结合进行常规浓度检测。这是因为其他组分会非特异性地结合到表面上并提供混杂数据。对此的完美解决方案是特异性捕获生物标志物，经由洗涤去除混杂组分，然后通过监测表面光散射的变化或差异来检测生物标志物的释放。该差异可以被赋予质量，然后可以赋予生物标志物的识别。
15.因此，在第一方面，提供了检测样品中生物标志物的方法，所述方法包括：使表面与样品接触，其中所述表面包含固定于其上的针对生物标志物的捕获剂；从该表面释放所有被捕获的生物标志物；以及通过光散射检测所述生物标志物的释放。
16.在干涉光散射显微镜或质量光度计中检测光散射。
17.合适地，提供了用于检测样品中生物标志物的方法，其中该方法包括：
18.i)提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合所述样品中存在的生物标志物；
19.ii)在允许所述样品中的生物标志物与所述捕获剂结合的条件下，使所述表面与所述样品接触；
20.iii)界定所述表面的第一检测区域；
21.iv)释放与所述表面结合的颗粒，其中所述颗粒选自：
22.i.从与所述生物标志物结合的所述捕获剂释放的生物标志物；
23.ii.包含与所述捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或
24.iii.未结合的捕获剂；
25.v)通过光散射检测从所述表面的第一检测区域释放的颗粒。
26.通过检测表面处光散射的变化来检测颗粒。因此，释放事件可能需要至少两个测量事件；在释放事件之前和之后各测量一次表面。
27.释放事件之前和之后的测量使得能够检测负质量事件。利用本发明的方法，通过记录表面处的变化，能够确定释放的颗粒的质量。这允许直接确定特定生物标志物是否存在。
28.合适地，提供了用于检测样品中生物标志物的方法，其中所述方法包括：
29.i)提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合所述样品中存在的生物标志物；
30.ii)在允许所述样品中的生物标志物与所述捕获剂结合的条件下，使所述表面与
所述样品接触；
31.iii)界定所述表面的第一检测区域，并利用光散射对所述表面进行测量；
32.iv)释放与所述表面结合的颗粒，其中所述颗粒选自：
33.i.从与其结合的所述捕获剂释放的生物标志物；
34.ii.包含与所述捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或
35.iii.未结合的捕获剂；
36.vi)通过确定光散射中的变化检测从所述表面的第一检测区域释放的颗粒。
37.表面的测量可以是表面处对目标的测量。所述表面优选为单一表面。所述表面可以是任何合适的构造，因为该表面的性质与所进行的测量无关。在示例中，所述表面是平坦的玻璃盖玻片。
38.光散射方法可以是干涉散射显微镜法。光散射方法可以是质量光度计法。
39.第一检测区域可以是可观察的表面，或者是释放剂所接触的区域。
40.实际上，本发明从根本上改变了干涉光散射(iscat)的使用方式，实现了测量方式的完全逆转。iscat及类似技术通常应用于基本上纯的或具有极少“杂质”(诸如不感兴趣的其他分子)的样品。为了检测样品中的“稀有”物质，已经尝试了各种技术，诸如阻断表面以防止其他物质结合。即使表面钝化，也可能发生非特异性结合。在此描述的新方法允许检测复杂样品中的稀有物质，因为并不检测非特异性结合事件，这些物种可以被洗掉，然后该方法完全集中于稀有物质特异性的解结合事件。
41.颗粒(包括单一生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂)从表面的释放可以被称为释放事件。合适地，从表面释放颗粒的步骤可以以允许通过光散射检测单个释放事件的速率进行。光散射显微镜法能够确定从表面释放到溶液中的颗粒的质量，通过知晓它们的质量可以确定它们的身份。实际上，在表面处检测质量损失。使用光散射显微镜法来检测从表面释放到溶液中的生物标志物使得能够以高度灵敏的方式特异性检测低丰度生物标志物。该方法具有避免需要对生物标志物或生物标志物/捕获剂复合物进行标签化的优点。此外，该方法允许捕获生物标志物群体的质量异质性，这是任何其他技术都无法获得的信息。
42.优选地，在光散射显微镜法中，任选地在质量光度计法中，表面可以被描述为几乎持续地被询问或检查，诸如经由接近连续的重复率。这通常使用本文描述的表面的受控照明来进行。光散射装置通过表面处的光散射来检测单种分子。因此，本发明可以监测表面并检测表面处的目标(其可以是单独的捕获剂、与生物标志物结合的捕获剂，或者甚至是来自样品的额外组分)。释放事件可以由释放剂的添加引起。每个释放事件引起局部光散射(例如目标的)的变化，从而利用散射光和反射光之间的优化干涉，能够高精度地检测到这种变化。信号的任何变化的幅度都可以转换成分子质量。
43.因此，释放的颗粒的质量被检测到。这种检测是间接的。
44.优选地，因为在释放事件之前和之后进行测量，所以能够检测某个位置的变化或某个位置的目标。简而言之，这意味着要进行两次测量来检测释放事件。因此，释放事件可作为负质量事件被检测到：检测到质量的离去。因此，该测量允许检测表面处的目标，然后随后该颗粒从该目标的释放。通过计算释放事件前后的质量差，能够确定被释放颗粒的身份。图5是检测到的“负质量”的示例。因此，该方法可包括监测一个或更多个特定目标的变
化。因此，该方法可以包括监测一个或更多个特定位置的变化。该变化可以是指示颗粒释放的光散射的变化。
45.可以对进行释放事件的速率进行控制，从而能够在负质量事件发生时对其进行监测。
46.信号的任何变化的幅度都被转换成该变化的分子质量。
47.使用本发明的方法可以检测生物标志物的任何修饰，例如糖基化、核酸的附接，或者泛素化。“翻译后”或其他修饰的检测可能是归因于与经修饰的生物标志物相关的特定分子量。
48.第一方面方法的方法可以用于确定样品中生物标志物的浓度。因此，该方法可包括：测量从捕获剂释放的生物标志物的量和/或从生物标志物/捕获剂复合物被固定的表面释放的生物标志物/捕获剂复合物的量。该方法可用于通过与校准曲线比较来确定浓度。为了构建校准图，制备一系列含有已知浓度参考标准的校准溶液。可以使用包括已知数量的释放事件的对照来构建校准曲线。校准曲线可用于获得生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂的量或浓度的测量。
49.也可以使用内部标准。作为分析方法的常规，内部标准是以恒定量添加到表面的化学物质，用于进行校准和/或生物标志物检测测定中的一者或两者。然后，通过绘制生物标志物信号与内标信号的比率随生物标志物浓度的变化，内部标准可用于校准。
50.然后，可使释放事件中检测到的对比度(contrast)与第二质量校准曲线相关联，以识别它们的质量。为了构建质量校准图，制备一系列含有已知质量颗粒的校准溶液。在使用质量光度计法的情况下，可以通过质量来识别颗粒，并且可以使用校准曲线来获得单一生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂的定量。测量从表面释放的未结合的捕获剂的量可用于定量样品中存在的生物标志物所占据的捕获剂的比例，并提供定量结果。
51.从表面释放生物标志物和/或生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂的步骤可以包括破坏生物标志物和捕获剂之间的结合，和/或破坏捕获剂和捕获剂固定于其上的表面之间的结合。合适地，该破坏足以使生物标志物与捕获剂和/或使捕获剂与表面完全分离。如本文所述，可以使用用于介导生物标志物和/或捕获剂释放的任何合适的手段或方法。合适的方法包括改变表面的化学环境、捕获剂的酶消化和/或光解或水解。释放生物标志物的合适方法包括引入竞争性配体，该竞争性配体对促进释放事件的捕获剂具有更高的结合亲和力。
52.该方法可以进一步包括将释放的生物标志物/捕获剂复合物的质量与生物标志物的预期质量进行比较。这种方法对于检测异质生物标志物群体中的生物标志物可能是有用的。
53.第一方面的方法可以进一步包括对表面的第二检测区域或额外的检测区域重复步骤iv)和步骤v)。对于第二检测区域或额外的检测区域，步骤iv)和步骤v)的重复可以在与在表面的第一检测区域或任何先前检测区域上进行的步骤iv)和步骤v)相同或不同的观察事件中进行。合适地，在任何具体观察事件中，生物标志物和/或生物标志物/捕获剂复合物的释放可以被限制到感兴趣的检测区域。
54.在步骤i)之前，本发明的方法可以进一步包括：在表面上捕获样品中存在的生物
标志物。这种捕获可以是特异性的，从而用于富集表面上的生物标志物。因此，本发明的方法可以包括：
55.i)提供表面；
56.ii)提供待分析生物标志物的存在和/或量的样品；
57.iii)将特异性结合待检测生物标志物的捕获剂固定在表面上；
58.iv)将iii)的表面与样品在合适的条件下孵育合适的时间，以允许样品中存在的生物标志物与固定在表面上的捕获剂结合。
59.任选地，在步骤(iv)之后，可以洗涤表面以除去未结合的实体，并除去已经非特异性结合到表面或捕获剂的实体。对洗涤条件进行选择，使得捕获剂和生物标志物之间的相互作用不受影响。合适的条件包括加入温和的洗涤剂或低浓度的盐溶液。或者，在添加用于检测步骤的合适溶液之前，可以包括干燥步骤。该干燥步骤可包括在表面上使用诸如氮气的气流。这种洗涤和任选的干燥步骤可以称为步骤(v)。
60.这种步骤(i)至(v)可以在任何光散射设备之外进行。
61.这种步骤(i)至(v)可以在照射表面之前进行。
62.一旦表面已经与样品接触并且进行了诸如(i)至(v)的适当的制备步骤，表面可以(vi)与缓冲液接触以确保表面在溶液中。
63.步骤(i)至(vi)中的任何一个可以在任何检测步骤之前以任何合适的顺序进行。
64.本发明的方法可以进一步包括进行表面的光散射的基线测量。这一步骤可以在上述步骤i)至步骤iv)中的任何一个或更多个之后进行。基线测量可以作为对照测量。基线测量可以通过其光散射提供关于固定在表面上的任何目标的信息。基线测量可用于确定表面的光散射，以允许任何校准。此外，基线测量可以提供随机释放事件的测量，从而提供基线，在该基线之上，预计的释放事件是特异性的并且值得检测。
65.本发明的方法可涉及多重测量步骤，一旦表面出现在光散射设备中，即已经进行了上述所有必要的准备步骤，就可以开始测量步骤。因此，测量可以在上述步骤(iii)之后的任何点开始。这些多重测量可以是离散的(例如以时间间隔)，或者测量可以有效地是连续的(以恒定速率进行测量，以便产生膜-见下文)。多重测量可以允许确定表面上目标的质量，并因此检测从所述目标释放的任何颗粒。因此，这允许检测释放事件。因此，释放事件的检测可以描述为在释放事件之前和之后检测目标的质量，并计算该目标的质量差。因此，监测一个或多个特定目标的质量变化。因此检测目标的信号幅度的变化。
66.本发明的方法可进一步包括使用具有已知数量的释放事件的对照分子生成校准曲线。
67.本发明第一方面的方法可用于检测或定量样品中的生物标志物。
68.第一方面的方法可用于检测生物分子的修饰，例如蛋白的翻译后修饰或核酸的甲基化状态。经修饰的生物分子可以是生物标志物。
69.第一方面的方法可用于检测样品中两种或更多种生物分子之间的相互作用。生物分子之间的复合物可以是生物标志物。
70.第一方面的方法可用于比较样品中两种或更多种生物标志物的量。
71.还提供了检测样品(例如细胞培养物或食物制备样品)中污染的方法，包括第一方面的方法，其中生物标志物的存在指示样品的污染。
72.还提供了定量产物表达水平的方法，其中该方法包括第一方面的方法，并且其中该生物标志物指示表达产物的存在或不存在。
73.还提供了检测或定量样品中生物分子之间相互作用的方法，包括第一方面的方法，其中生物标志物的存在或量指示相互作用的存在或不存在或量。这种方法对于检测影响生物标志物的存在或活性的化合物的存在或量可能是有用的。
74.在第二方面，本发明提供了在受试者中诊断与生物标志物的存在、不存在或量相关的疾病或病症的方法，其中所述方法包括使包含其上固定有生物标志物的捕获剂的表面与样品接触，从表面释放任何捕获的生物标志物，并通过光散射检测生物标志物的释放。该量可以是与另一种生物标志物相比的相对量。
75.合适地，在受试者中诊断与生物标志物的存在或量相关的疾病或病症的方法包括：
76.i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；
77.ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；
78.iii)界定表面的第一检测区域；
79.iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：
80.i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；
81.ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或
82.iii.未结合的捕获剂；
83.v)通过光散射检测从表面的第一检测区域释放的颗粒，
84.其中i)或ii)的存在与否指示受试者中疾病或病症的存在、严重性或发展可能性。
85.通过检测表面光散射的变化来检测颗粒。因此，释放事件可能需要至少两次测量事件；在释放事件之前和之后各测量一次表面。
86.合适地，在受试者中诊断与生物标志物的存在或量相关的疾病或病症的方法包括：
87.i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；
88.ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；
89.iii)界定表面的第一检测区域，并使用光散射对表面进行测量；
90.iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：
91.i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；
92.ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或
93.iii.未结合的捕获剂；
94.vi)通过确定光散射的变化来检测从表面的第一检测区域释放的颗粒，
95.其中i)或ii)的存在与否指示受试者中疾病或病症的存在、严重性或发展可能性。
96.表面的测量可以是表面处目标的测量。该表面优选为单一表面。该表面可以是任何合适的构造，因为该表面的性质与所进行的测量无关。在示例中，表面是平坦的玻璃盖玻片。
97.合适地，确定与样品中生物标志物的存在或量相关的污染物的存在/不存在的方
法包括：
98.i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；
99.ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；
100.iii)界定表面的第一检测区域；
101.iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：
102.i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；
103.ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或
104.iii.未结合的捕获剂；
105.v)通过光散射检测从表面的第一检测区域释放的颗粒；
106.其中i)或ii)的存在与否指示污染的存在、严重性或性质。
107.通过检测表面光散射的变化来检测颗粒。因此，释放事件可能需要至少两次测量事件；在释放事件之前和之后各测量一次表面。
108.合适地，确定与样品中生物标志物的存在或量相关的污染物的存在/不存在的方法包括：
109.i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；
110.ii)在允许样品中的生物标志物与捕获剂结合的条件下，使表面与样品接触；
111.iii)界定表面的第一检测区域，并使用光散射对表面进行测量；
112.iv)释放结合到所述表面的颗粒，其中所述颗粒选自：
113.i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；
114.ii.包含与捕获剂结合的生物标志物的复合物；和/或
115.iii.未结合的捕获剂；
116.v)通过确定光散射中的变化检测从表面的第一检测区域释放的颗粒；
117.其中i)或ii)的存在与否指示污染物的存在、严重性或性质。
118.表面的测量可以是表面处目标的测量。该表面优选为单一表面。该表面可以是任何合适的构造，因为该表面的性质与所进行的测量无关。在示例中，表面是平坦的玻璃盖玻片。
119.这些方法中的任一种或任何一种中的光散射方法可以是干涉散射显微镜法或质量光度计法。
120.在表面与样品接触后，可包括洗涤表面的任选步骤。本文描述了合适的洗涤条件。
121.在检测步骤之前，在表面与溶液接触之前，可包括对表面进行干燥的任选步骤。
122.本发明的方法可以进一步包括对表面的光散射进行基线测量。这一步骤可以在上述步骤(ii)之后进行。基线测量可以作为对照测量。基线测量可以通过其光散射提供关于固定在表面上的任何目标的信息。此外，基线测量可提供随机释放事件的测量，提供基线，在该基线之上，释放事件被预期是特异性的并且值得的检测。
123.如本文所使用的，目标可以是表面上的任何目标，诸如没有或没有相关生物标志性的捕获剂，甚至是来自样品的其他组分。
124.本发明的方法可以包括任何合适的内部标准或对照。内部对照可用于测定相对浓
度。本发明的方法可以包括任何合适的内部校准物。
125.该方法可用于确定样品中生物标志物的浓度。因此，该方法可以包括测量从捕获剂释放的生物标志物的量和/或从生物标志物/捕获剂复合物被固定的表面释放的生物标志物/捕获剂复合物的量。生物标志物的量可以用作疾病或病症的进展或严重性的指示。
126.生物标志物从捕获剂的释放和/或生物标志物/捕获剂复合物或未结合的捕获剂从表面的释放可以如本文所述，并且与第一方面相关。
127.如本文所述，第二方面的方法可以包括一个或多个额外的步骤，特别是与第一方面相关。
128.第二方面的方法可用于确定受试者将发展所述疾病或病症的风险。
129.第二方面的方法可适用于选择将对其施用物质或组合物的受试者，或者将对其开具治疗或给药方案的受试者，其中所述物质或组合物或方案适用于治疗或预防与来自受试者的样品中生物标志物的存在或量相关的疾病或病症。如果所述样品中生物标志物的存在或不存在或量指示所述疾病或病症发展的存在或可能性，则可以选择受试者施用所述物质或组合物，或进行所述治疗或给药方案。
130.第二方面还提供了在受试者中治疗或预防根据第二方面被诊断患有所述疾病或病症或有可能发展所述疾病或病症的受试者中的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用物质或组合物，或对其实施方案，从而有效治疗或预防受试者中的所述疾病或病症。
131.还提供了用于在受试者中治疗或预防根据第二方面被诊断患有的疾病或病症或有可能发展所述疾病或病症的受试者中的疾病或病症的方法中的物质或组合物。
132.还提供了物质或组合物在制备用于治疗或预防与生物标志物的存在、不存在或量相关的疾病或病症的药物中的用途，其中受试者根据第二方面的方法已被诊断患有疾病或病症或具有发展所述疾病或病症的可能性。
133.在第三方面，提供了一种试剂盒，其中该试剂盒包括适于实施本发明第一方面或第二方面的方法的工具。试剂盒可以包括选自以下的一项或更多项：合适的表面、捕获剂、缓冲液、校准图、根据本发明的方法使用的说明、样品收集装置、介导本文所述生物标志物或捕获剂释放的试剂、以及用于校准的一种或更多种标准生物标志物样品。
附图说明
134.以下，参考附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
135.图1是本发明方法的示意图；
136.图2示出了实施例1中所描述进行的本发明方法的结果。第一个图示出了对照测量值(通过质量识别的被释放的颗粒数目)，第二个图示出了在添加盐酸以降低tbs缓冲液的ph后从涂覆的盖玻片释放的her2的量，被释放的颗粒的质量；
137.图3示出了用于iscat并适用于本发明的设备的可能布置；
138.图4是本发明方法的示意图，这在实施例2中示例性方法；以及
139.图5示出了实施例2中的实验结果。这是示出了从表面释放的颗粒的质量的图(随着质量被释放时，显示出负数)。
具体实施方式
140.本发明人已经确定了使用单颗粒光散射，优选单颗粒干涉散射显微镜法或质量光度计法来检测样品中的生物标志物的方法。具体地，本发明人惊奇地发现，有可能利用光散射显微镜法来检测复杂样品中的低丰度生物标志物。典型地，在本领域中，即使在低丰度下，生物标志物的检测也是通过检测与支持物或者与结合对象(诸如抗体或受体蛋白)的结合事件来进行的。本发明基于本发明人采用的新方法，该方法首次提供了适用于检测复杂样品中低丰度生物标志物的高度特异和灵敏的测定。不是检测结合事件，本发明人已经发现，通过从生物标志物结合的表面释放生物标志物，并使用光散射显微镜检测该释放，可以以特定和灵敏的方式检测低丰度生物标志物。因此，本发明基于检测颗粒从表面解结合或释放的新方法。
141.这种方法可以用于检测样品中的任何生物标志物，并且具有许多应用，例如用在医学诊断、工业过程和质量控制的方法中。合适地，本发明的方法如本发明的第一和第二方面所述。还提供了如本发明第三方面所述的试剂盒。
142.出于本技术的目的，以下术语具有如下提供的含义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。
143.样品
144.样本可以是任何生物、工业或环境样品。样品可以是简单或复杂的溶液。生物样品包括取自或获得自人体或动物体或个体的样品，例如血液、血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、汗液、羊水、脑脊液、母乳、眼泪、分泌物、滑液、精液、胆汁或粘液、肺液样品；和粪便样品。体液可以是毛细血管血液、静脉血液或动脉血液或来自它们的血浆或血清。合适地，血液样品，诸如来自手指点刺的血液样品，可以用于本发明的方法中。在某些实施方式中，可以使用唾液样本，例如唾液的口腔拭子。体液是复杂溶液的示例，其中存在许多溶质，包括电解质、糖和尿素。生物样品可以是临床样品。生物样品可以是从人体或动物体或个体获得的组织样品。生物样品可以是细胞培养样品，例如细菌或病毒培养物，包括噬菌体培养物。生物样品可以来自体外源的。可以在分析前使用标准技术，诸如组织匀浆和细胞裂解来制备样品。
145.如果样品是环境样品，它可以取自任何来源，诸如水(例如井、溪流、河流、湖泊、雨水、海水等)，或废弃物(诸如污水、农业废水等)。
146.工业样品可取自食品和饮品(例如饮料)、农业样品或来自工厂和制造过程的液体样品。工业样品还可包括来自生物反应器和实验室的样品，以检查细胞制剂等的生物污染。
147.不同类型的样品可以通过本发明的方法或装置同时、依次或分别处理。在某些实施方式中，一次只可使用一种类型的样品。在替代实施方式中，两种或更多种样品可以被整合或组合，并用于同一方法中。
148.样品可能需要常规预处理，诸如细胞裂解、去除细胞碎片或其他诊断技术中常见的任何其他预处理。因此，本发明的方法可以包括制备供使用的样品。样品也可能需要稀释，例如稀释在合适的缓冲液中。典型地，合适的缓冲液具有生理ph和盐浓度。
149.本发明的方法可以包括使用任何合适的方法从受试者或从工业或环境源中获得样品的步骤。合适的方法是本领域已知的，可以包括唾液、痰或尿液的收集、拭子测试、手指点刺测试、用针进行的动脉或静脉血取样、腰椎穿刺、肺抽吸、活组织检查、羊膜穿刺术、穿
刺术或血凝测试。
150.本发明的方法可以包括从细胞培养物或从工业工艺或从环境中获得样品的步骤。本发明的方法可以包括获得污水样品的步骤。
151.通过光散射检测生物标志物所需的样品体积是极小的，并且可以小到微升，这取决于样品类型和收集方式。
152.样品可以被收集或提供在任何合适的样品室中。合适的室可以是样本容器、小瓶、瓶、安瓿、试管、eppendorf管、微量离心管、毛细管或袋。本发明的方法可以包括样品的储存。本发明的方法可包括将样品或其一部分转移到表面上，在该表面上进行本发明的方法。
153.受试者
154.术语“受试者”可以与术语“个体”和“患者”互换使用，是指动物受试者，合适的是脊椎动物受试者，甚至更合适的是哺乳动物受试者。合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类、啮齿类(例如小鼠、大鼠、豚鼠)、兔形目动物(例如兔(rabbits)、野兔)、牛科动物(例如牛)、绵羊科动物(例如绵羊)、山羊科动物(例如山羊)、猪科动物(例如猪)、马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、鸟类(例如鸡；火鸡；鸭；鹅；伴侣鸟，诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等)、海洋哺乳动物(例如海豚、鲸鱼)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)，还有鱼。优选的受试者是灵长类动物(例如，人、猿、猴、黑猩猩)。
155.受试者可以是患有疾病或病症的一种或更多种症状的个体。受试者可以是被归类为需要测试疾病或病症易感性或发展为特定疾病或病症的可能性的个体。
156.生物标志物
157.如本文所用，术语“生物标志物”是指来自待检测或定量的样品的任何生物特征。生物标志物实际上可以是可存在于待分析的样品中的任何生物化合物，诸如蛋白及其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质、核酸、有机或无机化学物质、天然聚合物和小分子。生物标志物可以是多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸或核糖核酸，诸如致病基因组或其片段。生物标志物可以是上述两种或更多种的组合或缀合物。根据本发明用于检测的合适生物标志物能够例如通过捕获剂结合或固定在表面上。
158.生物标志物对于测量一种或更多种生物过程、致病过程、疾病、病症或对治疗干预的响应的起始、进展、严重性、病理学、攻击性、等级、活性、致残性、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在特征能够使有用的或潜在有用的。本文所指的诊断包括进行这种测量。
159.根据其可能的应用，生物标志物可以被分类为不同的组，其中包括：诊断生物标志物，监测生物标志物，药效/响应生物标志物，预测性、预后性、安全性和易感性/风险生物标志物，以及质量控制标志物(califf,r.m.biomarker definitions and their applications.exp.biol.med.243,213
–
221(2018))。
160.如本文所用，术语“核酸”指由天然存在的碱基、糖和糖间键组成的核苷酸的聚合物或寡聚体或核苷单体。术语“核酸”还包括含有非天然存在的单体或其部分但功能类似的聚合物或寡聚体。核酸可以是dna、rna或嵌合体，即包含脱氧核苷酸和核糖核苷酸。生物标志物可以是核酸的经修饰的形式，例如其甲基化形式。
161.碳水化合物可以包括单糖、二糖、寡糖和多糖及它们的经修饰的形式，例如存在特定的乙酰基、酰基或芳基。
162.本文所用的蛋白可包括肽、多肽、翻译后修饰的蛋白(例如通过泛素化、脂质化、磷
酸化、烷基化或糖基化)。本发明的方法可用于确定生物标志物是否是翻译后修饰的。
163.生物标志物还包括脂肪，其包括脂类、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂、甘油脂类(glycerolipids)、甘油磷脂、鞘脂和糖脂类。
164.还包括小分子，包括但不限于药物及其代谢物、激素、神经递质、代谢物和维生素。
165.可以作为生物标志物的其他生物分子包括糖肽、糖蛋白、糖脂、蜡、甾醇、脂溶性维生素和脂蛋白。
166.还包括分子簇、组装体(assembies)、聚集体、蛋白/蛋白相互作用、蛋白/小分子相互作用、蛋白-核酸相互作用、蛋白-糖相互作用；和/或低聚组装体。
167.任何上述实体的衍生物或代谢物也可以被认为是生物标志物。
168.生物标志物的示例包括但不限于：
169.癌—afp(肝癌)、bcr-abl(慢性髓性白血病)、brca1/brca2(乳腺癌/卵巢癌)、braf v600e(黑色素瘤/结直肠癌)、ca-125(卵巢癌)、ca19.9(胰腺癌)、cea(结直肠癌)、egfr(非小细胞肺癌)、her-2(乳腺癌)、kit(胃肠癌)、psa(前列腺特异性抗原)、s100(黑色素瘤)。
170.心血管疾病—bnp和nt-probnp用于心力衰竭和/或心力衰竭恶化的诊断；肌钙蛋白用于疑似急性冠状动脉综合征患者的诊断和危险分层；crp用于评估心血管疾病、心脏病发作和中风的风险；mpo的循环水平用于预测冠心病风险(huang,et al dis.markers 2017,2
–
4(2017)；truemper,et al biomarkers cardiovasc.dis.27,1
–
20(2015))。
171.自身免疫性疾病—在该领域中已知并可用有广泛的生物标志物，并在综述在例如norouzinia,et al gastroenterol.hepatol.from bed to bench 10,155
–
167(2017)；jin,f.et al.front.immunol.9,1
–
9(2018)；shi,g.,et al j.immunol.res.2017,1
–
2(2017)；prince,h.e.et al biomarkers 10suppl 1,44
–
49(2005)中。
172.细菌感染—crp、白细胞(wbc)计数、多形核白细胞(pmn)计数和pct。
173.通过测量cd64和cd169，可以将病毒感染(例如早期阶段的爱泼斯坦-巴尔二氏病毒或急性hiv感染)与细菌感染区分开来。
174.肝损伤—丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶的血清水平。
175.合适地，生物标志物和/或生物标志物/结合剂复合物不被标签化来用于根据本发明的检测目的。因此，没有必要为捕获剂或生物标志物包括任何形式的标签。因此，本发明的方法可以被描述为无标签的。
176.生物标志物可以以低浓度或非常低的浓度存在于样品中。样品可以是高浓度和低浓度生物标志物的复杂混合物，其中低浓度生物标志物的浓度水平可以从微克每毫升水平变化到皮克每毫升范围内的浓度；低至毫微微克每毫升水平..
177.本文中，生物标志物还可以包括两种或更多种预限定的生物标志物的集合。该集合可以包括2、3、4、5、10或20种或更多种生物标志物。这组预限定的生物标志物可以与例如相同的疾病/病症相关，并且同样被描述为一组，使得使用单次测试进行完整的诊断或预后是可能的。在任何多重集合中，对不同的捕获剂使用不同的释放机制是可行的。
178.表面
179.用于本发明的表面可以是任何合适的表面，其可以被功能化以富集样品中的生物标志物，并且与所选择的检测方法相容。合适的表面能够结合或固定捕获剂。
180.表面可以包括一个或更多个检测区域。检测区域可以是任何合适的尺寸和形状。合适地，检测区域是可以同时或在单个观察事件中通过光散射显微镜分析的区域。检测区域的大小和形状可以由光散射过程中被照射区域的大小和形状决定，因此也由所用显微镜的类型决定。表面可以包括一个以上的检测区域。当在表面上提供一个以上的检测区域时，它们可以是相邻的，或者可以重叠。在提供多于一个检测区域的情况下，它们可以彼此隔开。表面可以包括1、2、3、4、5、10、20、50、70、100、500或1000个或更多个检测区域。
181.优选地，该表面是平坦的或基本平坦的。该表面可以是弯曲的或包括一些曲率，例如基本平坦的表面上的凹陷或凸起结构。该表面优选不是纳米颗粒的表面，因为小的球形目标本身会引起光散射，并阻碍释放事件质量的精确测定。纳米颗粒或超细颗粒通常被定义为直径在1至100纳米之间，任选地直径在1至60纳米之间，任选地直径小于50纳米的物质颗粒。因此，根据本发明，直径为60μm或更小，任选50μm或更小，任选40μm或更小的小球形颗粒任选不用作表面。基本平坦的表面可能是优选的。
182.可以预先界定检测区域。或者，可以在进行该方法期间界定检测区域。例如，检测区域可以由释放剂在表面上的流动来限定，使得检测区域完全或部分地由释放剂接触的区域来界定。检测区域可以由释放剂的浓度来限定。检测区域可以由光解照射的照射区域来界定。如果选择了替代的释放机制，释放和观察区域之间的相互作用将决定检测区域。
183.合适地，表面是固体(即不是凝胶或液体)。合适地，表面的检测区域允许紫外光(其在本文中可被定义为具有10nm至380nm范围内的波长)；可见光(其在本文中可被定义为具有380nm至740nm范围内的波长)；和/或红外光(其在本文中可被定义为具有740nm到300μm范围内的波长)透射。合适地，检测区域允许可见光光谱中的光透射。合适的是，检测区域基本上是透明的。
184.表面的检测区域可以是光滑的或有纹理的。有纹理的表面，例如网或针织或机织织物(knitted or woven fabric)，可增加检测区域的结合能力。表面除了检测区域之外的其余部分可以是光滑的或有纹理的，并且可以与检测区域相同或不同。光滑的表面是优选的。
185.表面或其检测区域可以是任何合适的材料，包括例如但不限于玻璃、金刚石、塑料、聚合材料(例如环烯烃共聚物；聚乙烯；聚乙烯(pe)，包括例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)和高密度聚乙烯(hdpe)和低密度聚乙烯(ldpe)；聚丙烯酸酯(丙烯酸)；聚苯乙烯(ps)，包括高抗冲聚苯乙烯(hips)；硅树脂；聚酯(例如聚乳酸(pla)或聚乳酸乙醇酸(pgla))；聚氨酯；聚丙烯(pp)；聚酰胺(尼龙)；丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)；聚乙烯/丙烯腈丁二烯苯乙烯(pe/abs)；酚醛塑料；橡胶；乳胶；聚碳酸酯(pc)；聚碳酸酯/丙烯腈丁二烯苯乙烯(pc/abs)；和聚氯乙烯，包括例如聚偏二氯乙烯(pvdc)；和蓝宝石。
186.就材料、纹理、尺寸、形状和功能化中的一个或更多个而言，表面的任何两个或更多个检测区域可以相同或不同。
187.表面可以具有任何合适的几何形状。例如，表面可以包括平坦的板，例如盖玻片，或者可以是孔、板、通道、容器、流动池、流动室、微流体池或腔室，或者载玻片。表面可以是更大的几何图形或装置的一部分。合适的表面可以是玻璃盖玻片或塑料盖玻片，其中塑料如上文关于表面所进行的描述。
188.表面优选形成样品保持件的一部分。所述样品保持件可以是光散射显微镜的元
件。样品保持件可以是高表面体积比的腔室。
189.表面或者实际上检测区域可以被功能化。表面或检测区域可以被钝化、活化、涂覆、处理或衍生化。该表面可以是钝化表面。钝化是对表面进行处理或涂覆以增强或降低化学反应性的过程，从而增加或减少结合事件的数量。本领域技术人员将知道合适的钝化剂，其示例包括bsa、pvpa、dds和/或peg。预期的是，在表面上使用脂质层，例如单层和双层。或者，表面不经钝化。
190.如果表面被涂覆、衍生化或修饰，薄的表面变化可能是可取的。过厚的被改变的表面层会改变表面的光散射特性。只改变最外面的几层分子(3至10nm)可能是可取的。
191.表面或检测区域可以被活化、涂覆、处理和/或衍生化，以使捕获剂能够结合到其上。表面或检测区域的功能化使得能够从样品中选择生物标志物，有效地在表面上富集生物标志物。检测区域的功能化可以包括i)对表面进行修饰以防止任何非特异性结合，ii)对表面进行修饰以能够结合捕获剂；和iii)使捕获剂结合到经修饰的表面上。合适地，结合到检测区域的捕获剂将被功能性地定向用于结合生物标志物。功能化可以是化学的(例如共价键)或物理的(例如吸附)。
192.可以应用任何合适的表面涂层来结合捕获剂。合适的方法和涂层是本领域技术人员已知且可用的，包括例如但不限于官能化的peg；硅烷；胺；氨基硅烷；用胺改性试剂(诸如aptes)的醛修饰；使用例如gopts的环氧修饰；使用例如edc、nhs、hobt、tbtu、pamam的羧酸盐修饰；使用例如nano2的重氮；和超分子，例如杯芳烃。将捕获剂固定在表面上的合适方法是本领域已知且可用的。
193.当表面或检测区域如本文所述被功能化以能够结合捕获剂时，捕获剂的功能化或结合不会显著改变如本文所述检测生物标志物的能力。合适地，捕获剂的功能化过程和/或结合基本上不影响通过表面的经处理的检测区域的光透射。
194.表面的功能化可以允许与捕获剂的各种相互作用，诸如化学相互作用(例如共价键)或物理相互作用(例如吸附)。捕获剂可以通过自由反应基团(诸如胺或羧基)与表面的官能团发生化学反应，使得形成共价键，从而固定捕获剂。疏水键、氢键、范德华键、离子键和配位键以及静电相互作用也可能发生在捕获剂和表面之间。这些类型的相互作用可能特别受条件的影响，使得温度和ph的变化会改变捕获剂与表面的相互作用，使得当条件改变时能够释放捕获剂。
195.可以对表面进行处理以改变其疏水性，如可以在表面上涂覆疏水性涂层。这可以允许捕获剂的固定。例如，蛋白和脂质可以被描述为两亲性大分子，因为它们具有分别吸引非极性和极性基团的疏水性和亲水性基团。这可用于实现捕集剂的固定。
196.将捕获剂固定到表面上的方式可以根据释放事件的要求来选择。例如，如果捕获剂可以被永久固定，并且可以使用释放剂从生物标志物中选择性地释放生物标志物，则表面可以被功能化以允许永久固定，使得在释放事件期间只有生物标志物被释放。或者，如果捕获剂对捕获剂具有高亲和力，则可以选择使得可以使用释放剂释放捕获剂(和任何相关的生物标志物)，例如改变ph的固定方法。
197.该表面可以被修饰或功能化以包括捕获剂的结合配偶体，以便能够固定。举例来说，生物素可以通过用peg和生物素化的peg涂覆表面而固定在表面上。然后，作为捕获剂的链霉亲和素可以利用其对生物素的结合亲和力而被固定。由于链霉亲和素是一种四聚体，
它仍然能够呈现生物素的结合位点，以捕获样品中的生物素化的生物标志物。
198.捕获剂
199.任何合适的捕获剂可以被固定在表面的检测区域上，以从样品中捕获感兴趣的生物标志物。合适的捕获剂将能够特异性结合感兴趣的生物标志物。特异性结合是指在相同条件下，捕获剂与待检测的生物标志物的结合亲和力大于其与其他分子的结合亲和力。特异性结合通常由1μm或更低，例如500nm或更低、400nm或更低、300nm或更低、250nm或更低、200nm或更低、150nm或更低、100nm或更低、50nm或更低、40nm或更低、30nm或更低、20nm或更低、10nm或更低，或者1nm或更低的解离常数表示。
200.捕获剂可以是特异性识别待检测的生物标志物的抗体或抗体片段。捕获剂可以是结合蛋白或非蛋白靶标(例如特异性结合配体的蛋白，诸如小分子生物标志物，或结合蛋白生物标志物的受体)的蛋白、肽或肽模拟物。捕获剂可以是核酸，诸如适配体或核酶。捕获剂可以是能与互补序列杂交的核酸。捕获剂可以是特异性结合生物标志物的多糖、脂质、脂多糖、磷壁酸或脂磷壁酸。捕获剂可以是特异性结合生物标志物的抗原或配体，其中所述生物标志物是抗体或其片段或者是受体。捕获剂可以是天然存在的，也可以是重组的或合成的。捕获剂可以不完全是天然存在的，可以包含天然存在的一部分和重组或非天然存在的片段或部分。
201.检测区域可以包括任何合适数量的捕获剂。捕获剂的数量可以取决于要检测的生物标志物的类型和丰度。检测区域可以包含超过1000个、或超过10000个、或超过100000个、或超过500000个、或超过1000000个对感兴趣的生物标志物特异性的捕获剂。
202.生物标志物和捕获剂之间的结合可以是非共价的，诸如氢键、范德华力、静电力、疏水力等中的一种或更多种。然而，相互作用或结合也可以是共价的。
203.如本文所用，术语“抗体”或“多种抗体”是指完整的免疫球蛋白或具有fc(可结晶片段)区或fc区的fcrn结合片段的单克隆或多克隆抗原结合部分。术语“抗体”还包括“抗体样分子”，诸如抗体的部分，例如抗原结合部分。抗原结合部分可以通过重组dna技术或完整抗体的酶或化学切割来产生。“抗原结合部分”包括fab、fab’、f(ab’)2、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体和多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分。为了本文所述的目的，也包括线性抗体。抗体可以是工程化的。
204.核酸捕获剂可以是能够以非序列依赖性方式特异性结合生物标志物的试剂，诸如适配体。适配体通常是获得能够结合的构象的短核酸序列。可以结合的其他核酸包括核酶等。
205.核酸捕获剂可以是本文定义的核酸，其具有特异性结合待检测的生物标志物的能力。核酸捕获剂可以包含非特异性序列和特异性序列组合。核酸捕获剂可以是天然存在的，也可以是重组的。核酸捕获剂可以被工程化为包括一个或多个对要检测的生物标志物具有特异性的结合序列。序列的特异性可以使得核酸捕获序列在严格条件下与核酸生物标志物或生物标志物的核酸部分结合。
206.术语“严格条件”是指这样的条件，在该条件下，核酸链将优先与其互补结合配偶体杂交或特异性结合，并在较小程度上与其他序列杂交或根本不与其他序列杂交。本文所用的术语“严格杂交条件”是指适于在互补核酸链之间产生双链体的条件，例如在样品中的
dna探针和互补靶标之间或在引物和待扩增的核酸分子之间产生双链体，而在非互补核酸链之间基本上不形成双链体。严格条件是本领域已知的，例如如sambrook et al.,2001,molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition,cold spring harbour laboratory press；和current protocols in molecular biology,chapter 2,ausubel et al.,eds.,greene publishing and wiley-lnterscience,new york(1995)中所限定。
207.蛋白捕获剂可以是蛋白、多肽或肽，任选与核酸、碳水化合物或脂质缀合。蛋白捕获剂包含待捕获的生物标志物的合适结合位点。蛋白捕获剂的结合位点可以表现出对核酸、蛋白、小分子、脂质或碳水化合物生物标志物的特异性结合。蛋白捕获剂的实例包括受体、转录因子、毒素、抗毒素、多糖和多糖衍生物。合适的蛋白捕获剂可以以纳摩尔到皮摩尔范围内的解离常数结合到待检测的生物标志物。应该注意的是，本发明的方法可以允许使用不像其他技术(诸如elisa)那样高度特异性的捕获剂，因为该技术允许通过重量鉴定结合的种类。因此，如果生物标志物具有容易识别的重量，使用具有微摩尔范围结合特异性的捕获剂也是可能的。
208.如果生物标志物本身能够结合实体，例如它是抗体、酶或受体，则这种捕获剂可以是生物标志物的结合对象，诸如抗原、底物或配体。
209.捕获剂可以通过本领域已知的任何方法产生。例如，抗体可以在抗血清中发现，从杂交瘤组织培养物上清液或腹水液中制备，或者可以来源于重组表达系统，如本领域众所周知的。例如抗体、受体或其他物质的片段、部分或亚单位可以通过化学、酶或其他方式产生。本发明还预期捕获剂可以包括重组、嵌合杂交、人源化、灵长类化或其它修饰的形式。
210.捕获剂可以是生物缀合物，包括例如用作捕获剂的生物分子的任何合适的组合。例如蛋白-核酸组合，或抗体-蛋白缀合物，抗体-核酸缀合物。
211.捕获剂可以是具有多个结合位点的结合剂。因此，这种捕获剂可以利用其结合亲和力来固定。在实施例中，示出了链霉亲和素可以通过用生物素化的peg涂覆表面而固定在表面上。链霉亲和素四聚体对生物素具有高亲和力(kd～10-14
mol/l)，并且每个亚基以相同的亲和力结合生物素。因此，在该实施例中，固定在生物素化的peg上的链霉亲和素仍具有可用于生物素化的生物标志物的结合位点。由于链霉亲和素对游离生物素具有最高的亲和力，因此可以加入游离生物素作为释放剂，从表面释放颗粒，颗粒的离开可以被检测。
212.本文所指的未结合的捕获剂是未与待检测的生物标志物结合的捕获剂。合适地，未结合的捕获剂不与任何其他生物分子结合，无论是特异性的还是非特异性的。在释放事件(作为“目标”)之前，捕获剂在表面上被测量时可能是未结合的。因此，没有生物标志物与该捕获剂结合。
213.释放剂可以在释放过程中与捕获剂(和任何存在的生物标志物)结合(例如实施例2中生物素与链霉亲和素的结合)。由于检测的是释放事件，而不是来自被释放的颗粒本身的任何信号，因此释放后颗粒的性质没有被询问。因此，任何释放剂的结合都是不相关的。
214.捕获剂可包含一个或更多个切割位点，用于酶消化或通过光解或水解(ph变化)进行切割。可以在生物标志物结合位点中提供一个或更多个切割位点，使得在切割时，释放结合的生物标志物。可选地或附加地，可以提供一个或更多个切割位点，使得在切割时，处于结合或未结合状态的捕获剂从表面释放。从表面释放捕获剂的切割位点优选接近捕获剂的表面结合位点，使得基本上整个捕获剂从表面释放。切割位点可以是捕获剂中天然存在的，
或者可以是例如通过重组技术人工引入的。可以在引入捕获剂的接头序列中提供切割位点。当捕获剂是核酸时，任何dna裂解酶都可以包括合适的序列，例如限制性酶位点。
215.当试剂含有用于光解的切割位点时，其可以是任何合适的光解位点，可以包含在捕获剂的任何合适的部分(包括将捕获剂束缚在表面上的接头)中。捕获剂可包含光不稳定的保护基团(ppg，也称为：光可去除、光敏或光可断裂的保护基团)，用于光敏切割。ppg可以是基于硝基苄基、羰基或苄基的。可以将简单的可光断裂的接头构建到捕获部分中。
216.光解不限于可见光；这需要使用任何具有足够能量的光子。因此，可见光或更高能量的电磁波，诸如紫外线、x-射线和γ-射线通常参与这种反应。可以选择光不稳定位置，使得用于切割的光适合与用于干涉光散射的照射源结合使用。因此，例如，紫外光可能是优选的。光可切割位点广泛用于化学和生物科学；因为光可以以非常高的时空精度传递。在单一表面上可使用不同光可断裂位点的多种捕获剂，以使用不同波长的光来释放各种捕获剂。
217.应当理解，ppg的使用不会阻碍捕获剂与生物标志物的相互作用。ppg的存在只是为了允许捕获剂或其一部分的断裂，并使其从表面释放。
218.水解是一分子水打破一个或多个化学键的任何化学反应。例如，水性溶液中肽中的酰胺键的非酶切割速率是ph依赖性的；碱性ph会促进酰胺键的断裂。捕获剂可以设计成包括更易于水解的部分。需要选择合适的条件以确保生物标志物不会被类似地分解。
219.合适的切割位点的示例，对于蛋白/抗体包括切割位点，或者对于核酸包括限制性酶位点。也可以使用dna或rna酶(dnazymes或rnazymes)进行酶促切割。这可以被设计成允许在靶位点进行特异性切割。限制性位点是本领域技术人员众所周知的，并且通常(对于核酸内切酶)涉及双链多核苷酸内的特定序列，其长度为约6至8个核苷酸。
220.捕获剂可以通过破坏产生固定的非共价相互作用来释放。因此，ph或温度的变化可能足以破坏捕获剂的固定，这可能是释放事件。
221.可以通过提供竞争性结合对象来破坏与固定的结合对象的结合，从而释放捕获剂(参见实施例5和图4)。
222.如果选择捕获剂和固定手段，使得使用释放剂释放捕获剂，则本发明的方法可以确定在释放事件之前生物标志物是否与表面上的捕获剂结合。
223.根据所使用的释放机制，在释放事件中没有、部分或全部捕获剂可以形成颗粒。
224.表面与样品的接触
225.在实施方式中，使表面与样品接触，以允许样品中存在的任何生物标志物与固定在表面上的捕获剂结合。
226.可以使用任何合适的手段和方法来使样品与表面接触。样品与表面的接触包括将样品孵育、暴露、混合或输送到表面。在某些实施方式中，接触可能需要搅动、涡旋、移液等。接触可以进行足够长的时间，以允许样品中存在的生物标志物与固定在表面上的捕获剂结合。接触时间可以是任何合适的长度，取决于捕获剂或生物标志物的结合亲和力和/或浓度、其浓度或孵育条件(例如，温度)。接触时间可以是至少约30秒、至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时或更长。本领域技术人员将能够相应地调整接触时间和条件。
227.合适的杂交条件是本领域技术人员已知的，并且将取决于生物标志物和捕获剂的
性质。
228.洗涤
229.在制备表面的过程中，可能会发生非特异性结合。为了去除非特异性结合到表面的任何分子，可以使用合适方法洗涤表面，该方法基本上不影响捕获剂的固定或感兴趣的生物标志物与其的结合。合适的洗涤缓冲液和方法对于本领域技术人员来说是已知且可用的，例如变化的盐浓度或温和的去污剂，其将合适地确保只有特异性期望的相互作用将保持完整。理想地，该洗涤步骤不会改变捕获剂被固定的条件。
230.缓冲液或检测溶液
231.然后，可以使经洗涤的表面与用于检测步骤的缓冲液或其他合适的溶液接触，这优选是清洁缓冲液。如本文所用，术语“清洁缓冲液”是指产生最小背景噪声的缓冲液，从而不会产生干扰测量、结果或结论的结果。本领域技术人员将会知晓，存在许多适合用于检测步骤的缓冲液的实例。清洁缓冲液的实例包括tris缓冲的盐水、磷酸盐缓冲的盐水、hepes、mes、mops或mem。合适的溶液是水。表面或其检测区域可以完全或部分浸没。合适地，至少被观察的检测区域完全浸没在缓冲液或溶液中。
232.生物标志物和/或复合物从表面的释放
233.本发明基于这样的认识：生物标志物以受控的速率从表面释放使得即使在样品中非常低的丰度下也能够识别生物标志物。释放事件可以引起生物标志物从固定在表面上的捕获剂中释放出来。它可以额外地或选择性地引起捕获剂(或其一部分)从其所固定的表面释放。捕获剂可以与感兴趣的生物标志物结合，或者可以是未结合的。捕获剂在释放后可以保持与生物标志物的结合，或者它可以解离。本发明的方法足够灵敏以测量生物标志物作为颗粒的释放和捕获剂和/或生物标志物作为颗粒的释放。
234.释放事件是在表面/溶液界面处结合的变化。因此，合适的释放事件是指颗粒从表面完全脱离进入到保持该表面的溶液中。一旦颗粒从表面释放，这种释放就被检测到。这种释放通过在释放事件之前和之后测量表面来检测。在颗粒的任何释放之前和之后，可以测量表面上的目标，例如捕获剂(具有或不具有相关联的生物标志物)。测量值之间的光散射差异检测到颗粒的释放事件。每个释放事件都引起局部光散射(例如目标的光散射)的变化，该变化可以高精度地来检测。信号的任何变化幅度都可以转换成分子质量。因此，颗粒的质量是由表面测量之前/之后计算的。为了避免疑问，并不通过光散射检测释放的颗粒本身，因为它已经被释放到溶液中。
235.因此，本发明涉及检测表面处颗粒的存在，然后检测表面上颗粒的不存在。通过计算这些测量值的差异，可以将质量归因于该颗粒。因此，有效地监测检测区域中的目标或位置的光散射变化。
236.因此，如果捕获剂与生物标志物在释放事件期间或之后解离，这不影响释放事件的检测或释放质量的计算。例如，如果首先释放生物标志物，随后释放捕获剂，这将被检测为表面处光散射的两次变化，引起这样的计算：生物标志物在释放事件之前存在于表面，随后释放了捕获剂。或者，如果最初释放的颗粒包含结合到捕获剂的生物标志物，并且这些生物标志物随后在溶液中解离，则仅检测到颗粒的释放。颗粒在表面之外(在溶液中)发生了什么是无法测量或检测的。检测将是相同的，因为检测到的事件是颗粒从表面“解结合(unbinding)”。由于颗粒已不在表面，一经发生解结合后会发生什么就无法检测了。
237.可能会释放多种类型的颗粒。这些颗粒包括单独的生物标志物、结合到捕获剂(或其部分)的生物标志物或未结合的捕获剂(或其部分)。三种颗粒类型，即任何生物标志物、未结合的捕获剂和/或结合的捕获剂(生物标志物/捕获剂复合物)在限定的条件下以限定的速率从表面释放。合适地，这些颗粒被释放到表面接触的溶液中。
238.合适地选择释放速率，以能够通过光散射检测单个释放事件。因此，本发明能够检测从表面释放的各个颗粒，包括任何感兴趣的生物标志物、复合物或未结合的捕获剂，并对其进行表征。以这种方式，本发明的方法能够基于在颗粒从表面释放之前和之后从目标获得的测量值来将质量分配给单个颗粒。颗粒的释放可以引起目标从表面释放(例如未结合的捕获剂或捕获剂/生物标志物复合物)。颗粒的释放会引起目标的一部分被释放(例如从捕获剂释放的生物标志物，或者与捕获剂的一部分复合的生物标志物，其中一部分留在表面上)。因此，通过监测表面处的目标并确定释放事件之前和之后存在什么来确定释放的颗粒的性质。
239.因此，合适地，为了最大化本发明方法的灵敏度，控制结合颗粒从表面的释放，使得其以能够通过光散射检测的速率发生，来识别和表征各个解结合(释放)事件。这允许监测在表面处的各个目标的颗粒释放。
240.因此，合适地，一次从检测区域释放单个颗粒。这可能意味着释放的速率使得每秒钟或在单个图像帧捕获内发生不超过100次释放事件。释放速率可以每秒至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50或至多40次释放事件。因此，虽然在一个或多个后续帧上可捕获单次释放事件，但是单个帧合适地不包括超过100次释放事件。这允许生物标志物、捕获剂或复合物的单独检测，以及单独释放事件的定量。在多个释放事件基本同时发生的情况下，使得在一帧中不能区分各个事件(例如由于被照射的斑点的重叠)，释放速率可能太高，并且需要调整以降低释放速率。本质上，虽然光散射显微镜的图像捕获装置能够记录与释放事件相关的光散射事件，但是在一定浓度以上，不可能区分各个目标并为其分配质量。因此，换句话说，合适的释放速率是提供图像捕获帧的速率，在该帧中任何事件都不重叠，因此可以被单独识别和表征。每帧的斑点数量以及释放速率将取决于帧的大小。每帧的曝光时间可以是0.01ms至50ms，合适地为0.5ms至20ms。
241.用于检测检测区域的释放事件的合适时间间隔将取决于各种因素，包括：检测区域的大小；与其结合的捕获剂的浓度；任何生物标志物的丰度；释放剂的强度和释放速率；和帧捕获速率。因此，合适的时间间隔将取决于检测事件的特定参数。然而，有可能施加某个时间或帧的限制，诸如10000帧。
242.释放事件可以由任何合适的方法触发。合适方法的示例包括：
243.i)改变表面的化学环境。因此，本发明的方法可以包括在表面的环境中实现化学变化以触发释放事件。实例包括改变包含检测区域的溶液的ph。已知ph的变化会破坏蛋白-蛋白相互作用，诸如抗体-抗原相互作用。降低ph可能是优选的。例如，化学环境的变化可包括降低其ph，例如通过添加酸，诸如盐酸。类似地，改变检测区域环境中的氧化还原条件也可以用来触发释放事件。特别是对于核酸，例如通过添加离子来改变环境的离子强度可能足以触发释放事件。可以使用任何合适的方法在环境中引入化学变化。合适的方法包括暴露于光下(例如，通过影响ph的笼状质子的光解)；添加缓冲剂或盐。
244.ii)通过酶促裂解破坏生物标志物与捕获剂之间的结合，和/或捕获剂与表面之间
的结合。合适的酶可用于靶向捕获剂结合位点中的切割位点。结合位点可以是生物标志物结合位点，或者可以是表面结合位点。生物标志物结合位点的切割可以用于从捕获剂中释放生物标志物。表面结合位点的切割可用于从表面释放捕获剂。释放的捕获剂可以是未结合的或者可以结合到生物标志物。合适的酶可以被活化，例如通过暴露于光。合适的酶可以是类似蛋白的(proteinaceous)，或者由核酸或其杂交体组成。
245.iii)消化捕获剂。可将任何合适的方法应用至表面以消化捕获剂，从而从表面释放生物标志物。可以使用酶来消化捕获剂。例如，如果捕获剂是核酸且生物标志物是蛋白，则可以使用核酸外切酶来释放生物标志物。
246.iv)可使用光解来诱导捕获剂中的化学切割，或引起生物标标志物从捕获剂中释放。化学切割位点可以是生物标志物结合位点，或者可以是表面结合位点。生物标志物结合位点的切割可以用于从捕获剂中释放生物标志物。表面结合位点的切割可用于从表面释放捕获剂。释放的捕获剂可以是未结合的或者可以结合到生物标志物。光解可以包括将检测区域暴露于合适波长的光(例如紫外光)以诱导切割。
247.v)加入竞争性结合剂以置换捕获剂上的生物标志物和/或表面上的捕获剂。
248.因此，本发明的方法可包括：改变检测区域的化学环境；向检测区域施加光，其中所述光的波长适于诱导切割；和/或，将酶应用于检测区域。
249.可替代地，可以改变表面的条件(环境)来引发释放事件。
250.调节表面环境的变化速率以提供所需的释放速率。环境的变化可以通过多种因素来控制，这些因素诸如试剂(诸如缓冲剂、盐、酸或酶)的施用速率；改变试剂或酶的浓度；或光的能量密度或强度。可能优选的是，以低浓度、强度或速率来施用所有试剂、酶或光以限制释放速率，并且如果需要增加释放速率，任选增加这些因素中的一种或更多种。例如，可以使试剂(诸如酶)从一个位点到另一位点的扩散速率最大化，以确保产生所需的释放速率。释放剂的随机释放可以被限制在预限定的检测区域。在通过光(例如光解)实现释放的情况下，可能可取的是，将光活化光与观察光或光学器件组合。
251.本文所限定的所有方法的步骤iv包括释放结合到表面的颗粒，其中所述颗粒选自以下任何一种或更多种：
252.i.从与其结合的捕获剂释放的生物标志物；
253.ii.包含结合到捕获剂的生物标志物的复合物；和/或
254.iii.未结合的捕获剂。
255.因此，步骤iv可能涉及所有可能类型的颗粒的释放，并且本文所述的方法足够灵敏以区分这些释放事件中的每一个。这将能够确定，例如，有多少事件释放了与捕获剂结合的生物标志物，以及有多少事件单独释放了捕获剂。
256.结果/检测
257.如前文所述，在释放事件之前可进行基线测量。
258.释放事件的检测可以使用光散射显微镜来进行，例如具有空间滤光器的iscat或质量光度计，例如如本文所述。iscat包括确定由样品中的目标散射的光与从样品位置反射的光之间的干涉。该干涉取决于目标的散射幅度，并作为iscat信号进行测量。正是对该目标质量的监测允许检测释放事件。
259.通过捕获表面的图像来进行检测。可将多个图像或帧进行组合来提供影片。视频
或影片可包括1000到48000帧。它可包括高达60000帧或高达100000帧。多个图像是优选的，因为这允许针对释放事件监测每个目标。
260.在施用释放剂之前进行一次或更多次初始测量。如前文所述，这可以发生在表面已经与样品接触并且已经进行了任何洗涤步骤的过程中。该初始测量提供了表面处存在的所有目标的信息。这种目标可以是未结合的捕获剂或结合有生物标志物的捕获剂。
261.从该初始测量不可能直接确定表面处目标的身份。目标的质量可以使用如本文所描述的标准技术来计算，包括使用校准曲线。
262.初始检测(或进一步测量)可以在施用释放剂时立即进行，或者其施用内5秒或更短时间、一秒或几分之一秒内进行。然而，如果释放剂需要限定的时间来起作用，则初始检测可以被优化以考虑该限定的时间。可替代地，如果释放剂立即起作用，例如在光解中，用于释放和检测的光可以并行施加(一个波长用于释放，另一个波长用于检测)，其立即进行检测。图像捕获形式的测量可以以0.01至1秒的间隔进行。显微镜照相机的帧捕获速率可以是每秒0.01至1。帧捕获速率可对应于检测或测量速率或者时间间隔。
263.通过图像捕获的检测可以在一段时间内有效地连续发生，或者可以以规则或不规则的间隔发生。这种连续测量可以在施用释放剂之前开始，并持续任何适当的时段。应当理解的是，测量之间的间隔可能与所研究的颗粒有关，因此可能更长。此外，在一次测定中，时间间隔可以变化。例如，最初的几次测量可以每秒进行一次，进一步测量可以以数分钟的更长时间间隔来进行。
264.如本文所讨论的，技术人员可以通过调节释放剂来调节释放速率，并且可以调节帧捕获速率，以产生合适的检测速率。
265.每个释放事件均涉及颗粒从表面脱离并进入溶液。这通过表面处目标的光散射变化来检测。这种变化与释放的颗粒的质量相关联。也可以检测到没有来自目标的释放事件，并且这可以指示样品中不存在生物标志物。
266.基于光散射，可以给每个释放事件分配质量。因此，本发明的方法可包括：结合的与未结合的捕获剂和/或生物标志物的直接定量。因此，本发明可以提供结合生物标志物的捕获剂的比例的测量。样品中以低丰度存在的生物标志物可能会使得表面上存在未结合的捕获剂。这可以通过本发明的方法来确定，因为其可以区分结合的和未结合的捕获剂。本发明的方法可包括：通过与已知标准比较来确定生物标志物的浓度。
267.所述方法还可用于分析生物标志物的异源群体。本发明的方法包括：为每个释放事件分配质量。生物标志物的质量，或者结合的捕获剂的质量与未结合捕获剂的质量的比较，可用于通过质量与预期质量的比较来确定生物标志物的性质。
268.所述方法不仅适于证实特定生物标志物的存在或不存在。它还可以用于确定生物标志物的状态，诸如翻译后修饰的存在或复合物中生物标志物的存在。因此，该方法适于相对定量和确定特定蛋白寡聚化、蛋白-核酸相互作用、蛋白-糖或多糖相互作用的存在/不存在。因此，可仔细研究许多不同的生物相互作用。翻译后修饰可通过确定生物标志物的质量或通过使用对不同经修饰的生物标志物特异性的捕获剂来简单地确定。
269.本发明的方法还适于相对于其它内部标准或两种或更多种感兴趣的生物标志物之间的分子的相对定量。
270.内部对照可以允许样品中生物标志物的相对定量，例如：内部标准可以是将以已
知浓度添加到样品中的确定分子量的生物分子。通过定量内部对照的释放和生物标志物的释放，我们将得到样品中生物标志物的相对浓度。
271.在这方面，内部对照具有与生物标志物不同的分子量，并且与这些生物标志物没有任何交叉反应性。
272.在一些方面，内部对照将需要特定的捕获剂，并且如果捕获剂对于内部标准具有与捕获剂对于生物标志物相同或相似的亲和力，这将是理想的。然而，如果这两种亲和力不同，则亲和力差异是已知的，并且可以用于确定生物标志物的相对浓度。在这样的布置中，内部对照和生物标志物的释放过程是相同的。
273.在一些方面，内部对照可以是已知存在于待分析样品中的第二生物标志物。这可能是浓度已经确定的常见生物标志物，例如血清中的白蛋白。第二生物标志物的水平与疾病无关，并且可以用于确定感兴趣的生物标志物的浓度。
274.如本文所用，内部对照可称为内部标准。
275.检测设备
276.该方法可包括使用合适的光散射显微镜，例如包括空间滤光器的干涉散射显微镜或者质量光度计。可以使用任何合适的设备，包括下面描述的布置。
277.合适的显微镜或光度计可包括：用于将表面保持在样品位置的样品保持件；布置成提供照明光的照明源；检测器；和光学系统，其被布置成将照明光引导到样品位置上，并且被布置成收集反射的输出光并将输出光引导到检测器，其中该输出光包括从样品位置散射的光和从样品位置反射的照明光。
278.显微镜可进一步包括被定位成过滤输出光的空间滤光器，该空间滤光器被布置成使输出光通过，但是在预定数值孔径内强度的降低比在较大数值孔径下更大。这种空间滤波器有利地最大化了图像对比度，如pct/gb2017/052070以及cole et al(acs photonics,2017,4(2),pp211-216)所描述。
279.所用的光可为：紫外光(本文可限定具有在10nm至380nm范围内的波长)；可见光(本文可限定具有在380nm至740nm范围内的波长)；红外光(本文可限定具有在740nm至300μm范围内的波长)。该光优选是可见光。光可以是多种波长的混合。照明光可以是相干光，例如由激光器提供。
280.本发明的方法可以使用检测光散射，优选单颗粒光散射的合适的显微镜来进行。iscat仪器的示例性设计描述在cole et al acs photonics,2017,4(2),pp 211
–
216和arroyo et al.nat protocols 2016,617-633中。关于该仪器的进一步细节在wo2018/011591和gb2552195中提供。合适的质量光度计可得自于refeyn limited,oxford,uk，例如onemp质量光度计。
281.合适的iscat显微镜如图3所示。
282.图3示出了可以在本发明中使用的iscat显微镜1，其布置如下(并且配置有如上所述的空间滤光器)。由于所讨论的原因，空间滤光器对于提高对比度是有利的，但是本发明的方法也可以采用没有空间滤光器的iscat显微镜。
283.除了下面更详细描述的空间滤光器之外，显微镜1包括具有显微镜领域中常规的结构的以下组件。
284.显微镜1包括用于将样品3保持在样品位置的样品保持件2。样品3可以是含待成像
目标的液体样品，这将在下文更详细地描述。样品保持件2可以采取适于保持样品3的任何形式。典型地，样品保持件2将样品3保持在表面上，该表面形成样品保持件2和样品3之间的界面。例如，样品保持件2可以是盖玻片和/或可以由玻璃制成。样品3可以以直接的方式提供在样品保持件2上，例如使用微量移液管。
285.显微镜1进一步包括照明源4和检测器5。
286.照明源4被布置成提供照明光。照明光可以是相干光。例如，照明源4可以是激光器。照明光的波长可以根据样品3的性质和/或要检查的特性来选择。在一个实例中，照明光的波长为405nm。
287.可选地，可以对照明光进行空间调制，以去除由照明和激光噪声的相干性质引起的散斑图案，例如如kukura et al.,“high-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of asingle virus”,nature methods 2009 6:923
–
935中所记载的。
288.检测器5接收来自样品位置的反射输出光。通常，显微镜1可以在宽视场模式下操作，在这种情况下，检测器5可以是捕获样品3的图像的图像传感器。可替代地，显微镜1可以在共焦模式下操作，在这种情况下，检测器5可以是图像传感器或者可以是点状检测器，诸如光电二极管，在这种情况下，扫描布置可以用于扫描样品3的区域以建立图像。可以用作检测器5的图像传感器的实例包括cmos(互补金属氧化物半导体)图像传感器或ccd(电荷耦合器件)。
289.显微镜1进一步包括布置在样品保持件2、照明源4和检测器5之间的光学系统10。光学系统10如下布置以将照明光引导到样品位置上用于照明样品3，并收集从样品位置反射的输出光，并将输出光引导到检测器5。
290.光学系统10包括物镜11，该物镜11是设置在样品保持件2前面的透镜系统。光学系统10还包括聚光透镜12和管透镜13。
291.聚光透镜12将来自光源11的照明光(在图1中由实线示出)通过物镜11会聚到样品位置处的样品3上。
292.物镜11收集输出光，该输出光包括(a)从样品位置反射的照明光，和(b)来自样品位置处的样品3散射的光。反射光主要从样品保持件2和样品3之间的界面反射。典型地，这是相对弱的反射，例如玻璃水反射。例如，反射的照明光的强度可以是入射照明光强度的约0.5％。散射光被样品3中的目标散射。
293.以与常规iscat类似的方式，来自样品表面处或附近的目标的散射光与反射光相长干涉，因此在由检测器5捕获的图像中是可见的。这种效应不同于透射操作的显微镜，在透射操作中，到达检测器的照明光透过样品的深度，导致小得多的成像对比度。
294.反射的照明光和散射光具有不同的方向性。特别地，反射的照明光具有由光源4和光学系统6输出的光束的几何形状产生的数值孔径。散射光在大范围的角度上散射，因此比反射的照明光填充更大的数值孔径。
295.管透镜13将来自物镜11的输出光聚焦到检测器5上。
296.光学系统6还包括分束器14，该分束器14被布置成分离来自光源4的照明光和引导至检测器5的输出光的光路。除了提供如下所述的空间滤光器之外，分束器14可以具有对入射到其上的光提供部分反射和部分透射的常规结构。例如，分束器14可以是板，典型地设置
有膜，该膜可以是金属的或电介质的，与光路成45
°
布置。可替代地，分束器14可以是由一对匹配的棱镜形成的立方体分束器，在棱镜之间的界面上具有部分反射膜。可替代地，分束器14可以是偏振分束器，与分束器14和样品3之间的四分之一波片结合使用。
297.在示例中，光源4偏离物镜11的光路，使得来自光源4的照明光被分束器14反射到物镜11中，并且相反地，检测器5与物镜11的光路对准，使得来自样品位置的输出光通过分束器14朝向检测器5透射。
298.除了上述可以是常规结构的部件之外，显微镜1还包括空间滤光器20。空间滤光器20形成在分束器14上，从而位于物镜11的后孔径之后，因此直接位于物镜11的后焦平面15之后。因此，空间滤光器20可以在不进入物镜的情况下实现，如在相衬显微术(phase contrast microscopy)中。将空间滤光器直接放置在物镜的入射孔径之后，而不是在共轭平面中(例如，如下所述)具有强烈抑制源自高数值孔径显微镜物镜内的多个透镜的背反射的明显优点。这又减少了成像噪声，降低了非干涉背景，并减少了实验复杂性、光学器件数量和光路长度，从而提高了光学装置的稳定性，并因此提高了图像质量。
299.然而，该位置并不是必需的，并且具有等效功能的空间滤光器可以设置在其他地方，如下所述。
300.空间滤光器20由此被定位成过滤传递到检测器5的输出光。在检测器5与物镜11的光路对准的实施例中，空间滤光器20因此是透射的。
301.空间滤光器20是部分透射的，因此通过输出光，该输出光包括反射照明光，但是强度降低。空间滤光器20也与光轴对准，并且具有预定的孔径，使得它在预定的数值孔径内提供强度的降低。本文中，数值孔径以其通常的方式被限定为表征相对于输出光所源自的样品位置的角度范围的无量纲量。具体地，数值孔径na可以由等式na＝n
·
sin(θ)来定义，其中θ是收集的半角，n是输出光穿过的材料(例如光学系统6的组件的材料)的折射率。
302.空间滤光器20在预定数值孔径之外不提供强度降低。原则上，可替代地，空间滤光器20在其预定孔径之外可提供强度降低，但是强度降低小于预定数值孔径内的强度降低，尽管这是不太理想的。
303.空间滤光器20可以以任何合适的方式形成，典型地包括沉积材料的层。该材料可以是例如金属，诸如银。可以使用任何合适的技术进行沉积。
304.由于界面附近的亚衍射尺寸的目标优先将光散射到比反射照明光更大的数值孔径中，所以由空间滤光器20提供的强度降低优先降低反射照明光的检测强度超过散射光。因此，空间滤光器20在低数值孔径下的强度降低主要影响反射的照明光，并且对散射光的影响最小，从而最大化捕获图像中的对比度。增强的成像对比度使得能够对作为弱散射体的目标进行高对比度检测。
305.对比度增强可如下理解。当空间滤光器20以预定数值孔径通过部分输出光时(即，在该示例中，是部分透射的)，照明光和散射光场的一部分到达检测器并干涉形成足够相干的照明源。到达检测器i
det
的光强由i
det
＝|e
inc
|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosφ}得出，其中e
inc
是入射光场，r2是界面的反射率，t2是空间滤光器20的透射率，s是目标的散射振幅，φ是透射照明光和散射光之间的相位差。因此，增强了散射对比度，尽管是以检测到的光子总数为代价。
306.因此，对比度以与类似常规iscat的方式来提供，但是其额外地受控于空间滤光器
的透射率。这提供了直接通过选择空间滤光器20的透射率t2来调节参考场振幅的能力，而不是像标准iscat中那样由玻璃-水界面的反射率来固定。在空间滤光器20是沉积材料层的情况下，通过选择该层的材料和/或厚度可选择透射率t2。这种调节可以根据例如感兴趣的散射目标、照相机满井容量和放大率来进行。
307.为了使iscat的这些有益效果最大化，预定数值孔径可以是输出光中反射的照明光的数值孔径，但这不是必需的。例如，如果预定数值孔径略小于或大于反射照明光的数值孔径，则可以获得类似性质的益处。
308.检测的方法
309.生物标志物的检测可以使用光散射进行，例如干涉散射显微镜法(iscat)、干涉散射质谱法或质量光度计法。合适地，使用iscat或质量光度计法。
310.iscat包括确定由样品中的目标散射的光和从样品位置反射的光之间的干涉。干涉取决于目标的散射幅度(以及其极化率，即体积，密度和折射率)，并作为iscat信号进行测量。该技术例如在kukura et al.,nature methods 2009 6:923
–
935和ortega-arroyo et al.,physical chemistry chemical physics 2012 14:15625
–
15636.中有所综述。
311.质量光度计法是iscat的发展(kukura et al.,nature methods 2009 6:923
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935和ortega-arroyo et al.,physical chemistry chemical physics 2012 14:15625
–
15636)，测量由单种分子(single molecules)散射的光，并将其与分子质量直接相关联。质量光度计法的原理如图4所示。颗粒散射的光与颗粒体积和折射率成线性比例。由于蛋白的光学性质和密度只相差百分之几，它们的散射信号与其序列质量成正比，因此能够用光对单种分子进行称重(图x1)。散射信号与质量的相关性适用于各种生物分子(糖蛋白、核酸或脂质)，这使得质量光度计法成为溶液中生物分子的通用分析工具。
312.iscat信号可以被描述为在颗粒存在和不存在的情况下检测到的光的比例。更详细地说，它可以定义为
313.(i
s-i
p
)/is，其中is不存在颗粒时样品位置(诸如玻璃表面)的反射强度，i
p
是存在颗粒时的同一测量值。
314.光散射信号可以用于给被检测的目标分配质量。因此，本发明的方法可以包括确定光散射信号并使用该信号来确定颗粒的质量。颗粒被有效地从目标中释放出来，因此通过确定目标的质量变化可以将质量归因于颗粒。当在本发明的方法中使用质量光度计法时，质量由质量光度计的方法来指示。
315.通过与待检测目标的预期质量进行比较，可以确定颗粒的存在或不存在。通过测量颗粒的存在/不存在，可以检测释放事件。因此，在生物标志物的检测中，可以将生物标志物和/或生物标志物/捕获剂复合物的预期质量与最终通过光散射识别的释放颗粒的质量进行比较，并且可以确定生物标志物或生物标志物/捕获剂复合物的存在或不存在。类似地，未结合的捕获剂的预期质量可以与通过光散射识别的颗粒的质量进行比较，并且可以确定是否存在未结合的捕获剂。生物标志物、生物标志物/捕获剂复合物和未结合的捕获剂的质量可以不同。实际上，本发明的方法允许测量颗粒的质量，而不具体询问颗粒，而是通过检查颗粒从其释放的目标。
316.本发明的方法可进一步包括将iscat对比度与校准或标准曲线进行比较，以确定感兴趣的颗粒的质量或浓度。
317.本发明的方法还可包括一个或多个图像处理步骤，包括例如但不限于去除图像上的背景，以及改进图像质量。
318.颗粒是凭借其从目标表面释放出来而被间接测量的。因此，被探测和定量的是该目标的“负质量”事件，这可以用来计算颗粒的质量。然后，颗粒的质量可以确定该颗粒中是否存在生物标志物。
319.一旦被释放，颗粒或其组分可以结合到表面上。这种结合事件可以被检测到，但会被忽略，因为这种结合事件发生在释放事件之后。这尤其可以从实施例1中看出。
320.校准曲线
321.当在本发明的方法中使用iscat时，可以使用校准曲线来确定释放颗粒的质量。可通过绘制两种或更多种标准品的已知质量与iscat产生的散射值来生成校准曲线。这种校准曲线可用于根据iscat获得的散射值确定颗粒的质量。本发明的方法可包括在校准曲线上绘制iscat散射值，以确定感兴趣的颗粒的质量；以及任选地表征颗粒，例如作为生物标志物、结合到生物标志物的捕获剂或未结合的捕获剂。
322.还可以生成校准曲线来确定样品中的颗粒浓度。
323.在一个方面，为了生成校准曲线，可以用增加浓度的纯化生物标志物进行测量。这将允许了解当与不同浓度的生物标志物一起孵育时发生的解结合事件的数量。已知的解结合事件相对于所添加的生物标志物的浓度的图可允许确定生物标志物的浓度。
324.在另一方面，可以使用复杂样品(例如血清)，并且通过包括用于具有已知浓度的第二生物标志物(诸如血清白蛋白)的捕获剂来进行校准。本文进一步描述了这一方面，使得第二生物标志物用作内部对照。
325.另一种校准方法是对样品的系列稀释物进行该方法，或者可替代地，使用具有不同浓度的生物标志物的不同样品将也允许构建浓度相对于解结合的图。
326.本领域技术人员将会理解，所选择的释放条件需要在测量时间内是定量的。例如，在光解中，剂量可以随时间增加，以确保最终所有可裂解的键都被裂解。检测结合和未结合的捕获剂将允许计算结合:未结合的比例作为内部对照，并最终计算生物标志物浓度。
327.可替代地，可以使用内部对照或标准。内部标准或对照可以具有与颗粒(诸如生物标志物、捕获剂，或生物标志物和捕获剂的复合物)类似的特征。内部对照和标准在前文已经讨论过了。
328.试剂盒
329.试剂盒可包含一种或更多种适于通过光散射显微镜法检测生物标志物的组分。试剂盒可包括根据本发明的方法使用试剂盒的说明。该说明可以提供一种或更多种生物标志物的质量或浓度的参考水平，和/或生物标志物的参考单颗粒直方图。试剂盒还可以包括关于可以对哪些受试者实施诊断方法的细节。试剂盒可包括选自以下的一项或更多项：合适的表面，例如盖玻片；捕获剂；封闭缓冲液；洗涤缓冲液；释放缓冲液；本文所述的校准图或直方图；根据本文所述的本发明方法的使用说明；样品收集容器；样品收集装置(诸如毛细管血液收集装置、手指针刺收集装置或包括针的任何仪器)；介导本文所述的生物标志物或捕获剂释放的试剂；以及，一种或更多种用于校准的标准生物标志物样品。
330.额外地，该试剂盒可包括用于测量其他实验室或临床参数的工具。
331.使用这些试剂盒的方案可以由临床实验室、实验实验室、医疗从业者或个人进行。
332.额外的方法
333.本发明的方法可包括一个或更多个其他步骤。
334.额外地，根据本发明的诊断方法可包括基于根据本发明的方法的结果对受试者进行诊断或预后。诊断方法可进一步包括选择合适的治疗方案或给药方案，用于施用至根据本发明的方法诊断患有疾病或病症的受试者。本发明的方法可包括对受试者进行合适的治疗或给药方案。
335.本发明的方法可包括改变细胞或病毒培养方法，以减少或增加培养物的特定生物标志物。
336.本发明的方法可包括改变制造过程以改变产物，其中通过本发明的方法检测的生物标志物的存在、不存在或量来指示产品的期望或不期望的特征，例如质量。
337.本发明的方法可包括去除或清洁产物或培养物，例如去除影响寡聚化、翻译后修饰或生物标志物相互作用的特征或参数。
338.疾病/感染
339.本发明的方法可以适于检测生物标志物的存在。生物标志物可以指示但不限于诸如疾病或病症的存在、类型、发作、严重性、可能复发或复发、进展，或对疾病或病症的易感性等因素。本文所指的诊断包括测试疾病或病症的存在、类型、发作、严重性、可能的复发或复发、进展，或对疾病或病症的易感性。
340.易感性是受试者将感染疾病或病症的可能性，例如特定的时间范围。因此，本发明提供了如本文所述的用于确定受试者对特定疾病或病症的易感性的方法。本发明检测生物样品中低丰度生物标志物的能力使其特别适于确定受试者将患有该生物标志物所指示的疾病或病症的可能性。在其他实施方式中，该方法是用于诊断受试者疾病的方法，并且受试者中可检测标志物的存在指示受试者患有该疾病，受试者中不存在可检测标志物指示受试者未患有该疾病。
341.合适地，本文所述的诊断方法在从受试者获得的样品上进行。样品可以使用毛细管血液收集装置、手指穿刺收集装置或包括针的任何仪器来获得。样品可以使用任何合适的活组织检查技术或收集方法(包括支气管肺泡灌洗、吸痰法、拭子)来收集，并且可以放入任何合适的容器中。
342.本发明可适于诊断疾病或病症，包括但不限于癌症，退行性疾病，肝损伤或疾病，细菌、真菌或病毒感染，或炎性疾病。
343.本发明可适于诊断涉及任何蛋白修饰的疾病或病症，包括但不限于由以下原因引起的疾病：蛋白寡聚化、蛋白-蛋白相互作用、蛋白与其他生物分子(例如核酸、糖、聚合物、小肽、有机和无机分子)的相互作用、蛋白翻译后修饰(例如蛋白磷酸化、糖基化、泛素化、核酸(例如甲基化)或多糖(例如特定乙酰基或酰基的存在)的变化。由于特定生物标志物的存在(包括特定dna或rna序列；包膜和/或膜蛋白；脂多糖；效应蛋白的存在)/不存在，本发明还可适于特定细菌、真菌或病毒感染的检测。本发明可适用于通过检测碳水化合物、核酸或蛋白生物标志物或其任意组合来诊断癌症。
344.与蛋白修饰相关的疾病包括朊病毒疾病，诸如动物的羊痒病、羊痒病和牛海绵状脑病，以及人类的克罗伊茨费尔特-雅各布病(creutzfeldt-jakob)和格斯特曼-施特劳斯纳(gerstmann-straussler-scheinker)病。导致包涵体形成的蛋白聚集体是许多神经退行
性疾病(包括肌萎缩性侧索硬化、帕金森病和亨廷顿舞蹈病)共同的病理学标志。
345.本文使用的术语“癌症”是指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞白血病、肺癌、非小细胞肺(nscl)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括任何上述癌症的难治型，或一种或更多种上述癌症的组合。
346.炎性疾病包括但不限于诸如心血管疾病、炎性肠病、感染、多发性硬化、动脉粥样硬化、过敏性疾病、哮喘和copd的病症。
347.自身免疫性疾病是一组具有共同病因的不同疾病，其中免疫系统对自身抗原产生反应，导致组织损伤或功能障碍。自身免疫性疾病，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、银屑病和系统性红斑狼疮(norouzinia,et al gastroenterol.hepatol.from bed to bench 10,155
–
167(2017)；jin,f.et al.front.immunol.9,1
–
9(2018)；shi,g.,zhang,z.&li,q.j.immunol.res.2017,1
–
2(2017)；prince,h.e.biomarkers 10suppl 1,44
–
49(2005))。
348.肝损伤可包括酒精相关的肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝炎、血色素沉着症和肝硬化。
349.细菌、真菌、寄生虫或病毒感染包括例如但不限于：细菌感染，诸如博德特氏菌(bordetella)、衣原体或支原体、军团菌(legionella)、细菌性脑膜炎、肺炎、支气管炎、败血症；以及病毒感染，诸如冠状病毒、人类免疫缺陷病毒(hiv)、乙型肝炎病毒(hbv)或丙型肝炎病毒(hcv)、hsv、cmv、鼻病毒(rhinovirus)、甲型流感、乙型流感、副流感或rsv。真菌感染包括但不限于曲霉属(aspergillus)、念珠菌属(candida)、青霉菌(penicillin)、副球菌属(paracoccidodiodes)、组织胞浆菌属(histoplasma)、产色芽生菌属(fonsecaea)、隐球菌属(cryptococcus)、酵母属(saccaromyces)、毕赤酵母属(pichia)、c albicans、c glabrata、c tropicalis、镰刀菌属spp(fusarium spp)、酿酒酵母菌(saccaromyces cerevisiae)和枝顶孢霉属spp(acremonium spp)。寄生虫感染包括但不限于疟疾、弓形体病、利什曼病和非洲锥虫病。还可检测阿米巴感染，例如福氏奈格勒虫(naegleria fowleri)或溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)。
350.工业应用
351.该文件中描述的这种方法不限于诊断应用，而是可以扩展到任何其他相关应用，诸如质量控制、环境控制和生物分析方法。本发明可用于任何需要检测和/或定量生物分子的应用，诸如用在食品和饮料的大规模生产中。
352.因此，本发明的方法可用于检测样品或细胞或病毒培养物中的污染，确定样品相对于已知标准的质量，检测生物分子的修饰(例如蛋白的翻译后修饰)，检测或定量样品中两种或更多种生物分子之间的相互作用(例如检测或定量结合或缔合)，比较样品中两种或更多种生物标志物的量，定量产物的表达水平。
353.本发明还可用于大规模测试过程，诸如测试污水或废水的感染爆发，诸如病毒感染。
354.如本文所描述的试剂盒可被提供用于这种方法。
355.在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包括(comprise)”和“包含(contain)”以及这些词语的变形，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，意味着“包括但不限于”，并且不意于(并且并不)排除其他部分、添加剂、组分、整数(integers)或步骤。
356.在本说明书的整个描述和权利要求中，单数涵盖复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词的情况下，说明书应被理解为考虑复数和单数，除非上下文另有要求。
357.结合本发明的具体方面、实施方式或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方式或实施例，除非与其不相容。
358.读者的注意力被引向与本技术相关的本说明书同时提交或先于本说明书提交的所有论文和文献，这些论文和文献与本说明书一起向公众公开，并且所有这些论文和文献的内容通过引用并入本文。
359.本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些这样的特征和/或步骤相互排斥的组合。
360.除非另有明确说明，否则本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的每个特征可被用于相同、等同或类似目的的替代特征所替代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅是一系列等效或相似特征的一个示例。
361.本发明不限于任何前述实施方式的细节。本发明扩展至在本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或者扩展至如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。
362.实施例
363.实施例1
364.将洁净的盖玻片与10μl的400μm抗体(赫赛汀，herceptin)(hoffmann-laroche)溶液一起孵育10分钟，以使其通过非特异性吸附结合至盖玻片。孵育后，通过用tbs缓冲液洗涤盖玻片除去过量和未结合的抗体。使用线内(in-line)氮气空气除去过量的缓冲液。然后将10μl的her2(≈500nm)添加至盖玻片，并在室温下孵育20分钟，以使蛋白与盖玻片中的抗体结合。孵育后，通过用大量tbs缓冲液洗涤除去过量和未结合的蛋白。使用线内氮气空气干燥盖玻片，并用于质量光度计法。将acquiremp(refeyn，uk)设置为每段影片收集18000帧512
×
260像素的roi(感兴趣区域)。对于测量，将10μl的tbs(ph 7.4)添加至盖玻片以找到焦点并获取对照数据来评估由于涂层本身引起的随机结合/解结合事件(对照实验，图2a)。然后除去5μl缓冲液，添加5μl盐酸(1m),不混合，获得第二影片(图2b)。
365.用tbs ph 7.4孵育的经涂覆的盖玻片表明没有蛋白从其表面显著释放(图2a)。
366.向tbs缓冲液中加入hcl来降低缓冲液的ph，以诱导her2蛋白从赫赛汀(herceptin)中释放出来，而赫赛汀大部分保持与表面结合。已知的是，降低缓冲液ph诱导抗体释放结合的抗原，这解释了her2解结合。表面钝化的缺乏允许her2重新结合到玻璃上
的可用空间，这解释了图2b中的大量结合事件(334个结合事件)。解结合事件的数量仍然高于绑定事件(516个解结合事件对334个结合事件)。
367.结果表明，使用诱导释放的条件从抗体(赫赛汀)中释放乳腺癌生物标志物(her2)是可能的，此外，结果表明，可以使用质量光度计法来评估从抗体解结合的生物标志物，并且可以通过评价在释放事件之前和之后与有或没有her2的表面结合的赫赛汀的分子量来确认其释放。这在图1中进行了描绘。制备具有赫赛汀的功能化盖玻片。其与可能包含许多组分的样品一起孵育。赫赛汀与her2(如果存在)特异性结合，而其他组分被洗掉。然后将该表面引入该设备，并拍摄表面的图像，该图像描绘了目标(在文中，为结合或未结合her2的赫赛汀)。然后改变条件，使得赫赛汀从表面释放。然后确定每个目标的光散射的变化，并且可以分配释放的颗粒的质量。该质量将指示是单独释放的赫赛汀(无her2)还是与her2结合的赫赛汀。结合与未结合的赫赛汀的比例可用于指示样品中her2的浓度。
368.实施例2
369.实验装置的总结(图4)
370.用peg和peg-生物素的混合物涂覆玻璃盖玻片(步骤1)。peg是已知的防污涂层，其最大限度地减少非特异性蛋白与表面的结合。peg-生物素聚合物中存在的生物素分子在与链霉亲和素一起孵育时将与该蛋白结合(步骤2)。
371.现在通过生物素结合至涂层的链霉亲和素被用作经生物素标签化的蛋白的捕获剂，在这种情况下是用生物素标签化的赫赛汀抗体(步骤3)。玻璃表面peg的存在最大限度地减少了其他蛋白的附着。因此，即使赫赛汀-生物素(herc-b)与其他蛋白(诸如血清蛋白)的复杂混合物在表面孵育，孵育和洗涤后留在玻璃中的唯一蛋白将是经标签化的抗体herc-b(步骤3)。
372.链霉亲和素对游离生物素的亲和力明显高于其对经标签化的分子(诸如经标签化的抗体)的亲和力，因此，向盖玻片中添加高浓度的游离生物素将促进抗体从玻璃表面的释放(步骤4)。这种释放可以通过测量表面处光散射并记录信号幅度的变化来经由质量光度计法测定。
373.详细方案-盖玻片的制备:
374.用(9∶1)比例的peg和peg-生物素涂覆洁净的盖玻片。将经涂覆的盖玻片与链霉亲和素(50μl，200nm)一起孵育30分钟，以使链霉亲和素与涂层上的生物素结合。孵育后，彻底洗涤盖玻片并进行干燥。
375.为了确定涂层是否会促进herc-b的选择性结合并有效减少与表面结合的其他蛋白，在盖玻片上孵育之前，将herc-b与经稀释的胎牛血清(fbs)混合。将fbs在pbs中稀释2倍，并与herc-b混合至经标签化的抗体的最终浓度为100nm。然后将得到的复合物和高浓度蛋白混合物在盖玻片上孵育30分钟，然后洗涤以除去未结合的蛋白，干燥并用在质量光度计法测量值中。
376.质量光度计法测量值和结果：
377.当herc-b是复杂样品的一部分时，从经涂覆的盖玻片上释放herc-b之后：
378.将制备的盖玻片引入质量光度计中，记录初始测量值，使用大fov跟踪从盖玻片释放的蛋白或结合到盖玻片的蛋白500秒。
379.简而言之，测量如下进行：
380.将孔与20μl pbs一起孵育约5分钟，以使表面重新水合。在该短暂孵育后，除去pbs，添加新鲜的pbs，进行对照测量。基线或对照测量期间检测到的事件解释了涂层和背景噪音上的非特异性解结合/结合。在对照测量之后，除去pbs，将游离生物素以25mm的浓度加入到玻璃中，在相同的孔上进行测量。
381.结果(表1和图5)表明，生物素的存在显著增加了检测到的事件的总数，特别是解结合事件的数量可能与接近herc-b抗体预期的150kda的分子量有关(图5)。表1总结了在76至273kda范围内检测到的结合和解结合事件的数目，假设在该范围内将检测到各种颗粒的释放。
382.数据显示，游离生物素添加后的第一个500秒，促进了在herc-b mw范围内的460个事件的释放(图5中的深灰色线)。连续测量显示了更多的计数，但是结合(未显示)和解结合事件(图5，浅灰色线)的数目之间的差异较小，表明大多数解结合事件发生在第一个500秒内。与pbs对照相比，两个时间点的结合时间与解结合事件的差异更大，表明生物素促进经标签化的抗体的受控释放(表1)。
383.此外，使用生物素检测的大多数释放事件使得能够计算出释放的颗粒的分子量接近于herc-b释放所预期的预期分子量释放，表明涂层已经有效地从复杂的高浓度蛋白混合物中捕获了抗体，其中该复杂的高浓度混合物由牛血清中存在的普通蛋白(非常高的浓度)和以低浓度(100nm)混合的herc-b组成。
384.图5仅描绘了检测到的负质量事件，即解结合事件。检测到负质量是因为监测表面处的复合物(目标)释放颗粒(在这种情况下是herc-b)。鉴于这种抗体的分子量是已知的，就有可能监测涉及从表面释放预期质量的解结合事件。图5是从表面释放的质量(kda)相对于计数的直方图。描绘了三组数据—深灰色线和浅灰色线表示用25mm生物素(重复2次)获得的结果。最黑的线表示用pbs代替生物素的结果。
385.表1：总结了与76和273kda之间的分子量相关的与玻璃结合和解结合的事件数目，解结合和结合事件数量之间的差异，以及与对照(pbs)相比解结合的结合事件的增加(以百分比计算)
[0386][0387]
因此，该实施例证实了生物素在本发明方法中用作释放剂的能力，以及生物素化的peg固定链霉亲和素捕获剂的效用。尽管记录了结合事件，但这对于本发明的方法并不重要。抗体的释放可被检测为释放事件，并且表面处变化的幅度可用于为颗粒分配分子量。

技术特征：
1.一种用于通过干涉光散射或质量光度计法检测样品中生物标志物的方法，其中所述方法包括：i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合所述样品中存在的所述生物标志物；ii)在允许所述样品中的生物标志物与所述捕获剂结合的条件下，使所述表面与所述样品接触；iii)界定所述表面的第一检测区域，并使用光散射对表面进行测量；iv)释放与所述表面结合的颗粒，其中所述颗粒选自：i.从与所述生物标志物结合的所述捕获剂释放的生物标志物；ii.包含与所述捕获剂结合的所述生物标志物的复合物；和/或iii.未结合的捕获剂；v)通过确定表面处光散射的变化来检测从所述表面的第一检测区域释放的颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤v)包括确定所述表面的质量损失。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述表面的质量损失允许确定所述颗粒的身份。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤iv)包括：将释放剂施加至所述表面的检测区域。5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤iv)包括：改变所述表面的检测区域的化学环境；酶消化所述捕获剂和/或光解所述捕获剂。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述释放剂是酶、光、缓冲液或化学试剂。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述表面的检测区域被钝化、活化、涂覆、处理或衍生化。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，用于测量生物标志物的浓度，其中所述方法包括：i)确定权利要求1的颗粒的所预期的质量，ii)确定从所述表面释放的所预期的质量的颗粒数目或对比度；以及任选地，iii)将ii)的结果与标准曲线或校准曲线进行比较。9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，包括：对所述表面的第二检测区域或另外的检测区域重复步骤iv)和步骤v)。10.一种通过干涉光散射或质量光度计法诊断与受试者中生物标志物的存在或量相关的疾病或病症的方法，其中所述方法包括：i)在溶液中提供表面，所述表面上固定有捕获剂，其中所述捕获剂能够结合样品中存在的生物标志物；ii)在允许所述样品中的生物标志物与所述捕获剂结合的条件下，使所述表面与所述样品接触；iii)界定所述表面的第一检测区域，并使用光散射对表面进行测量；iv)释放与所述表面结合的颗粒，其中所述颗粒选自：i.从与所述生物标志物结合的所述捕获剂释放的生物标志物；ii.包含与所述捕获剂结合的所述生物标志物的复合物；和/或iii.未结合的捕获剂；v)通过确定光散射的变化来检测从所述表面的第一检测区域释放的颗粒，其中i)或ii)的存在或不存在指示所述受试者中疾病或病症的存在、严重性或发展可
能性。11.根据权利要求10所述的方法，其中方法如权利要求1至9中任一项所限定。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括：i)提供表面；ii)提供待分析生物标志物的存在和/或量的样品；iii)将捕获剂固定在所述表面上，所述捕获剂特异性结合待检测的生物标志物。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤ii)包括：将所述表面与所述样品在合适的条件下孵育合适的时间段，以允许所述样品中存在的生物标志物与固定在所述表面上的所述捕获剂结合。14.一种选择受试者的方法，所述受试者将被施用物质或组合物或者将被开具治疗或给药方案，其中所述物质或组合物或方案适合于治疗或预防与来自所述受试者的样品中生物标志物的存在或量相关的疾病或病症，所述方法包括权利要求10至13中任一项所限定的诊断方法。15.一种治疗或预防根据权利要求10至13中任一项诊断的患有疾病或病症的受试者或具有所述疾病或病症的发展可能性的受试者中的疾病或病症的方法，其中所述方法包括：向所述受试者施用物质或组合物，或者向所述受试者开具方案，以有效治疗或预防所述受试者中的所述疾病或病症。16.物质或组合物，所述物质或组合物用于治疗或预防根据权利要求10至13中任一项诊断的患有疾病或病症的受试者或具有所述疾病或病症的发展可能性的受试者中的疾病或病症。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物是蛋白及其片段、肽、多肽、蛋白聚糖、糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物、脂质、核酸、有机或无机化学品、天然聚合物，或小分子，或者它们的组合。18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获剂是抗体或其衍生物、核酸、蛋白、无机分子或聚合物。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获剂包含一个或多个切割位点，用于化学消化、酶消化或光解切割，以从所述捕获剂释放生物标志物和/或从所述表面释放捕获剂。20.一种检测生物分子的修饰的方法，包括：根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述生物标志物指示经修饰的生物分子的存在。21.一种用于检测样品中两种或更多种生物分子之间相互作用的方法，包括：根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述生物标志物指示所述两种或更多种生物分子之间相互作用的存在。22.一种检测样品中污染的方法，包括：根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述生物标志物指示所述样品的污染。23.一种对产物的表达水平进行定量的方法，包括根据权利要求8所述的方法，其中所述生物标志物指示表达产物的存在。24.一种试剂盒，包括：表面、捕获剂、缓冲液、权利要求1至23中任一项中所定义的方法的使用说明、样品收集装置、用于校准的一种或更多种标准生物标志物样品，以及任选的介
导所述生物标志物或捕获剂从表面释放的试剂。25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述试剂是化学试剂或酶。

技术总结
描述了通过光散射显微镜法检测样品中生物标志物的方法和试剂盒。本发明对于检测复杂样品中的低丰度生物标志物尤其有用，并且适合用在护理点环境中。在实施方式中，本发明的方法描述了使用质量光度计法检测样品中的生物标志物。标志物。标志物。


技术研发人员：安娜
受保护的技术使用者：雷费恩有限公司
技术研发日：2021.09.21
技术公布日：2023/8/1