疫苗的制作方法

疫苗
发明领域
1.本发明涉及用于靶向抗原递送至禽抗原呈递细胞的工程蛋白。本发明还涉及作为靶向抗原递送疫苗(tadv)或抗原靶向疫苗(atv)的禽疫苗。疫苗保护禽受试者免受包含至少一种抗原的病原体的后续攻击。本发明还涉及此类疫苗治疗和/或预防禽受试者的疾病的用途。
2.发明背景
3.疫苗是减少疾病(诸如癌症或感染性疾病)对养殖动物和人的影响的主要工具。
4.家禽疫苗设计中采用了若干方法。 目前，实践了针对家禽疾病的三种主要疫苗配制剂。这些包括灭活疫苗、减毒活疫苗和载体疫苗。
5.大多数获得许可的家禽疫苗是灭活疫苗并主要在含胚鸡蛋中生产，并且在灭活后，用佐剂重构这些病毒。这些疫苗具有一些固有缺点，包括对接种疫苗的鸟类的次优保护。例如，尽管对个别鸟类施用多剂(例如，一年期间对蛋鸡施用2至5剂)，感染性病毒可能继续在接种疫苗的鸟群中传播；接种疫苗的鸟类不易通过普通血清学检测与天然感染的鸟类区分开；来自灭活疫苗的残留致病性可能导致病原体，这可能促成或加剧爆发；与制造疫苗相关的生物危害；以及当使用高致病性株作为疫苗种子病毒时，含胚鸡蛋的低产率阻碍它们的成本效益生产。
6.以多剂量施用的许多疫苗，诱导可能保护免受临床疾病和死亡的次优免疫，不能防止接种疫苗动物的感染性病原体的脱落。因此，疾病的地方性循环仍在继续。
7.近年来，已经开发各种策略来增强疫苗的免疫原性。一种此类策略是atv或重组tadv技术。该疫苗平台将抗原选择性递送至称为抗原呈递细胞(apc)的宿主免疫细胞，这些抗原呈递细胞捕获、加工和呈递抗原以启动和维持免疫应答，从而将保护性抗原选择性递送至专职性apc，诸如树突状细胞(dc)、巨噬细胞和b细胞。这些细胞捕获、加工抗原并将其呈递至t淋巴细胞，用于启动和维持免疫应答。
8.以前，各种研究探索了经由内吞作用-205(dec205)的dc受体至哺乳动物apc的基于抗体的靶向，但收效有限。dec205是甘露糖受体家族的c型外源凝集素内吞受体并且显示经由主要组织相容性复合物ii(mhcii)途径增强抗原呈递。可用于靶向禽apc以调节家禽疫苗的免疫原性的数据有限。
9.需要改良的疫苗来控制疾病和/或防止疾病在禽受试者中传播。


技术实现要素：

10.一般而言，本发明涉及将抗原直接递送至禽免疫细胞并增强禽疫苗的效价和功效。
11.在一个方面，本发明提供了工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和至少一种抗原性多肽。
12.在一个方面，工程蛋白是基因工程蛋白。
13.适当地，抗原性多肽可以包含抗原的部分或全部。
14.适当地，抗原性多肽可以是抗原的部分或全部(例如，抗原性多肽可以包含抗原的一个或多个域或由抗原的一个或多个域组成)。
15.在一个方面，本发明提供了工程蛋白(诸如基因工程蛋白)，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
16.至少一个结合域和至少一种抗原性多肽或至少两个结合域可以包含在单个重组蛋白中。
17.能够与细胞表面蛋白结合的至少一个结合域可以可操作地连接至至少一种抗原性多肽或能够与抗原结合的至少一个结合域。
18.抗原呈递细胞可以是树突状细胞、巨噬细胞、b细胞、t细胞或自然杀伤细胞中的至少一种。
19.禽抗原呈递细胞可以选自树突状细胞、巨噬细胞、b细胞、t细胞或自然杀伤细胞中的至少一种。
20.细胞表面蛋白可以选自免疫球蛋白家族蛋白、整联蛋白家族受体或c型凝集素。
21.细胞表面蛋白可以选自cd83、cd11c或dec205。细胞表面蛋白可以是cd83。
22.至少一种抗原性多肽可以是禽流感病毒抗原性多肽，诸如血凝素抗原性多肽。
23.根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白)可以包含信号肽。
24.根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白)可以包含改善工程蛋白的溶解、稳定和/或折叠的域。特别地，该域可以改善抗原的溶解、稳定和/或折叠。
25.结合域可以基于或者可以是抗体或抗体片段的抗原结合位点，诸如单链可变片段(scfv)、fv、f(ab’)或f(ab’)2。
26.在另一个方面，本发明提供了核酸构建体，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，该第一多核苷酸编码能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；该第二多核苷酸编码至少一种抗原性多肽或能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
27.在另一个方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明的核酸构建体。
28.在另一个方面，本发明提供了工程改造细胞，其表达根据本发明的工程改造蛋白，或包含根据本发明的核酸构建体，或包含根据本发明的载体。
29.在另一个方面，本发明提供了禽疫苗，其包含根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白)、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的载体以及药学上可接受的载剂。
30.在一个方面，提供了根据本发明的禽疫苗用于治疗和/或预防受试者的疾病。
31.在另一个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的根据本发明的疫苗的步骤。
32.适当地，根据本发明的疫苗的施用可以在受试者中引发体液和/或细胞免疫应答。
33.适当地，根据本发明的疫苗的施用可以降低受试者中的攻击病原体负载(诸如病毒负载、细菌负载或寄生物负载)。
34.适当地，施用根据本发明的疫苗可以在受试者中引发交叉反应性抗体的产生。
35.适当地，受试者可以是禽受试者。
36.适当地，受试者可以是家禽，例如受试者可以选自鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽或鹅。
37.在另一个方面，本发明提供了用于制备根据本发明的疫苗的方法，该方法包括将根据本发明的基因工程蛋白、根据本发明的核酸构建体，和/或根据本发明的载体，和药学上可接受的载剂混合的步骤。
38.在进一步的方面，本发明提供了根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白)、根据本发明的核酸构建体和/或根据本发明的载体在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
附图说明
39.图1显示了scfv和h9ha胞外域融合的scfv抗体表达盒的示意性代表。(a)scfv表达盒包含位于5’末端的启动子和黑腹果蝇(drosophila melanogaster)免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)分泌信号序列，接着是apc特异性mab可变轻链(vl)、接头肽(gly4ser)4和可变重链(vh)。(b)表达盒包含位于5’末端的bip分泌信号序列，接着是h9ha基因，其与血凝素三聚信号(表示为foldon)融合，与apc特异性mabvl、接头肽(gly4ser)4和vh连接。
40.图2显示了重组血凝素构建体的示意性代表。(a)全长a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2血凝素前体(ha0：1-560个氨基酸(aa))，ha1：19-338aa，ha2：339-560aa)tm＝跨膜域(510-550aa)ct＝胞质尾域(550-560aa)。(b)可溶性a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2构建体。可溶性h9ha构建体通过除去tm和ct域(510-560aa)并将血凝素的c端融合到来自t4的三聚体蛋白fibritin的30aa长三聚foldon序列而生成。
41.图3显示了重组蛋白的his标签纯化结果。(a)scfv抗体的his标签纯化。纯化蛋白的大小为约30kda。泳道1：来自未转染细胞的对照上清液；泳道2：dec205 scfv；泳道3：cd11c scfv；泳道4：cd83 scfv。(b)h9ha foldon和h9hafoldon-scfv的his标签纯化。纯化蛋白的大小分别为约70kda和100kda。泳道1：来自未转染细胞的对照上清液；泳道2：h9ha foldon；泳道3：h9ha foldon
–
dec205 scfv；泳道4：h9ha foldon
–
cd11c scfv；泳道5：h9ha foldon
–
cd83 scfv。
42.图4显示了确定具有foldon的重组h9ha胞外域的寡聚体形式的交联实验的结果。泳道1：不含交联剂双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(bissulfosuccinimidyl suberate，bs3)的h9ha foldon；泳道2：具有10 mm bs3的h9ha foldon；泳道3：不含bs3的h9ha foldon-scfv；泳道4：具有10mm bs3的h9ha foldon-scfv。m＝单体(70kda*100kda^)d＝二聚体(140kda*200kda^)t＝三聚体(210kda*300kda^)*h9ha foldon^h9ha foldon-scfv。
43.图5显示了表1；测试具有foldon的重组h9ha的活性的血凝测定的结果。
44.图6显示了scfv和h9ha foldon-scfv的表征。(a)用于测试scfv和h9ha foldon-scfv的结合和检测的间接elisa。(b)通过h9ha foldon-cd11c scfv进行从鸡脾细胞提取物中的cd11c受体蛋白的检测。泳道1代表仅介质对照；泳道2代表鸡脾细胞提取物。cd11c蛋白的预期分子量为150kda(箭头所示)。
45.图7显示了在用scfv抗体刺激后脾细胞的细胞因子和趋化因子产生。(a)脾细胞中的细胞因子(ifnγ、il6、il1β、il4和il18)和趋化因子(cxcli2)mrna水平。使用2-δδct方法计算数据(与仅介质对照组相比的n倍变化)并报告为相对于管家基因核糖体磷蛋白侧柄亚基po(rplpo1)的表达水平归一化的值。(b)刺激脾细胞后的ifnγ蛋白水平。对于(a)和(b)两者，数据通过单向anova、随后的tukey多重比较检验进行分析。测试scfv和对照scfv
之间的统计显著性已用星号显示。*p《0.05。
46.图8显示了在用h9ha foldon和h9ha foldon-scfv刺激后脾细胞的细胞因子和趋化因子产生。(a)脾细胞中的细胞因子(ifnγ、il6、il1β、il4和il18)和趋化因子(cxcli2)mrna水平。使用2-δδct方法计算数据(与仅介质对照组相比的n倍变化)，并报告为相对于管家基因rplpo1的表达水平归一化的值。(b)刺激脾细胞后的ifnγ蛋白水平。对于小图(a)和(b)两者，数据均通过单向anova、随后的tukey多重比较检验进行分析。h9ha foldon-scfv疫苗(靶向)和h9ha foldon疫苗(非靶向)组之间的统计显著性已用星号显示。***p《0.001**p《0.01*p《0.05。
47.图9显示了表2；血清血凝抑制(hi)抗体滴度测定的结果。进行hi测定以确定疫苗接种鸡的血清中的hi抗体滴度。hi滴度表示为导致4个单位的病毒血凝活性完全抑制的抗血清的最高稀释的倒数。显示每(n＝8)的平均数据。图例：《表示小于5的hi滴度；-表示不适用
48.图10显示了免疫鸡的血清中的ha特异性igy、igm和iga抗体水平(35μg剂量)。通过elisa在初次接种疫苗后第6、14、21和28天收集的200倍稀释血清中测定抗体的ha特异性同种型。数据表示为平均值
±
sd，并通过单向anova、随后的tukey多重比较检验进行分析。h9ha foldon-scfv(靶向)和h9ha foldon(非靶向)组之间的统计显著性已用星号显示****p《0.0001***p《0.001**p《0.01*p《0.05。治疗组的符号说明从左到右提供。
49.图11显示了表3；通过病毒微量中和(mnt)测定法测量的用h9ha foldon或含有cd83 scfv、cd11c或dec205的h9ha foldon、灭活h9n2病毒和pbs对照免疫的鸡的血清中的病毒中和抗体滴度。mnt滴度表示为阻断用150tcid
50
(50％组织培养感染剂量)接种的培养细胞中的病毒感染性的抗血清最高稀释的倒数。显示了平均数据(n＝8)。
50.图12显示了病毒攻击后鸡的生存和平均体重增加。小图a)显示了用h9n2病毒攻击的接种疫苗和pbs处理的对照鸡之间的生存百分比。显示了直接感染pbs对照组(第4-8天的底部线)和直接感染或接触接种疫苗组之间的生存曲线显著不同p值＝《0.05(对数秩(mantel-cox)检验)。小图b)显示了用h9n2病毒攻击的接种疫苗和pbs处理的对照鸡之间的平均体重增加百分比。数据通过单向anova、随后的tukey多重比较检验进行分析。接种疫苗和pbs处理的对照组之间的统计学显著性用星号表示****p《0.0001。
51.图13显示了用h9n2病毒攻击的接种疫苗和pbs处理的对照鸡的颊脱落概况。小图(a)显示了在感染后不同天数的鸡的颊脱落概况，每只鸡由单个点表示。小图(b)显示了对于直接感染鸟类，每组至少6只鸡的平均颊脱落概况。小图(c)显示了对于接触鸟类，每组至少6只鸡的平均颊脱落概况。数据表示为均值
±
sd，并通过单向anova，随后是用于(a、b)的tukey多重比较检验进行分析和用于(c)的未配对t检验进行分析。对于小图(b)，星号表示h9hafoldon和h9ha foldon-cd83 scfv(直接)组之间的显著差异。****p《0.0001***p《0.001**p《0.01*p《0.05。对于小图(a)，治疗组的符号说明从左到右提供。
52.图14显示了表4：血清hi抗体滴度测定的结果。这使用疫苗病毒株udl01/08和uae/415两者进行hi测定以确定接种疫苗鸡的血清中的hi抗体滴度。hi滴度表示为抑制4个单位的病毒血凝活性的抗血清的最高稀释的倒数。显示每(n＝10)的平均数据。图例《表示小于5的hi滴度。
53.图15显示编码氨基酸seq id no:62的核苷酸序列seq id no:65。seq id no:65按
顺序包含以下域：bip信号-h9ha胞外域-foldon-接头-dec205 scfv-v5-his标签-核苷酸序列。
54.图16显示编码氨基酸seq id no: 63的核苷酸序列seq id no: 66。seq id no: 66按顺序包含以下域：bip信号-h9ha胞外域-foldon-接头-cd83
55.scfv-v5-his标签-核苷酸序列。
56.图17显示编码氨基酸seq id no: 64的核苷酸序列seq id no: 67。seq id no: 67按顺序包含以下域：bip信号-h9ha胞外域-foldon-接头-cd11c scfv-v5-his标签-核苷酸序列。
57.图18显示基因工程蛋白的示意图，该基因工程蛋白包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；以及能够与抗原结合的至少一个结合域，其中基因工程蛋白是包含能够与病毒抗原结合的结合域的双特异性蛋白。
58.图19显示elisa结果，其证明双特异性scfv抗体与禽流感病毒的结合。ig10是可以与a/ck/pakistan/h9n2/udl 01/08禽流感病毒的血凝素蛋白结合的非中和性scfv抗体。ig10-cd83是通过重组缀合ig10 scfv和cd83 scfv制备的双特异性抗体。
59.图20显示elisa结果，其证明双特异性scfv抗体与鸡cd83受体蛋白的结合。
60.图21显示编码氨基酸seq id no: 68的核苷酸序列seq id no: 69。seq id no: 69按顺序包含以下域：cd33信号-ig10 scfv-(甘氨酸4丝氨酸)4接头-cd83 scfv-c标签。
61.图22 用h5ha-foldon-cd83scfv和h9ha-foldon接种疫苗的鸡的血清中hi抗体滴度的分析。hi滴度表示为导致4个ha单位的病毒血凝活性的总抑制的血清的最高稀释的倒数。数据表示为均值
±ꢀ
sd，并通过单向anova和未配对学生t检验进行分析。***p《0.005。
62.图23 使用hdr-crispr/cas9系统生成表达h9ha-foldon-cd83scfv和h9ha-foldon抗原的rhvt的示意图。
63.图24 rhvt-foldon-h9ha和rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv的生长动力学。在用100 pfu的每种病毒感染后的不同时间点，通过(a)噬斑滴定和(b)从受感染的鸡成纤维细胞(cef)中提取的dna上的hvt sorf1基因的qrt-pcr测量病毒滴度。通过计算每10,000个cef细胞的hvt基因组拷贝数来确定病毒生长。数据表示为均值
±ꢀ
sd，并通过单向anova、随后的tukey多重比较检验进行分析。
64.图25用rhvt-h9ha-foldon-cd83 scfv和rhvt-h9ha-foldon接种疫苗的鸡的血清中hi抗体滴度的分析。hi滴度表示为导致4个ha单位的病毒血凝活性的总抑制的血清的最高稀释的倒数。数据表示为均值
±
sd，并通过单向anova和未配对学生t检验进行分析。****p《0.0001，*p《0.05
65.图26用rhvt-h9ha-foldon和rhvt-h9ha-foldon-cd83 scfv接种疫苗的鸡的血清中的ha特异性igy抗体。数据表示为均值
±
sd，并通过单向anova、随后的tukey多重比较检验进行分析。****p《0.0001***p《0.001**p《0.01*p《0.05
66.图27用靶向(rhvt-h9ha-foldon cd83scfv)和非靶向(rhvt-h9ha-foldon)疫苗接种疫苗的鸡的血清中病毒中和抗体滴度的分析。数据表示为均值
±
sd，并通过单向anova和未配对学生t检验进行分析。**p《0.01
67.图28构建体的核苷酸序列
68.图29构建体的氨基酸序列
69.图30 rndv-h9ha-foldon-cd83scfv的示意性代表。使用not1和pac1限制性位点将表示为“插入物”的表达盒(h9ha-foldon-cd83scfv)克隆到修饰的ndv基因组中(seq id no:75)。表达盒包括h9n2病毒(a/chicken/pakistan/827/2016，登录号mh180417.1)的ha蛋白胞外域(1-509的氨基酸)。ha的c端与t4 fibritin三聚信号的30个氨基酸序列(表示为foldon)融合。随后是apc特异性cd83scfv的248个氨基酸序列，其由可变轻链(vl)、接头肽(gly4ser)4和可变重链(vh)构成。随后是4个氨基酸(epea)c标签序列。
70.图31用rndv-h9ha-foldon-cd83scfv和ndv对照(无h9ha插入物)接种疫苗的鸡的血清中h9ha特异性hi抗体滴度的分析。hi滴度表示为导致4个ha单位的h9n2病毒血凝活性的总抑制的血清的最高稀释的倒数。数据表示为均值
±
sd。
71.发明详述
72.本发明提供了能够将货物靶向禽抗原呈递细胞的工程蛋白。工程蛋白包含能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域。货物通常能够在禽受试者中引发免疫应答，诸如体液和/或细胞免疫应答。因此，根据本发明的工程蛋白可以用于禽疫苗或用作禽疫苗。适当地，货物可以是至少一种抗原性多肽，诸如来自禽病原体的抗原(例如，来自病毒、细菌或寄生物的抗原)。适当地，货物可以是能够与至少一种抗原性多肽，诸如来自鸟类病原体的抗原(例如，来自病毒、细菌或寄生物的抗原)结合的至少一个结合域。
73.如本文所用，“工程蛋白”是指基因工程蛋白和化学工程蛋白两者。
74.在一个方面，本发明提供了基因工程蛋白。
75.在一个方面，本发明提供了化学工程蛋白。
76.在一个方面，工程蛋白是一种多肽。
77.基因工程蛋白
78.如本文所用，“基因工程蛋白”是指已使用重组技术设计和合成的蛋白质。
79.在一个方面，基因工程蛋白是重组蛋白。在一个方面，基因工程蛋白是一种单个重组蛋白。基因工程蛋白可以使用重组dna技术进行设计、合成和融合。适当地，基因工程蛋白可以由已经重组融合在一起的域组成。
80.本发明提供了基因工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
81.a)至少一种抗原性多肽；或
82.b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
83.在一个方面，基因工程蛋白由单个开放阅读框编码。在一个方面，基因工程蛋白是单个重组蛋白。
84.在一些方面，基因工程蛋白不通过化学缀合产生。
85.换言之，基因工程蛋白包含：
86.a)能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
87.b)至少一种抗原性多肽；或
88.c)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域，其中a)和b)或a)和c)通过氨基键接合。
89.与生产抗体靶向疫苗的其他方法相比，重组工程蛋白可能更具可重复性和可扩展性。在一些情况下，化学缀合可以降低或消除蛋白质的活性。
90.在一个方面，至少一个结合域可操作地连接至至少一种抗原性多肽；或能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
91.当递送至受试者时，基因工程蛋白能够治疗和/或预防所述受试者的疾病。当施用于受试者时，基因工程蛋白可能能够引发体液和/或细胞免疫应答或减少攻击病原体负载(例如病毒负载、细菌负载或寄生物负载)。
92.如本文所用，术语“可操作地连接”是指并列，其中所描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。
93.例如，在载体或表达构建体的情况下，能够驱动核酸序列表达的启动子可操作地连接至所述核酸序列。
94.例如，在工程蛋白的背景下，能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的结合域定位a)至少一种抗原性多肽或b)能够与禽抗原呈递细胞的细胞表面上的至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域，该能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的结合域分别可操作地连接至a)或b)。
95.在一个方面，基因工程蛋白是融合蛋白。
96.如本文所用，“融合蛋白”或嵌合蛋白是指包含至少两个域的蛋白质，该至少两个域由单独的基因天然编码但已连接在一起，所以它们被转录和翻译以产生单个多肽。
97.融合蛋白可以由其中结合域和抗原性多肽直接或间接附接的核酸编码。间接附接的实例是在域之间提供合适的间隔基团，诸如肽接头。
98.在一个方面，结合域和抗原性多肽通过肽键连接或接合。
99.合适的间隔物的实例是肽接头。肽接头可以分为三组，柔性的、刚性的和可切割的。柔性接头通常由小的非极性或极性残基，诸如gly、ser和thr构成。例如，柔性肽接头可以是富含甘氨酸和/或丝氨酸的肽。合适的肽接头可以包含4-20、4-15、4-10、8-20或8-15个氨基酸。合适的肽接头的实例是本领域已知的并且包括但不限于ggsggs (seq id no: 34)、sgsgsgs (seq id no: 35)、ggggsggggs (seq id no: 36)、gsgsgsgsgs (seq id no:37)、ggsggsggsggs (seq id no: 38)和ggggsggggsggggs (seq id no: 39)。
100.更刚性的接头可以包括脯氨酸残基或聚脯氨酸基序，诸如富含脯氨酸的序列。例如，合适的间隔物可以包括富含脯氨酸的序列(xp)n其中x是任何氨基酸，优选地ala、lys或glu或富含脯氨酸和甘氨酸的接头(pgpg)n。刚性接头可以包括形成α螺旋的接头，例如，包含(eaaak)n的序列。
101.可切割接头可以包括环肽接头、体内可切割二硫化物接头，诸如leagcknffpr*sftscgsle (seq id no: 33)，其中*表示切割位点。其他可切割接头可以包括四肽，诸如gly-phe-leu-gly (seq id no: 70)和ala-leu-ala-leu (seq id no: 71)。可切割接头允许在体内分离域。
102.适当地，工程蛋白可以是单个重组蛋白质。
103.适当地，工程蛋白可以由核酸构建体编码，该核酸构建体包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，该第一多核苷酸编码能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；该第二多核苷酸编码至少一种抗原性多肽；或能够与至少一种抗原性多肽结合的第二结合域。
104.在一个实施方案中，本发明提供了基因工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞
上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和能够与抗原结合的至少一个结合域。
105.在一些方面，能够与抗原结合的结合域是非中和的。
106.通常，能够与抗原结合的至少一个结合域将能够与来自鸟类病原体的抗原结合。适当地，禽病原体可以选自任何病原体，例如选自病毒、细菌或寄生物。
107.在一些方面，抗原可以存在于病毒诸如灭活病毒的表面上。在一些方面，抗原可以存在于细菌诸如灭活细菌的表面上。在一些方面，抗原可以存在于寄生物诸如灭活寄生物的表面上。
108.抗原可能来自正粘病毒科(orthomyxoviridae family)的病毒。例如，禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)。抗原可能来自副粘病毒科(paramyxoviridae family)的病毒。例如，新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)。抗原可能来自冠状病毒科(coronaviridae family)的病毒。例如，传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，ibv)。抗原可能来自双rna病毒科(birnaviridae family)的病毒。例如，传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)。抗原可能来自指环病毒科(anelloviridae family)的病毒。例如，鸡贫血病毒(chicken anaemia virus，cav)。抗原可能来自呼肠孤病毒科(reoviridae family)的病毒。例如，禽呼肠孤病毒(avian reovirus，arv)。抗原可能来自腺病毒科(adenoviridae family)的病毒。例如鸭腺病毒a(duck atadenovirus a.)或家禽腺病毒(fowl adenoviruses)(fadv的2、4、8、11)。
109.适当地，能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；以及并且能够与抗原结合的至少一个结合域包含在单个重组蛋白中。
110.适当地，能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域可操作地连接到能够与抗原结合的至少一个结合域。
111.抗原呈递细胞
112.在一个方面，本发明提供了基因工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
113.a)至少一种抗原性多肽；或
114.b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
115.抗原呈递细胞可以是任何禽抗原呈递细胞。
116.在一些方面，基因工程蛋白包含至少一个结合域，其能够与树突状细胞、巨噬细胞、b细胞或自然杀伤细胞中的至少一种上的细胞表面蛋白结合。适当地，结合域可能能够结合树突状细胞。适当地，结合域可能能够结合巨噬细胞。适当地，结合域可能能够结合b细胞。适当地，结合域可能能够结合自然杀伤细胞。
117.在一些方面，结合域可能能够与选自树突状细胞、巨噬细胞、b细胞或自然杀伤细胞的两种或更多种或三种或更多种或所有四种细胞结合。
118.细胞表面蛋白
119.在一个方面，本发明提供了工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；a)至少一种抗原性多肽；或
120.b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
121.细胞表面蛋白可以是本文所述的任何禽细胞表面蛋白。
122.在一个方面，细胞表面蛋白选自免疫球蛋白家族蛋白、整合素家族受体或c型凝集
素。
123.cd83是属于免疫球蛋白(ig)超家族成员的跨膜糖蛋白。cd83在大多数dc的表面表达，包括胸腺dc、皮肤中的朗格汉斯细胞、用gm-csf和il4培养后的单核细胞衍生dc，以及脾脏内的指突状网状细胞(interdigitating reticulum cell)。cd83也发现于巨噬细胞、中性粒细胞和nk细胞的表面。cd83被认为与免疫应答有关，但其对dc和t细胞的功能仍不清楚。基于cd83的表达谱及其与b7家族成员(cd80/cd86)的结构相似性，cd83被认为在免疫系统细胞间的相互作用期间发挥重要作用。
124.在一个方面，细胞表面蛋白可以是免疫球蛋白家族蛋白，诸如cd83。在一个方面，细胞表面蛋白是cd83。
125.cd11c是在多种白细胞，包括dc、巨噬细胞、nk细胞、b和t细胞上表达的beta2(β2)整合素。整合素在先天免疫中发挥重要作用。它们参与吞噬细胞与内皮细胞和细胞外基质的相互作用、补体调理病原体的摄入和细胞因子产生。此外，它们还参与适应性免疫过程中淋巴细胞的增殖、存活和分化。
126.在一个方面，细胞表面蛋白可以是整合素家族受体，诸如cd11c。在一个方面，细胞表面蛋白是cd11c。
127.c型凝集素受体(clr)属于跨膜和可溶性受体的大家族，其可以以钙依赖性方式识别病原体上的多种聚糖。
128.dec205是i型clr，由单条多肽链组成；细胞外部分含有n端富含半胱氨酸的域、ii型纤连蛋白域和10个碳水化合物识别域(crd)。在哺乳动物中，dec205的表达主要限于树突状细胞和胸腺皮质上皮细胞，尽管人dec205也可以在外周t细胞和b细胞、自然杀伤(nk)细胞和巨噬细胞上检测到。在鸡中，已在cd4+ve、cd8+ve和γδt淋巴细胞、b淋巴细胞和巨噬细胞中检测到dec205的低水平表达，其中树突状细胞上表达最多。已表征dec205在抗原摄取、加工和呈递中的功能。
129.在一个方面，细胞表面蛋白可以是c型凝集素，诸如dec205。在一个方面，细胞表面蛋白是dec205。
130.化学工程蛋白
131.在其他方面，本发明提供了化学工程蛋白。
132.如本文所用，“化学工程蛋白”是指包含由非氨基(或辅基或辅因子)接合在一起的域的蛋白质。换言之，该蛋白质包含在没有氨基键的情况下接合在一起的域。
133.本发明提供了化学工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
134.a)至少一种抗原性多肽；或
135.b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
136.换言之，化学工程蛋白包含：
137.a)能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
138.b)至少一种抗原性多肽；或
139.c)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域；其中a)和b)或a)和c)已经化学缀合。
140.用于化学缀合蛋白质的方法是本领域已知的并且包括例如在两种或更多种单独
的蛋白质之间形成稳定的共价键。化学缀合的实例包括使用交联试剂，其通常含有将连接到蛋白质中发现的官能团(例如伯胺、巯基、羰基、碳水化合物或羧酸)的两个或更多个化学反应性基团。交联剂可以是同双功能、异双功能或光反应性的。
141.在一个方面，可以通过交联两种或更多种蛋白质来产生化学工程蛋白，该两种或更多种蛋白质包含能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和至少一种抗原。
142.例如，可以通过使用将胺交联至巯基的异双功能交联剂，例如使用硫醇化剂，然后是磺基-smcc(磺基琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)试剂进行交联，从而产生化学工程蛋白。
143.抗原呈递细胞
144.在一个方面，本发明提供了化学工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
145.a)至少一种抗原性多肽；或者
146.b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域；其中禽抗原呈递细胞是巨噬细胞、b细胞或自然杀伤细胞。适当地，结合域可能能够结合巨噬细胞。适当地，结合域可能能够结合b细胞。适当地，结合域的细胞可能能够结合自然杀伤细胞。
147.在一些方面，结合域能够与存在于选自树突状细胞、巨噬细胞、b细胞或自然杀伤细胞的两个或更多个或三个或更多个或所有四种细胞上的细胞表面蛋白结合，细胞表面蛋白发现于树突状细胞和巨噬细胞上。
148.细胞表面蛋白
149.在一个方面，本发明提供了化学工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
150.a)至少一种抗原性多肽；或
151.b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域；其中细胞表面蛋白是免疫球蛋白家族蛋白或整合素家族受体。适当地，细胞表面蛋白可以是免疫球蛋白家族蛋白，诸如cd83。适当地，细胞表面蛋白可以是整联蛋白家族受体，诸如cd11c。
152.在一个方面，细胞表面蛋白是cd83。在一个方面，细胞表面蛋白是cd11c。
153.工程蛋白的方面
154.信号肽
155.在一些方面，根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白或化学工程蛋白)包含信号肽。
156.当包含信号肽的蛋白质在细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网，并随后至细胞表面，在此处它与细胞表面结合或分泌到培养基中。可以使用signalp和targetp方法(nielsen,h., et al., (1997) protein eng., 10, 1
–
6；emanuelsson, o., nielsen,h., brunak,s. and von heijne,g. (2000) j. mol. biol.,300, 1005
–
1016)预测经典蛋白质分泌，其通过引用并入本文。
157.信号肽的长度通常为16到30个氨基酸并且通常位于新合成蛋白质的n端。
158.可以使用的信号肽的实例是bip分泌信号序列，诸如下面的seq id no:1：
159.mklcillavvafvglslg (seq id no: 1)。
160.可以用于本发明的信号肽的另一个实例是cd33信号肽序列。例如下面的seq id no: 40:
161.mplllllpllwagalam (seq id no: 40)。
162.适当地，工程蛋白可以包含具有序列seq id no: 1或seq id no: 40的信号肽，或其具有至少80％同一性的变体，该变体发挥信号序列的功能。
163.溶解/稳定性和折叠域
164.在一些方面，根据本发明的工程蛋白(例如基因工程蛋白或化学工程蛋白)包含改善工程蛋白的溶解、稳定和/或折叠的域。特别地，该域可以改善工程蛋白的溶解、稳定和/或折叠。特别地，该域可以改善抗原的溶解、稳定和/或折叠。
165.用于在各种系统中改善蛋白质生产的方法是本领域众所周知的，并且包括分子伴侣，其作用是将新生蛋白质保存在折叠活性(folding-competent)的构象中并防止聚集。
166.例如，各种蛋白质标签诸如谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、小泛素相关修饰物(sumo)和泛素(ub)可以用于增强溶解度并促进重组蛋白的正确折叠。可以使用亮氨酸拉链、gcn4和gcn4pii以促进蛋白质的寡聚化，诸如二聚化和三聚化。
167.改善工程蛋白或抗原的溶解、稳定和/或折叠的域的实例是foldon。适当地，基因工程或化学工程蛋白可以包含来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的foldon序列，诸如来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的30个氨基酸三聚foldon序列。
168.foldon域通常可以用于改善三聚体蛋白质的溶解、稳定性和/或折叠。例如，foldon域可以用于改善血凝素的溶解、稳定性和/或折叠。foldon域的示例性序列是：
169.gsgyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl (seq id no: 2)
170.适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含具有序列seq id no: 2的foldon域，或其具有至少80％同一性的变体，该变体发挥改善工程蛋白或抗原的溶解、稳定和/或折叠的功能。适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含具有序列seq id no: 2的foldon域或其具有至少15、至少20、至少25、至少26、至少27、至少其28个或至少29个氨基酸的变体。
171.结合域
172.根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白和化学工程蛋白)包含能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域。
173.在一些方面，根据本发明的基因工程蛋白和化学工程蛋白进一步包含能够与抗原结合的至少一个结合域。
174.适当地，工程蛋白可以包含至少两个、至少三个、至少四个、至少5个或至少6个结合域。结合域可能能够与来自一种病原体的不同株(血清型/基因型)的两种或更多种抗原结合，以便针对一种疾病进行免疫。结合域可能能够与来自两种或更多种病原体的两种或更多种抗原结合以针对两种或更多种疾病进行免疫。换言之，工程蛋白可以是双特异性、三特异性、四特异性、多特异性的，即能够与两种或更多种抗原、三种或更多种抗原或四种或更多种抗原结合。
175.能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域(或抗原结合域)是识别并结合抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白的工程蛋白的部分。
176.能够与抗原结合的至少一个结合域(或抗原结合域)是识别并结合抗原，例如灭活病毒、灭活细菌或灭活寄生物上的抗原的工程蛋白的部分。
177.各种结合域是本领域已知的，包括基于抗体、抗体片段、抗体模拟物和t细胞受体的抗原结合位点的那些结合域。
178.在一些方面，在工程蛋白中使用抗体片段以改善溶解度和折叠可能是有利的。
179.能够与选定靶标结合的抗体片段的实例包括fv、scfv、f(ab’)和f(ab’)2。
180.在一个方面，结合域基于或者是单链可变片段(scfv)。scfv可以包含使用接头肽，例如使用甘氨酸-丝氨酸接头诸如(gly4ser)4接合在一起的可变轻链和可变重链。
181.结合域可以是具有包含至少一个互补决定区(cdr)的抗原结合位点的多肽。结合域可以包含3个cdr并具有与域抗体(dab)的抗原结合位点等同的抗原结合位点。结合域可以包含6个cdr并且具有与经典抗体分子的抗原结合位点等同的抗原结合位点。多肽的其余部分可以是为结合位点提供合适的支架并以合适的方式展示它以使其结合抗原的任何序列。结合域可以是免疫球蛋白分子的一部分，诸如fab、f(ab)’2、fv、单链fv(scfv)片段、纳米抗体或单链可变域(其可以是vh或vl链，具有3个cdr)。结合域可以是禽的。结合域可以是嵌合的。
182.结合域可以包含不是衍生自或基于免疫球蛋白的结合域。例如， 已经开发许多“抗体模拟物”设计的重复蛋白(drp)以利用非抗体多肽的结合能力。此类分子包括锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白，例如darpins (设计的锚蛋白重复蛋白)、anticalins、avimers和versabodies。
183.结合域可以与本文定义的细胞表面蛋白或抗原“特异性结合”。如本文所用，“特异性结合”是指结合域与细胞表面蛋白或抗原结合但不与其他蛋白质结合，或以较低的亲和力与其他蛋白质结合。
184.两个分子(例如抗原结合域和抗原)之间的结合亲和力可以例如通过测定解离常数(kd)例如通过表面等离子共振(spr)方法(例如biacoretm)来量化。
185.结合域可以包含不基于抗体的抗原结合位点的域。例如，抗原结合域可以包含基于蛋白质/肽的域，该蛋白质/肽是细胞表面受体的可溶性配体(例如可溶性肽，诸如细胞因子或趋化因子)；或其结合对配对物在细胞上表达的膜锚定配体或受体的细胞外域。
186.结合域可以基于抗原的天然配体。
187.结合域可以包含来自组合文库的亲和肽。
188.在一个方面，能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的结合域与cd83结合。
189.在一个方面，能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的结合域基于抗cd83抗体克隆f890/ge8。
190.适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:5、6、7和/或seq id no:10、11或12中所示氨基酸序列的结合域。
191.适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:4和/或seq id no:9中所示的氨基酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体的结合域。适当地，变体可以包含seq id no:5、6、7和/或seq id no:10、11或12中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
192.适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含由seq id no:3和/或seq id no:8中所
示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
193.抗cd83抗体克隆f890/ge8重链核苷酸序列(seq id no:3)
[0194][0195]
抗cd83抗体克隆f890/ge8重链氨基酸序列(seq id no:4)
[0196][0197]
抗cd83抗体克隆f890/ge8重链氨基酸cdr-h1(seq id no:5)
[0198]
dyyin
[0199]
抗cd83抗体克隆f890/ge8重链氨基酸cdr-h2(seq id no:6)
[0200]
dinptngdstysqkfkg
[0201]
抗cd83抗体克隆f890/ge8重链氨基酸cdr-h3(seq id no:7)
[0202]
dyamdy
[0203]
抗cd83抗体克隆f890/ge8轻链核苷酸序列(seq id no:8)
[0204][0205][0206]
抗cd83抗体克隆f890/ge8轻链氨基酸序列(seq id no:9)
[0207][0208]
抗cd83抗体克隆f890/ge8轻链氨基酸cdr-l1(seq id no:10)
[0209]
tssqvllhspnqknyla
[0210]
抗cd83抗体克隆f890/ge8轻链氨基酸cdr-l2(seq id no:11)
[0211]
fastres
[0212]
抗cd83抗体克隆f890/ge8轻链氨基酸cdr-l3(seq id no:12)
[0213]
qqhystplt
[0214]
在一个方面，结合域基于抗cd11c抗体克隆8f2。
[0215]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:15、16、17和/或
seq id no:20、21或22中所示氨基酸序列的结合域。
[0216]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:14和/或seq id no:19中所示的氨基酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体的结合域。适当地，变体可以包含seq id no:15、16、17和/或seq id no:20、21或22中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0217]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含由seq id no:13和/或seq id no:18中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0218]
抗cd11c抗体克隆8f2重链核苷酸序列(seq id no:13)
[0219][0220][0221]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸序列(seq id no:14)
[0222][0223]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸cdr-h1(seq id no:15)
[0224]
nyvlh
[0225]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸cdr-h2(seq id no:16)
[0226]
yinpyndgtkfnekfkg
[0227]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸cdr-h3(seq id no:17)
[0228]
gdnlrpyyfdy
[0229]
抗cd11c抗体克隆8f2轻链核苷酸序列(seq id no:18)
[0230][0231]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸序列(seq id no:19)
[0232][0233]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸cdr-l1(seq id no:20)
[0234]
sasssvsfmy
[0235]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸cdr-l2(seq id no:21)
[0236]
dtsslss
[0237]
抗cd11c抗体克隆8f2重链氨基酸cdr-l3(seq id no:22)
[0238]
qqwsryppt
[0239]
适当地，结合域可以针对鸡dec205受体的碳水化合物识别域4和/或5和/或6产生或可以识别鸡dec205受体的碳水化合物识别域4和/或5和/或6。
[0240]
在一个方面，结合域不针对鸡dec205受体的碳水化合物识别域2产生或不识别鸡dec205受体的碳水化合物识别域2。
[0241]
在一个方面，结合域基于抗dec205抗体克隆f887/ad6
[0242]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:25、26、27和/或seq id no:30、31或32中所示氨基酸序列的结合域。
[0243]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no: 24和/或seq id no: 29中所示的氨基酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体的结合域。适当地，变体可以包含seq id no: 25、26、27和/或seq id no: 30、31或32中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0244]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含由seq id no: 23和/或seq id no: 28中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0245]
抗dec205抗体克隆f887/ad6重链核苷酸序列(seq id no: 23)
[0246][0247]
抗dec205抗体克隆f887/ad6重链氨基酸序列(seq id no: 24)
[0248][0249]
抗dec205抗体克隆f887/ad6重链氨基酸cdr-h1(seq id no: 25)sygms
[0250]
抗dec205抗体克隆f887/ad6重链氨基酸cdr-h2(seq id no: 26)ssggsytyypdsvkgrf
[0251]
抗dec205抗体克隆f887/ad6重链氨基酸cdr-h3(seq id no: 27)lstwdwyfdv
[0252]
抗dec205抗体克隆f887/ad6轻链核苷酸序列(seq id no: 28)
[0253][0254]
抗dec205抗体克隆f887/ad6轻链氨基酸序列(seq id no: 29)
[0255][0256]
[0257]
抗dec205抗体克隆f887/ad6氨基酸cdr-l1(seq id no:30)
[0258]
svsssissgnfh
[0259]
抗dec205抗体克隆f887/ad6氨基酸cdr-l2(seq id no:31)
[0260]
gtsnlas
[0261]
抗dec205抗体克隆f887/ad6氨基酸cdr-l3(seq id no:32)
[0262]
qqwssypft
[0263]
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其与cd83，诸如禽cd83，特别是家禽和/或鸡cd83结合。
[0264]
在一个方面，本发明提供了具有seq id no:5、6、7和/或seq id no:10、11或12中所示cdr的抗体或其抗原结合片段。
[0265]
适当地，该抗体可以包含seq id no:4和/或seq id no:9中所示的序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体。适当地，变体可以包含seq id no:5、6、7和/或seq id no:10、11或12中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0266]
适当地，抗体可以包含由seq id no:3和/或seq id no:8中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0267]
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其与cd11c，诸如禽cd11c，特别是家禽和/或鸡cd11c结合。
[0268]
在进一步的方面，本发明提供了具有seq id no:15、16、17和/或seq id no:20、21或22中所示cdr的抗体或其抗原结合片段。
[0269]
适当地，抗体可以包含seq id no:14和/或seq id no:19中所示的序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体。适当地，变体可以包含seq id no:15、16、17和/或seq id no:20、21或22中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0270]
适当地，该抗体可以包含由seq id no:13和/或seq id no:18中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0271]
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其与dec205，诸如禽dec205，特别是家禽和/或鸡dec205结合。
[0272]
在进一步的方面，本发明提供了具有seq id no:25、26、27和/或seq id no:30、31或32中所示的cdr的抗体或其抗原结合片段。
[0273]
适当地，抗体可以包含seq id no:24和/或seq id no:29中所示的氨基酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体。适当地，变体可以包含seq id no:25、26、27和/或seq id no:30、31或32中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0274]
适当地，该抗体可以包含由seq id no:23和/或seq id no:28中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0275]
在一个方面，能够与抗原结合的结合域与禽流感病毒的血凝素，诸如h9n2禽流感病毒的血凝素抗原结合。
[0276]
在一个方面，结合域基于抗cd83抗体克隆f955/ig10。
[0277]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:44、45、46和/或seq id no:49、50或51中所示氨基酸序列的结合域。
[0278]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no:43和/或seq id no:48中所示的氨基酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体的结合域。适当地，变体可以包含seq id no:44、45、46和/或seq id no:49、50或51中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0279]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含由seq id no:42和/或seq id no:47中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0280]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10重链核苷酸序列(seq id no:42)
[0281][0282][0283]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10重链氨基酸序列(seq id no:43)
[0284][0285]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10重链氨基酸cdr-h1(seq id no:44)
[0286]
ntymh
[0287]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10重链氨基酸cdr-h2(seq id no:45)
[0288]
ridpangntryapkfqg
[0289]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10重链氨基酸cdr-h3(seq id no:46)
[0290]
yyfgpdy
[0291]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10轻链核苷酸序列(seq id no:47)
[0292][0293]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10轻链氨基酸序列(seq id no:48)
[0294][0295]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10轻链氨基酸cdr-l1(seq id no:49)
[0296]
hasqgissnig
[0297]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10轻链氨基酸cdr-l2(seq id no:50)
[0298]
hatnled
[0299]
抗血凝素抗体克隆f955/ig10轻链氨基酸cdr-l3(seq id no:51)
[0300]
vqygqfpft
[0301]
在一个方面，能够与抗原结合的结合域与禽流感病毒的血凝素，诸如h9n2禽流感病毒的血凝素抗原结合。
[0302]
在一个方面，结合域基于抗cd83抗体克隆f955/hd8。
[0303]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no: 54、55、56和/或seq id no: 59、60或61中所示氨基酸序列的结合域。
[0304]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含基于或具有seq id no: 53和/或seq id no: 58中所示的氨基酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体的结合域。适当地，变体可以包含seq id no: 54、55、56和/或seq id no: 59、60或61中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0305]
适当地，根据本发明的工程蛋白可以包含由seq id no: 52和/或seq id no: 57中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0306]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8重链核苷酸序列(seq id no: 52)
[0307][0308]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8重链氨基酸序列(seq id no: 53)
[0309][0310]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8重链氨基酸cdr-h1(seq id no: 54)ntymh
[0311]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8重链氨基酸cdr-h2(seq id no: 55)ridpangntryapkfqg
[0312]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8重链氨基酸cdr-h3(seq id no: 56)tefrnamdy
[0313]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8轻链核苷酸序列(seq id no: 57)
[0314][0315]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8轻链氨基酸序列(seq id no: 58)
[0316][0317]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8轻链氨基酸cdr-l1(seq id no: 59)raseniysnla
[0318]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8轻链氨基酸cdr-l2(seq id no: 60)aatnlad
[0319]
抗血凝素抗体克隆f955/hd8轻链氨基酸cdr-l3(seq id no: 61)qhfyntpyt
[0320]
在一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其与禽流感病毒的血凝素抗原，诸如h9n2禽流感病毒的血凝素抗原结合。
[0321]
在一个方面，本发明提供了具有seq id no: 44、45、46和/或seq id no: 49、50或51中所示cdr的抗体或其抗原结合片段。
[0322]
适当地，该抗体可以包含seq id no: 43和/或seq id no: 48中所示的序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体。适当地，变体可以包含seq id no: 44、45、46和/或seq id no: 49、50或51中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0323]
适当地，该抗体可以包含由seq id no: 42和/或seq id no: 47中所示的核苷酸序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0324]
在一个方面，本发明提供了具有seq id no: 54、55、56和/或seq id no: 59、60或61中所示cdr的抗体或其抗原结合片段。
[0325]
适当地，该抗体可以包含seq id no: 53和/或seq id no: 58中所示的序列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体。适当地，变体可以包含seq id no: 54、55、56和/或seq id no: 59、60或61中所示cdr的至少一个、至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个。
[0326]
适当地，抗体可以包含由seq id no: 52和/或seq id no: 57中所示的核苷酸序
列或其具有至少80％同一性(与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性)的变体编码的结合域。
[0327]
细胞表面蛋白
[0328]
根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白和化学工程蛋白)包含能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域。
[0329]
如本文所用，“细胞表面蛋白”是指在细胞的表面表达的蛋白质。换言之，蛋白质的至少一部分暴露于细胞外空间。
[0330]
细胞表面蛋白可以是质膜蛋白，其具有暴露于细胞外空间或质膜的外质表面的域的至少一部分。
[0331]
细胞表面组织抗原可以是整合(或内在)膜蛋白。整合膜蛋白永久附接至膜，并具有嵌入磷脂双层的一个或多个域。整合膜蛋白的实例包括转运蛋白、通道、受体和细胞粘附蛋白。
[0332]
细胞表面组织抗原可以是跨膜蛋白。跨膜蛋白跨越脂质双层。跨膜蛋白可以是单或多通道膜蛋白。例如，跨膜蛋白可以是免疫球蛋白超家族的成员。细胞表面蛋白可以是与脂质双层的一侧缔合并且不跨越脂质双层的整合单向蛋白。
[0333]
细胞表面蛋白可以是外周膜蛋白。外周膜蛋白不与磷脂双层的疏水核心相互作用。外周膜蛋白通常通过与整合膜蛋白的相互作用间接或通过与脂质极性头基团的相互作用直接结合到膜上。外周蛋白可能位于质膜的外表面。细胞表面蛋白可以是外周外质膜蛋白。
[0334]
细胞表面组织抗原可以锚定至质膜，例如共价附接至嵌入细胞膜内的脂质(诸如经由糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚)。
[0335]
细胞表面膜蛋白可以是gpi锚定蛋白。
[0336]
存在许多用于确定蛋白质亚细胞定位的方法并且其包括例如： 电子显微术；使用与已知膜蛋白的共定位的共聚焦显微术；免疫荧光；和使用荧光标签化抗体的流式细胞术。
[0337]
根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白和化学工程蛋白)可以包含至少一个结合域，其与选自cd83、cd11c、dec205、bu-1、cd28、cd40、cd14、cd80、cd86、mrc1l、cd25、cd45、mhvii或cd44的细胞表面蛋白结合。
[0338]
根据本发明的基因工程蛋白和化学工程蛋白可以包含至少一个结合域，其与下表5中所列的细胞表面蛋白结合：
[0339][0340][0341]
抗原
[0342]
在一些方面，根据本发明的工程蛋白(诸如基因工程蛋白和化学工程蛋白)包含至少一种抗原性多肽。
[0343]
在一个方面，抗原性多肽是抗原的至少一部分。
[0344]
换言之，工程蛋白可以包含抗原性的抗原的至少一部分的氨基酸序列。例如，工程蛋白可以包含抗原的域的一部分或一个或多个域的一部分。
[0345]
在一个方面，工程蛋白包含完整抗原。
[0346]
通常，抗原或其部分或抗原性多肽将能够诱导针对病原体例如病毒、细菌或寄生物的特异性中和抗体。
[0347]
不希望受理论的束缚，抗原性多肽将由受试者的免疫系统识别并将引发体液和/或细胞免疫应答。
[0348]
适当地，至少一种抗原性多肽可以来自禽病原体。
[0349]
如本文所用，“来自禽病原体的抗原或抗原性多肽”是指来自禽受试者中发现的病原体的抗原或抗原性多肽。例如，抗原或抗原性多肽可能与禽受试者的疾病相关联，并且在健康的禽受试者中可能不表达或可能以低水平表达。
[0350]
适当地，合适地，该抗原的表达水平可以比相应的健康禽受试者高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％。
[0351]
适当地，抗原可以是疾病特异性的。
[0352]
如本文所用，“疾病特异性”是指抗原在健康禽受试者中不表达或以较低量表达。可以使用本领域已知的方法例如elisa来计算表达水平。可以在取自已知感染有疾病的受试者和已知健康的受试者的样品之间进行比较。
[0353]
抗原可以来自任何病原体。在一个方面，抗原是病毒抗原。在另一个方面，抗原是细菌抗原。
[0354]
例如，病毒抗原可以是来自aiv、ndv、ampv、ibv、ibd、ibdv)、cav、arv或adv的抗原。
[0355]
在一个方面，抗原性多肽可以包含免疫原性肽表位或由其组成。抗原性多肽可以包含来自禽病原体的肽免疫原性表位或由其组成。
[0356]
如本文所用，“免疫原性肽表位”是指由t细胞受体(tcr)或b细胞受体(bcr)/抗体识别的肽。
[0357]“肽”是两个或多个氨基酸的短链。通常，肽由多达二十个左右的氨基酸组成。
[0358]
适当地，免疫原性肽表位可以是t细胞表位或b细胞表位。
[0359]
在一个方面，免疫原性肽表位是t细胞表位。
[0360]
在适应性免疫应答中，t细胞能够识别蛋白质抗原的内部表位。apc摄取蛋白质抗原并将其降解为短肽片段。肽可以与细胞内部的主要组织相容性复合物(mhc ii类)结合并被带到细胞表面。当与mhc分子一起在细胞表面呈递时，肽可以由t细胞(经由tcr)识别，在这种情况下，肽是t细胞表位。
[0361]
适当地，免疫原性肽表位当在mhc的背景下呈递时能够被tcr识别。与mhc i类结合的肽通常为7到13个氨基酸，更通常地8到10个氨基酸。肽的结合在其两个末端处通过肽主链中的原子与所有mhc i类分子的肽结合沟中的不变位点之间的接触而稳定。在结合肽的氨基和羧基端的沟的两个末端处有不变位点。肽长度的变化由肽主链中的扭结(通常在允许柔性的脯氨酸或甘氨酸残基处)来调节。
[0362]
与mhc ii类分子结合的肽的长度通常在8到20个氨基酸之间，更通常在10到17个氨基酸之间，并且可以更长(例如多达40个氨基酸)。这些肽位于沿着mhc ii肽结合沟的延伸构象中，该沟(与mhc i类肽结合沟不同)在两个末端均是开放的。肽主要通过主链原子与排列在肽结合沟中的保守残基接触而固定。
[0363]
因此，t细胞表位是可衍生自抗原的肽，其能够与mhc分子的肽结合沟结合并由t细胞识别。
[0364]
最小表位是可衍生自表位的最短片段，其能够与mhc i类或ii类分子的肽结合沟结合并由t细胞识别。对于给定的免疫原性区，通常可以生成充当表位的重叠肽的“嵌套集合”，所有这些含有最小的表位，但在其侧翼区不同。
[0365]
因此，有可能通过测量对截短肽的应答来鉴定特定mhc分子: t细胞组合的最小表位。例如，如果获得对重叠文库中包含残基1-15的肽的应答，则在两个末端截短的集合(即1-14、1-13、1-12等和2-15、3-15、4-15等)可以用于鉴定最小表位。
[0366]
用于从蛋白质预测t细胞表位的生物信息学方法是本领域已知的并且包括但不限于epidock、motifscan、rankpep、syfpeithi、mappp、predivac、pepvac、episopt、vaxign、mhcpred、epitop、bimas、tepitope、propred、epijen、iedb-mhci、iedb-mhcii、multipred2、mhc2pred、netmhc、netmhcii、netmhcpan、netmhciipan、nhlapred、svmhc、svrmhc、netctl和wapp。
[0367]
在一个方面，免疫原性肽表位是b细胞表位。ab细胞表位是指能够与b细胞受体(bcr)/抗体结合的肽。b细胞表位通常根据其结构和与抗体的相互作用分为两个类别，构象表位和线性表位。构象表位由不连续氨基酸残基相互作用采用的3d构象形成。相反，线性表位由连续氨基酸残基相互作用采用的3d构象形成。
[0368]
适当地，当在连接的抗原性肽构建体中提供时，肽表位可以是线性b细胞表位。
[0369]
用于从蛋白质预测b细胞表位的生物信息学方法是本领域已知的并且包括但不限于线性b细胞表位预测物诸如people、bepipred、abcpred、lbtope、bcpreds和svmtrip以及构象b细胞表位预测物诸如cep、discotope、ellipro、pepito、seppa、epitopia、epsvr、epipred、pease、mimox、pepitope、episearch、mimopro和cbtope。
[0370]
本发明的工程蛋白可以包含如本文定义的至少一种b细胞表位和至少一种t细胞表位。
[0371]
适当地，抗原性多肽可以包含至少一种免疫原性b细胞表位。
[0372]
肽表位的长度可以独立地为至少7、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50或至少100个氨基酸。
[0373]
肽表位的长度可以独立地为约7至约100、约7至约50或约7至约20个氨基酸。
[0374]
抗原性多肽在施用于受试者时诱导免疫应答。抗原性多肽可以在受试者中诱导细胞毒性t细胞应答和/或体液免疫应答。优选地，抗原性多肽可以在受试者中诱导记忆体液免疫应答。
[0375]
用于确定肽是否具有免疫原性的方法是本领域已知的并且包括例如使用cd4+和/或cd8+t细胞或b细胞的免疫细胞活化测定。
[0376]
活化的合适标志物可以包括使用诸如定量pct、elisa和/或elispot的方法的t细胞增殖和/或细胞因子(例如ifnγ、il6、il1β、il4和cxcli2(il8))的表达。
[0377]
t细胞表位可以使用上述测定和/或mhc结合测定来确定。
[0378]
适当地，b细胞表位可以从由分离自先前感染病原体感染/从病原体感染恢复和/或先前用来自病原体的抗原接种疫苗的受试者的抗体结合的表位鉴定。用于确定由抗体结合的表位(即b细胞表位)的方法包括但不限于x射线晶体学、低温电子显微术、基于阵列的寡肽筛选、定点诱变作图、高通量诱变作图、氢-氘交换、交联耦合质谱法。
[0379]
例如，抗原可以是来自aiv、ndv、ampv、ibv、ibdv、cav或arv的抗原。
[0380]
适当地，所述抗原可以是：来自禽流感的血凝素(例如，genbank登录号：acp50708.1，ha1：19-349和ha2：1-174)；来自ndv的融合蛋白(f)蛋白质(例如genbank登录号：aak55550.1)；来自ndv的血凝素-神经氨酸酶(hn)(例如genbank登录号：mh614933.1)；来自ibdv的vp2蛋白(例如genbank登录号：kx827589.1)；来自ibv的刺突蛋白(例如genbank登录号：aaa66578.1)；或来自cav的vp1和/或vp2蛋白(例如genbank登录号：aqm56826.1和af313470.1)。
[0381]
在一个方面，抗原是禽流感抗原并且本发明的疫苗治疗和/或预防禽流感。例如，抗原可以是血凝素。
[0382]
在一些方面，血凝素可以使用共有序列合成产生。血凝素可以来自任何亚型。例如，血凝素可以选自h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15、h16、h17或h18中的任一种，适当地，血凝素可以选自禽流感病毒。
[0383]
在一些方面，该抗原可以与a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2病毒(genbank登录号：acp50708.1，ha1：19-349和ha2：1-174)病毒的血凝素胞外域或禽流感h5n8病毒株(a/duck/egypt/ss19/2017，登录号mh893738.1)的h5ha抗原具有约90％(例如约95％，例如约96％，例如约97％，例如约98％)的氨基酸序列相似性。
[0384]
适当地，抗原可以是可溶的。适当地，抗原可以是分泌蛋白。
[0385]
在一些方面，抗原经工程化改造以改善溶解度和/或分泌。例如，可以对抗原进行工程化改造以除去通常存在的任何跨膜域。抗原可以经工程化改造以包含允许从受试者的细胞分泌的信号肽。
[0386]
在一些方面，基因工程蛋白或化学工程蛋白可以包含h9ha基因的胞外域，其缺乏血凝素基因信号肽和跨膜域两者，由来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的30个氨基酸三聚foldon序列替换。
[0387]
适当地，用于本发明的h9ha胞外域可以包含seq id no: 41中所示的氨基酸序列：
[0388][0389]
在一个方面，抗原包含序列seq id no: 41；或其具有至少80％同一性(诸如与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)的变体，或由其组成。
[0390]
在一些方面，基因工程蛋白或化学工程蛋白可以包含h5n8基因的胞外域，其缺乏
血凝素基因信号肽和跨膜域两者，由来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的30个氨基酸三聚化foldon序列替换。
[0391]
适当地，用于本发明的h5n8胞外域可以包含seq id no: 80中所示的氨基酸序列：
[0392][0393][0394]
在一个方面，抗原包含序列seq id no:80；或其具有至少80％同一性(诸如与其具有至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性)的变体，或由其组成。
[0395]
关于功能，变体应该能够诱导免疫应答。举例来说，免疫应答的诱导可以通过分离自先前用多肽或其免疫原性片段免疫的受试者的外周免疫细胞或脾细胞中回忆应答的证明来确定。例如，回忆应答可以通过在用先前用于免疫受试者的抗原或多肽进行体外攻击后的干扰素产生(例如ifnγ)和/或增殖反应来证明。(实施例1中提供了示例性测定)。优选地，该变体应该能够在受试者中诱导保护性免疫应答，以抵抗随后的禽流感病毒攻击。
[0396]
示例性架构
[0397]
根据本发明和用于根据本发明的疫苗的工程蛋白架构的实例包括下表6中所列的那些；通常，工程蛋白将包含如本文所述的结合域和如本文定义的抗原，并且可以任选地包含信号肽和/或溶解/稳定或折叠域。
[0398]
表6.示例性工程蛋白架构
[0399][0400]
[0401]
可以在本发明中使用的域架构的实例是，按以下顺序(seq id no: 62)：bip信号-h9ha胞外域-foldon-接头-cd83 scfv-v5-his标签
[0402][0403]
其中h9ha胞外域是至少一种抗原并且cd83 scfv是能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一种结合域。bip信号域是信号肽，foldon域是改善溶解、稳定和/或折叠的域，v5和his标签用于纯化工程蛋白。将理解，seq id no:42中所示的bip信号、foldon和接头域是任选的。针对编码氨基酸序列seq id no:62的黑腹果蝇进行密码子优化的核苷酸序列(seq id no:65)在图15中给出。
[0404]
可以在本发明中使用的域架构的实例是，按以下顺序(seq id no:63)：bip信号-h9ha胞外域-foldon-接头-cd11c scfv-v5-his标签
[0405]
scfv是能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域。cd33信号域是信号肽，甘氨酸4丝氨酸4是接头并且c标签用于纯化工程蛋白。将理解，seq id no:68中所示的信号、接头和纯化标签域是任选的。编码氨基酸序列seq id no:68的核苷酸序列(seq id no:69)在图21中给出。
[0416]
进一步的例示性实施方案显示为seq id no:72(核苷酸序列)和seq id no:76(氨基酸序列)。本发明的构建体可以包含上述序列中的任一者或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的变体，或由其组成。本发明的构建体可以包含seq id no:72或76或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的变体，或由其组成。
[0417]
核酸/核酸构建体
[0418]
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。核酸序列可以是任何合适类型的核苷酸序列，诸如合成的rna/dna序列、cdna序列或部分基因组dna序列。
[0419]
技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文所述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映在其中将表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。
[0420]
本发明提供了编码根据本发明的工程蛋白的多核苷酸。本发明提供了编码工程蛋白的多核苷酸，该工程蛋白包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和至少一种抗原。
[0421]
编码根据本发明的工程蛋白的核酸可以包括dna或rna。它们可以是单链或双链的。它们也可以是多核苷酸，其中包括合成或修饰的核苷酸。许多不同类型的寡核苷酸的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应理解可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
[0422]
多核苷酸可以是分离的或重组的形式。它可以掺入载体中并且该载体可以掺入宿主细胞中。此类载体和合适的宿主构成了本发明的又进一步的方面。
[0423]
编码根据本发明的工程蛋白的多核苷酸可以是密码子优化的。不同的细胞在特定密码子的使用上不同。这种密码子偏倚对应于细胞类型中特定trna相对丰度的偏倚。通过改变序列中的密码子，使得其与相应trna的相对丰度相匹配，有可能增加表达。适当地，可以对多核苷酸进行密码子优化以在特定禽受试者中表达。
[0424]
在一个实施方案中，提供了核酸构建体，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，该第一多核苷酸编码本文定义的能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；该第二多核苷酸编码本文定义的至少一种抗原性多肽。
[0425]
在一个实施方案中，第一和第二多核苷酸可操作地连接至同一启动子。适当地，根据本发明的核酸构建体可以编码基因工程蛋白，诸如融合蛋白，其中第一和第二多核苷酸可操作地连接至同一启动子
[0426]
在一些方面，核酸构建体编码至少两种、至少三种、至少四种、至少五种抗原。这样，单一疫苗将表达衍生自多种抗原性上趋异病毒的抗原，并提供针对多种病原体和/或病毒亚型内抗原性上趋异变体的保护。
[0427]
在一些方面，核酸构建体包含允许纯化工程蛋白的域，诸如亲和标签。适用于蛋白
质纯化的许多标签是本领域已知的并且包括例如his标签、polyhis标签、聚半胱氨酸标签、flag表位、组氨酸亲和标签、噬菌体t7表位和其他表位标签。
[0428]
载体
[0429]
本发明还提供了包含至少一种根据本发明的核酸构建体的载体。
[0430]
如本文所用，术语“载体”包括表达载体，即能够表达根据本发明的工程蛋白的构建体。
[0431]
适当地，表达载体能够表达根据本发明的工程蛋白。
[0432]“表达盒”包含感兴趣的基因(开放阅读框(orf))和能够表达感兴趣的基因的一个或多个调控序列。通常表达盒包含启动子、感兴趣的基因和终止子。
[0433]
在一些实施方案中，载体是多价载体。多价载体包含能够表达超过一种根据本发明的工程蛋白的多个表达盒。
[0434]
在一些实施方案中，载体是克隆载体。
[0435]
合适的载体可以包括但不限于质粒、病毒载体、转座子、与多肽复合或固定化在固相颗粒上的核酸。
[0436]
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体(诸如火鸡疱疹病毒(htv/hvt)、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体)。
[0437]
逆转录病毒是生命周期不同于裂解性病毒的rna病毒。在这方面，逆转录病毒是通过dna中间体复制的感染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组通过逆转录酶转化为dna形式。dna拷贝充当模板用于生产新的rna基因组和病毒编码的蛋白质，这些蛋白质是感染性病毒颗粒组装所必需的。
[0438]
逆转录病毒有很多种，例如鼠白血病病毒(mlv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、马感染性贫血病毒(eiav)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、劳斯肉瘤病毒(rsv)、藤浪肉瘤病毒(fusv)、莫洛尼鼠白血病病毒(mo-mlv)、fbr鼠骨肉瘤病毒(fbr msv)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(mo-msv)、艾贝尔森鼠白血病病毒(a-mlv)、禽髓细胞瘤病毒29(mc29)和禽成红细胞增多症病毒(aev)和所有其他逆转录病毒亚科，包括慢病毒。
[0439]
逆转录病毒的详细列表可以见于coffin等人，(“retroviruses
”ꢀ
1997 cold spring harbour laboratory press eds:jm coffin, sm hughes, he varmus pp758-763)，通过引用并入本文。
[0440]
慢病毒也属于逆转录病毒家族，但它们可以感染分裂和非分裂细胞(lewis et al., (1992) embo j. 3053-3058)，通过引用并入本文。
[0441]
载体可能能够将本发明的多核苷酸转移至细胞，例如本文定义的宿主细胞。载体应理想地能够在宿主细胞中持续高水平表达，以便vh和/或vl域在宿主细胞中适当表达。
[0442]
该载体可以是逆转录病毒载体。该载体可以基于或可衍生自mp71载体主链。该载体可能缺少土拨鼠肝炎响应元件(wpre)的全长或截短型式。
[0443]
特别适合用作根据本发明使用的载体的病毒载体的实例包括疱疹病毒载体(诸如火鸡疱疹病毒(htv/hvt)、新城疫病毒(ndv)、鸭肠炎病毒(dev)、禽传染性喉气管炎(ilt)、禽腺病毒、马立克病病毒(mdv)和传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性支气管炎病毒(ibv)。
[0444]
特别地，可以用于本发明的载体的实例是htv/hvt和ndv。
[0445]
细胞
[0446]
本发明还提供了工程细胞，其包含根据本发明的工程蛋白(诸如根据本发明的基因工程蛋白或化学工程蛋白)。在一个方面，工程细胞可以包含编码根据本发明的工程蛋白的核酸构建体或载体。工程细胞可以是可以用于表达和产生根据本发明的工程蛋白的任何细胞。适当地，细胞可以是禽细胞。适当地，细胞可以来自雏鸡或鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽或鹅。适当地，该细胞可以包含根据本发明的病毒载体。
[0447]
疫苗/药物组合物
[0448]
本发明还提供包含至少一种本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体、或根据本发明的载体或根据本发明的工程细胞的疫苗。
[0449]
如本文所用，术语“疫苗”是指当施用于受试者时诱导或刺激保护性免疫应答的制剂。疫苗可以使得生物体对特定疾病(例如禽流感)免疫。因此，本发明的疫苗在受试者中诱导免疫应答，其保护免受随后的病原体攻击，例如病毒、细菌或寄生物攻击。本发明的疫苗能够诱导针对多种病毒基因型的交叉保护性免疫应答。在一个实施方案中，单一基因型的本发明疫苗可能能够诱导针对多种病原体血清型、亚型和基因型的交叉保护性免疫应答。
[0450]
适当地，疫苗可以是重组亚基疫苗。
[0451]
疫苗可以包含多种组分，诸如根据本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的载体和药学上可接受的载剂。多种组分可以对应于多种不同的分离物，例如，高毒力或未知毒力的不同分离物。此类疫苗可能能够诱导针对多种病毒基因型的交叉保护性免疫应答。
[0452]
在一些实施方案中，疫苗是单价疫苗。适当地，单价疫苗可以使受试者针对单一抗原免疫。在一些实施方案中，疫苗是多价或多价疫苗。适当地，多价或多价疫苗可以针对来自一种病原体的不同株(血清型/基因型)的两种或更多种抗原来免疫受试者，以便针对一种疾病进行免疫。在一些实施方案中，疫苗是多疾病或多病原体疫苗。适当地，多疾病或多病原体疫苗可以包含来自两种或更多种病原体的保护性抗原以针对两种或更多种疾病进行免疫。
[0453]
在一些方面，疫苗编码至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同抗原。抗原可以来自亚型内的趋异变体(例如禽流感病毒的不同分离物)或病毒或可以来自趋异病毒(例如来自禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和传染性支气管炎病毒)。以此方式，单一疫苗可以表达衍生自多种抗原性上趋异病原体、病毒和/或细菌的抗原，并提供针对多种病原体和/或病毒亚型内抗原性上趋异变体的保护。
[0454]
该疫苗可以用于预防疾病。因此，本发明提供了用于治疗和/或预防疾病的本发明的疫苗。
[0455]
本发明还提供药物组合物，其包含至少一种本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的载体。该药物组合物可以用于治疗或预防受试者的疾病。
[0456]
疫苗或药物组合物可以任选地包含一种或多种佐剂、赋形剂、载剂和稀释剂。药物赋形剂、载剂或稀释剂的选择可以根据预期的施用途径和标准药物实践进行选择。药物组合物可以包含正如(或除此之外)载剂、赋形剂或稀释剂、任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、溶解剂和其他载剂。药物组合物通常应该是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。用于胃肠外施用的配制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂、纳米颗粒和可植入的持续释放或可生物降解的配制剂。可以使用无毒胃肠外可接
受的稀释剂或溶剂制备无菌可注射配制剂。本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的分散剂、润湿剂、助悬剂、等渗剂、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、载剂、赋形剂、盐或稳定剂，其在所用剂量和浓度下对受试者无毒。优选地，此类组合物可以进一步包含用于治疗疾病的药学上可接受的载剂或赋形剂，其与给定的施用方法和/或施用部位相容，例如用于胃肠外(例如皮下、真皮内或静脉内注射)施用。
[0457]
疫苗或药物组合物可以包含有效量的一种或多种本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的载体。
[0458]
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的载体，当将其施用于受试者时诱导免疫应答，该免疫应答保护免受随后的病原体攻击。在一个实施方案中，本发明提供了本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体或根据本发明的载体， 当将其施用于受试者时诱导免疫应答，该免疫应答保护免受随后的与疫苗病原体不同的亚型或基因型的病原体攻击。
[0459]
预防/治疗方法
[0460]
本发明还提供了通过向受试者施用有效量的本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体或根据本发明的禽疫苗来预防和/或治疗受试者的疾病的方法。
[0461]
术语“预防”旨在指避免、延缓、阻止或阻碍染上疾病。例如，通过将疾病特异性抗原递送至专职性抗原呈递细胞，可以使受试者的免疫系统能够通过体液或细胞免疫应答识别和消除感染细胞。
[0462]
术语“治疗”旨在指减少或减轻现有疾病或感染的至少一种症状。
[0463]
适当地，可以通过向受试者施用有效量的本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体或根据本发明的禽疫苗来降低受试者中的攻击病原体负载(例如病毒负载、细菌负载或寄生物负载)。
[0464]
适当地，向受试者施用有效量的本发明的工程蛋白、根据本发明的核酸构建体、根据本发明的载体或根据本发明的禽疫苗可以引发交叉反应性抗体的产生。
[0465]
根据本发明的疫苗可以引发抗体的产生，该抗体能够靶向来自病原体例如病毒的不同株的两种或更多种抗原性上变异抗原性多肽。例如，设计用于靶向h9流感病毒的疫苗可以提供针对抗原性上变异h9变体的保护。
[0466]
适当地，根据本发明的疫苗的施用在受试者中引发体液和/或细胞免疫应答。适当地，相对于相应对照的施用，疫苗的施用诱导增加的体液和/或细胞免疫应答。例如，合适的对照可以与根据本发明的疫苗相同，只是它缺少能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域。换言之，相应的对照可能主要由抗原组成。
[0467]
适当地，与相应对照相比，根据本发明的疫苗的施用可以在受试者中引发更快的体液和/或细胞免疫应答。例如，根据本发明的疫苗可以在初次接种疫苗后(ppv) 6天内引发体液和/或细胞反应。
[0468]
通常，体液免疫应答是由抗体分子介导的，抗体分子由接种疫苗或感染的宿主免疫细胞(诸如b细胞)的浆细胞分泌。这些抗体分子与病原体(病毒)结合并中和它们感染和引起疾病的能力(例如，通过阻断病毒与宿主细胞结合或进入宿主细胞的能力)。
[0469]
适当地，体液免疫应答可以通过确定应答于免疫而产生的抗体的滴度并将其与合
适的对照进行比较来测量。例如， 当与合适的对照相比时，根据本发明的疫苗可以引发更高的体液免疫应答。适当地，免疫受试者的血清中的抗原特异性抗体可以通过elisa来测量。(实施例1描述了抗原特异性免疫球蛋白(ig) igy(哺乳动物igg等效物)的测量，血清中的iga和igm抗体水平通过elisa测定法来确定)。对于在其表面具有血凝素糖蛋白的病毒，血凝抑制测定(hi)可以用于量化抗体的相对浓度。
[0470]
通常，细胞免疫应答或细胞介导免疫是指激活宿主免疫细胞，诸如t细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞，并分泌细胞因子，其直接或间接地破坏或阻断入侵的病原体并保护宿主免受感染。
[0471]
细胞因子和趋化因子的产生是细胞免疫应答的组成部分。适当地，细胞免疫应答可以通过测量炎性细胞因子诸如干扰素γ (ifnγ)、白细胞介素6 (il6)、白细胞介素1β (il1β)、cxcli2 (il8)和白细胞介素4 (il4)的产生来确定。
[0472]
适当地，相对于相应对照，细胞免疫应答(例如通过ifnγ、il6、il1β、cxcli2 (il8)和/或il4来测量)可能增加了至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍。
[0473]“攻击病原体负载”是指给定体积流体中攻击病原体(例如，病毒病原体、细菌病原体或寄生物病原体)的量赋予的值。
[0474]“攻击病原体”是指疫苗所针对的病原体。
[0475]“病毒负载”是指给定体积流体中病毒的量赋予的值。较高的病毒负载通常与活动性病毒感染的严重程度相关。
[0476]
受试者的攻击病原体负载可以通过进行噬斑测定或使用定量聚合酶链反应(qpcr)对病毒rna的量进行量化来确定。
[0477]
受试者
[0478]
在一个实施方案中，受试者可以是任何禽受试者。受试者可以是家禽。受试者可以选自鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽或鹅。
[0479]
适当地，根据本发明接种疫苗的受试者可以是家养的家禽。受试者可以是家养的鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽或鹅。
[0480]
在一个实施方案中，受试者是鸡并且疾病是禽流感(由禽流感病毒引起)。
[0481]
疾病
[0482]
本发明的疫苗可以治疗和/或预防受试者的疾病。
[0483]
本发明的疫苗可以治疗和/或预防由任何病原体例如病毒、细菌或寄生物引起的疾病。
[0484]
在一些实施方案中，疫苗可以治疗和/或预防一种或多种病毒性疾病。在一些实施方案中，疫苗可以治疗和/或预防一种或多种细菌性疾病。在一些实施方案中，疫苗可以治疗和/或预防一种或多种病毒性疾病和一种或多种细菌性疾病。
[0485]
病毒性疾病可能由来自正粘病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可能是aiv。
[0486]
病毒性疾病可能由来自副粘病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可能是ndv。例如，病毒性疾病可能由ampv引起。
[0487]
病毒性疾病可能由来自冠状病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可能是由ibv引起的传染性支气管炎。
[0488]
病毒性疾病可能由来自双rna病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可以是由ibdv引起的ibd。
[0489]
病毒性疾病可能由来自指环病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可能是由cav引起的鸡贫血。
[0490]
病毒性疾病可能由来自呼肠孤病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可能由arv引起。
[0491]
病毒性疾病可能由来自腺病毒科的病毒引起。例如，病毒性疾病可能是由鸭腺病毒a引起的减蛋综合征’76。病毒性疾病可能由fowl腺病毒(fadv的2、4、8、11)引起。
[0492]
在一个实施方案中，本发明的疫苗治疗和/或预防禽流感。
[0493]
施用
[0494]
本发明的疫苗可以通过任何方便的途径，诸如通过注射，例如肌肉内或皮下注射施用。其他合适的施用途径包括鼻内、局部眼部、口服或经皮。在一个实施方案中， 口服施用包括将疫苗添加到动物饲料或饮用水中。在另一个实施方案中，可以将疫苗添加到用于野生动物的诱饵中，例如适用于可能感染家禽和其他鸟类和动物物种的野生水鸟或野禽的诱饵。
[0495]
用于免疫的剂量可以为约1 μg至约100 μg。例如，剂量可以是约1 μg至约90 μg、约1 μg至约80 μg、约1 μg至约70 μg、约1 μg至约60 μg、约1μg至约50 μg、约1 μg至约40 μg、约1 μg至约35 μg、约1 μg至约30 μg、约1 μg至约25 μg、约1 μg至约20 μg、约1 μg至约15 μg、约1 μg至约10μg，或约1 μg至约5 μg。
[0496]
用于免疫的剂量可以为约2 μg至约100 μg。例如，剂量可以是约2 μg至约90 μg、约2 μg至约80 μg、约2 μg至约70 μg、约2 μg至约60 μg、约2μg至约50 μg、约2 μg至约40 μg、约2 μg至约35 μg、约2 μg至约30 μg，约2 μg至约25 μg，约2 μg至约20 μg，约2 μg至约15 μg，约2 μg至约10μg，或约2 μg至约5 μg。剂量可以为约2 μg至约35 μg。例如剂量可以是约20 μg至约35 μg。
[0497]
剂量可以由兽医在合理的兽医判断范围内确定。例如，考虑剂量节约，例如在不影响治疗的情况下减少剂量的能力。
[0498]
疫苗可以在初免-加强(prime-boost)方案之后施用。例如，在第一次接种后，受试者可能在一段时间(诸如约6、7、14、21或28天)后接受第二次加强施用。在一些方面，加强施用的剂量可以与初免施用的剂量相同。在其他方面，加强施用的剂量可以高于初免施用。
[0499]
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以用于实施或测试本公开的实施方案。数值范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则分别地，任何核酸序列均以5’到3’方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。
[0500]
必须注意，如本文和所附权利要求书所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。
[0501]
如本文所用，术语“包含”与“包括”或“含有”同义，并且是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、非列举的成员、要素或方法步骤。术语“包含”还包括术语“由
……
组成”。
[0502]
此处讨论的出版物仅提供其在本技术的申请日之前的公开。本文中的任何内容均不得解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
[0503]
实施方案
[0504]
以编号的段落呈现的本发明的以下实施方案可以与本文描述的其他实施方案组合使用：
[0505]
1.在一个实施方案中，本发明提供了工程蛋白，其包含：能够与抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
[0506]
a)至少一种抗原性多肽；或
[0507]
b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
[0508]
2.在一个实施方案中，本发明提供了工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和
[0509]
a)至少一种抗原性多肽；或
[0510]
b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
[0511]
3.根据段落1或2的工程蛋白，其中所述工程蛋白包含至少一种抗原性多肽。
[0512]
4.根据段落1或2的工程蛋白，其中所述工程蛋白包含能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
[0513]
5.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述工程蛋白是基因工程化的。
[0514]
6.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述工程蛋白是化学工程化的。
[0515]
7.根据段落1至5中任一项的工程蛋白，其中所述能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和a)至少一种抗原性多肽；或b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域包含在单个重组蛋白中。
[0516]
8.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和a)至少一种抗原性多肽；或b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域经可操作地连接。
[0517]
9.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述禽抗原呈递细胞是树突状细胞、巨噬细胞、b细胞或自然杀伤细胞中的至少一种。
[0518]
10.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述细胞表面蛋白选自免疫球蛋白家族蛋白质、整联蛋白家族受体或c型凝集素。
[0519]
11.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中细胞表面蛋白选自cd83、cd11c或dec205。
[0520]
12.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述细胞表面蛋白是cd83。
[0521]
13.根据段落1至11中任一项的工程蛋白，其中所述细胞表面蛋白是cd11c。
[0522]
14.根据段落1至11中任一项的工程蛋白，其中细胞表面蛋白是dec205。
[0523]
15.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中所述至少一种抗原是禽流感病毒抗原，诸如血凝素。
[0524]
16.根据段落1至3或5至15中任一项的工程蛋白，其中所述至少一种抗原性多肽是禽流感病毒抗原性多肽，诸如血凝素抗原性多肽。
[0525]
17.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其进一步包含信号肽。
[0526]
18.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其进一步包含改善所述工程蛋白的溶解、稳定和/或折叠的域。
[0527]
19.根据段落1或4至18中任一项的工程蛋白，其中所述能够与抗原结合的至少一
个结合域能够结合禽抗原。适当地，来自禽病原体的抗原可以存在于任何病原体例如禽病原体的表面上。例如，抗原可以存在于病毒的表面上、细菌的表面上或寄生物的表面上。适当地，抗原可以存在于灭活病毒的表面上、灭活细菌的表面上或灭活寄生物的表面上。
[0528]
20.根据前述段落中任一项的工程蛋白，其中至少一个结合域基于抗体或抗体片段诸如单链可变片段(scfv)、fv、f(ab’)或f(ab’)2的抗原结合位点。
[0529]
21.核酸构建体，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸编码如段落1至20中任一项所定义的能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；所述第二多核苷酸编码如段落1至20中任一项所定义的至少一种抗原性多肽或能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。
[0530]
22.载体，其包含根据段落21的核酸构建体。
[0531]
23.根据段落22的载体，其是疱疹病毒载体(诸如火鸡疱疹病毒(htv/hvt)或新城疫病毒(ndv)载体。
[0532]
24.工程细胞，其表达根据段落1至20中任一项的工程蛋白，或包含根据段落21的核酸构建体，或包含根据段落22或23的载体。
[0533]
25.禽疫苗，其包含根据段落1至20中任一项的基因工程蛋白、根据段落21的核酸构建体或根据段落22或23的载体以及药学上可接受的载剂。
[0534]
26.根据段落24的禽疫苗，其用于治疗和/或预防受试者的疾病。
[0535]
27.根据段落1至20中任一项的基因工程蛋白、根据段落21的核酸构建体和/或根据段落22或23的载体在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
[0536]
28.用于治疗和/或预防受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的根据段落25或26的疫苗的步骤。
[0537]
29.根据段落26使用的疫苗，或根据段落28的方法，其中所述疫苗的施用在受试者中引发体液和/或细胞免疫应答。
[0538]
30.根据段落26至29使用的疫苗、疫苗的用途或方法，其中所述疫苗的施用降低所述受试者中的攻击病原体负载。
[0539]
31.根据段落26至30使用的疫苗、疫苗的用途或方法，其中所述疫苗的施用引发交叉反应抗体的产生。
[0540]
32.根据段落26至31使用的疫苗、疫苗的用途或方法，其中所述受试者是禽受试者。
[0541]
33.根据段落25至32使用的疫苗、疫苗的用途或方法，其中所述受试者是家禽，例如所述受试者可以选自鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽或鹅。
[0542]
34.用于制备根据段落25的疫苗的方法，所述方法包括将根据段落1至20中任一项的基因工程蛋白、根据段落21的核酸构建体和/或根据段落22或23的载体，以及药学上可接受的载剂混合的步骤。
[0543]
现将通过实施例进一步描述本发明，实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0544]
实施例1
–
抗体靶向疫苗在鸡中诱导更快更强的免疫力和保护
[0545]
材料和方法
[0546]
病毒和细胞
[0547]
a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2病毒在10日龄的无特定病原体(spf)含胚鸡蛋中繁殖，并通过噬斑测定或madin-darbey犬肾(mdck)细胞上的tc1d
50
进行滴定。使用β-丙内酯(bpl)对病毒进行化学灭活，并通过连续的30-60％w/v蔗糖梯度超速离心来纯化。
[0548]
将mdck细胞维持在补充有10％胎牛血清(fbs)和0.1％青霉素和链霉素的dulbecco改良eagle培养基(dmem)中。果蝇schneider 2(s2)细胞获得自invitrogen，并在25℃下维持在补充有10％fbs的schneider昆虫培养基中。
[0549]
表达scfv和h9ha融合的scfv蛋白的质粒的构建
[0550]
将衍生自小鼠杂交瘤的包含鸡dec205 mab(克隆：iahf877：ad6)、推定鸡cd11c mab(克隆：iah 8f2)和鸡cd83 scfv mab(克隆：iah f890：ge8)的vl链和vh链的基因序列进行了商业分析(absolute antibody ltd，uk)。含有apc-mab的vl和vh序列的合成cdna通过(gly4ser)4接头肽序列接合，并由geneart(thermo fisher scientific)商业制造。然后使用not i和xba i限制位点将各自的个体vl-接头-vh cdna克隆到黑腹果蝇表达载体(pmt/bip/v5-his型式a，thermo fisher scientific)中(图1a)。名为pmt-bip-scfv-v5-his的所得载体用于使用kpni和paci限制位点插入h9ha基因的胞外域，该基因缺乏血凝素基因信号肽和tm域两者，由来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的30个氨基酸三聚foldon序列替换(图1b)。本研究中使用的血凝素是掺入h9n2病毒血凝素的共有序列合成产生的，该共有序列衍生自使用最小球体共识(mscon)方法的g1样h9病毒谱系的超过2000个h9ha序列(来自公共数据库)的分析。然而，这种合成的血凝素与a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2病毒(genbank登录号：acp50708.1，ha1：19-349和ha2：1-174)病毒的血凝素胞外域具有约98％的氨基酸序列相似性。图1显示了表达盒和融合构建体的示意性代表。
[0551]
scfv和h9ha融合scfv蛋白的表达和纯化
[0552]
使用果蝇表达系统(life technologies)生产和纯化重组蛋白。简而言之，将pmt/bip/scfv/v5-his或pmt/bip/h9ha foldon scfv/v5-his质粒与潮霉素b抗性质粒(pcohygro，life technologies)一起共转染到果蝇s2细胞中。使用浓度为250μg/ml的潮霉素b进行持续四周的抗生素选择，并且经由有限稀释获得单个细胞克隆。重组蛋白在cuso4(500μm)诱导后分泌到培养物上清液中，然后通过profinity
tm
imac不带电柱(bio-rad)纯化。纯化的重组蛋白的浓度通过bradford测定来确定，并且纯度通过sds-page和western印迹来评估。
[0553]
scfv和h9ha foldon-scfv蛋白的表征
[0554]
进行间接酶联免疫吸附测定(elisa)以检查dec205/cd83 scfv和h9ha foldon-dec205/cd83 scfv蛋白是否可以检测并与其各自受体蛋白结合。将鸡cd83胞外域和dec205 c型凝集素域4-5-6的编码序列(staines et al.,plos one 2013,8(1),e51799)克隆到pmt/bip/his载体中，用于在黑腹果蝇s2细胞中表达。简而言之，将8μg的各自受体蛋白添加到96孔maxisorp elisa板(thermo fisher scientific)的第一个孔中。然后，进行各自受体蛋白的两倍稀释。将板在4℃下温育过夜。为了检测，将板与等摩尔浓度的各自scfv和h9ha foldon-scfv在4℃下温育两小时。随后与辣根缀合(hrp)抗v5二抗进一步温育。通过添加四甲基联苯胺(tmb)底物(thermo fisher scientific)进行比色检测，并在elx808吸
光度酶标仪(biotek)中以450 nm波长读取。
[0555]
对于h9ha foldon-cd11c scfv的表征，使用western印迹分析来分析鸡脾细胞提取物中存在的相应cd11c受体分子的检测。简而言之，将鸡脾细胞用400μl裂解缓冲液(np40)在冰上溶解30分钟。在与裂解缓冲液温育期间，裂解物每10分钟涡旋一次。然后将裂解物以12,000 rpm离心10分钟，并收获所得上清液。鸡脾细胞提取物在10％sds-page上运行。将来自sds-page凝胶的蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上，并与h9ha foldon-cd11c scfv在4℃下温育过夜。随后在室温下与抗v5 hrp二抗温育1小时。然后添加3,3
’‑
二氨基联苯胺(dab)底物(thermo fisher scientific)进行检测。
[0556]
流式细胞术
[0557]
使用流式细胞术进一步研究了重组scfv抗体与鸡脾细胞的结合。简而言之，用200ng/ml脂多糖(lps，sigma)刺激1x105个鸡脾细胞24小时。将脾细胞离心并在4℃下重悬浮于含有3μg各自scfv蛋白的50μl facs缓冲液(含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs)中45分钟。与scfv蛋白温育后，将脾细胞用150μl facs缓冲液清洗并重悬浮于100μl含有二抗(fitc缀合抗v5标签，1:100稀释，bio-rad antibodies)的facs缓冲液中，并在4℃下黑暗中温育30分钟。随后用50μl 1％多聚甲醛(pfa)在黑暗中固定标记的脾细胞20分钟。第二天使用macsquant流式细胞仪读取板，并使用fcs express 6软件进行分析。
[0558]
双[磺基琥珀酰亚胺]辛二酸酯(bs3)交联
[0559]
为了确定含有三聚foldon域的重组h9ha的寡聚结构，使用bs3(thermo fisher scientific)进行交联。简而言之，将15μg重组蛋白在存在bs3(终浓度10mm)的情况下在室温下温育一小时。通过添加1m tris-hcl ph8.0至终浓度为50mm来终止交联。将交联产物在还原条件下在sds凝胶上分离，印迹并使用抗h9ha单克隆抗体进行免疫检测。
[0560]
鸡脾细胞的制备和刺激
[0561]
根据制造商的说明，使用histopaque 1083(sigma)通过密度梯度离心从3周龄的未接种疫苗的无特定病原体(spf)鸡的脾脏中制备脾细胞。将约2x106个细胞铺板到24孔板的每个孔中，悬浮于300μl含有10％fbs和0.1％青霉素和链霉素的完全roswell park memorial institute 1640培养基中。用10μg h9ha foldon或14μg h9ha foldon-scfv(根据分子量含有10μg h9ha foldon)或10μg scfv处理细胞。还用佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯(phorbol myristate acetate，pma)/离子霉素(终浓度10μg/ml)刺激细胞，作为ifnγ细胞因子产生的阳性对照。所有细胞均在41℃下体外刺激5小时、22小时、30小时和45小时。
[0562]
细胞因子和趋化因子的rna提取和定量逆转录pcr(qrt-pcr)
[0563]
根据制造商的方案，使用rneasy
tm
试剂盒(qiagen)从经刺激的脾细胞中提取rna。为进行rna定量，使用superscript
tm iii platinum one-step qrt-pcr试剂盒(lifetechnologies)在7500快速实时pcr机(applied biosystems)中按照制造商的方案进行单步实时逆转录pcr。循环条件如下：i)在50℃下保持5分钟ii)在95℃下保持2分钟iii)在95℃下进行3秒的40个循环，在60℃下退火和延伸30秒。使用2-δδ
ct
方法计算数据(与仅介质对照组相比的n倍变化)，并报告为相对于管家基因rplpo1的表达水平归一化的值。在选择用于归一化的三个参考基因(rplpo-1、rpl13和28s)中，rplpo1是样品间最稳定的基因，因此选择用于标准化。
[0564]
ifnγ夹心elisa
[0565]
收获来自经刺激的脾细胞的上清液并通过夹心elisa检查。简而言之，将抗鸡ifnγ(1:150稀释，invitrogen)包被到96孔maxisorp elisa板(thermo fisher scientific)上。包被的板在室温下用含有3％bsa的pbs封闭1小时。在含有3％bsa的pbs缓冲液中进行上清液的1:2稀释。然后将板与稀释的上清液在室温下温育两小时。使用生物素化抗鸡ifnγ检测抗体(1:600稀释，invitrogen)在室温下1小时，然后hrp缀合的链霉亲和素(1:1000稀释，amersham)在室温下再1小时来进行检测。添加100μl四甲基联苯胺(tmb)底物(bd biosciences)10分钟。使用2m h2so4终止反应并在elx808吸光度酶标仪(biotek)中在波长450nm下读取。
[0566]
血凝测定(ha)和血凝抑制(hi)测定
[0567]
遵循世界卫生组织指南进行hi测定(world health organization.who global influenza.surveillance network.who global influenza surveillance network:manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza.2011,153)，并如先前所述进行ha测定(walker,j.m.in animal infuenza virus,第2版；spackman,erica.；springer science+business media:new york,usa,2014；pp.6-10,isbn 978-1-4939-0757-1)。对于hi测定，使用了4个ha单位的病毒。两种测定均使用50μl的1％鸡红细胞(rbc)。
[0568]
鸡疫苗接种和血液样品收集
[0569]
一组7日龄spf鸡(n＝8)用含有2.8μg、28μg和49μg重组h9ha foldon-dec205 scfv、h9ha foldon-cd11c scfv或h9ha foldon-cd83 scfv蛋白(相当于2μg、20μg和35μg重组h9ha foldon(等摩尔浓度))的疫苗剂量免疫。在montadine isa 71 vg(seppic)佐剂中配制蛋白质。蛋白质与佐剂体积的比率为1:3。疫苗剂量(0.2ml)皮下施用，在颈后部递送。对照组用pbs或montadine佐剂免疫。此外，一组鸡(n＝8)用灭活h9n2病毒(a/chicken/pakistan/udl01/2008,1024 hau/剂量)接种疫苗。所有接种疫苗组在14日龄时接受加强剂量。在所有情况下，在第一次接种疫苗后第6、14、21和28天从翼静脉收集血液样品。
[0570]
病毒攻击和拭子样品收集
[0571]
对于病毒攻击研究，spf鸡(n＝7)分为四组：pbs对照、灭活h9n2病毒(a/chicken/pakistan/udl 01/2008)、h9ha foldon(25μg/剂量)和h9ha foldon cd83 scfv(h9ha foldon的25μg/剂量当量)。pbs对照和h9ha foldon-cd83scfv组进一步分为两个亚组：直接病毒接种和接触。鸡在7天和14日龄时接种疫苗。除接触组外的所有鸡在22日龄(加强疫苗接种后一周)用1x106个噬斑形成单位(pfu)/100μl a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2病毒鼻内攻击。在整个实验过程中每天监测鸡的临床体征和体重变化。
[0572]
每天从口腔和泄殖腔收集拭子样品，直到感染后第7天，最后一次采样在感染后第10天进行。将无菌聚酯尖头拭子转移到病毒运输介质中，涡旋并以4500rpm离心10分钟以澄清介质。样品储存在-80℃直至进一步分析。
[0573]
血清igy、iga和igm抗ha抗体水平的测量
[0574]
血清中的抗原特异性igy(哺乳动物igg等效物)、iga和igm抗体水平通过elisa测定法确定。简而言之，平底96孔maxisorp elisa板(thermo fisher scientific)在4℃下用50μl碳酸盐缓冲液(ph 9.6)稀释的1μg重组h9ha foldon蛋白包被过夜。蛋白质包被板在室温下用pbs-tween 0.1％(pbs-t)中的5％乳粉(marvel)封闭1小时。用清洗缓冲液pbs-t清
洗板三次。在具有1％乳粉的pbs-t缓冲液中进行鸡血清的1:200稀释。然后将板与50μl稀释的血清在室温下温育1小时。将板再次清洗三次，并在室温下与50μl山羊抗鸡igy、iga和igm抗体一起温育1小时，该抗体与hrp(abcam)缀合，在具有1％乳粉的pbst缓冲液中以1:3000稀释。用pbs-t清洗板x4，然后添加100μl tmb底物(bd biosciences)10分钟。使用2m h2so4终止反应并在elx808吸光度酶标仪(biotek)中在波长450nm下读取。所有测定中均包括标准血清(从用a/chicken/pakistan/udl 01/2008(h9n2)病毒攻击的35日龄鸡收集的血清)。抗ha igy、igm或iga抗体的量表示为样品与参考比率(测试血清样品的吸光度与参考血清的吸光度的关系)。
[0575]
噬斑测定法
[0576]
来自尿囊液或拭子样品的病毒滴度使用噬斑测定法获得。用10倍连续稀释的样品接种具有mdck细胞的预接种12孔板，并在37℃下放置1小时。用pbs清洗细胞并用含有0.6％纯化琼脂(oxoid)和2μg/ml tpck胰蛋白酶的dmem(1x mem、0.21％bsa、1mm l-谷氨酸盐、0.15％碳酸氢钠、10mmhepes、0.1％青霉素g/链霉素)覆盖。将细胞在37℃下放置72小时。3天后除去培养基，并将细胞在结晶紫溶液中染色30分钟。
[0577]
病毒微量中和(mnt)测定法
[0578]
将mdck细胞预接种到96孔板中以达到90-95％的汇合度。免疫鸡血清在56℃下灭活30分钟。然后，进行灭活血清的1:200稀释。随后一式三份进行两倍连续稀释，并与90μl含有150tcid
50
的a/chicken/pakistan/udl 01/2008(h9n2)病毒混合。血清-病毒混合物在37℃下温育1小时。用pbs清洗细胞并用血清病毒混合物在37℃下接种1小时。温育后，用pbs再次清洗细胞并添加含有2μg/ml tpck胰蛋白酶的无血清dmem，细胞在37℃放置72小时。3天后除去培养基，并将细胞在结晶紫溶液中染色30分钟。
[0579]
统计分析
[0580]
结果表示为均值
±
标准偏差(sd)。使用prism
tm 8.3.0(graphpad软件)使用单向anova、对数秩(mantel-cox)检验、未配对学生t检验和tukey多重比较检验确定统计显著性(p值)。如果p《0.05，则认为差异具有统计学意义。
[0581]
结果
[0582]
重组蛋白的表达和纯化
[0583]
为了创建可溶性h9ha蛋白，将h9ha的tm域用来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的30个氨基酸长的foldon替换(图2)。此外，可溶性h9ha蛋白与靶向鸡apc上的dec205、cd11c和cd83受体蛋白的scfv抗体重组融合。scfv和h9ha foldon-scfv蛋白在果蝇s2细胞中成功表达。通过his标签亲和层析对重组蛋白的后续纯化产生预期分子量为约30kda(scfv)、70kda(h9ha foldon)和100kda(h9ha foldon-scfv)的蛋白质(图3)。根据回收的纯化蛋白，估计重组蛋白的表达水平范围为10-20mg/升培养物上清液。
[0584]
与t4噬菌体foldon融合的h9ha胞外域可以三聚化并保留血凝活性
[0585]
具有三聚foldon的可溶性h9ha蛋白的寡聚状态通过使用bs3的交联来确定。暴露于该交联剂的多聚体蛋白质将使每个亚基用酰胺键的形成交联在一起。这为它们的接近提供了直接证据。这也有助于稳定寡聚物的结构，使它们能够在sds变性凝胶上进行western印迹分析。使用该方法来确认蛋白质的天然结构。将重组h9ha foldon和h9ha foldon-scfv蛋白暴露于bs3交联剂，并且将交联产物在还原和变性条件下在sds凝胶上分离，印迹并使
用抗h9ha单克隆抗体进行免疫检测。结果如图4所示。
[0586]
未经bs3交联，观察到三种种类；单体、二聚体和三聚体(单体为主要条带；泳道1和泳道3分别对应于h9ha foldon和h9ha foldon-scfv的约70kda和100 kda)。通过交联，观察到稳定的三聚体形式(泳道2和泳道4分别对应于h9ha foldon和h9ha foldon-scfv的约210kda和300kda)。这表明具有foldon的重组h9ha蛋白的天然结构是三聚体。
[0587]
接下来，使用ha测定法测试了可溶性h9ha foldon和h9ha foldonscfv蛋白的生物活性(图5)。可溶性h9ha foldon蛋白本身以及与scfv抗体融合时均能够凝集鸡rbc，同时保留其血凝活性。此外，平均而言，可溶性h9ha foldon和h9ha foldon scfv显示高达0.14μg/ml的血凝。较低浓度的可溶性h9ha foldon和h9ha foldon scfv和pbs对照显示没有血凝活性。结果如图5所示。
[0588]
scfv抗体与h9ha foldon蛋白的融合不影响其功能
[0589]
scfv抗体的特异性通过与鸡脾细胞的结合得到证实(图6a)。鸡脾细胞由所有scfv抗体染色。为了确定scfv抗体在与h9ha foldon蛋白融合后是否保持其活性，进行了间接elisa。dec205/cd83 scfv和h9ha foldon融合的dec205/cd83 scfv抗体均能够检测并结合它们各自的受体蛋白，并且正如预期，scfv抗体与其受体蛋白结合的能力随着与血凝素蛋白的融合而降低。由于鸡cd11c受体蛋白的编码序列不是公开可用的，我们无法表达鸡cd11c受体蛋白并用它来表征h9ha foldon-cd11c scfv。然而，为了测试与h9ha foldon融合的cd11c scfv的活性，我们进行了western印迹分析。h9ha foldon-cd11c scfv能够检测鸡脾细胞提取物中的150kda cd11c蛋白(图6b)。scfv、h9ha foldon和h9ha foldon-scfv蛋白对鸡脾细胞的离体激活
[0590]
从未接种疫苗的spf鸡中分离脾细胞，并在体外用scfv、h9ha foldon和h9ha foldon-scfv蛋白处理5小时、22小时、30小时和45小时。我们研究了细胞因子ifnγ、il6、il1β、il4、il18和趋化因子cxcli2的产生。关于scfv的刺激，与对照scfv相比，cd83 scfv和cd11c scfv能够诱导il6(约5-15倍，cd11c scfv约13倍，刺激后5小时p《0.05)、il1β(约5-10倍)和cxcli2(约5-20倍)的表达(图7a)。几乎没有或没有il4和il18细胞因子的表达。在cd11c scfv和cd83 scfv刺激后45小时，ifnγ表达较低。这已通过ifnγelisa验证(图7b)。
[0591]
有趣的是，与h9ha foldon相比，h9ha foldon-cd83 scfv和h9ha foldon-cd11c scfv能够诱导显著更高水平的促炎细胞因子ifnγ(约50-180倍)、il6(约50-115倍)和il1β(约30-45倍)(图8a和8b)。h9ha foldon-cd83 scfv和h9ha foldon-cd11c scfv较早(刺激后5小时)诱导il6和il1β细胞因子，而较晚(刺激后22小时)诱导ifnγ。没有il18细胞因子的表达。此外，与h9ha foldon相比，h9ha foldon-cd83 scfv和h9ha foldon-cd11c scfv在刺激后22小时和30小时诱导更高水平的il4(约15倍)和趋化因子cxcli2(约15-55倍)(不显著)。
[0592]
用h9ha foldon-scfv蛋白进行的免疫诱导更快和更高的体液应答
[0593]
进行了标准hi测定以测试h9ha foldon-scfv生成hi抗体的能力。在初次接种疫苗后第6、14、21和28天测量hi抗体滴度。使用20μg和35μg剂量的h9ha-scfv，能够早在初次接种疫苗后(ppv)第6天就检测到hi抗体(图9，表2)。发现2μg剂量的h9ha-scfv不足以诱导更早的抗体应答，如由20μg和35μg剂量诱导的那样。然而，在ppv 21天后，即使是2μg h9ha foldon-scfv疫苗组也具有高于或类似于灭活疫苗组的hi抗体滴度。此外，使用20μg和35μg
scfv：1220 pfu/ml，h9ha foldon：3052 pfu/ml)和感染后第3天(h9ha foldon-cd83scfv：390 pfu/ml，h9ha foldon：1257 pfu/ml)，与h9ha foldon疫苗接种鸡相比，h9ha foldon-cd83 scfv疫苗接种鸡具有显著更低的平均病毒滴度。没有看到h9ha foldon-cd83 scfv和灭活病毒疫苗组在病毒感染后所有天的病毒负载方面有任何显著差异。到感染后第4天，病毒几乎从所有直接感染的接种疫苗组中清除，而一些病毒仍留在直接感染的pbs对照组中。在另一个方面，与pbs接触组相比，h9ha foldon-cd83 scfv接触组鸡具有显著更低的病毒滴度，并且疫苗接种接触组的鸡比pbs接触组晚一天显示出病毒(图13)。到感染后第6天，病毒已从所有组(直接和接触)中清除。
[0600]
总结
[0601]
这项研究提供的证据表明，含有与apc表面上的受体分子特异性抗体融合的抗原的tadv或atv在鸡中诱导更快和更强的免疫力。原型tadv由作为模型抗原的h9n2 aiv的血凝素抗原组成，该抗原与鸡apc受体cd83、cd11c和dec205特异性的scfv抗体融合。与cd83 scfv、cd11c scfv或dec205 scfv抗体融合的所得修饰的血凝素抗原在昆虫细胞中作为重组可溶性三聚体糖蛋白产生，并使用western印迹和elisa测定法进行表征。结果表明，血凝素抗原与scfv抗体的融合不消除血凝素或scfv抗体的功能活性。与非靶向对应物或常规杀死的h9n2病毒疫苗相比，用这些apc靶向h9ha foldon-scfv疫苗对鸡进行免疫诱导更快和更强的血凝素抗原特异性抗体应答。
[0602]
例如，与非靶向h9ha foldon相比，重组h9ha foldon-cd83 scfv诱导了更高的血清hi和病毒中和抗体。此外，用tadv (h9ha foldon-cd83 scfv)接种疫苗的鸡在受到h9n2病毒攻击时也显示出临床疾病体征减少和口腔病毒脱落减少。
[0603]
这些研究表明，经由针对鸡apc的抗体靶向抗原增强家禽疫苗针对aiv的免疫原性和保护功效。此外，h9ha foldon-scfv还能够在体外刺激鸡脾细胞诱导促炎细胞因子(ifnγ、il1β和il6)和趋化因子(cxcli2)的表达。因此，scfv抗体可以充当内置佐剂，同时将抗原货物递送到apc，并增加抗原的免疫刺激潜力。
[0604]
实施例2
–
与商业疫苗相比，抗体靶向疫苗显示出增强的免疫原性
[0605]
病毒和疫苗
[0606]
用于制备重组h9ha foldon和重组h9ha foldon-cd83 scfv的血凝素通过掺入h9n2病毒血凝素的共有序列合成产生，该序列衍生自对g1样h9病毒谱系的2000多个h9ha序列(来自公共数据库)的分析。这种合成的血凝素与a/chicken/pakistan/udl 01/2008(udl 01/08)h9n2病毒(genbank登录号：acp50708.1，ha1：19-349和ha2：1-174)病毒的血凝素胞外域具有98％的氨基酸序列相似性。
[0607]
测试的商业疫苗是灭活病毒疫苗并且具有a/chicken/uae/415/99(uae/415)h9n2病毒和新城疫(nd)病毒的混合物。
[0608]
鸡疫苗接种和血液样品收集
[0609]
进行这项动物研究是为了比较重组抗体靶向疫苗与目前市售禽流感疫苗的性能。鸡被分为五组(每组n＝10)：商业疫苗、h9ha foldon(每剂35μg)、h9ha foldon-cd83 scfv(根据分子量相当于35μg h9ha foldon)、灭活h9n2(a/chicken/pakistan/udl 01/2008，其序列在genbank登录号：acp50708.1中公开可用)和未接种疫苗的对照组。h9ha foldon、h9ha foldon-cd83 scfv组进一步分为单次疫苗接种组和双次疫苗接种组，后者接受加强
疫苗接种。所有疫苗均按照工业要求配制。重组疫苗和灭活h9n2疫苗的体积均保持在每剂0.2ml，以与之前的实验保持一致。但是，根据工业要求，商业疫苗的体积保持在每剂量0.25ml。鸡在1日龄(spf白来亨(white leghorn))皮下接种疫苗，因为这模仿了孵化场1日龄鸡的大规模应用途径。仅h9ha foldon、h9ha foldon-cd83 scfv和灭活h9n2疫苗组在7日龄时给予了加强疫苗接种。在所有情况下，在疫苗接种后第6、14、21、28和35天从翼静脉收集血液样品。
[0610]
血凝测定(ha)和血凝抑制(hi)测定
[0611]
hi测定和ha测定遵循世界卫生组织指南。两种测定均使用1％的鸡红细胞(rbc)。
[0612]
结果
[0613]
商业和重组疫苗病毒株之间的抗原性关系
[0614]
重组h9ha foldon/h9ha foldon-cd83 scfv疫苗和商业疫苗中使用的h9n2病毒株分别为a/chicken/pakistan/udl01/2008和a/chicken/uae/415/99。这两种病毒具有94％的氨基酸序列相似性。我们使用同源和异源病毒两者对抗血清进行了hi测定，以确定两种病毒之间的抗原性关系。使用’r’值来确定两种病毒株之间的抗原性差异程度，如archetti et al.,j exp med,1950 nov 1；92(5):441-62中所述。
[0615][0616]
表5：商业疫苗和灭活h9n2 pirbright疫苗抗血清与同源和异源病毒两者的hi滴度。同源滴度以粗体表示。
[0617]
两种h9n2病毒之间的’r’值为0.73，这意味着这两种病毒在抗原性上相似(’r’值＝1表示没有抗原性差异)。因此，预计抗血清之间有一些交叉反应。
[0618]
抗血清分析
[0619]
a/chicken/pakistan/udl 01/2008 h9n2病毒的hi抗体滴度
[0620]
进行标准的hi测定以测试来自免疫鸡的抗血清。a/chicken/pakistan/udl 01/2008用于该测定。该病毒对于h9ha foldon、h9ha foldon-cd83 scfv和灭活h9n2 pirbright疫苗是同源的并且对于商业疫苗是异源的。在初次接种疫苗(ppv)后第6、14、21、28和35天测量hi抗体滴度。结果显示，在所有测试天数中，h9ha foldon-cd83 scfv产生的hi抗体的滴度显著高于h9ha foldon。有趣的是，单次和双次接种疫苗的h9ha foldon/h9ha foldon-cd83 scfv组之间没有显著差异，即有和没有加强疫苗接种的hi抗体滴度相似。此外，还看到商业疫苗抗血清与异源udl 01/08病毒的良好交叉反应性。然而，在商业疫苗和h9ha foldon-cd83 scfv组(单次和双次疫苗接种组两者，图14，表4)之间的hi抗体滴度之间没有观察到显著差异。在大多数测试天数中，h9ha foldon-cd83 scfv组的hi抗体滴度高于(不显著)商业疫苗组(表5)。此外，在初次接种疫苗后14天后观察到免疫鸡中的hi抗体产生。
[0621]
a/chicken/uae/415/99的hi抗体滴度
[0622]
进行标准的hi测定以测试来自免疫鸡的抗血清。a/chicken/uae/415/99用于该测定。该病毒对于h9ha foldon、h9ha foldon-cd83 scfv和灭活h9n2 pirbright疫苗是异源的并且对于商业疫苗是同源的。在初次接种疫苗后第6、14、21、28和35天测量hi抗体滴度。正如预期，看到h9ha foldon、h9ha foldon-cd83 scfv和灭活h9n2 pirbright疫苗抗血清与异源uae/415病毒的hi抗体滴度降低。令人惊讶的是，与h9ha foldon和灭活h9n2 pirbright疫苗相比，来自用h9ha foldon-cd83 scfv免疫的鸡的抗血清与uae/415病毒具有更高的交叉反应性。此外，h9ha foldon-cd83 scfv组的hi抗体滴度在所有测试天数均与商业疫苗的抗体滴度相似(图14，表4)。在初次接种疫苗后14天后观察到免疫鸡中的hi抗体产生。
[0623]
总结
[0624]
在这项研究中，我们评估了h9ha foldon-cd83 scfv疫苗与商业禽流感疫苗相比的免疫原性。h9ha foldon-cd83 scfv疫苗(a/chicken/pakistan/udl01/2008)与商业疫苗(a/chicken/uae/415/99)之间的疫苗病毒株存在差异。然而，这些病毒具有94％的氨基酸相似性和0.73的“r”值，这表明这两种疫苗病毒株在抗原性上相似。同源病毒udl 01/08，h9ha foldon-cd83 scfv组的hi抗体滴度高于(不显著)商业疫苗组。有趣的是，h9ha foldon-cd83 scfv与异源uae/415/99病毒诱导的hi抗体滴度与商业疫苗诱导的相似。这表明具有cd83 scfv的靶向h9ha抗原可以提高疫苗对其他异源病毒的交叉反应性，因此，这可能是一种增强广泛交叉反应性抗体滴度的策略。此外，在单次和双次疫苗接种h9hafoldon/h9hafoldon-cd83scfv组之间的hi抗体滴度没有观察到显著差异。这提供了证据表明，没有加强的单次疫苗接种计划可以增强h9hafoldon-cd83 scfv疫苗的免疫原性。这是非常有利的，因为在场中优选单次疫苗接种以减少成本和时间。
[0625]
总的来说，这些发现表明h9hafoldon-cd83 scfv亚基疫苗可能比商业整个死病毒疫苗表现更好。
[0626]
实施例3
ꢀ–ꢀ
包含双特异性或多特异性结合域(ig10)的抗体靶向疫苗
[0627]
生成了对两种抗原具有结合特异性的双特异性单链片段可变(scfv)抗体。一个scfv与病毒抗原(在本例中为禽流感病毒表面蛋白血凝素)结合。
[0628]
病毒特异性scfv (图18)能够与病毒抗原结合并且是非中和的，这意味着它将与病毒结合但不会中和它(在此实施例中，第一结合域与灭活病毒上的血凝素结合)。
[0629]
apc特异性scfv (图18)能够与apc上的细胞表面蛋白结合，在此实施例中，结合域是cd83 scfv，它将靶向禽宿主apc。
[0630]
为了证明将灭活的整个禽流感病毒抗原连接至apc细胞表面受体的方法，生成了与h9n2禽流感病毒的血凝素抗原特异性结合的非中和性scfv抗体(本文称为ig10)。
[0631]
使用接头序列将ig10 scfv的scfv序列与cd83 scfv融合。所得构建体ig10 scfv-cd83 scfv在昆虫s2细胞中表达为双特异性scfv抗体并作为可溶性抗体(ig10 scfv-cd83 scfv)分泌到s2细胞培养基中。含有分泌型ig10 scfv-cd83 scfv的培养基特异性结合到灭活的h9n2病毒。在elisa测定中，抗体构建体显示出与禽流感病毒的特异性结合和与cd83受体抗原的特异性结合。ig10的结果显示于图19和图20中。
[0632]
图19中的结果表明，ig10-cd83双特异性抗体可以以与ig10 scfv相似的亲和力结
合h9n2病毒。
[0633]
图20中的结果显示ig10-cd83可以结合并识别鸡cd83受体蛋白。两个ig10-cd83的信号可能被认为是相对较低的，因为这些蛋白质未针对该测定进行纯化。预计纯化的双特异性抗体的信号将更高。
[0634]
从图19和图20的结果可以看出，ig10 scfv-cd83 scfv双特异性抗体具有双特异性结合能力并且可以与h9n2病毒和鸡cd83受体蛋白两者结合。
[0635]
实施例4
–
包含双特异性或多特异性结合域(hd8)的抗体靶向疫苗
[0636]
为了证明将灭活的整个禽流感病毒抗原连接至apc细胞表面受体的方法，生成了与h9n2禽流感病毒的血凝素抗原特异性结合的非中和性scfv抗体(本文称为hd8)。
[0637]
使用接头序列将hd8scfv的scfv序列与cd83 scfv融合。所得构建体hd8scfv-cd83 scfv在昆虫s2细胞中表达为双特异性scfv抗体并作为可溶性抗体(hd8scfv-cd83 scfv)分泌到s2细胞培养基中。含有分泌型ig10 scfv-cd83 scfv的培养基特异性结合到灭活的h9n2病毒。
[0638]
hd8scfv-cd83 scfv的结合活性通过elisa测试，如实施例3中所述。
[0639]
实施例5
–
疫苗配制剂双特异性抗体
[0640]
在疫苗配制过程中，将双特异性或多特异性抗体与灭活病毒(诸如商业死病毒疫苗配制剂)混合。这将导致与灭活病毒缀合的抗体的形成。以这种方式，灭活病毒的抗原靶向apc。这种疫苗配制剂增强了apc灭活疫苗的功效，而无需任何化学缀合。
[0641]
实施例6
–
用与cd83 scfv蛋白融合的h5ha进行的免疫诱导更快和更高的体液应答
[0642]
h5ha和h5ha-cd83scfv表达质粒的构建。
[0643]
使用描述h9ha表达盒h9ha-foldon-cd83scfv(图1)和h9ha-foldon(图2)生成的相同方法生成h5ha疫苗构建体(h5ha-foldon-cd83scfv和h5ha-foldon)。表达盒(bip-h5ha-foldon-cd83scfv-c标签，seq id no:72)含有禽流感h5n8病毒株(a/duck/egypt/ss19/2017，登录号mh893738.1)的h5ha抗原的胞外域序列(氨基酸17-527)。h5ha序列经修饰以将ha切割位点从多碱基变为单碱基，血凝素基因信号肽由果蝇bip蛋白信号序列和tm域替换，用来自噬菌体t4的三聚体蛋白fibritin的30个氨基酸三聚foldon序列替换。将四个氨基酸“epea”序列作为标签(称为epea标签或c标签)融合在表达盒的c端，用于重组蛋白表达检测和纯化。第二表达盒(bip-h5ha-foldon-c标签，seq id no:73)缺少cd83scfv序列。使用ecor1和sacii克隆位点将两个表达盒克隆到黑腹果蝇表达载体(ps2v1)中。
[0644]
h5ha和h5ha融合scfv蛋白的表达和纯化
[0645]
使用果蝇表达系统(life technologies)生产和纯化重组蛋白。简而言之，将含有表达盒(bip-h5ha-foldon-cd83scfv-c标签或bip-h5ha-foldon-c标签)的pexpres2-v1质粒转染到果蝇s2细胞中。使用浓度为1.5mg/mlzeocin的zeocine进行了为期4周的抗生素选择。zeocine选择的细胞在28℃下在无血清培养基(,merck)中培养。将重组蛋白分泌到培养物上清液中，然后使用c标签亲和矩阵(captureselect
tm
，thermofisher)进行纯化。纯化的重组蛋白的浓度通过bradford测定法确定，纯度通过标准sds-page和westernblot评估。
[0646]
鸡疫苗接种
[0647]
用h5ha-foldon-cd83scfv和h5ha-foldon疫苗中含有等摩尔浓度的h5ha蛋白的疫
苗免疫多组一日龄白来亨spf鸡(每组n＝4)。蛋白质在montanide(
tm
)isa71 vg(seppic)佐剂中配制。蛋白质与佐剂体积的比率为1:3。疫苗剂量(0.2ml)皮下施用，在颈后部递送。在7、14、21、28和35日龄时从翼静脉收集血液样品，并使用hi测定法分析血清中h5ha特异性抗体的存在。
[0648]
结果：
[0649]
h5ha-foldon-cd83scfv和h5ha-foldon疫苗的生产
[0650]
重组h5ha-foldon-cd83scfv和h5ha-foldon蛋白的表达水平在90-120mg/升培养物上清液的范围内。使用sds-page分析可视化蛋白质的纯度，显示单体蛋白质的单一条带，h5ha-foldon-cd83scfv的分子量为100kda并且h5ha-foldon的分子量为70kda。两种蛋白质的纯度估计高达99％。
[0651]
用h5hafoldon-cd83scfv疫苗进行的免疫诱导更快和更高的体液应答
[0652]
用每剂0.2ml含有等摩尔浓度的纯化h5ha-foldon-cd83scfv(49μg)和h5ha-foldon(35μg)的疫苗来疫苗接种一日龄雏鸡。使用针对灭活病毒抗原(a/duck/egypt/ss19/2017)的标准hi测定分析在7、14、21、28和35日龄收集的血清样品。图22中呈现的数据显示，与用h5ha-foldon接种疫苗的鸡相比，用h5ha-foldon-cd83scfv接种疫苗的鸡含有显著更高水平的hi滴度。结论：与缺乏cd83scfv抗体的aiv h5ha相比，与cd83scfv抗体融合的aiv h5ha诱导显著更快和更高的免疫应答。
[0653]
实施例7
–
表达h9ha-foldon-cd83scfv蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rhvt)在鸡中诱导更快和更高的体液应答
[0654]
结果：
[0655]
使用hdr crispr/cas9系统生成rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv和rhvt-h9ha-foldon。
[0656]
如图23中所例示，使用hdr-crispr/cas9生成rhvt-h9ha-foldon疫苗和rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv疫苗。将产生h9ha-foldon和h9ha-foldon-cd83scfv蛋白的表达盒整合到ul45/ul46之间hvt基因组的基因间区域，该ul45/ul46含有来自伪狂犬病病毒(prv)的糖蛋白b(gb)启动子和猫科动物α疱疹病毒1的polya终止子。ha蛋白序列衍生自h9n2病毒株a/chicken/pakistan/skp/2016(genbank登录号：avx19091.1)。
[0657]
为了挽救rhvt，cef细胞用gfp grna质粒和供体质粒中的每一者转染，该供体质粒含有表达盒(h9ha-foldon疫苗和rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv)，其两侧是与cas9切割位点同源的序列。随后在转染后12小时以0.01的感染复数(moi)用rhvt-gfp感染。含有h9ha-foldon或rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv的表达盒的rhvt病毒噬斑鉴定为绿色荧光阴性的h9ha-foldon疫苗和rhvt-h9ha-foldon-cd83 scfv。这些gfp阴性噬斑要么是正确的rhvt-h9ha阳性克隆，要么是gfp沉默的假阳性克隆。提取病毒dna并使用靶向h9ha插入物内区域的引物进行pcr分析。总共11％和22％的克隆分别对h9ha-foldon和h9ha-foldon-cd83scfv插入呈阳性。取来自每个构建体的阳性rhvt克隆之一用于空斑纯化、疫苗储备制备、体外复制动力学、插入稳定性和鸡中免疫原性的评价。
[0658]
rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv和rhvt-h9ha-foldon显示出与野生型hvt相似的体外复制动力学。
[0659]
将rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv的复制适应性与野生型hvt进行比较，以确定表达
盒(h9ha-foldon或h9ha-foldon-cd83scfv)的插入是否影响培养细胞中rhvt构建体的感染性和复制。为此，用100 pfu的hvt野生型、rhvt-h9ha或rhvt-h9ha-cd83scfv感染鸡胚成纤维细胞(cef)细胞。通过计数噬斑(图24a)和用于基因组拷贝数的qrt-pcr (图24b)来测量病毒复制率。通过噬斑测定或qrt-pcr测量的病毒复制率显示，野生型hvt与rhvt-h9ha-foldon和rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv疫苗构建体之间的病毒复制适应性没有差异。
[0660]
与rhvt-h9ha-foldon相比，rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv在接种疫苗的鸡中诱导更高的抗体应答。
[0661]
用4000 pfu的rhvt-h9ha-foldon和rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv皮下免疫多组一日龄白来亨spf鸡(每组n＝20)。在pv第6、14、21、28和35天时从翼静脉收集血液样品，并使血清样品经受hi、抗ha igy elisa和病毒mnt测定，以测量ha抗原特异性抗体滴度。
[0662]
用rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv疫苗接种疫苗的鸡在pv第21天时显示可检测的hi抗体，而用rhvt-h9ha-foldon接种疫苗的鸡的那些组仅从pv第28天起显示出可检测水平的hi抗体。(图25)。
[0663]
rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv和rhvt-h9ha-foldon之间hi抗体滴度的比较表明，在pv第21天后，rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv能够诱导显著高于rhvt-h9ha-foldon的hi抗体滴度(pv第28天：p《0.05，pv第35天：p《0.0001，pv第42天：p《0.0001)(图25)。
[0664]
对在不同时间点(pv第6、14、21、28和35天)从疫苗接种鸡收集的血清样品中的igy抗体滴度的分析也显示，与rhvt-h9ha-foldon疫苗相比，rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv疫苗诱导更高的抗h9haigy抗体滴度(图26)。在pv第21天(p《0.05)、pv第28天(p《0.001)和pv第35天(p《0.05)，与rhvt-h9ha-foldon组相比，rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv组显示出显著较高的抗haigy抗体。
[0665]
特异性中和h9n2病毒的血清抗体水平的分析是使用微量中和(mnt)测定法确定的。在pv第42天，与rhvt-h9ha-foldon相比，从用rhvt-h9ha-foldon-cd83scfv接种疫苗的鸡收集的血清样品显示出显著更高水平的病毒中和抗体(p《0.01)(图27)。
[0666]
实施例8
ꢀ–ꢀ
表达h9ha-foldon-cd83scfv的重组新城疫病毒(rndv)的生成。
[0667]
生成了携带表达盒(h9ha-foldon-cd83scfv)的rndv，该表达盒编码与鸡apc受体cd83特异性scfv抗体融合的可溶性形式三聚体h9ha抗原。表达盒(seq id no: 75)是化学合成的，并且针对在鸡(原鸡(gallus gallus))细胞(genscript)中的表达进行密码子优化。将表达盒整合到lasota株的ndv基因间区域(p/v和m基因之间)(图30)。生成的rndv疫苗构建体产生分泌形式的h9ha-foldon-cd83scfv抗原。用rndv-h9ha-foldon-cd83scfv疫苗进行7日龄鸡的疫苗接种引发了强h9ha抗原特异性hi抗体滴度(图31)。该结果得出结论，ndv可以用作在鸡中生产和递送apc靶向疫苗的载体。
[0668]
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解所要求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在在以下权利要求的范围内。

技术特征：
1.工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和a)至少一种抗原性多肽；或b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。2.根据权利要求1的工程蛋白，其中所述工程蛋白是基因工程蛋白。3.根据权利要求2的工程蛋白，其中所述能够与细胞表面蛋白结合的至少一个结合域和所述至少一种抗原性多肽包含在单个重组蛋白中；或所述能够与细胞表面蛋白结合的至少一个结合域和所述能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域包含在单个重组蛋白中。4.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述能够与细胞表面蛋白结合的至少一个结合域可操作地连接至所述至少一种抗原性多肽或所述能够与抗原性多肽结合的至少一个结合域。5.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞、巨噬细胞、b细胞或自然杀伤细胞中的至少一种。6.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述细胞表面蛋白选自免疫球蛋白家族蛋白、整联蛋白家族受体或c型凝集素。7.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述细胞表面蛋白选自cd83、cd11c或dec205。8.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述细胞表面蛋白是cd83。9.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述至少一种抗原性多肽是禽流感病毒抗原性多肽，诸如血凝素。10.根据前述权利要求中任一项的工程蛋白，其中所述结合域是基于抗体或抗体片段诸如单链可变片段(scfv)、fv、f(ab’)或f(ab’)2的抗原结合位点。11.核酸构建体，其包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，所述第一多核苷酸编码如权利要求1至10中任一项所定义的能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；所述第二多核苷酸编码如权利要求1至10中任一项所定义的至少一种抗原性多肽或能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。12.载体，其包含根据权利要求11的核酸构建体。13.工程细胞，其表达根据权利要求1至10中任一项的工程蛋白，或包含根据权利要求11的核酸构建体，或包含根据权利要求12的载体。14.禽疫苗，其包含根据权利要求1至10中任一项的工程蛋白、根据权利要求11的核酸构建体、根据权利要求12的载体和/或根据权利要求14的工程细胞，以及药学上可接受的载剂。15.根据权利要求14的疫苗，其用于治疗和/或预防禽受试者的疾病。16.根据权利要求1至10中任一项的基因工程蛋白、根据权利要求11的核酸构建体、根据权利要求12的载体和/或根据权利要求13的工程细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。17.用于治疗和/或预防禽受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求14的疫苗的步骤。
18.根据权利要求15使用的疫苗或根据权利要求17的方法，其中所述疫苗的施用在所述受试者中引发体液和/或细胞免疫应答。19.根据权利要求15或18使用的疫苗，或根据权利要求17或18的方法，其中所述疫苗的施用降低所述受试者中的攻击病原体负载。20.根据权利要求15、18或19中任一项使用的疫苗，或根据权利要求17至19中任一项的方法，其中所述受试者是家禽，优选地所述受试者可以选自鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鸽或鹅。21.用于制备根据权利要求14所述的疫苗的方法，所述方法包括将根据权利要求1至10中任一项的基因工程蛋白、根据权利要求11的核酸构建体、根据权利要求12的载体，和/或根据权利要求13的工程细胞，和药学上可接受的载剂混合的步骤。

技术总结
本发明涉及基因工程蛋白，其包含：能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和a)至少一种抗原性多肽或b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域。本发明还涉及禽疫苗，其包含能够与禽抗原呈递细胞上的细胞表面蛋白结合的至少一个结合域；和a)至少一种抗原性多肽或b)能够与至少一种抗原性多肽结合的至少一个结合域，以及此类疫苗治疗和/或预防禽受试者的疾病的用途。苗治疗和/或预防禽受试者的疾病的用途。


技术研发人员：M
受保护的技术使用者：皮尔布莱特研究所
技术研发日：2021.10.25
技术公布日：2023/8/1