细胞培养方法和使用其的细胞培养装置

1.本发明涉及在生物体外对构成血脑屏障(blood-brain barrier)in vitro(体外)模型(以下称为bbb模型。)的细胞进行培养的技术，特别是涉及能够实现包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的大量生产的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置。需说明的是，“in vitro”是拉丁语，意为“在玻璃容器中”，一般表示生物体的一部分被摘出“生物体外”或游离于“生物体外”的状态。


背景技术：

2.血脑屏障(bbb)是解剖学上的脑毛细血管，由脑来源的血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞等构成。以围绕血管内皮细胞的方式存在的周细胞具有控制血管内皮细胞的分化、增殖的功能，星形胶质细胞具有向神经细胞供应营养、同时通过迅速将过剩的离子、神经递质除去来保护神经细胞的功能。
3.血脑屏障(bbb)具有限制血液与脑组织液之间进行的物质交换的重要功能，通过该功能来维持神经细胞的恒定性。但该功能在开发中枢神经性疾病中使用的预防药物、治疗药物上是一个重大障碍。例如，存在应当作用于中枢神经系统的药物向脑内的移动实际上被bbb阻碍、无法获得期待的效果的情况。此外，还存在本来预想不会向脑内移动的药物与预想相反地穿过bbb、结果对中枢神经系统产生不良影响的情况。
4.关于什么样的物质会穿过bbb并没有一定的规律，因此在开发中枢神经性疾病中使用的预防药物、治疗药物时，有必要使用bbb模型进行筛选。
5.本技术发明人迄今为止已成功开发了准确再现bbb的解剖学结构的模型，由此，目前药物研发中筛选研究的水平有了飞跃性提高。
6.该bbb模型呈下述结构：星形胶质细胞和周细胞之间夹持多孔质膜，分别形成层状，同时，以与周细胞直接接触的方式配置层状的血管内皮细胞。需说明的是，该bbb模型以往是通过熟练的研究者的手动操作来制作的，其制作需要特殊的技术，因此存在无法大量生产的问题。
7.作为与上述bbb模型的制作相关的技术，例如专利文献1中，公开了名为“细胞培养插件”的、在多孔质膜的两面对细胞进行共培养的装置相关的发明。
8.专利文献1公开的细胞培养装置的特征在于，具备下端安装有多孔性的膜的外侧管状主体、与该外侧管状主体下端的外径嵌合的辅助管状主体、以及至少1个法兰盘从上端在横向延伸、外径的全周或一部分与外侧管状主体的内径嵌合的悬挂构成要素，在第1阶段，外侧管状主体与辅助管状主体连接而形成用于第1细胞培养的自立式插件，在第2阶段，外侧管状主体从辅助管状主体脱离，同时，为了进行第2细胞培养而安装于悬挂构成要素。
9.该细胞培养装置中，将辅助管状主体与外侧管状主体的下端连接后，将两者翻转，从而形成细胞培养室。因此，该细胞培养室中，在向辅助管状主体内突出的膜的外表面上接种细胞(第1细胞接种)。接下来，在经过适当的培养时间的时刻，将外侧管状主体和辅助管状主体的组合体翻回来，将悬挂构成要素与外侧管状主体连接后，将辅助管状主体移除。将
这样操作得到的悬挂插件配置在细胞培养板的孔内，在呈向上方突出状态的膜的内表面上实施第2细胞接种。
10.这样，利用上述结构的细胞培养装置，通过对膜的外表面和内表面分两个阶段分别进行细胞接种，能够在膜的两面对细胞进行共培养。
11.现有技术文献
12.专利文献
13.专利文献1：日本特许第5674953号公报


技术实现要素：

14.发明所要解决的课题
15.专利文献1公开的发明中，虽然能够制作在多孔质膜的两面分别形成有不同种类细胞层的细胞培养模型，但用于形成细胞培养室和悬挂插件的操作必须挨个手动进行操作，因而不适合细胞培养模型的量产。因此认为，即便将专利文献1公开的细胞培养装置应用于bbb模型的制作，也无法对bbb模型进行量产。
16.本发明的第1目的在于应对这样的现有情况，提供能够对包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型进行量产的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置。此外，本发明的第2目的在于，提供能够通过长时间维持层叠有上述3种细胞的状态来提高包括这些细胞层的bbb模型的量产性的细胞培养方法。
17.用于解决课题的方法
18.为了实现上述目的，第1发明的特征在于，具备细胞培养室，将形成为筒状的内壁被多孔质膜上下划分而成的一对细胞培养室连接多个而使被上下划分的细胞培养室分别一体化，其中，多孔质膜形成为两面可固着生物材料；并且具备细胞培养室盖，其使被划分且被分别一体化的细胞培养室中的至少任一方同时闭塞。
19.这样结构的细胞培养装置中，因为具备覆盖细胞培养室的开口端的细胞培养室盖，所以具有无需担忧注入细胞培养室内的细胞培养液、接种的细胞在操作时从细胞培养室漏出的作用。
20.需说明的是，之所以设为一对细胞培养室中的至少任一方被细胞培养室盖闭塞的构成，是因为如果最初将包括固着于多孔质膜的上侧(第1面)的生物材料的一个细胞培养室闭塞，将这一细胞培养室翻转而朝向下侧，使另一细胞培养室为上侧，在先前的多孔质膜的背面(第2面)使生物材料固着，然后再翻转，则即使不将两者闭塞，也能够在多孔质膜的两面培养生物材料。
21.此外，“使被划分且被分别一体化的前述细胞培养室中的至少任一方同时闭塞”的意思是，除了将被一体化的细胞培养室整体同时闭塞的情况以外，还包括将构成一体化的细胞培养室的各个细胞培养室中的每一个同时闭塞的情况。
22.第2发明的特征在于，在第1发明中，具备：细胞培养板，其具有作为内壁使用的多个第1通孔，同时以覆盖该第1通孔的方式在底面设置有由多孔质膜构成的片；第1底面盖，其上部开口，在底板设有与第1通孔一起作为内壁使用的多个第2通孔，并且设于细胞培养板的底面；以及第2底面盖，其作为细胞培养室盖，设于第1底面盖的底板；第2通孔设置在俯视设于细胞培养板的底面的状态的第1底面盖时与第1通孔匹配的位置。
23.第2发明中，在第1发明的作用的基础上，具有下述作用：如果在将细胞培养板翻转的状态下在底面设置第1底面盖后，在第2通孔内部接种细胞培养液以及星形胶质细胞，则利用第2通孔的内壁，防止细胞培养液和星形胶质细胞的漏出，因此容易利用多孔质膜的外表面培养星形胶质细胞。此外，还具有下述作用：如果将第2底面盖设于第1底面盖，将细胞培养板与第1底面盖和第2底面盖一起翻转后，在细胞培养板的第1通孔内部接种细胞培养液以及周细胞和血管内皮细胞，则利用第1通孔的内壁，防止细胞培养液、周细胞和血管内皮细胞的漏出，因此容易利用多孔质膜的内表面培养周细胞和血管内皮细胞。进一步，设有第1底面盖和第2底面盖的细胞培养板还具有作为微孔板发挥功能的作用。
24.第3发明的特征在于，在第1发明中，具备：细胞培养插件的第1内壁，其一端被多孔质膜闭塞，且作为细胞培养室的内壁使用；细胞培养板，其内插有该细胞培养插件，且设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔；以及平板状的第1板盖和第2板盖，其作为细胞培养室盖，分别设于细胞培养板的两面且覆盖内插有细胞培养插件的状态的通孔。
25.第3发明中，在第1发明的作用的基础上，具有下述作用：如果在底部朝下的状态下在通孔设有细胞培养插件的细胞培养板的上表面设置第1板盖后，将细胞培养板与该第1板盖一起翻转，在细胞培养板的通孔内部接种细胞培养液以及星形胶质细胞，则利用细胞培养板的通孔的内壁，防止细胞培养液和星形胶质细胞的漏出，因此容易利用多孔质膜的外表面培养星形胶质细胞。此外，还具有下述的作用：如果将第2板盖设于细胞培养板中未设置第1板盖的面，将细胞培养板与第1板盖和第2板盖一起翻转，则利用细胞培养板的通孔，细胞培养插件以底部向下的状态被保持，因此，在细胞培养插件内部接种细胞培养液以及周细胞和血管内皮细胞的操作、在细胞培养插件内部对血管内皮细胞和周细胞进行培养的操作变得容易。进一步，设有第2板盖的细胞培养板还具有作为微孔板发挥功能的作用。
26.第4发明的特征在于，在第1发明中，具备：作为细胞培养室使用的膜保持件，其一端被多孔质膜闭塞且具备作为内壁使用的第2内壁；板，其在形成有作为内壁使用的多个第1通孔的平板状的第1基部的一面垂直竖立有第1筒体，所述第1筒体与第1通孔连通、内部设有膜保持件、且与第1通孔一起作为内壁使用；板盖，其在平板状的第2基部的一面设有与多个第1筒体分别同时嵌合的多个第1突出部，作为细胞培养室盖而覆盖内部设有膜保持件的状态的第1通孔；衬套盖，其在平板状的第3基部的一面设有与多个第1筒体分别同时嵌合的多个第2突出部，作为细胞培养室盖而覆盖内部设有膜保持件的状态的第1通孔；衬套，其在形成有数量与第1通孔相同的、作为内壁使用的第2通孔的平板状的第4基部的一面，以与第2通孔连通的方式垂直竖立有多个第2筒体，所述多个第2筒体与第1筒体一起构成细胞培养室、分别同时向多个第1筒体进行内插且与第2通孔一起作为内壁使用；以及挤出件，其在平板状的挤出板的一面垂直竖立有多个挤出部，所述多个挤出部分别同时向多个第1通孔进行内插。
27.第4发明中，在第1发明的作用的基础上，具有下述作用：如果在衬套的第2筒体的上端设置膜保持件、将板的第1筒体外插于衬套的第2筒体、同时使第2突出部与第1筒体嵌合、将衬套盖安装于衬套，则利用衬套盖，防止了注入衬套的第2筒体内部的细胞培养液通过板的第1通孔漏出，同时，呈利用衬套的第2筒体保持膜保持件的状态，因此用多孔质膜的内表面培养星形胶质细胞的操作变得容易。
28.此外，如果在弃去衬套的第2筒体内的细胞培养液后，使第1突出部与第1筒体嵌
合，将衬套盖安装于衬套，将衬套与板盖和衬套盖一起翻转，进一步将衬套盖移除后，在衬套的第2筒体内部接种细胞培养液以及周细胞，则利用衬套的第2筒体的内壁，防止细胞培养液和周细胞的漏出，因此利用多孔质膜的外表面培养周细胞的操作变得容易。
29.而且，还具有下述作用：如果将板盖和衬套盖以及衬套从板移除、同时将挤出件的挤出部内插于板的第1通孔后，以挤出板与板的第1基部抵接的方式使挤出件靠近板，则膜保持件被挤出部向第1筒体的外部挤出。
30.进一步还具有下述作用：如果在向板的第1筒体的外部挤出的膜保持件的上表面敷设血管内皮细胞的细胞片后，用套筒将血管内皮细胞的细胞片从上方落料并直接将套筒压入膜保持件而将膜保持件安装于套筒前端，则膜保持件与套筒一体化，从而得到底部形成有包括血管内皮细胞的细胞片、周细胞和星形胶质细胞的3种细胞层的细胞培养插件。
31.第5发明的特征在于，在第1发明中，具备：作为细胞培养室使用的膜保持件，其一端被多孔质膜闭塞且具备作为内壁使用的第3内壁；作为细胞培养室的板，其在平板状的基部设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔，所述多个通孔在内部设有膜保持件；平板状的2块板盖，其以作为细胞培养室盖而覆盖内部设有膜保持件的状态的通孔的方式设置于板；以及挤出件，其在平板状的挤出板的一面垂直竖立有多个挤出部，所述多个挤出部分别同时向多个通孔进行内插。
32.第5发明中，在第1发明的作用的基础上，具有下述作用：如果将板盖安装于板的下表面、以多孔质膜的外表面为下侧的方式将膜保持件设于通孔内部后，在板的通孔内部注入细胞培养液，则利用板的通孔的内壁，防止细胞培养液的漏出，因此利用用多孔质膜的内表面培养星形胶质细胞的操作变得容易。
33.此外还具有下述作用：将另一块板盖安装于板的上表面、将板翻转后，将最初安装的板盖从板移除的情况下，在板的通孔内部，膜保持件翻转，形成多孔质膜的外表面朝向上侧的状态，因此通过在板的通孔内部接种周细胞，容易利用多孔质膜的内表面培养周细胞。
34.进一步还具有下述作用：如果将另一块板盖从板移除、同时将挤出件的挤出部内插于板的通孔后，以挤出板与板的基部抵接的方式使挤出件靠近板，则膜保持件被挤出部向筒体的外部挤出。
35.而且还具有下述作用：如果在向板的筒体的外部挤出的膜保持件的上表面覆设血管内皮细胞的细胞片后，用插件主体将血管内皮细胞的细胞片从上方落料并直接将插件主体压入膜保持件，将膜保持件安装于插件主体的前端，则膜保持件与插件主体一体化，从而得到底部形成有包括血管内皮细胞的细胞片、周细胞和星形胶质细胞的3种细胞层的细胞培养插件。
36.第6发明的特征在于，在第5发明中，板中，在基部两面以俯视基部时包围通孔的方式分别设有与通孔连通的第1突出部和第2突出部；板盖中，一面设有与多个第1突出部和第2突出部分别同时嵌合的多个第1筒体；挤出件中，比挤出部短、向多个第1突出部和第2突出部分别同时嵌合的多个第2筒体以分别包围挤出部的方式设于挤出板的一面。
37.需说明的是，第6发明中的“板的第1突出部和第2突出部”、“板盖的第1筒体”和“挤出件的第2筒体”分别相当于实施方式中随后用图11(a)、图11(c)和图11(f)描述的“板14的第1环状突出部14b和第2环状突出部14c”、“构成板盖15的保持部15b的短圆筒体”和“构成挤出件17的保持部17b的短圆筒体”的上位概念。
38.第6发明中，在第5发明的作用的基础上，通过使板盖的第1筒体与板的第1突出部或第2突出部嵌合，板盖对板的密合性提高，同时，通过使挤出件的第2筒体与板的第1突出部或第2突出部嵌合，挤出件的位置与板正确匹配。
39.第7发明的特征在于，在第1发明中，具备：作为细胞培养室使用的细胞培养插件，其一端被多孔质膜闭塞且具备作为内壁使用的第4内壁；作为细胞培养室使用的细胞培养盒，其上部开口，在底板设有多个通孔，所述多个通孔作为内壁使用、并且内插有细胞培养插件；插件保持单元，以使多个细胞培养插件能够分别同时向该细胞培养盒的多个通孔进行内插的状态进行保持；以及盒用盖，其作为细胞培养室盖而覆设在细胞培养盒的上部。
40.第7发明中，在第1发明的作用的基础上，还具有下述作用：在使利用插件保持单元保持的多个细胞培养插件为倒扣的状态，对多个细胞培养插件以底部分别从各通孔突出的方式设置细胞培养盒后，在细胞培养盒中注入细胞培养液的情况下，细胞培养盒具有细胞培养液在内部储存而不会漏出的功能，因而容易利用多孔质膜的外表面培养星形胶质细胞。
41.此外，还具有下述作用：在将盒用盖安装于细胞培养盒的上表面后，将细胞培养盒与插件保持单元一起翻转的情况下，利用盒用盖防止了细胞培养液从细胞培养盒的漏出，同时，多个细胞培养插件同时翻转呈朝向上侧的状态，因此通过在细胞培养插件内部接种周细胞，容易利用多孔质膜的内表面培养周细胞。
42.进一步，在通过在细胞培养插件内部接种血管内皮细胞进行培养而得到底部形成有包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的3种细胞层的细胞培养插件的情况下，多个细胞培养插件利用插件保持单元而一体化，因而容易进行向微孔板的孔转移的操作。
43.第8发明为一种细胞培养方法，其特征在于，为使用多对细胞培养室制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的细胞培养方法，所述多对细胞培养室为形成为筒状的内壁被形成为两面可固着生物材料的多孔质膜上下划分而成的细胞培养室，所述细胞培养方法包括：在多孔质膜中朝向上方的第1面接种星形胶质细胞的工序，对星形胶质细胞进行培养的工序，将多对细胞培养室的上端开口部同时闭塞的工序，将多对细胞培养室同时翻转、在多孔质膜的第2面接种周细胞的工序，对周细胞进行培养的工序，在多孔质膜的第2面上敷设片状的血管内皮细胞的工序，以及对血管内皮细胞进行培养的工序。
44.需说明的是，发明的实施方式中，将对星形胶质细胞、周细胞和血管内皮细胞进行培养的工序和将细胞培养液注入细胞培养插件的工序作为不同工序进行了说明，但根据细胞培养装置结构的不同，也存在培养周细胞、血管内皮细胞时处于可利用星形胶质细胞的培养所用的细胞培养插件的状况、没有必要重新在细胞培养插件中注入细胞培养液的情况，因此第8发明和第9发明中，对星形胶质细胞、周细胞和血管内皮细胞进行培养的工序包括可利用已经注入细胞培养插件的细胞培养液的工序和将新的细胞培养液注入细胞培养插件的工序中的任一工序。
45.第8发明中，具有在同时使多对细胞培养室的上端开口部闭塞的状态下将这些细胞培养室同时翻转的工序，因此具有无需担忧注入细胞培养室内的细胞培养液、接种的细胞在操作时从细胞培养室漏出的作用。
46.第9发明的特征在于，在第8发明中，血管内皮细胞具有温度敏感性，在希望的温度
下细胞停止增殖；并且，具备将血管内皮细胞以包埋于在上述温度下溶解的温度敏感性凝胶的状态下在多孔质膜的第2面上接种的工序，以代替在多孔质膜的第2面上敷设片状的血管内皮细胞的工序；并且，在对血管内皮细胞进行培养的工序之后，具备使温度敏感性凝胶溶解的工序。
47.第9发明中，在第8发明的作用的基础上，具有下述作用：通过温度敏感性凝胶的溶解，完成星形胶质细胞、周细胞和血管内皮细胞良好层叠的状态，同时，维持上述3种细胞层叠的状态直至使它们的温度降至细胞增殖开始的温度。
48.发明效果
49.根据第1发明，被多孔质膜划分而成的一对细胞培养室连接多个而一体化的细胞培养室中的至少任一方用细胞培养室盖闭塞，能够在无需担忧注入细胞培养室内部的细胞培养液、接种的细胞在操作中的翻转时漏出的同时进行操作，因此，通过使用操作装置，能够高效进行多孔质膜的翻转操作、将制作的bbb模型转移至微孔板的孔的操作。进一步，能够对多个细胞培养室实施没有时间差的操作，因而能够在细胞培养室间实施均一的细胞培养。
50.根据第2发明，在第1发明的效果的基础上实现了下述效果：在不需要细胞培养插件的基础上，能够将细胞培养板直接作为微孔板使用，因而与使用细胞培养插件、微孔板的情况相比，包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的量产性提高。
51.根据第3发明，细胞培养液和星形胶质细胞不会从多孔质膜的外表面漏出，因此在第1发明的效果的基础上实现了下述效果：能够在多孔质膜的外表面高效形成星形胶质细胞的细胞层。此外，将在多个通孔内部分别设有细胞培养插件的状态的细胞培养板翻转时，多孔质膜的翻转操作对全部细胞培养插件同时进行，因此短时间内在多孔质膜的两面形成星形胶质细胞和周细胞的细胞层。因此，根据第3发明，能够高效制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型。
52.根据第4发明，将多孔质膜翻转的操作、从板的通孔内部将膜保持件取出的操作和在周细胞的上部配置血管内皮细胞的操作对于多个多孔质膜、膜保持件同时进行，因此在第1发明的效果的基础上，实现了能够在短时间内制作多个bbb模型的效果。
53.根据第5发明，在多孔质膜的两面分别对星形胶质细胞和周细胞进行培养时必需的将多孔质膜翻转的操作、从板的通孔内部将膜保持件取出的操作和在周细胞的上部配置血管内皮细胞的操作对于多个多孔质膜、膜保持件同时进行，因此在第1发明的效果的基础上，实现了在短时间内制作多个bbb模型的效果。
54.根据第6发明，利用第1筒体提高板盖对板的密合性，因此在第5发明的效果的基础上，实现了能够切实防止注入通孔内部的细胞培养液从板与板盖之间的漏出的效果。此外，根据第6发明，利用第2筒体，正确进行挤出件对板的位置匹配，因此实现了板、挤出件难以发生故障的效果。
55.根据第7发明，能够在一体化的状态下将多个细胞培养插件翻转、或者转移至微孔板的孔中，因此在第1发明的效果的基础上，实现了能够在短时间内高效制作多个bbb模型的效果。
56.第8发明中，无需担忧注入细胞培养室内部的细胞培养液、接种的细胞在操作时漏
出，因此能够使用操作装置等同时高效将多对细胞培养室翻转。由此，包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的量产性提高。
57.根据第9发明，在第8发明的效果的基础上，无需预先准备血管内皮细胞的细胞片，因此能够省去制作该细胞片的工序，因此实现了能够提高包括上述3个细胞层的bbb模型的量产性的效果。
附图说明
58.[图1]中，(a)和(b)分别为细胞培养插件的外观立体图和纵截面图，(c)为微孔板的外观立体图，(d)为图1(c)中的a-a线向视截面图。
[0059]
[图2]为显示本发明第1实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。
[0060]
[图3]中，(a)和(b)为显示细胞培养液注入细胞培养插件的多孔质膜的外表面的情形的图，(c)为显示细胞接种于设在微孔板的孔中的细胞培养插件的情形的图。
[0061]
[图4]中，(a)为图3(c)中的b-b线向视截面图，(b)为图4(a)中虚线所包围部分的放大图。
[0062]
[图5]中，(a)和(b)分别为插件保持板和细胞培养盒的外观立体图。
[0063]
[图6]中，(a)和(b)分别为插件按压件和盒用盖的外观立体图。
[0064]
[图7]为显示本发明第2实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。
[0065]
[图8]中，(a)为显示细胞培养插件设于插件保持板的状态的立体图，(b)为图8(a)中的c-c线向视截面图。
[0066]
[图9]中，(a)为显示在图8(a)中的插件保持板的上方设有细胞培养盒的状态的立体图，(b)为显示在图9(a)中的细胞培养盒上安装盒用盖后，与插件保持板一起翻转的状态的立体图。
[0067]
[图10]中，(a)为图9(b)中的d-d线向视截面图，(b)为显示安装有插件保持板和插件按压件的细胞培养插件设于微孔板的孔中的状态的立体图。
[0068]
[图11]中，(a)为板盖和板的侧视图，(b)和(c)分别为衬套和挤出件的侧视图，(d)至(f)分别为多孔质膜、膜保持件和插件主体的外观立体图。
[0069]
[图12]中，(a)和(c)分别为图11(a)所示的板和板盖的俯视图，(b)和(d)分别为图11(a)中的e-e线向视截面图和图11(c)中的f-f线向视截面图。
[0070]
[图13]中，(a)为图11(b)和图11(c)所示的衬套和挤出件的俯视图，(b)和(c)分别为衬套和挤出件的截面图。
[0071]
[图14]中，(a)和(c)分别为图11(f)和图11(e)所示的插件主体和膜保持件的俯视图，(b)和(d)分别为图14(a)中的h-h线向视截面图和图14(c)中的i-i线向视截面图。
[0072]
[图15]为显示本发明第3实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。
[0073]
[图16]中，(a)为显示在下表面用板盖覆盖、同时内部设有膜保持件的板的内部接种了星形胶质细胞的细胞的状态的截面图，(b)为表示板的上部用板盖覆盖的状态的截面图。
[0074]
[图17]中，(a)为显示图16(b)中上下翻转后，设于下表面的板盖被移除、同时板的内部接种了周细胞的细胞的状态的截面图，(b)为显示图17(a)中设于下表面的板盖被移除、设置了图11(c)所示挤出件的状态的截面图。
[0075]
[图18]中，(a)为显示在图17(b)中多孔质膜的外表面敷设了片状血管内皮细胞的状态的截面图，(b)为显示图18(a)中膜保持件安装于插件主体的下端的状态的截面图，(c)为由膜保持件和插件主体构成的细胞培养插件的截面图。
[0076]
[图19]中，(a)为显示在下表面用图11(b)所示的衬套覆盖同时内部设有膜保持件的板的内部接种了星形胶质细胞的细胞的状态的截面图，(b)为表示板的上部和下部用衬套覆盖的状态的截面图。
[0077]
[图20]为显示图19(b)中上下翻转后，设于下表面的衬套被移除、同时在板的内部接种了周细胞的细胞的状态的截面图。
[0078]
[图21]中，(a)和(b)为板的外观立体图，(c)和(d)分别为板盖(衬套盖)和衬套的外观立体图。
[0079]
[图22]中，(a)至(c)分别为挤出件、膜保持件和套筒的外观立体图，(d)和(e)分别为图22(b)中的j-j线向视截面图和图22(c)中的k-k线向视截面图。
[0080]
[图23]中，(a)和(b)分别为表示板的圆筒体中内插有衬套的圆筒体的状态的纵截面图和表示板的圆筒体中内插有挤出件的挤出部的状态的纵截面图。
[0081]
[图24]为显示本发明第4实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。
[0082]
[图25]中，(a)为显示图21(d)所示的衬套的圆筒体的上端设置有膜保持件的状态的图，(b)为显示在图25(a)的衬套中安装了衬套盖和板并上下翻转的状态的图，(c)为图25(b)中的衬套和板的圆筒体以及膜保持件的纵截面图。
[0083]
[图26]中，(a)为显示在图25(b)的板中安装了板盖并上下翻转的状态的图，(b)为显示图26(a)中衬套盖被移除的状态的图。
[0084]
[图27]中，(a)为图26(b)中的衬套和板的圆筒体以及膜保持件的纵截面图，(b)为显示在图26(b)的衬套中再次安装了衬套盖的状态的图，(c)为显示在图27(b)中板盖和衬套盖被移除、挤出件安装于板的状态的图。
[0085]
[图28]中，(a)为图27(c)中的板的圆筒体、挤出件的挤出部和膜保持件的纵截面图，(b)为显示在图27(c)中向板的圆筒体的上方挤出的膜保持件的上表面敷设了血管内皮细胞的细胞片的状态的图，(c)为图28(b)中的板的圆筒体、挤出件的挤出部和膜保持件的纵截面图。
[0086]
[图29]中，(a)为表示图28(b)所示的血管内皮细胞的细胞片用套筒落料的情形的图，(b)为显示图29(a)中在将血管内皮细胞的细胞片落料后的套筒上安装有膜保持件的状态的图。
[0087]
[图30]中，(a)为图29(b)中由套筒和膜保持件构成的细胞培养插件的纵截面图，(b)为显示图30(a)所示细胞培养插件配置在微孔板的孔中的情形的图。
[0088]
[图31]为显示图24所示工序图的变形例的图。
[0089]
[图32]中，(a)为显示在图27(c)中膜保持件上安装有套筒的状态的图，(b)为图32(a)中的板的圆筒体、挤出件的挤出部和由套筒和膜保持件构成的细胞培养插件的纵截面图。
[0090]
[图33]中，(a)至(c)分别为细胞培养板、上表面盖(下表面盖)和细胞培养插件的外观立体图。
[0091]
[图34]为显示本发明第5实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。
[0092]
[图35]中，(a)为显示图33(c)所示的细胞培养插件配置在细胞培养板的通孔中的情形的图，(b)和(c)分别为图35(a)中的l-l线向视截面图和m-m线向视截面图。
[0093]
[图36]中，(a)为显示在设置于细胞培养板的通孔中的细胞培养插件中接种细胞的情形的图，(b)为图36(a)中的n-n线向视截面图，(c)为图36(b)中虚线所包围部分的放大图。
[0094]
[图37]中，(a)为显示在从图36(a)的状态上下翻转后的细胞培养板的通孔中设置的细胞培养插件中接种细胞的情形的图，(b)为图37(a)中的p-p线向视截面图，(c)为图37(b)中虚线所包围部分的放大图。
[0095]
[图38]中，(a)和(c)为细胞培养板的外观立体图，(b)为图38(a)中的q-q线向视截面图。
[0096]
[图39]中，(a)和(c)分别为第1底面盖和第2底面盖的外观立体图，(b)为图39(a)中的r-r线向视截面图。
[0097]
[图40]为显示本发明第6实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。
[0098]
[图41]中，(a)为显示在上下翻转后的细胞培养板上安装有第1底面盖的状态的图，(b)为图41(a)中的s-s线向视截面图，(c)为图41(b)中虚线所包围部分的放大图。
[0099]
[图42]中，(a)为显示在图41(a)中第1底面盖上安装有第2底面盖、同时将细胞培养板的上下翻转的状态的图，(b)为图42(a)中的t-t线向视截面图，(c)为图42(b)中虚线所包围部分的放大图。
具体实施方式
[0100]
使用图1至图42对本发明的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置进行说明。需说明的是，构成本发明的细胞培养装置的构件全部是塑料制的。此外，对于说明过一次的构成要素标以同一符号，从而适当省略其说明。进一步，实施方式的说明中，微孔板呈具有12个孔的结构，但孔的数量不受其限定，可适当变更。例如微孔板具有384个孔时，也可同样地发挥以下说明的本发明的作用和效果。而且，以下的说明中举出在37℃溶解的温度敏感性凝胶为例，但温度敏感性凝胶只要是在血管内皮细胞的细胞增殖停止的温度下溶解的凝胶即可，因此其溶解温度不限定于37℃。
[0101]
实施例1
[0102]
参照图1对本发明第1实施方式涉及的细胞培养装置进行说明。图1(a)和图1(b)分别为细胞培养插件的外观立体图和纵截面图，图1(c)为微孔板的外观立体图，图1(d)为图1(c)中的a-a线向视截面图。需说明的是，为了避免附图的复杂化，图1(c)和图1(d)中仅对1个孔标记了符号。
[0103]
如图1(a)至图1(d)所示，本实施例的细胞培养装置具备细胞培养插件1，该细胞培养插件1在使用具有由圆形有底孔构成的孔2b的微孔板2进行生物化学分析、临床检查时设置在孔2b中，侧面1a呈喇叭状。
[0104]
细胞培养插件1中，一对法兰盘1d、1d以相对的方式分别设于大直径开口部1b侧的端部外表面，同时，形成为两面可固着生物材料的聚碳酸酯制的多孔质膜3以将小直径开口部1c闭塞的方式设于底部内表面。微孔板2呈长方体状，在上表面2a设有12个(纵3列
×
横4列)孔2b。
[0105]
多孔质膜3中，孔的直径为1～3μm左右，是后述细胞培养液可通过的结构，通过热熔合固定于细胞培养插件1。
[0106]
此外，孔2b的内径s1(参照图1(d))比设有一对法兰盘1d、1d的位置的侧面1a的外径s2(参照图1(b))长，比一对法兰盘1d、1d的最外表面间的距离s3(参照图1(b))短。进一步，孔2b的深度h1(参照图1(d))比从侧面1a中小直径开口部1c侧的端面到设有一对法兰盘1d、1d的位置的沿中心轴x的距离h2(参照图1(b))长。即，微孔板2呈下述结构：对于细胞培养插件1，能够在使一对法兰盘1d、1d卡止于孔2b的端缘的状态下，使多孔质膜3的外表面与孔2b的底面2c(参照图1(d))不接触，将设有一对法兰盘1d、1d的位置以外的部分设于孔2b内部(参照图4(a))。需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的第4内壁1e的细胞培养插件1如后述那样作为细胞培养室使用。
[0107]
这里，参照图2至图4，对使用本实施例的细胞培养装置制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的本发明的细胞培养方法进行说明。
[0108]
图2为显示本发明第1实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。图3(a)和图3(b)显示的是在细胞培养插件的多孔质膜的外表面注入细胞培养液的情形，图3(c)显示的是在设置于微孔板的孔中的细胞培养插件中接种细胞的情形。此外，图4(a)为图3(c)中的b-b线向视截面图，图4(b)为图4(a)中虚线所包围部分的放大图。
[0109]
需说明的是，为了避免附图的复杂化，图3(c)和图4(a)中仅对1个孔标记了符号，同时，图3(c)显示的是仅对设于微孔板的12个孔中的4个孔设有细胞培养插件的状态。
[0110]
如图3(a)所示，首先，将细胞培养插件1设为倒扣的状态(底部为上侧的状态)，使用移液器4在多孔质膜3的外表面注入悬浮状态的细胞培养液5(图2的步骤s1)。而且，如图3(b)所示，对于由于表面张力而不会透过多孔质膜3、在其外表面上呈近半球状凸起的状态的细胞培养液5接种星形胶质细胞(图2的步骤s2)。然后，使细胞培养液5的温度维持在例如33℃，进行数天培养，直至使星形胶质细胞形成层状(图2的步骤s3)。
[0111]
将从图3(b)所示的状态上下翻转后的细胞培养插件1如图3(c)和图4(a)所示设于内部被细胞培养液5充满的微孔板2的孔2b中(图2的步骤s4)。然后，使用移液器4在细胞培养插件1内部接种周细胞的细胞(图2的步骤s5)，在使细胞培养插件1内部的温度维持在例如33℃的情况下，对周细胞进行数天培养直至形成层状(图2的步骤s6)。然后，在周细胞生长为层状的阶段将细胞培养液5舍弃。
[0112]
以这种方式，已经在多孔质膜3的外表面形成为层状的星形胶质细胞成为来自细胞的足突贯通多孔质膜3的小孔而伸到形成于多孔质膜3的内表面侧的周细胞的附近的状态。
[0113]
接下来，在周细胞的细胞层之上涂布在血管内皮细胞的细胞增殖停止的温度(例如37℃)以上溶解的温度敏感性凝胶6(例如新田明胶株式会社制明胶ls-250)(图2的步骤s7)。进一步在该温度敏感性凝胶6中包埋血管内皮细胞(图2的步骤s8)，在使细胞培养插件1内部的温度维持在例如33℃的情况下，对血管内皮细胞进行数天培养(图2的步骤s9)。
[0114]
由此，形成如图4(b)所示包括包埋于温度敏感性凝胶6的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层形成于细胞培养插件1的底部的状态。需说明的是，周细胞8具有控制血管内皮细胞7的分化、增殖的功能，但在这种状态下，包埋于温度敏感性凝胶6的血管内皮细胞7不会与周细胞8接触，因此不会发挥该功能。因此，如果使细胞培养插件1内
部的温度为37℃，则血管内皮细胞7的细胞增殖停止，同时，温度敏感性凝胶6溶解(图2的步骤s10)。由此，血管内皮细胞7与周细胞8接触。通过在该状态下使细胞培养插件1内部的温度维持在33℃、再次开始血管内皮细胞7的培养，包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型完成。
[0115]
这样，本实施例的细胞培养装置中，细胞培养液5向细胞培养插件1的多孔质膜3的外表面的注入、星形胶质细胞9的接种或者底部制作了bbb模型的细胞培养插件1向微孔板2的孔2b的转移成为单纯的操作，因此，各操作中可以使用结构简单的操作装置。而且，通过使用这样的操作装置，可以实现包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型的量产化。
[0116]
此外，本实施例的细胞培养方法中，具有在周细胞8的细胞层之上接种包埋于温度敏感性凝胶6的状态的血管内皮细胞7的工序。这种情况下，在温度敏感性凝胶6溶解之前，血管内皮细胞7不会与周细胞8接触，因此不会发挥周细胞8控制血管内皮细胞7的分化、增殖的功能。即，本实施例的细胞培养方法中，通过使细胞培养插件1内部的温度保持在温度敏感性凝胶6不溶解的温度，具有利用图2所示的步骤s1～步骤s9的工序对形成于细胞培养插件1底部的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的层叠状态进行长时间维持的作用。此外，在使用温度敏感性凝胶6的情况下，没有必要预先准备血管内皮细胞的细胞片，因此能够省去制作该细胞片的工序。因此，根据上述细胞培养方法，能够提高包括上述3个细胞层的bbb模型的量产性。
[0117]
需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的第4内壁1e的细胞培养插件1如后述那样作为细胞培养室使用。
[0118]
实施例2
[0119]
参照图5和图6对本发明第2实施方式涉及的细胞培养装置进行说明。图5(a)和图5(b)分别为插件保持板和细胞培养盒的外观立体图，图6(a)和图6(b)分别为插件按压件和盒用盖的外观立体图。
[0120]
需说明的是，为了避免附图的复杂化，图5(a)和图5(b)中仅对方孔和圆孔的一部分标记了符号。
[0121]
本实施例的细胞培养装置具备俯视时呈同样大小的矩形的插件保持板10(参照图5(a))和细胞培养盒11(参照图5(b))、插件按压件12(图6(a)参照)、以及盒用盖13(参照图6(b))。
[0122]
插件保持板10中，如图5(a)所示在平行的一对侧板10a、10a中分别各设有5个方孔10c，同时，在底板10b设有12个(纵3列
×
横4列)圆孔10d。此外，细胞培养盒11如图5(b)所示上部开口，同时，在底板11a中设有12个(纵3列
×
横4列)圆形的通孔11b。
[0123]
需说明的是，插件保持板10的底板10b中，纵向排列的3个圆孔10d以它们的中心轴配置在与侧板10a和底板10b垂直的同一平面上的方式形成，横向并排的4个圆孔10d以它们的中心轴配置在与侧板10a平行的同一平面上的方式形成。此外，2个圆孔10d、10d的中心线的间隔s5(参照图5(a))比细胞培养插件1中的一对法兰盘1d、1d的最外表面间的距离s3(参照图1(b))长。即，插件保持板10呈使多个细胞培养插件1以各中心轴x(参照图1(b))分别与圆孔10d的中心轴一致的方式配置在底板10b上的情况下，相邻细胞培养插件1彼此互不接触的结构。
[0124]
此外，细胞培养盒11在与插件保持板10平行且俯视时两者完全重合的状态下配置在插件保持板10上方的情况下，呈12个通孔11b的中心轴与插件保持板10的12个圆孔10d的中心轴一致的结构。
[0125]
而且，插件按压件12包括图6(a)所示那样相互平行、可同时对5个方孔10c插通地配置的5根方条12a、以及将该5根方条12a的一端连接的连接板12b。需说明的是，方条12a以比插件保持板10的一对侧板10a、10a的外表面间的距离长的方式形成。
[0126]
此外，俯视呈矩形、作为细胞培养室盖使用的盒用盖13包括图6(b)所示那样的矩形凹部13a和设于该凹部13a周围的框状突出部13b，凹部13a设置在细胞培养盒11的上部时，呈可向突出部13b的内侧配置一对侧板10a、10a的结构。
[0127]
需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的通孔11b的细胞培养盒11如后述那样作为细胞培养室使用。
[0128]
这里，参照图7至图10，对使用本实施例的细胞培养装置制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的本发明的细胞培养方法进行说明。
[0129]
图7为显示本发明第2实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图，图8(a)为显示利用插件按压件将细胞培养插件固定于插件保持板的状态的立体图，图8(b)为图8(a)中的c-c线向视截面图。图9(a)显示的是在图8(a)中的插件保持板的上方设有细胞培养盒的状态，图9(b)显示的是在图9(a)中安装有盒用盖的细胞培养盒与插件保持板一起翻转的状态。图10(a)为图9(b)中的d-d线向视截面图，图10(b)为显示安装有插件保持板和插件按压件的细胞培养插件设置在微孔板的孔中的状态的立体图。
[0130]
需说明的是，为了避免附图的复杂化，图9(b)和图10(a)中仅对方孔和圆孔的一部分标记了符号，同时，图8(a)、图9(a)和图9(b)中仅对1个细胞培养插件标记了符号。此外，图10(a)中，省略了细胞培养盒和盒用盖的图示。
[0131]
如图8(a)所示，使12个细胞培养插件1倒扣的状态下，以各中心轴x(参照图1(b))分别与圆孔10d的中心轴一致的方式设置在插件保持板10的底板10b上(图7的步骤s1)。接下来，在分别设于插件保持板10的一对侧板10a、10a中的全部方孔10c、10c中使插件按压件12的5根方条12a同时连通。
[0132]
需说明的是，插件保持板10的2个方孔10c、10c的间隔s4(参照图5(a))比细胞培养插件1中设有一对法兰盘1d、1d的位置的侧面1a的外径s2(参照图1(b))长，比一对法兰盘1d、1d的最外表面间的距离s3(参照图1(b))短。此外，方孔10c距离底板10b的高度h3(参照图5(a))比细胞培养插件1中的法兰盘1d的厚度h4(参照图1(b))稍长。而且，方孔10c以可将插件保持件12的方条12a(参照图6(a))连通的方式分别在2个侧板10a、10a中相对的位置形成。因此，图8(a)所示那样设置在插件保持板10的底板10b上的12个细胞培养插件1在插件按压件12的2根方条12a、12a之间各配置有3个，同时，一对法兰盘1d、1d分别配置在2根方条12a、12a与插件保持板10的底板10b之间(参照图8(b))。结果，形成了细胞培养插件1无法从插件保持板10脱离的状态。
[0133]
以这种方式，插件按压件12中，在插件保持板10的一对侧板10a、10a中相对的位置形成的一对方孔10c、10c中，使方条12a连通，从而细胞培养插件1被固定于插件保持板10(图7的步骤s2)。
[0134]
接下来，如图9(a)所示使细胞培养盒11与图8(a)状态的插件保持板10平行且以俯
视时两者完全重合的方式配置在其上方，同时使细胞培养插件1的底部从通孔11b突出，形成多孔质膜3的外表面在细胞培养盒11内部露出的状态(图7的步骤s3)。然后，在细胞培养盒11中注入悬浮状态的细胞培养液(图中未显示)，同时，接种星形胶质细胞9(图7的步骤s4和步骤s5)。而且，在使细胞培养液的温度维持在例如33℃的情况下，对星形胶质细胞9进行数天培养直至形成层状(图7的步骤s6)。
[0135]
在细胞培养盒11的上表面安装盒用盖13后，一边留意使细胞培养液和星形胶质细胞9不会漏出，一边如图9(b)所示与插件保持板10和插件按压件12一起将细胞培养盒11的上下翻转(图7的步骤s7)。然后，使用移液器4，从插件保持板10的圆孔10d在细胞培养插件1内部接种周细胞8(图7的步骤s8)，在使细胞培养插件1内部的温度维持在例如33℃的情况下，对周细胞8进行数天培养直至形成层状(图7的步骤s9)。然后，在周细胞生长为层状的阶段将细胞培养液舍弃。由此，已经在多孔质膜3的外表面形成层状的星形胶质细胞9成为来自细胞的足突贯通多孔质膜3的小孔而伸到形成于多孔质膜3的内表面侧的周细胞8附近的状态。
[0136]
这样，细胞培养插件1的底部从通孔11b突出的情况下，细胞培养盒11内部可与细胞培养插件1同样地作为细胞培养室使用，细胞培养插件1内部和细胞培养盒11内部被多孔质膜3分隔。即，以底部从通孔11b突出的方式将多个细胞培养插件1设于细胞培养盒11的情况下，成为细胞培养盒11内部与多个细胞培养插件1分别被多孔质膜3分隔的状态。因此，可以认为本实施例的细胞培养装置是下述结构：形成为筒状的细胞培养插件1的第4内壁1e(参照图1(b))和设于细胞培养盒11的底板11a的通孔11b的内壁构成被多孔质膜3上下划分的一对细胞培养室，同时，将多个该细胞培养室连接、且使被上下划分的细胞培养室分别一体化而具备该细胞培养室。
[0137]
接下来，在细胞培养插件1内部，在周细胞的细胞层之上涂布在血管内皮细胞的细胞增殖停止的温度(例如37℃)以上溶解的温度敏感性凝胶6(图7的步骤s10)，进一步在该温度敏感性凝胶6中包埋血管内皮细胞7(图7的步骤s11)。然后，在使细胞培养插件1内部的温度维持在例如33℃的情况下，对血管内皮细胞7进行数天培养(图7的步骤s12)。
[0138]
以这种方式，如图10(a)所示那样在细胞培养插件1的底部形成包括包埋于温度敏感性凝胶6的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层。然后，将被插件按压件12固定于插件保持板10的12个细胞培养插件1从细胞培养盒11的通孔11b取出，将插件保持板10和插件按压件12分别移至微孔板2(图7的步骤s13)。
[0139]
如果在全部细胞培养插件1的底部分别配置在微孔板2的孔2b内部的状态下，将插件按压件12的全部方条12a从插件保持板10的方孔10c同时拔出，则细胞培养插件1对插件保持板10的约束状态解除，全部细胞培养插件1分别对微孔板2的孔2b同时配置。因此，如果将插件保持板10和插件按压件12从细胞培养插件1移除，则细胞培养插件1向微孔板2的孔2b的设置操作结束，成为前述图4(a)所示的状态(图7的步骤s14)。进一步，如果使细胞培养插件1内部的温度为37℃，则血管内皮细胞7的细胞增殖停止，同时，温度敏感性凝胶6溶解(图7的步骤s15)，血管内皮细胞7与周细胞8接触。通过在该状态下使细胞培养插件1内部的温度维持在33℃、再次开始血管内皮细胞7的培养，包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型完成。
[0140]
这样，本实施例的细胞培养装置中，插件保持板10和插件按压件12作为保持能够
将多个细胞培养插件1向细胞培养盒11的通孔11b同时进行内插的状态的插件保持单元发挥功能，因而能够以一体化的状态将多个细胞培养插件1翻转或者转移至微孔板2的孔2b中。因此，根据本实施例的细胞培养装置，能够在短时间内高效制作多个bbb模型。
[0141]
此外，本实施例的细胞培养方法中，具备在周细胞8的细胞层之上涂布温度敏感性凝胶6的工序。这种情况下，没有必要预先准备血管内皮细胞7的细胞片，因此能够省去制作该细胞片的工序。
[0142]
需说明的是，设于细胞培养盒11的底板11a的通孔不限于通孔11b，也可以是方孔、除此以外的形状。但是，为了防止注入细胞培养盒11内部的细胞培养液5的漏出，细胞培养插件1必须是与这些通孔嵌合的结构。
[0143]
实施例3
[0144]
参照图11至图24对本发明第3实施方式涉及的细胞培养装置进行说明。图11(a)为板盖和板的侧视图，图11(b)和图11(c)分别为衬套和挤出件的侧视图，图11(d)至图11(f)分别为多孔质膜、膜保持件和插件主体的外观立体图。图12(a)和图12(c)分别为图11(a)所示的板和板盖的俯视图，图12(b)和图12(d)分别为图12(a)中的e-e线向视截面图和图12(c)中的f-f线向视截面图。
[0145]
图13(a)为图11(b)和图11(c)所示的衬套和挤出件的俯视图，图13(b)和图13(c)分别为衬套和挤出件的截面图，均相当于图13(a)中的g-g线向视截面图。图14(a)和图14(c)分别为图11(f)和图11(e)所示的插件主体和膜保持件的俯视图，图14(b)和图14(d)分别为图14(a)中的h-h线向视截面图和图14(c)中的i-i线向视截面图。
[0146]
需说明的是，图13(a)至图13(c)中，衬套和挤出件以比图12(a)至图12(d)所示的板和板盖放大的状态显示。此外，衬套和挤出件在俯视时呈同样的形状，因此在图13(a)中，将它们的符号一起显示。
[0147]
如图11(a)至图11(f)所示，本实施例的细胞培养装置具备：板14，其在平板状的基部14a的两面分别设有外径相等的第1环状突出部14b和第2环状突出部14c；板盖15，其在平板状的基部15a的一面设有保持部15b；以及衬套16和挤出件17，其在由平板材构成的基部16a和挤出板17a的一面设有圆筒体16c和圆筒状挤出部17c，该圆筒体16c和圆筒状挤出部17c形成为可内插于保持部16b、17b以及第1环状突出部14b和第2环状突出部14c的大小。
[0148]
进一步，该细胞培养装置还具备：膜保持件18，其呈短圆筒状、形成为可内插于第2环状突出部14c的大小；多孔质膜3，其以对于膜保持件18将一端闭塞的方式安装、形成为两面可固着生物材料、且为聚碳酸酯制；以及插件主体19，其呈圆筒状、一端安装有膜保持件18、另一端设有一对法兰盘19a、19a，且与膜保持件18一起构成细胞培养插件。
[0149]
需说明的是，板盖15、衬套16和挤出件17形成为能够将板14的第1环状突出部14b和第2环状突出部14c的开口部闭塞的大小。此外，多孔质膜3通过热熔合而固定于膜保持件18。
[0150]
如图12(a)和图12(b)所示，板14的基部14a中形成有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔14d，在基部14a的两面，与通孔14d内径相等的第1环状突出部14b和第2环状突出部14c分别以夹着基部14a对称且通过通孔14d连通的方式设置。
[0151]
如图12(c)和图12(d)所示，设于板盖15的一面的保持部15b由多个短圆筒体构成，该多个短圆筒体形成为可分别与板14的第1环状突出部14b和第2环状突出部14c的开口端
嵌合的大小。即，作为细胞培养室盖使用的板盖15设为使第1环状突出部14b和第2环状突出部14c的开口端与保持部15b嵌合，呈对于板14的上下可分别拆卸的结构(参照图16(b))。
[0152]
如图13(a)至图13(c)所示，设于衬套16和挤出件17的一面的保持部16b、17b由可与设于板14的多个第1环状突出部14b的开口端同时嵌合的多个短圆筒体构成。即，衬套16和挤出件17设为使第1环状突出部14b的开口端与保持部16b、17b分别嵌合，呈对于板14的上下分别可拆卸的结构(参照图17(b)和图20)。
[0153]
衬套16的基部16a和挤出件17的挤出板17a中，在设有保持部16b、17b的一侧，多个圆筒体16c和挤出部17c以圆筒轴相对于构成保持部16b、17b的上述圆筒体相互一致、同时使基部16a和挤出板17a与板14的基部14a平行的方式配置的情况下，从与基部16a和挤出板17a中的任一个以及基部14a这两者都正交的方向观察时，多个圆筒体16c和挤出部17c设于与第1环状突出部14b和第2环状突出部14c匹配的位置。即，衬套16和挤出板17a形成为，在基部16a和挤出板17a与板14的基部14a平行配置的情况下，全部的圆筒体16c和挤出部17c的圆筒轴与全部的第1环状突出部14b和第2环状突出部14c的圆筒轴分别一致。
[0154]
此外，圆筒体16c和挤出部17c的外径比第1环状突出部14b的内径小，形成为可与第1环状突出部14b、第2环状突出部14c和通孔14d嵌合。即，衬套16和挤出件17呈下述结构：在基部16a和挤出板17a与板14的基部14a平行的状态下，能够使全部的圆筒体16c和挤出部17c与全部的第1环状突出部14b、第2环状突出部14c和通孔14d分别同时嵌合，而且，能够在维持基部16a和挤出板17a与基部14a的平行状态的情况下，使圆筒体16c和挤出部17c在通孔14d内部移动。
[0155]
而且，衬套16的圆筒体16c的两倍长度与膜保持件18的长度的合计与第1环状突出部14b、第2环状突出部14c和通孔14d的合计长度相等。即，垫片16呈下述结构：如果将圆筒体16c内插于板14的通孔14d、使基部16a与第2环状突出部14c的端面抵接、同时将另一衬套16的圆筒体16c内插于板14的通孔14d、使基部16a与第1环状突出部14b的端面抵接，则如后述那样，膜保持件18被2块衬套16的圆筒体16c从上下夹持(参照图19(b))。
[0156]
进一步，挤出件17的挤出部17c与膜保持件18的合计长度比第1环状突出部14b、第2环状突出部14c和通孔14d的合计长度长。即，挤出件17呈下述结构：如果将挤出部17c内插于板14的通孔14d、使挤出板17a与第2环状突出部14c的端面抵接，则如后述那样在设置于挤出部17c的前端面17d的膜保持件18上安装的多孔质膜3与膜保持件18一起向第1环状突出部14b的外部被挤出(参照图17(b))。
[0157]
需说明的是，插件主体19的内径和外径分别与膜保持件18的内径和外径相等，但膜保持件18的外径比板14的通孔14d的内径小。此外，插件主体19的未设置法兰盘19a、19a一侧的端部如图14(a)所示设有尖锐部19b，膜保持件18的安装有多孔质膜3一侧的端部设有可与插件主体19的尖锐部19b卡合的环状凹陷(卡合部18a)。
[0158]
此外，衬套16的圆筒体16c和挤出件17的挤出部17c的内径与膜保持件18的内径相等。因此，如下面使用图17(a)描述的那样在板14的通孔14d内部以与板14的基部14a平行的方式设置多孔质膜3的状态下，将衬套16的圆筒体16c或挤出件17的挤出部17c内插于板14的通孔14d内部时，圆筒体16c或挤出部17c的前端面16d、17d(参照图13(b)和图13(c))不与多孔质膜3接触(参照图17(b)和图20)。即，衬套16的圆筒体16c和挤出件17的挤出部17c呈下述结构：通过使前端面16d、17d与膜保持件18中安装有多孔质膜3一侧的端面抵接，可推
动膜保持件18而不对多孔质膜3的外表面形成的细胞层产生影响。
[0159]
需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的第3内壁18b(参照图14(d))的膜保持件18与在基部14a设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔14d的板14一起如后述那样作为细胞培养室使用。
[0160]
这里，参照图15至图20对使用本实施例的细胞培养装置制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的本发明的细胞培养方法进行说明。
[0161]
图15为显示本发明第3实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。图16(a)为显示在下表面用板盖覆盖同时内部设有膜保持件的板的内部接种了星形胶质细胞的细胞的状态的截面图，图16(b)为表示板的上部用板盖覆盖状态的截面图。图17(a)为显示图16(b)中上下翻转后，设于下表面的板盖被移除、同时板的内部接种了周细胞的细胞的状态的截面图，图17(b)为显示图17(a)中设于下表面的板盖被移除、设有图11(c)所示挤出件的状态的截面图。
[0162]
图18(a)为显示图17(b)中多孔质膜的外表面敷设有片状血管内皮细胞的状态的截面图，图18(b)为显示图18(a)中膜保持件安装于插件主体的下端的状态的截面图，图18(c)为由膜保持件和插件主体构成的细胞培养插件的截面图。此外，图19(a)为显示在下表面被图11(b)所示的衬套覆盖、同时内部设有膜保持件的板的内部接种了星形胶质细胞的细胞的状态的截面图，图19(b)为表示板的上部和下部被衬套覆盖的状态的截面图。进一步，图20为显示图19(b)中上下翻转后，设于下表面的衬套被移除、同时板的内部接种了周细胞的细胞的状态的截面图。
[0163]
首先，在以基部14a水平、且第1环状突出部14b向上方开口的状态的方式设置的板14的下表面安装板盖15后，在通孔14d内部以多孔质膜3的外表面为下侧的方式设置膜保持件18(图15的步骤s1)。接下来，如图16(a)所示在板14的通孔14d内部注入细胞培养液(图中未显示)，同时，接种星形胶质细胞9(图15的步骤s2和步骤s3)。这种状态下，在使通孔14d内部的温度维持在例如33℃的情况下，对星形胶质细胞9进行数天培养直至形成层状(图15的步骤s4)。
[0164]
如图16(b)所示在板14的上表面安装板盖15后，一边留意使细胞培养液和星形胶质细胞9不会漏出一边将板14上下翻转(图15的步骤s5)。如图17(a)所示将安装于第2环状突出部14c一侧的板盖15移除后，在板14的通孔14d内部接种周细胞8(图15的步骤s6)。而且，在使通孔14d内部的温度维持在例如33℃的情况下，对周细胞8进行数天培养直至形成层状，在周细胞8生长为层状的阶段将细胞培养液舍弃(图15的步骤s7)。由此，已经在多孔质膜3的内表面形成层状的星形胶质细胞9成为来自细胞的足突贯通多孔质膜3的小孔而伸到形成于多孔质膜3的外表面侧的周细胞8的附近的状态。
[0165]
这样，板14的通孔14d内部作为细胞培养室使用，在其内部设有膜保持件18的情况下，呈该细胞培养室被多孔质膜3分为两部分的状态。因此，可以认为本实施例的细胞培养装置为下述结构：形成为筒状的膜保持件18的第3内壁18b(参照图14(d))和设于板14的基部14a的通孔14d的内壁构成被多孔质膜3上下划分而成的一对细胞培养室，并且，将多个该细胞培养室连接、使被上下划分的细胞培养室分别一体化而具备该细胞培养室。
[0166]
图17(a)中将板盖15从板14的第1环状突出部14b移除，如图17(b)所示从下方将挤出件17的挤出部17c插入板14的通孔14d内部，利用该挤出部17c，如图17(b)所示将膜保持
件18向第2环状突出部14c一侧挤出(图15的步骤s8)。
[0167]
在图17(b)中露出于板14的外部的周细胞8上敷设图18(a)所示那样的血管内皮细胞7的细胞片20(图15的步骤s9)。进一步利用插件主体19将血管内皮细胞7的细胞片20从上方落料，将插件主体19直接压入膜保持件18，在插件主体19的前端安装膜保持件18(参照图18(b))。由此，形成包括血管内皮细胞7的细胞片20、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层配置在插件主体19内部的状态(图15的步骤s10)。在该状态下使插件主体19内部的温度保持在例如33℃，对血管内皮细胞7进行数天培养(图15的步骤s11)。然后，在血管内皮细胞7的培养结束的阶段，如图18(c)所示将由插件主体19和膜保持件18构成的细胞培养插件21从板14移除(图5的步骤s12)。
[0168]
需说明的是，在步骤s5中将板14上下翻转时，为了防止通孔14d内部中的膜保持件18向上下方向移动，可以使用衬套16来代替板盖15。
[0169]
即，在步骤s1中，代替板盖15，如图19(a)所示将衬套16安装于板14的下表面，并且，在步骤s5中，代替板盖15，如图19(b)所示在通孔14d的上表面安装衬套16并将板14上下翻转，进一步如图20所示将安装于第2环状突出部14c侧的衬套16移除后，在步骤s6中，在板14的通孔14d内部接种周细胞8。这种情况下，将板14上下翻转时，膜保持件18被2块衬套16的挤出部17c夹持，不会在通孔14d内部向上下方向移动，因此具有膜保持件18内部的细胞培养液和星形胶质细胞9难以漏出的优点。
[0170]
这样，根据本实施例的细胞培养装置，同时对多个多孔质膜3、膜保持件18进行在多孔质膜3的两面分别培养星形胶质细胞9和周细胞8时所必需的将多孔质膜3翻转的操作、从板14的通孔14d内部将膜保持件18取出的操作和在周细胞8的上部配置血管内皮细胞7的操作，因此能够在短时间内制作多个bbb模型。
[0171]
此外，本实施例的细胞培养装置中，具有下述作用：通过使板盖15的保持部15b与板14的第1环状突出部14b或第2环状突出部14c嵌合，板盖15对板14的密合性提高，同时，通过使挤出件17的保持部17b与板14的第1环状突出部14b或第2环状突出部14c嵌合，准确进行挤出件17与板14的位置匹配。
[0172]
因此，根据本实施例的细胞培养装置，利用保持部15b提高板盖15与板14的密合性，因此能够切实防止注入通孔14d内部的细胞培养液从板14与板盖15之间漏出。此外，利用保持部17b准确进行挤出件17与板14的位置匹配，因此板14、挤出件17难以发生故障。
[0173]
本发明的细胞培养装置不限于本实施例所示的结构。例如也可以是下述结构：在板盖15的保持部15b与板14的第1环状突出部14b或第2环状突出部14c之间、衬套16的保持部16b或挤出件17的保持部17b与板14的第1环状突出部14b或第2环状突出部14c之间，设有由石蜡、聚乙烯等形成的、具有水密性的膜。这种情况下，板14与板盖15之间、板14与衬套16或挤出件17之间的水密性提高，因此具有注入通孔14d的细胞培养液5难以从板盖15至挤出件17之间漏出的优点。
[0174]
实施例4
[0175]
参照图21至图23对本发明第4实施方式涉及的细胞培养装置进行说明。图21(a)和图21(b)为板的外观立体图，图21(c)和图21(d)分别为板盖(衬套盖)和衬套的外观立体图。图22(a)至图22(c)分别为挤出件、膜保持件和套筒的外观立体图，图22(d)和图22(e)分别为图22(b)中的j-j线向视截面图和图22(c)中的k-k线向视截面图。图23(a)和图23(b)分别
为表示板的圆筒体中内插有衬套的圆筒体的状态的纵截面图和表示板的圆筒体中内插有挤出件的挤出部的状态的纵截面图。
[0176]
需说明的是，板盖与衬套盖仅圆形突出部的外径不同，外观的形状大致相同，因此在图21(c)中标记了两者的符号。此外，为了避免附图的复杂化，图21(a)至图21(d)以及图22(a)中仅对1个圆筒体、圆形突出部和通孔标记了符号。进一步，图23(a)显示的是板的圆筒体及其基端周围的一部分、板盖和衬套盖的圆形突出部及其基端周围的一部分以及衬套的圆筒体及其基端周围的一部分和设于衬套的圆筒体的膜保持件在包括板的圆筒体的圆筒轴的平面内被切断的状态。此外，图23(b)显示的是挤出件的挤出部及其基端周围的一部分、被挤出件挤出的膜保持件和板的圆筒体及其基端周围的一部分在包括板的圆筒体的圆筒轴的平面内被切断的状态。
[0177]
如图21(a)至图21(d)以及图22(a)至图22(e)所示，本实施例的细胞培养装置具备：板22，其在形成有多个通孔22b的平板状的基部22a的一面设有数量与通孔22b相同的作为细胞培养室的内壁使用的圆筒体22c；作为细胞培养室盖使用的板盖23和衬套盖24，其在平板状的基部23a、24a的一面分别设有数量与板22的圆筒体22c相同的圆形突出部23b、24b；衬套25，其在形成有数量与通孔22b相同的作为细胞培养室的内壁使用的通孔25b(参照图23(a))的平板状的基部25a的一面，设有数量与通孔25b相同的圆筒体25c；挤出件26，其在平板状的挤出板26a的一面设有数量与板22的圆筒体22c相同的圆筒状挤出部26b；膜保持件27，其呈近短圆筒状，且形成为可内插于板22的圆筒体22c；以及近圆筒状套筒28，其在一端安装膜保持件27。
[0178]
如图22(b)和图22(d)所示，膜保持件27在一端具有法兰盘27a，在另一端的内表面通过热熔合固定有多孔质膜3。
[0179]
板22的圆筒体22c的内径与通孔22b的直径相等，而且以各圆筒轴分别与全部通孔22b的中心轴一致的方式设置。
[0180]
板盖23的圆形突出部23b可与板22的圆筒体22c嵌合，而且，在基部22a与基部23a平行的状态下，以各圆形突出部23b的中心轴分别与全部通孔22b的中心轴一致的方式设置。即，板盖23呈下述结构：如果在保持基部23a相对于板22的基部22a的平行状态的同时使基部23a靠近基部22a，则全部圆形突出部23b与全部圆筒体22c分别同时嵌合(参照图23(a))。
[0181]
另一方面，衬套盖24的圆形突出部24b可与衬套25的圆筒体25c嵌合，而且，在基部25a与基部24a平行的状态下，以各圆形突出部24b的中心轴分别与全部圆筒体25c的圆筒轴一致的方式设置。即，衬套盖24呈下述结构：如果在保持基部24a相对于衬套25的基部25a的平行状态的同时使基部24a靠近基部25a，则全部圆形突出部24b与全部圆筒体25c分别同时嵌合(参照图23(a))。
[0182]
衬套25的圆筒体25c的外径比板22的圆筒体22c的内径小，可与圆筒体22c嵌合，而且，在基部22a与基部25a平行的状态下，以各圆筒轴分别与全部通孔22b的中心轴一致的方式设置。即，衬套25呈下述结构：如果在保持基部25a相对于板22的基部22a的平行状态的同时使基部25a靠近基部22a，则全部圆筒体25c与全部圆筒体22c分别同时嵌合(参照图23(a))。
[0183]
挤出件26的挤出部26b的外径比板22的圆筒体22c的内径小，可与圆筒体22c嵌合，
而且，在基部22a与挤出板26a平行的状态下，以各圆筒轴分别与全部通孔22b的中心轴一致的方式设置。即，挤出件26呈下述结构：如果在保持挤出板26a相对于板22的基部22a的平行状态的同时使挤出板26a靠近基部22a，则全部挤出部26b与全部圆筒体22c分别同时嵌合(参照图23(b))。此外，挤出件26的挤出部26b与膜保持件27的合计长度比基部22a与圆筒体22c的合计长度长。即，挤出件26呈下述结构：如果将挤出部26b内插于板22的通孔22b、使挤出板26a与基部22a抵接，则在设于挤出部26b的前端面26c的膜保持件27上安装的多孔质膜3与膜保持件27一起被向圆筒体22c的外部挤出(参照图23(b))。
[0184]
需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的第2内壁27b(参照图22(d))的膜保持件27与基部22a设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔22b和圆筒体22c的板22以及基部25a设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔25b和圆筒体25c的衬套25一起如后述那样作为细胞培养室使用。
[0185]
这里，参照图24至图30对使用本实施例的细胞培养装置制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的本发明的细胞培养方法进行说明。
[0186]
图24为显示本发明第4实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。图25(a)显示的是在图21(d)所示的衬套的圆筒体的上端设有膜保持件的状态，图25(b)显示的是图25(a)的衬套中安装有衬套盖和板并上下翻转的状态。而且，图25(c)为图25(b)中的衬套和板的圆筒体以及膜保持件的纵截面图。此外，图26(a)显示的是图25(b)的板中安装有板盖并上下翻转的状态，图26(b)显示的是图26(a)中衬套盖被移除的状态。
[0187]
图27(a)为图26(b)中的衬套和板的圆筒体以及膜保持件的纵截面图，图27(b)显示的是在图26(b)的衬套上再次安装衬套盖的状态。而且，图27(c)显示的是图27(b)中板盖和衬套盖被移除、挤出件安装于板上的状态。
[0188]
图28(a)为图27(c)中的板的圆筒体、挤出件的挤出部和膜保持件的纵截面图，图28(b)显示的是在图27(c)中向板的圆筒体的上方挤出的膜保持件的上表面敷设有血管内皮细胞的细胞片的状态，图28(c)为图28(b)中的板的圆筒体、挤出件的挤出部和膜保持件的纵截面图。此外，图29(a)显示的是图28(b)所示的血管内皮细胞的细胞片用套筒落料的情形，图29(b)显示的是图29(a)中在将血管内皮细胞的细胞片落料后的套筒上安装有膜保持件的状态。进一步，图30(a)为图29(b)中由套筒和膜保持件构成的细胞培养插件的纵截面图，图30(b)显示的是图30(a)所示的细胞培养插件设于细胞培养板的孔中的情形。
[0189]
需说明的是，为了避免附图的复杂化，图25(a)中显示的是仅一部分圆筒体设有膜保持件27的状态。此外，图25(a)、图25(b)、图26(a)、图26(b)、图27(b)、图27(c)、图28(b)、图29(a)和图29(b)中显示的是仅对1个圆筒体、膜保持件和通孔标记了符号，并且，图30(b)中，仅对1个孔标记了符号，同时示出了仅对设于细胞培养板的12个孔中的1个孔设置细胞培养插件的情形。
[0190]
进一步，图25(c)显示的是衬套的圆筒体及其基端周围的一部分、衬套盖的圆形突出部及其基端周围的一部分、板的圆筒体及其基端周围的一部分和设置于衬套的圆筒体的膜保持件在包括板的圆筒体的圆筒轴的平面内被切断的状态。此外，图27(a)显示的是衬套的圆筒体及其基端周围的一部分、板盖的圆形突出部及其基端周围的一部分、板的圆筒体及其基端周围的一部分和设于衬套的圆筒体的膜保持件在包括板的圆筒体的圆筒轴的平面内被切断的状态。而且，图28(a)和图28(c)中显示的是挤出件的挤出部及其基端周围的
一部分、被挤出件挤出的膜保持件和板的圆筒体及其基端周围的一部分在包括板的圆筒体的圆筒轴的平面内被切断的状态。进一步，图30(a)显示的是细胞培养插件在包括套筒的圆筒轴的平面内被切断的状态。
[0191]
首先，如图25(a)所示，在衬套25的圆筒体25c的上端设置膜保持件27(图24的步骤s1)。接下来，将使圆筒体22c朝向下方的状态的板22以基部25a与基部22a平行的方式配置，将全部圆筒体22c外插于全部圆筒体25c，同时，从基部25a的下表面侧使圆形突出部24b嵌合于圆筒体25c，将衬套盖24安装于衬套25(图24的步骤s2)。然后，如图25(b)所示，使用移液器4，通过板22的通孔22b，在衬套25的圆筒体25c内部注入悬浮状态的细胞培养液(图中未显示)，同时，接种星形胶质细胞9(参照图25(c))的细胞(图24的步骤s3和步骤s4)。然后，在使细胞培养液的温度维持在例如33℃的情况下，对星形胶质细胞9进行数天培养直至形成层状(图24的步骤s5)。
[0192]
从图25(b)所示的状态将细胞培养液舍弃，使圆形突出部23b从基部22a的下表面侧嵌合于通孔22b而将板盖23安装于板22后，如图26(a)所示，将板22与板盖23、衬套盖24和衬套25一起上下翻转(图24的步骤s6)。进一步，如图26(b)所示，将衬套盖24移除，使用移液器4在衬套25的圆筒体25c内部注入前述细胞培养液，同时，接种周细胞8(参照图27(a))的细胞(图24的步骤s7和步骤s8)。然后，如图27(b)所示，再次在衬套25上安装衬套盖24，在使衬套25的圆筒体25c内部的温度维持在例如33℃的情况下，对周细胞8进行数天培养直至形成层状，在周细胞8成长为层状的阶段将细胞培养液舍弃(图24的步骤s9和步骤s10)。由此，已经在多孔质膜3的内表面形成为层状的星形胶质细胞9成为来自细胞的足突贯通多孔质膜3的小孔而伸到如图28(a)所示形成于多孔质膜3的外表面侧的周细胞8的附近的状态。
[0193]
这样，板22的通孔22b和衬套25的圆筒体25c内部作为细胞培养室使用、其内部设有膜保持件27的情况下，呈该细胞培养室被多孔质膜3分为两部分的状态。因此，可以认为本实施例的细胞培养装置具备下述结构：形成为筒状的膜保持件27的第2内壁27b(参照图22(d))以及设于衬套25的基部25a的通孔25b和圆筒体25c的内壁或膜保持件27的第2内壁27b以及设于板22的基部22a的通孔22b和圆筒体22c的内壁构成被多孔质膜3上下划分而成的一对细胞培养室，并且，使多个该细胞培养室连接、使被上下划分的细胞培养室分别一体化而具备该细胞培养室。
[0194]
如果如图27(c)所示将板盖23和衬套盖24以及衬套25移除、同时将挤出件26的挤出部26b内插于板22的通孔22b后，以挤出板26a与基部22a抵接的方式使挤出件26靠近板22，则安装于挤出部26b的前端面26c(参照图28(a))的膜保持件27向圆筒体22c的外部被挤出(图24的步骤s11)。
[0195]
对于如图27(c)所示向板22的圆筒体22c的外部被挤出的膜保持件27的上表面，如图28(b)和图28(c)所示敷设血管内皮细胞7的细胞片20(图24的步骤s12)。然后，如图29(a)所示用套筒28将图28(b)所示的血管内皮细胞7的细胞片20从上方落料，同时，将落料后残留的细胞片20除去(图24的步骤s13)。然后，将套筒28直接压入膜保持件27，如图29(b)所示在套筒28的前端安装膜保持件27(图24的步骤s14)。结果，膜保持件27与套筒28一体化，形成如图30(a)所示包括血管内皮细胞7的细胞片20、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层在细胞培养插件21的底部形成的状态。然后，将细胞培养插件21从挤出件26的挤出部26b移除，如图30(b)所示设于微孔板2的孔2b中(图24的步骤s15)。然后，在该状态下使细胞培养
插件21内部的温度保持在例如33℃，对血管内皮细胞7进行数天培养(图24的步骤s16)。
[0196]
这样，根据本实施例的细胞培养装置，将多孔质膜3翻转的操作、从板22的通孔22b内部将膜保持件27取出的操作和在周细胞8的上部配置血管内皮细胞7的操作对多个多孔质膜3、膜保持件27同时进行，因此能够在短时间内制作多个bbb模型。
[0197]
参照图31和图32对本实施例的细胞培养方法的变形例进行说明。图31为显示图24所示工序图的变形例的图。此外，图32(a)为显示在图27(c)中膜保持件上安装有套筒的状态的图，图32(b)为由图32(a)中的板的圆筒体、挤出件的挤出部和套筒和膜保持件构成的细胞培养插件的纵截面图。需说明的是，为了避免附图的复杂化，图32(a)中分别仅对1个圆筒体和套筒标记了符号。此外，图32(b)显示的是挤出件的挤出部及其基端周围的一部分、用挤出件挤出的膜保持件和板的圆筒体及其基端周围的一部分在包括板的圆筒体的圆筒轴的平面内被切断的状态。进一步，图31所示的工序中，步骤s1～步骤s11与图24中的步骤s1～步骤11为相同的工序，因此省略了对这些工序的说明。
[0198]
具体地，在步骤s1～步骤s11的工序后，在图27(c)所示状态的膜保持件27中压入套筒28，如图32(a)所示在套筒28的前端安装膜保持件27(图31的步骤s12)。接下来，在细胞培养插件21内部，在周细胞8的细胞层之上涂布在血管内皮细胞的细胞增殖停止的温度(例如37℃)以上溶解的温度敏感性凝胶6(图31的步骤s13)，进一步在该温度敏感性凝胶6中包埋血管内皮细胞7(图32的步骤s14)。然后，在使细胞培养插件21内部的温度维持在例如33℃的情况下，对血管内皮细胞7进行数天培养(图31的步骤s15)。
[0199]
由此，如图32(b)所示包括包埋于温度敏感性凝胶6的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层在细胞培养插件21的底部形成。然后，将细胞培养插件21从挤出件26的挤出部26b移除，如图30(b)所示设于微孔板2的孔2b中(图31的步骤s16)。进一步，如果使细胞培养插件21内部的温度为37℃，则血管内皮细胞7的细胞增殖停止，同时温度敏感性凝胶6溶解(图31的步骤s17)，血管内皮细胞7与周细胞8接触。在该状态下使细胞培养插件21内部的温度维持在33℃，再次开始血管内皮细胞7的培养，从而包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型完成。
[0200]
周细胞8具有控制血管内皮细胞7的分化、增殖的功能，但在血管内皮细胞7包埋于温度敏感性凝胶6的状态下，血管内皮细胞7不会与周细胞8接触，因此不会发挥该功能。即，图31所示的细胞培养方法中，通过使细胞培养插件21内部的温度保持为温度敏感性凝胶6不会溶解的温度，具有长时间维持通过图31所示的步骤s1～步骤s15的工序在细胞培养插件21的底部形成的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的层叠状态的作用。此外，使用温度敏感性凝胶6的情况下，没有必要预先准备血管内皮细胞的细胞片，因此能够省去制作该细胞片的工序。因此，根据上述细胞培养方法，能够提高包括上述3个细胞层的bbb模型的量产性。
[0201]
实施例5
[0202]
参照图33对本发明第5实施方式涉及的细胞培养装置进行说明。图33(a)至图33(c)分别为细胞培养板、第1板盖(第2板盖)和细胞培养插件的外观立体图。需说明的是，为了避免附图的复杂化，图33(a)中仅对1个孔标记了符号。此外，第1板盖和第2板盖在俯视时呈相同的形状，因此在图33(b)中将它们的符号一起显示。
[0203]
如图33(a)至图33(c)所示，本实施例的细胞培养装置具备：细胞培养板29，其具有
作为细胞培养室的内壁使用的圆形的通孔29e；第1板盖30和第2板盖31，其分别设于该细胞培养板29上下，作为细胞培养室盖使用；以及细胞培养插件32。
[0204]
细胞培养板29如图33(a)所示呈近长方体状，上表面29a设有作为孔发挥功能的12个(纵3列
×
横4列)通孔29e，同时，上表面29a和下表面29b(参照图35(b))设有第1矩形突出部29c和第2矩形突出部29d(参照图35(b))。
[0205]
第1板盖30和第2板盖31为下述结构：如图33(b)所示由矩形的凹部30a、31a和设于该凹部30a、31a周围的框状突出部30b、31b构成，凹部30a、31a设于细胞培养板29的上表面29a时，可向突出部30b、31b的内侧配置第1矩形突出部29c和第2矩形突出部29d。
[0206]
细胞培养插件32如图33(c)所示由一端设有法兰盘32a的圆筒体构成，该圆筒体的另一端的内表面通过热熔合而固定有多孔质膜3。需说明的是，细胞培养板29的通孔29e呈具有大直径部29f和小直径部29g的阶梯式结构。而且，大直径部29f的内径比法兰盘32a的外径大，且具有可在内部配置法兰盘32a的深度。此外，小直径部29g的内径比法兰盘32a的外径小，并且其深度为内部可配置细胞培养插件32的法兰盘32a以外的部分、且在法兰盘32a卡止于大直径部29f的状态下细胞培养插件32的安装有多孔质膜3一侧的端面不会与底面接触。
[0207]
需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的第1内壁32b(参照图33(c))的细胞培养插件32与设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔29e的细胞培养板29一起如后述那样作为细胞培养室使用。
[0208]
这里，参照图34至图37对使用本实施例的细胞培养装置制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的本发明的细胞培养方法进行说明。
[0209]
图34为显示本发明第5实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。图35(a)显示的是图33(c)所示的细胞培养插件设于细胞培养板的通孔的情形，图35(b)和图35(c)分别为图35(a)中的l-l线向视截面图和m-m线向视截面图。图36(a)显示的是在设于细胞培养板的通孔中的细胞培养插件中接种细胞的情形，图36(b)为图36(a)中的n-n线向视截面图，图36(c)为图36(b)中虚线所包围部分的放大图。图37(a)显示的是在从图36(a)的状态上下翻转后的细胞培养板的通孔中设置的细胞培养插件中接种细胞的情形，图37(b)为图37(a)中的p-p线向视截面图，图37(c)为图37(b)中虚线所包围部分的放大图。
[0210]
首先，如图35(a)和图35(c)所示，在细胞培养板29的大直径部29f配置法兰盘32a，在通孔29e中设置细胞培养插件32(图34的步骤s1)。然后，在细胞培养板29的上表面29a设置第1板盖30后，如图36(b)所示将与第1板盖30一体化的细胞培养板29上下翻转(图34的步骤s2和步骤s3)。接下来，如图36(a)所示，使用移液器4在细胞培养板29的通孔29e内部注入细胞培养液(图中未显示)，同时，接种星形胶质细胞9(图34的步骤s4和步骤s5)。进一步，在该状态下使通孔29e内部的温度维持在例如33℃的情况下，对图36(c)所示星形胶质细胞9进行数天培养直至成为层状(图34的步骤s6)。然后，在细胞培养板29的下表面29b设置第2板盖31，将与第1板盖30和第2板盖31一体化的细胞培养板29上下翻转(图34的步骤s7和步骤s8)。
[0211]
进一步，如图37(b)所示从细胞培养板29的上表面29a将第1板盖30移除后，如图37(a)所示，使用移液器4在设于细胞培养板29的通孔29e中的细胞培养插件32内部注入细胞培养液(图中未显示)，同时，接种周细胞8(图34的步骤s9至步骤s11)。然后，在使细胞培养
插件32内部的温度维持在例如33℃的情况下，对周细胞8进行数天培养直至成为层状，在周细胞8生长为层状的阶段将细胞培养液舍弃(图34的步骤s12)。由此，已经在多孔质膜3的外表面形成为层状的星形胶质细胞9成为来自细胞的足突贯通多孔质膜3的小孔而伸到形成于多孔质膜3的内表面侧的周细胞8的附近的状态。
[0212]
这样，当细胞培养板29的通孔29e内部被作为细胞培养室使用，且其内部设有细胞培养插件32的情况下，呈该细胞培养室被多孔质膜3分为两部分的状态。因此，可以认为本实施例的细胞培养装置具备下述结构：形成为筒状的细胞培养插件32的第1内壁32b(参照图33(c))和设于细胞培养板29的通孔29e的内壁构成被多孔质膜3上下划分而成的一对细胞培养室，并且，将多个该细胞培养室连接、使被上下划分的细胞培养室分别一体化而具备该细胞培养室。
[0213]
接下来，在周细胞8的细胞层之上涂布在血管内皮细胞的细胞增殖停止的温度(例如37℃)以上溶解的温度敏感性凝胶6(图34的步骤s13)，进一步在该温度敏感性凝胶6中包埋血管内皮细胞7(图34的步骤s14)。然后，在使细胞培养插件32内部的温度维持在例如33℃的情况下，对血管内皮细胞7进行数天培养(图34的步骤s15)。
[0214]
由此，如图37(c)所示，在细胞培养插件32的底部形成包括包埋于温度敏感性凝胶6的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层。然后，将细胞培养插件32从细胞培养板29的通孔29e取出，设置在微孔板2(参照图1(c))的孔2b中。进一步，如果使细胞培养插件32内部的温度为37℃，则血管内皮细胞7的细胞增殖停止，同时，温度敏感性凝胶6溶解(图34的步骤s16)，血管内皮细胞7与周细胞8接触。因此，使细胞培养插件21内部的温度维持在33℃，再次开始血管内皮细胞7的培养。由此，包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型完成。
[0215]
这样，本实施例的细胞培养装置中，如果在使底部朝下的状态下在细胞培养插件32设于通孔29e的细胞培养板29的上表面29a设置第1板盖30后，将细胞培养板29与该第1板盖30一起翻转，在通孔29e内部接种细胞培养液5以及星形胶质细胞9，则利用通孔29e的内壁，防止细胞培养液5和星形胶质细胞9的漏出，因此具有容易利用多孔质膜3的外表面培养星形胶质细胞9的作用。此外，如果在细胞培养板29的下表面29b设置第2板盖31，将细胞培养板29与第1板盖30和第2板盖31一起翻转，则利用通孔29e，细胞培养插件32以底部朝下的状态被保持。因此，在细胞培养插件32内部接种细胞培养液5以及周细胞8和血管内皮细胞7的操作、在细胞培养插件32内部培养血管内皮细胞7和周细胞8的操作变得容易。进一步，设有第2板盖31的细胞培养板29作为微孔板2发挥功能。因此，根据本实施例的细胞培养装置，能够高效制作多个bbb模型。
[0216]
此外，本实施例的细胞方法中，具备在周细胞8的细胞层之上涂布温度敏感性凝胶6的工序。这种情况下，没有必要预先准备血管内皮细胞7的细胞片20，因此能够省去制作该细胞片的工序。
[0217]
实施例6
[0218]
参照图38和图39对本发明第6实施方式涉及的细胞培养装置进行说明。图38(a)和图38(c)为细胞培养板的外观立体图，图38(b)为图38(a)中的q-q线向视截面图。图39(a)和图39(c)分别为第1底面盖和第2底面盖的外观立体图，图39(b)为图39(a)中的r-r线向视截面图。
[0219]
如图38(a)至图38(c)以及图39(a)至图39(c)所示，本实施例的细胞培养装置具备：细胞培养板33，其设有作为细胞培养室的内壁使用的圆形的通孔33d；第1底面盖35，其设于该细胞培养板33的底面33b；以及第2底面盖36，其设于第1底面盖35的底板35a，且作为细胞培养室盖使用。
[0220]
细胞培养板33如图38(a)至图38(c)所示那样呈近长方体状，上表面33a设有作为孔发挥功能的12个(纵3列
×
横4列)上述通孔33d，同时，设于底面33b的矩形突出部33c上粘贴或热熔合有由多孔质膜3构成的片34。
[0221]
第1底面盖35和第2底面盖36如图39(a)至图39(c)所示设有矩形底板35a、36a以及包围该底板35a、36a的框状突出部。而且，第1底面盖35设置于细胞培养板33的底面33b时，呈可向突出部内侧配置矩形突出部33c的结构，第2底面盖36设置于第1底面盖35时，呈可将矩形突出部35b向突出部内侧配置的结构。此外，在第1底面盖35的底板35a中，当第1底面盖35设于细胞培养板33的底面33b时在与12个通孔33d匹配的位置设有内径与通孔33d相等、作为细胞培养室的内壁使用的2个(纵3列
×
横4列)圆形的通孔35c。
[0222]
需说明的是，具备作为细胞培养室的内壁使用的通孔33d的细胞培养板33与设有作为细胞培养室的内壁使用的多个通孔35c的第1底面盖35一起如后述那样作为细胞培养室使用。
[0223]
这里，参照图40至图42对使用本实施例的细胞培养装置制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的本发明的细胞培养方法进行说明。
[0224]
图40为显示本发明第6实施方式涉及的细胞培养方法的步骤的工序图。图41(a)显示的是在上下翻转后的细胞培养板上安装有第1底面盖的状态，图41(b)为图41(a)中的s-s线向视截面图，图41(c)为图41(b)中虚线所包围部分的放大图。此外，图42(a)显示的是图41(a)中将第2底面盖安装于第1底面盖、同时将细胞培养板上下翻转的状态，图42(b)为图42(a)中的t-t线向视截面图，图42(c)为图42(b)中虚线所包围部分的放大图。
[0225]
首先，如图41(a)和图41(b)所示，在上下翻转的细胞培养板33的底面33b设置第1底面盖35(图40的步骤s1)。接下来，如图41(a)所示，使用移液器4在第1底面盖35的通孔35c内部注入细胞培养液(图中未显示)，同时，接种星形胶质细胞9(图40的步骤s2和步骤s3)。进一步，在该状态下使通孔35c内部的温度维持在例如33℃的情况下，对图41(c)所示星形胶质细胞9进行数天培养直至成为层状(图40的步骤s4)。
[0226]
然后，在第1底面盖35上设置第2底面盖36后，将与第1底面盖35和第2底面盖36一体化的细胞培养板33上下翻转(图40的步骤s5和步骤s6)。进一步如图42(a)所示，使用移液器4在细胞培养板33的通孔33d内部注入细胞培养液(图中未显示)，同时，接种周细胞8(图40的步骤s7和步骤s8)。
[0227]
然后，在使细胞培养板33的通孔33d内部的温度维持在例如33℃的情况下，对周细胞8进行数天培养直至成为层状，在周细胞8生长为层状的阶段将细胞培养液舍弃(图40的步骤s9)。由此，已经在多孔质膜3的外表面形成为层状的星形胶质细胞9成为来自细胞的足突贯通多孔质膜3的小孔而伸到形成于多孔质膜3的内表面侧的周细胞8的附近的状态。
[0228]
这样，当细胞培养板33的通孔33d和第1底面盖35的通孔35c内部作为细胞培养室使用、在细胞培养板33上设有第1底面盖35的情况下，形成犹如1个细胞培养室被多孔质膜3分为两部分的状态。因此，可以认为本实施例的细胞培养装置为下述结构：设于细胞培养板
33的通孔33d和设于第1底面盖35的通孔35c的内壁构成由多孔质膜3上下划分而成的一对细胞培养室，并且，将多个该细胞培养室连接、使被上下划分的细胞培养室分别一体化而具备该细胞培养室。
[0229]
接下来，在周细胞8的细胞层之上涂布在血管内皮细胞的细胞增殖停止的温度(例如37℃)以上溶解的温度敏感性凝胶6(图40的步骤s10)，进一步在该温度敏感性凝胶6中包埋血管内皮细胞7(图40的步骤s11)。然后，在使细胞培养板33的通孔33d内部的温度维持在例如33℃的情况下，对血管内皮细胞7进行数天培养(图40的步骤s12)。
[0230]
结果，如图42(c)所示在细胞培养插件32的底部形成了包括包埋于温度敏感性凝胶6的血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3种细胞层。然后，如果使细胞培养板33的通孔33d内部的温度为37℃，则血管内皮细胞7的细胞增殖停止，同时，温度敏感性凝胶6溶解(图40的步骤s12)，血管内皮细胞7与周细胞8接触。如果在这种状态下使细胞培养板33的通孔33d内部的温度维持在33℃、再次开始血管内皮细胞7的培养，则包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型完成。
[0231]
这样，本实施例的细胞培养装置中，如果在将细胞培养板33翻转的状态下在底面33b设置第1底面盖35后，在通孔35c内部接种细胞培养液5以及星形胶质细胞9，则利用通孔35c的内壁，防止细胞培养液5和星形胶质细胞9的漏出，因此具有容易利用多孔质膜3的外表面培养星形胶质细胞9的作用。此外，如果在第1底面盖35上设置第2底面盖36，将细胞培养板33与第1底面盖35和第2底面盖36一起翻转后，在细胞培养板33的通孔33d内部接种细胞培养液5以及周细胞8和血管内皮细胞7，则利用通孔33d的内壁，防止细胞培养液5、周细胞8和血管内皮细胞7的漏出，因此具有容易利用多孔质膜3的内表面培养周细胞8和血管内皮细胞7的作用。进一步，设有第1底面盖35和第2底面盖36的细胞培养板33具有作为微孔板2发挥功能的作用。
[0232]
因此，根据本实施例的细胞培养装置，能够在不必需细胞培养插件的基础上，直接利用细胞培养板33作为微孔板2，因而与使用细胞培养插件、微孔板2时相比，能够提高包括血管内皮细胞7、周细胞8和星形胶质细胞9的3层结构的bbb模型的量产性。
[0233]
此外，本实施例的细胞方法中，具备在周细胞8的细胞层之上涂布温度敏感性凝胶6的工序。这种情况下，没有必要预先准备血管内皮细胞7的细胞片20，因此能够省去制作该细胞片的工序。因此，上述bbb模型的量产性进一步提高。
[0234]
产业可利用性
[0235]
本发明涉及的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置能够应用于要实现包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的量产化的情况。
[0236]
符号说明
[0237]
1细胞培养插件；1a侧面；1b大直径开口部；1c小直径开口部；1d法兰盘；1e第4内壁；2微孔板；2a上表面；2b孔；2c底面；3多孔质膜；4移液器；5细胞培养液；6温度敏感性凝胶；7血管内皮细胞；8周细胞；9星形胶质细胞；10插件保持板；10a侧板；10b底板；10c方孔；10d圆孔；11细胞培养盒；11a底板；11b通孔；12插件按压件；12a方条；12b连接板；13盒用盖；13a凹部；13b突出部；14板；14a基部；14b第1环状突出部；14c第2环状突出部；14d通孔；15板盖；15a基部；15b保持部；16衬套；16a基部；16b保持部；16c圆筒体；16d前端面；17挤出件；17a挤出板；17b保持部；17c挤出部；17d前端面；18膜保持件；18a卡合部；18b第3内壁；19插
件主体；19a法兰盘；19b尖锐部；20细胞片；21细胞培养插件；22板；22a基部；22b通孔；22c圆筒体；23板盖；23a基部；23b圆形突出部；24衬套盖；24a基部；24b圆形突出部；25衬套；25a基部；25b通孔；25c圆筒体；26挤出件；26a挤出板；26b挤出部；26c前端面；27膜保持件；27a法兰盘；28套筒；28a法兰盘；29细胞培养板；29a上表面；29b下表面；29c第1矩形突出部；29d第2矩形突出部；29e通孔；29f大直径部；29g小直径部；30第1板盖；30a凹部；30b突出部；31第2板盖；31a凹部；31b突出部；32细胞培养插件；32a法兰盘；32b第1内壁；33细胞培养板；33a上表面；33b底面；33c矩形突出部；33d通孔；34片；35第1底面盖；35a底板；35b矩形突出部；35c通孔；36第2底面盖；36a底板。

技术特征：
1.一种细胞培养装置，其特征在于，具备细胞培养室，将形成为筒状的内壁被多孔质膜(3)上下划分而成的一对细胞培养室连接多个而使被上下划分的所述细胞培养室分别一体化，其中，所述多孔质膜(3)形成为两面可固着生物材料，并且具备细胞培养室盖，其将被划分且被分别一体化的所述细胞培养室中的至少任一方同时闭塞。2.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具有：细胞培养板(33)，其具有作为所述内壁使用的多个第1通孔(33d)，同时以覆盖该第1通孔(33d)的方式在底面(33b)设置有由所述多孔质膜(3)形成的片(34)，第1底面盖(35)，其上部开口，在底板(35a)设有与所述第1通孔(33d)一起作为所述内壁使用的多个第2通孔(35c)，并且，设于所述细胞培养板(33)的所述底面(33b)，以及第2底面盖(36)，其作为所述细胞培养室盖，设于所述第1底面盖(35)的所述底板(35a)；所述第2通孔(35c)设置在俯视设于所述细胞培养板(33)的所述底面(33b)的状态的所述第1底面盖(35)时与所述第1通孔(33d)匹配的位置。3.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具备：细胞培养插件(32)的第1内壁(32b)，其一端被所述多孔质膜(3)闭塞，且作为所述细胞培养室的所述内壁使用，细胞培养板(29)，其内插有该细胞培养插件(32)，且设有作为所述细胞培养室的所述内壁使用的多个通孔(29e)，以及平板状的第1板盖(30)和第2板盖(31)，其作为所述细胞培养室盖，分别设于所述细胞培养板(29)的两面且覆盖内插有所述细胞培养插件(32)的状态的所述通孔(29e)。4.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具备：作为所述细胞培养室使用的膜保持件(27)，其一端被所述多孔质膜(3)闭塞，且具备作为所述内壁使用的第2内壁(27b)，板(22)，其在形成有多个第1通孔(22b)的平板状的第1基部(22a)的一面垂直竖立有第1筒体(22c)，所述第1筒体(22c)与所述第1通孔(22b)连通、内部设有所述膜保持件(27)、且与所述第1通孔(22b)一起作为所述内壁使用，板盖(23)，其在平板状的第2基部(23a)的一面设有与多个所述第1筒体(22c)分别同时嵌合的多个第1突出部(23b)，作为所述细胞培养室盖而覆盖内部设有所述膜保持件(27)的状态的所述第1通孔(22b)，衬套盖(24)，其在平板状的第3基部(24a)的一面设有与多个所述第1筒体(22c)分别同时嵌合的多个第2突出部(24b)，作为所述细胞培养室盖而覆盖内部设有所述膜保持件(27)的状态的所述第1通孔(22b)，衬套(25)，其在形成有数量与所述第1通孔(22b)相同的、作为所述内壁使用的第2通孔(25b)的平板状的第4基部(25a)的一面以与所述第2通孔(25b)连通的方式垂直竖立有多个第2筒体(25c)，所述多个第2筒体(25c)与所述第1筒体(22c)一起构成所述细胞培养室、分别同时向多个所述第1筒体(22c)进行内插且与所述第2通孔(25b)一起作为所述内壁使用，以及
挤出件(26)，其在平板状的挤出板(26a)的一面垂直竖立有多个挤出部(26b)，所述多个挤出部(26b)分别同时向多个所述第1通孔(22b)进行内插。5.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具备：作为所述细胞培养室使用的膜保持件(18)，其一端被所述多孔质膜(3)闭塞，且具备作为所述内壁使用的第3内壁(18b)，作为所述细胞培养室的板(14)，其在平板状的基部(14a)设有作为所述细胞培养室的所述内壁使用的多个通孔(14d)，所述多个通孔(14d)在内部设有所述膜保持件(18)，平板状的2块板盖(15)，其以作为所述细胞培养室盖而覆盖内部设有所述膜保持件(18)的状态的所述通孔(14d)的方式设于所述板(14)，以及挤出件(17)，其在平板状的挤出板(17a)的一面垂直竖立有多个挤出部(17c)，所述多个挤出部(17c)分别同时向多个所述通孔(14d)进行内插。6.根据权利要求5所述的细胞培养装置，其特征在于，所述板(14)中，在所述基部(14a)的两面以俯视所述基部(14a)时包围所述通孔(14d)的方式分别设有与所述通孔(14d)连通的第1突出部(14b)和第2突出部(14c)，所述板盖(15)中，一面设有与多个所述第1突出部(14b)和所述第2突出部(14c)分别同时嵌合的多个第1筒体(15b)，所述挤出件(17)中，比所述挤出部(17c)短、向多个所述第1突出部(14b)和所述第2突出部(14c)分别同时嵌合的多个第2筒体(17b)以分别包围所述挤出部(17c)的方式设于所述挤出板(17a)的一面。7.根据权利要求1所述的细胞培养装置，其特征在于，具备：作为所述细胞培养室使用的细胞培养插件(1)，其一端被所述多孔质膜(3)闭塞，且具备作为所述内壁使用的第4内壁(1e)，作为所述细胞培养室使用的细胞培养盒(11)，其上部开口，在底板(11a)设有多个通孔(11b)，所述多个通孔(11b)作为所述内壁使用、并且内插有所述细胞培养插件(1)，插件保持单元(10、12)，以使多个所述细胞培养插件(1)能够分别同时向该细胞培养盒(11)的多个所述通孔(11b)内插的状态进行保持，以及盒用盖(13)，其作为所述细胞培养室盖而覆设在所述细胞培养盒(11)的所述上部。8.一种细胞培养方法，其特征在于，为使用多对细胞培养室制作包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的bbb模型的细胞培养方法，所述多对细胞培养室为形成为筒状的内壁被形成为两面可固着生物材料的多孔质膜(3)上下划分而成的多对细胞培养室，所述细胞培养方法包括：在所述多孔质膜(3)中朝向上方的第1面接种所述星形胶质细胞的工序，对所述星形胶质细胞进行培养的工序，将多对所述细胞培养室的上端开口部同时闭塞的工序，将多对所述细胞培养室同时翻转、在所述多孔质膜(3)的第2面接种所述周细胞的工序，对所述周细胞进行培养的工序，在所述多孔质膜(3)的所述第2面上敷设片状的所述血管内皮细胞的工序，以及对所述血管内皮细胞进行培养的工序。
9.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其特征在于，所述血管内皮细胞具有温度敏感性，在希望的温度下细胞停止增殖，并且所述细胞培养方法具备将所述血管内皮细胞以包埋于温度敏感性凝胶的状态下在所述多孔质膜(3)的所述第2面上接种的工序，以代替在所述多孔质膜(3)的所述第2面上敷设片状的所述血管内皮细胞的工序，并且，在对所述血管内皮细胞进行培养的工序后，具备使所述温度敏感性凝胶溶解的工序。

技术总结
提供能够对包括血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞的三层结构的BBB模型进行量产的细胞培养方法和使用其的细胞培养装置，以及可提高其量产性的细胞培养方法。本发明的细胞培养方法具备：在细胞培养插件的多孔质膜的外表面注入悬浮状态的细胞培养液的工序；在该细胞培养液中接种星形胶质细胞的细胞，对星形胶质细胞进行培养的工序；在上下翻转的细胞培养插件内部接种周细胞的细胞，对周细胞进行培养的工序；在将具有温度敏感性的血管内皮细胞包埋于温度敏感性凝胶的状态下进行接种，对血管内皮细胞进行培养的工序；以及使温度敏感性凝胶溶解的工序。解的工序。解的工序。


技术研发人员：竹下幸男 藤川晋 松尾欣哉 藤泽美和子 玉田雅也 冈本雅史 盐田考矢 畑朋宏 福迫阳人
受保护的技术使用者：国立大学法人山口大学
技术研发日：2021.10.21
技术公布日：2023/8/1