一种便携式肝炎标志物检测试剂盒和肝炎标志物的检测方法

1.本发明属于生物化学检测领域，涉及一种便携式肝炎标志物检测试剂盒及其制备方法，以及基于该试剂盒检测肝炎标志物的方法。


背景技术：

2.肝脏是众多药物代谢的场所，不合理的用药和过大的压力都可能会造成肝损伤。肝炎是指肝脏发生炎症的疾病，通常由病毒、药物、酒精、自身免疫等多种因素引起。对乙酰氨基酚是一种常用的退烧药，近年来，因不规范的使用退烧药造成肝损伤的案例不断上升。转氨酶是一类重要的肝脏酶，其包括谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)，它们一般在肝脏内具有较高的浓度，当肝细胞受到损伤或发生炎症时，转氨酶会被释放到血液中，导致血清中的ast和alt浓度升高。此外，肝损伤可能引起碱性磷酸酶(alp)浓度升高，表明肝脏发生了一些疾病或损伤，如胆管阻塞、肝脓肿、原发性胆汁性胆管炎、肝炎、肝硬化等。因此，同时对上述三种肝炎标志物进行检测具有重要意义。
3.目前，检测转氨酶和碱性磷酸酶的方法主要包括比色法、荧光法、化学发光法、酶动力学法和电化学法。例如：中国专利申请cn115656290a公开了一种用于肝炎快速诊断的生物传感芯片的制备方法，该方法通过制备超高比表面积的多孔普鲁士蓝@金属氧化物核壳结构，极大提升了活性酶分子的负载量以及电化学传感性能。该检测芯片制备过程简易可控，基于该芯片的生物传感器能够在1min内实现真实血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的快速识别和同时检测，极大提升了肝炎疾病的诊断效率。
4.上述检测方法虽然具有较好的检测效率，但是仍存在不足：检测方法依靠的仪器设备相对昂贵，不适用于资源匮乏的偏远地区；检测方法仅限于实验室，使用范围有限，难以进一步扩大商业化。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种便携式肝炎标志物检测试剂盒。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.一种便携式肝炎标志物检测试剂盒，所述的检测试剂盒含有水凝胶；所述的水凝胶是以空心二氧化锰(h-mno2)分散在水中得到h-mno2分散液，h-mno2分散液与海藻酸钠溶液混合得到混合液，加入钙盐溶液得到的水凝胶；所述的空心二氧化锰(h-mno2)由锰普鲁士蓝类似物纳米粒子(mn-pba)经氢氧化钠刻蚀得到的；所述的锰普鲁士蓝类似物纳米粒子是以铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷、锰盐为原料制得的。
8.本发明的另一个目的是提供一种便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤：
9.步骤(1)、制备空心二氧化锰(简称h-mno2)：将铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮溶于水中配成a溶液，将锰盐溶于相同体积的水中配成b溶液，将b溶液缓慢加入到a溶液中，室温孵育10～24h，离心、干燥，得到锰普鲁士蓝类似物纳米粒子；将锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分
散于溶剂中，超声使纳米粒子分散均匀，加入氢氧化钠溶液，25～60℃搅拌0.1～4小时，离心、干燥，得到空心二氧化锰(h-mno2)；
10.步骤(2)、制备便携式肝炎标志物检测试剂盒：称取100～350mg海藻酸钠溶解于10ml naac-hac缓冲溶液中，得到海藻酸钠溶液；将h-mno2分散在水中得到浓度为1mg/ml的h-mno2分散液，将100～250μlh-mno2分散液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌，得到混合液；取200μl混合液，加入到小皿中，加入20μl钙盐溶液，充分混合，得到水凝胶，即为便携式肝炎标志物检测试剂盒。
11.步骤(1)中，所述的铁氰化钾和锰盐的物质的量之比为1:1～1:3，优选为1:1.5；所述的铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮的用量比为1mmol:3g；b溶液加入到a溶液之后，铁氰化钾的浓度为1～100mm。
12.所述的锰盐为mncl2、mnso4、mn(no3)2中的任意一种。
13.将20～200mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分散在10～40ml溶剂中；每20～200mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子使用40ml氢氧化钠溶液。
14.优选的，将100mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分散在20ml溶剂中；每100mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子使用40ml氢氧化钠溶液。
15.所述的溶剂为无水乙醇、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)中的一种。
16.具体的，将锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分散于溶剂中，超声3分钟使纳米粒子分散均匀。
17.所述的氢氧化钠溶液中naoh的浓度为0.01～1m，优选为0.05～1m，更优选为0.1m。
18.步骤(2)中，所述的海藻酸钠溶液的配制方法为：称取100～350mg海藻酸钠溶解于10ml naac-hac缓冲溶液中，室温搅拌12～24h，得到海藻酸钠溶液。
19.海藻酸钠与钙离子交联形成水凝胶，水凝胶一般具有多孔结构，有利于底物的扩散，本发明通过控制海藻酸钠和naac-hac缓冲溶液的用量，避免出现“高浓度海藻酸钠形成的水凝胶多孔径很小，不利于底物的扩散，实验表现为海藻酸钠浓度大时颜色变化速率慢并且变化的不均匀；低浓度时，海藻酸钠不具备成胶性质”，此外，naac-hac缓冲溶液为h-mno2提供了最佳的ph环境。
20.所述的混合液的配制方法为：将100～250μlh-mno2分散液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌0.5～4小时，得到混合液。
21.所述的naac-hac缓冲溶液的浓度为0.025～0.2m，所述的naac-hac缓冲溶液ph为4～6，优选为5.5。
22.所述的钙盐溶液中钙盐的浓度为20mg/ml。
23.所述的钙盐为cacl2、ca(no3)2中的一种。
24.所述的小皿的容量为250～300μl。具体的，所述的小皿可以采用离心管盖。
25.作为本发明所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法的进一步优选技术方案，便携式肝炎标志物检测试剂盒密封，4℃保存。
26.本发明的另一个目的是提供所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒在检测肝炎标志物的应用。
27.所述的肝炎标志物为谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)。
28.本发明的另一个目的是提供一种肝炎标志物的检测方法，包括下列步骤：
29.步骤(a)、绘制转氨酶标准曲线：将不同浓度的谷草转氨酶、苹果酸脱氢酶(mdh)、催化底物1构建孵育体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，拍照，获取照片的rgb值，由rgb值计算灰度值，以谷草转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷草转氨酶标准曲线；将不同浓度的谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶(ldh)、催化底物2构建孵育体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，拍照，获取照片的rgb值，由rgb值计算灰度值，以谷丙转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷丙转氨酶标准曲线；
30.绘制碱性磷酸酶标准曲线：将不同浓度的碱性磷酸酶与催化底物3构建孵育体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，拍照，获取照片的rgb值，由rgb值计算灰度值，以碱性磷酸酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立碱性磷酸酶标准曲线；
31.步骤(b)、样品分析：取血清样本，稀释；
32.将稀释后的血清样本与苹果酸脱氢酶(mdh)、催化底物1构建检测体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，按照步骤(a)获得灰度值，将灰度值代入谷草转氨酶标准曲线，获得血清样本中谷草转氨酶含量；
33.将稀释后的血清样本与乳酸脱氢酶(ldh)、催化底物2构建检测体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，按照步骤(a)获得灰度值，将灰度值代入谷丙转氨酶标准曲线，获得血清样本中谷丙转氨酶含量；
34.将稀释后的血清样本与催化底物3构建检测体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，按照步骤(a)获得灰度值，将灰度值代入碱性磷酸酶标准曲线，获得血清样本中碱性磷酸酶含量。
35.步骤(a)中，谷草转氨酶的催化底物1包括天冬氨酸、α-酮戊二酸和nadh。
36.孵育体系中，天冬氨酸、α-酮戊二酸、nadh的终浓度分别为600mm、15mm和1mm，mdh的终浓度为300～1000u/l，谷草转氨酶的终浓度为5～170u/l；孵育体系的ph为7.4。
37.所述的孵育的温度为37℃，时间为30分钟。
38.具体的，绘制谷草转氨酶标准曲线的方法为：
39.配制底物溶液1：将7.986g天冬氨酸和0.219gα-酮戊二酸溶解在100ml 0.2m氢氧化钠溶液中，加热搅拌促进溶解，调节ph＝7.4左右，冷却后加入0.663g nadh，得到催化底物溶液1；
40.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.1m，ph7.4)，依次加入50μl底物溶液1、50μl mdh溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中mdh的终浓度为600u/l、100μl ast溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中ast终浓度分别为5、10、30、50、70、90、110、130、150、170u/l，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，分大于5个点分散加入20μl tmb溶液(20mm，由二甲基亚砜配制)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里避免不稳定的外源光对颜色产生影响，使用智能手机拍照，捕获试剂盒的颜色强度；使用软件color picker处理照片，得到照片的rgb值，由rgb值计算灰度值(gray)；
41.以谷草转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷草转氨酶标准曲线。
42.谷丙转氨酶的催化底物2包括丙氨酸、α-酮戊二酸和nadh。
43.孵育体系中，丙氨酸、α-酮戊二酸和nadh的终浓度分别为400mm、15mm和1mm，ldh的终浓度为300～1000u/l，谷丙转氨酶的终浓度为5～180u/l；孵育体系的ph为7.4。
44.所述的孵育的温度为37℃，时间为30分钟。
45.具体的，绘制谷丙转氨酶标准曲线的方法为：
46.配制底物溶液2：将5.844g丙氨酸和0.219gα-酮戊二酸溶解在100ml 0.2m氢氧化钠溶液中，加热搅拌促进溶解，调节ph＝7.4左右，冷却后加入0.663g nadh，得到底物溶液2；
47.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.1m，ph7.4)，依次加入50μl底物溶液2、50μl ldh溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使其终浓度为800u/l、100μl不同浓度的alt溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，分大于5个点分散加入20μl tmb溶液(20mm，由二甲基亚砜配制)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，使用智能手机拍照，捕获试剂盒的颜色强度；使用软件color picker处理照片，得到照片的rgb值，由rgb值计算灰度值；
48.以谷丙转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷丙转氨酶标准曲线。
49.碱性磷酸酶的催化底物3为抗坏血酸磷酸酯(aa2p)。
50.孵育体系中，抗坏血酸磷酸酯的终浓度为200mm，碱性磷酸酶的终浓度为5～110u/l；孵育体系的ph为8。
51.所述的孵育的温度为37℃，时间为30分钟。
52.具体的，绘制碱性磷酸酶标准曲线的方法为：
53.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.01m，ph8)，依次加入100μl aa2p溶液(用水配制)使孵育溶液中aa2p为终浓度200mm、100μl不同浓度的alp溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中alp终浓度分别为5、10、30、50、70、90、110u/l，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，分大于5个点分散加入20μl tmb(20mm，由二甲基亚砜配制)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，使用智能手机拍照，捕获试剂盒的颜色强度，使用软件color picker处理照片，得到照片的rgb值，由rgb值计算灰度值；
54.以碱性磷酸酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立碱性磷酸酶标准曲线。
55.所述的灰度值的计算公式：gray＝(0.299*r)+(0.587*g)+(0.114*b)。
56.步骤(b)中，检测谷草转氨酶时，检测体系中，天冬氨酸、α-酮戊二酸、nadh的终浓度分别为600mm、15mm和1mm，mdh的终浓度为300～1000u/l；检测体系的ph为7.4。
57.检测谷丙转氨酶时，检测体系中，丙氨酸、α-酮戊二酸、nadh的终浓度分别为400mm、15mm和1mm，ldh的终浓度为300～1000u/l；检测体系的ph为7.4。
58.检测碱性磷酸酶时，检测体系中，抗坏血酸磷酸酯(aa2p)的终浓度为200mm；检测体系的ph为8。
59.使用便携式肝炎标志物检测试剂盒检测三种肝炎标志物，ast的线性范围为5～170u/l，alt的线性范围为5～180u/l，碱性磷酸酶的线性范围为5～110u/l，总体回收率在96.5％～113％之间。
60.本发明试剂盒的工作原理：h-mno2具有类氧化酶活性的性质，可以催化无色的tmb
转变为蓝色的oxtmb。alt催化α-酮戊二酸和丙氨酸之间的转移反应，生成丙酮酸和谷氨酸；在ldh的作用下，丙酮酸可以与nadh反应，产生乳酸和nad
+
。类似的，ast催化天冬氨酸和α-酮戊二酸反应生成谷氨酸、草酰乙酸；在mdh的作用下，草酰乙酸和nadh生成苹果酸和nad
+
；以上两个反应都涉及nadh的使用，不同浓度的转氨酶在单位时间内消耗nadh的量不同，剩余的nadh能够抑制类氧化酶的活性，通过tmb显色剂与类氧化酶反应，能够间接的反映转氨酶的浓度。碱性磷酸酶能够催化aa2p产生抗坏血酸(aa)，aa能够抑制类氧化酶的活性，降低类氧化酶对显色剂tmb的氧化。
61.本发明所述的试剂盒同样适用于检测其它具有还原性的小分子，如谷胱甘肽、半胱氨酸、多巴胺、没食子酸、对乙酰氨基酚等。
62.与现有技术相比，本发明的有益效果：
63.本发明以聚乙烯吡咯烷酮作为形貌诱导剂，促进铁氰化钾和锰盐反应生成立方体结构的锰普鲁士蓝类似物，再以锰普鲁士蓝类似物为模板、氢氧化钠为刻蚀剂，制备具有类氧化酶活性的空心二氧化锰，该空心二氧化锰显示出极高的类酶活性，表现出优异的光学传感能力。利用海藻酸钠具有成凝胶的性质，将具有空心结构的二氧化锰封装在海藻酸钠的水凝胶中，制备便携式的水凝胶试剂盒，该试剂盒能够在4℃冰箱长期保存。
64.本发明利用空心二氧化锰对显色剂tmb的颜色变化，构建了一种使用智能手机捕获信号用于检测肝炎标志物的方法。nadh和抗坏血酸(aa)对类氧化酶的活性都具有抑制作用，并且nadh和aa分别可以作为肝炎标志物催化的底物，利用该原理检测了典型的肝炎标志物：ast、alt、alp。
65.本发明水凝胶试剂盒降低了肝炎标志物的检测成本，不需要大型仪器，并且便携性强、适用范围广，极大提升了肝炎标志物检测的应用场景范围，具有作为新型即时检验(poct)设备的巨大潜力。
附图说明
66.图1为mn-pba和h-mno2的xps图。
67.图2为h-mno2的tem图。
68.图3为h-mno2的类酶活性。
69.图4为不同浓度naoh刻蚀产生的h-mno2的类酶活性。
70.图5为不同ph对h-mno2的类酶活性的影响。
71.图6为ast的标准曲线。
72.图7为alt的标准曲线。
73.图8为alp的标准曲线。
74.图9为试剂盒的选择性考察结果。
具体实施方式
75.实施例1
76.空心二氧化锰(h-mno2)的制备：将1.0mmol无水铁氰化钾和3.0g聚乙烯吡咯烷溶于50ml水中配成a溶液，将1.5mmol mncl2·
4h2o溶于50ml水中配成b溶液，将b溶液缓慢加入到a溶液中，室温孵育24h，离心、干燥得到锰普鲁士蓝类似物纳米粒子(mn-pba)；取100mg锰
h-mno2分散液和20μl tmb(20mm)，混合均匀，室温反应3min，混合液的颜色均快速由无色变为蓝色，颜色变深，使用紫外-可见吸收分光光度计(uv3600)测量650nm处吸光度。按照实施例2计算h-mno2在不同ph的体系中的相对活性。
93.结果见图5，显示，h-mno2在不同ph的体系都具有氧化酶活性，但是类氧化酶活性具有较大的差异。ph为4～6时，h-mno2能够发挥较好的氧化酶活性；尤其是ph为5.5时，h-mno2具有最好的类酶活性。因此，优选将h-mno2在ph为5.5的环境中使用。
94.实施例4
95.水凝胶试剂盒的制备，包括下列步骤：将150mg海藻酸钠溶解于10ml naac-hac溶液(0.1m，ph5.5)，室温搅拌12h，得到海藻酸钠溶液；取实施例1制备的h-mno2，分散在水中，配成浓度为1mg/ml的h-mno2分散液；往海藻酸钠溶液中加入150μl 1mg/ml的h-mno2分散液，搅拌4小时，得到混合液；取200μl混合液加入到1.5ml离心管盖中，将20μlcacl2浓度为20mg/ml的cacl2溶液加入到上述离心管盖中，充分混合，等待10min左右，得到半透明水凝胶，即为水凝胶试剂盒，将离心管盖朝下，水凝胶不会滴落。
96.实施例5
97.ast的标准曲线绘制，包括下列步骤：
98.底物溶液1的配制：将7.986g天冬氨酸和0.219gα-酮戊二酸溶解在100ml 0.2m氢氧化钠溶液中，加热搅拌促进溶解，调节ph＝7.4左右，冷却后加入0.663g nadh，得到底物溶液1，保存于4℃冰箱。
99.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.1m，ph7.4)，依次加入50μl底物溶液1、50μl mdh溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中mdh的终浓度为600u/l、100μlast溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中ast终浓度分别为5、10、30、50、70、90、110、130、150、170u/l，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl上述孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂盒中，然后分大于5个点分散加入20μl tmb(20mm)，每组不同浓度的ast分别制作三组平行，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，使用智能手机(iphone 11)，保持镜头与试剂盒的距离为11cm，拍照，捕获试剂盒的颜色强度。使用软件color picker(color picker在app store下载)处理照片，得到照片的rgb值，由rgb值计算灰度值(gray)：gray＝(0.299*r)+(0.587*g)+(0.114*b)。
100.以谷草转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷草转氨酶标准曲线，结果如图6所示，随着ast浓度的升高，试剂盒的灰度值下降，ast浓度与试剂盒的灰度值有较好的线性关系，线性范围为5～170u/l。
101.实施例6
102.alt的标准曲线绘制，包括下列步骤：
103.底物溶液2的配制：将5.844g丙氨酸和0.219gα-酮戊二酸溶解在100ml 0.2m氢氧化钠溶液中，加热搅拌促进溶解，调节ph＝7.4左右，冷却后加入0.663g nadh，得到底物溶液2，保存至4℃冰箱。
104.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.1m，ph7.4)，依次加入50μl底物溶液2、50μl ldh溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使其终浓度为800u/l、100μl不同浓度的alt溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；后续的检测步骤参照实施例5，仅将ast替换为alt；具体为：取45μl上述孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂
alt溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中终浓度为50u/l，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂盒中，然后分散加入20μltmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，按照实施例6方法获得灰度值。
116.alt实验组：参照alt对照组孵育溶液的制备方法，同时分别加入干扰物：终浓度为10μm的氨基酸：半胱氨酸(cys)、组氨酸(his)、丙氨酸(ala)、苯丙氨酸(phe)、赖氨酸(lys)、色氨酸(try)、精氨酸(arg)、谷氨酸(glu)；小分子化合物(终浓度为10μm)：谷胱甘肽(gsh)、抗坏血酸(aa)、h2o2；蛋白质(终浓度为20μg/ml)：葡萄糖氧化酶(gox)、牛血清白蛋白(bsa)；离子(终浓度为5mm)：ca
2+
，na
+
，k
+
，hco
3-，hpo
42-。取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂盒中，然后分大于5个点分散加入20μltmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，按照实施例6方法获得灰度值。
117.alp对照组：取300μl tris-盐酸缓冲液(0.01m,ph8)，依次加入100μl aa2p溶液(用水配制)使孵育溶液中aa2p为终浓度200mm、100μl alp溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中alp终浓度为50u/l，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的试剂盒中，然后分散加入20μl tmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，按照实施例7方法获得灰度值。
118.alp实验组：参照alp对照组孵育溶液的制备方法，同时分别加入干扰物：终浓度为10μm的氨基酸：半胱氨酸(cys)、组氨酸(his)、丙氨酸(ala)、苯丙氨酸(phe)、赖氨酸(lys)、色氨酸(try)、精氨酸(arg)、谷氨酸(glu)；小分子化合物(终浓度为10μm)：谷胱甘肽(gsh)、抗坏血酸(aa)、h2o2；蛋白质(终浓度为20μg/ml)：葡萄糖氧化酶(gox)、牛血清白蛋白(bsa)；离子(终浓度为5mm)：ca
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，na
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，k
+
，hco
3-，hpo
42-。取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂盒中，然后分大于5个点分散加入20μltmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，按照实施例6方法获得灰度值。
119.分别将实验组得到的灰度值和对照组的灰度进行对比，结果如图9所示，肝炎标志物与干扰物共存时，灰度值变化不大，表明这些干扰物对试剂盒的干扰较小，这归因于酶级联反应的专一性。
120.实施例9
121.利用实施例4制备的试剂盒对真实样本进行检测，包括下列步骤：
122.按照血清样本和磷酸盐缓冲溶液的体积比为1:19，血清样本用磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)稀释至体积分数为5％，并按照表1往稀释血清样本中分别加入ast、alt、alp标准品，进行加标试验。
123.稀释血清样本中ast含量的检测方法参照实施例5：
124.底物溶液1的配制：同实施例5；
125.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.1m，ph7.4)，依次加入50μl底物溶液1、50μl mdh溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使孵育溶液中mdh的终浓度为600u/l、100μl稀释血清样本，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂盒中，然后分大于5个点分散加入20μl tmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，使用智能手机(iphone 11)，保持镜头与试剂盒的距离为11cm，拍照，捕获试剂盒的颜色强度，按照实施例5方法获得灰度值，将灰度值代入谷草转氨酶标准曲线，获得稀
释血清样本中ast的含量。
126.稀释血清样本中alt含量的检测方法参照实施例6：
127.底物溶液2的配制：同实施例6；
128.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.1m，ph7.4)，依次加入50μl底物溶液2、50μl ldh溶液(由10mm tris-盐酸缓冲液配制)使其终浓度为800u/l、100μl稀释血清样本，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的水凝胶试剂盒中，然后分散加入20μl tmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，使用智能手机(iphone 11)，保持镜头与试剂盒的距离为11cm，拍照，捕获试剂盒的颜色强度，按照实施例6方法获得灰度值，将灰度值代入谷丙转氨酶标准曲线，获得稀释血清样本中alt的含量。
129.稀释血清样本中alp含量的检测方法参照实施例7：
130.取300μl tris-盐酸缓冲液(0.01m，ph8)，依次加入100μl aa2p溶液(用水配制)使孵育溶液中aa2p为终浓度200mm、100μl稀释血清样本，37℃孵育30分钟，得到孵育溶液；取45μl孵育溶液，加入到实施例4制备的试剂盒中，然后分散加入20μl tmb(20mm)，静止20min，将变色的试剂盒放置在一个密闭的盒子里，使用智能手机(iphone 11)，保持，镜头与试剂盒的距离为11cm，拍照，捕获试剂盒的颜色强度，按照实施例7方法获得灰度值，将灰度值代入碱性磷酸酶标准曲线，获得稀释血清样本中alp的含量。
131.表1.本发明方法和商业试剂盒对临床血清样品的检测结果
[0132][0133]
由表1可知，本发明便携式肝炎标志物检测试剂盒对临床样本中的肝炎标志物测定结果准确可靠。具体而言，ast的回收率在95.3％～105.4％，alt的回收率为97.3％～107.9％，alp的回收率为97.1％～102.4％；且本发明便携式肝炎标志物检测试剂盒与商业试剂盒之间的测量误差小于6％，因此本发明便携式肝炎标志物检测试剂盒具有巨大的商业应用潜力。

技术特征：
1.一种便携式肝炎标志物检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒含有水凝胶；所述的水凝胶是以空心二氧化锰h-mno2分散在水中得到h-mno2分散液，h-mno2分散液与海藻酸钠溶液混合得到混合液，加入钙盐溶液得到的水凝胶；所述的空心二氧化锰由锰普鲁士蓝类似物纳米粒子经氢氧化钠刻蚀得到的；所述的锰普鲁士蓝类似物纳米粒子是以铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷、锰盐为原料制得的。2.一种权利要求1所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤(1)、制备空心二氧化锰h-mno2：将铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮溶于水中配成a溶液，将锰盐溶于相同体积的水中配成b溶液，将b溶液缓慢加入到a溶液中，室温孵育10～24h，离心、干燥，得到锰普鲁士蓝类似物纳米粒子；将锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分散于溶剂中，超声使纳米粒子分散均匀，加入氢氧化钠溶液，25～60℃搅拌0.1～4小时，离心、干燥，得到空心二氧化锰h-mno2；步骤(2)、制备便携式肝炎标志物检测试剂盒：称取100～350mg海藻酸钠溶解于10ml naac-hac缓冲溶液中，得到海藻酸钠溶液；将h-mno2分散在水中得到浓度为1mg/ml的h-mno2分散液，将100～250μlh-mno2分散液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌，得到混合液；取200μl混合液，加入到小皿中，加入20μl钙盐溶液，充分混合，得到水凝胶，即为便携式肝炎标志物检测试剂盒。3.根据权利要求2所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的铁氰化钾和锰盐的物质的量之比为1:1～1:3；所述的铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷酮的用量比为1mmol:3g；b溶液加入到a溶液之后，铁氰化钾的浓度为1～100mm。4.根据权利要求2所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的锰盐为mncl2、mnso4、mn(no3)2中的任意一种。5.根据权利要求2所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，将20～200mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分散在10～40ml溶剂中；每20～200mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子使用40ml氢氧化钠溶液；优选的，将100mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子分散在20ml溶剂中；每100mg锰普鲁士蓝类似物纳米粒子使用40ml氢氧化钠溶液。6.根据权利要求2所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的溶剂为无水乙醇、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种。7.根据权利要求2所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的氢氧化钠溶液中naoh的浓度为0.01～1m，优选为0.05～1m，更优选为0.1m。8.根据权利要求2所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的naac-hac缓冲溶液ph为4～6，优选为5.5；所述的钙盐溶液中钙盐的浓度为20mg/ml；所述的钙盐为cacl2、ca(no3)2中的一种。9.一种肝炎标志物的检测方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤(a)、绘制转氨酶标准曲线：将不同浓度的谷草转氨酶、苹果酸脱氢酶、催化底物1构建孵育体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，拍照，获取照片的rgb值，由rgb值计算灰度值，以谷草转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷草转氨酶标准曲线；将不同浓度的谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、催化底物2构建孵育体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，
加入tmb显色，拍照，获取照片的rgb值，由rgb值计算灰度值，以谷丙转氨酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立谷丙转氨酶标准曲线；绘制碱性磷酸酶标准曲线：将不同浓度的碱性磷酸酶与催化底物3构建孵育体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，拍照，获取照片的rgb值，由rgb值计算灰度值，以碱性磷酸酶浓度为横坐标，灰度值为纵坐标，建立碱性磷酸酶标准曲线；步骤(b)、样品分析：取血清样本，稀释；将稀释后的血清样本与苹果酸脱氢酶、催化底物1构建检测体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，按照步骤(a)获得灰度值，将灰度值代入谷草转氨酶标准曲线，获得血清样本中谷草转氨酶含量；将稀释后的血清样本与乳酸脱氢酶、催化底物2构建检测体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，按照步骤(a)获得灰度值，将灰度值代入谷丙转氨酶标准曲线，获得血清样本中谷丙转氨酶含量；将稀释后的血清样本与催化底物3构建检测体系，孵育；取孵育后的溶液，加入到所述的便携式肝炎标志物检测试剂盒中，加入tmb显色，按照步骤(a)获得灰度值，将灰度值代入碱性磷酸酶标准曲线，获得血清样本中碱性磷酸酶含量。10.根据权利要求9所述的肝炎标志物的检测方法，其特征在于：步骤(a)中，谷草转氨酶的催化底物1包括天冬氨酸、α-酮戊二酸和nadh；孵育体系中，天冬氨酸、α-酮戊二酸、nadh的终浓度分别为600mm、15mm和1mm，mdh的终浓度为300～1000u/l，谷草转氨酶的终浓度为5～170u/l；孵育体系的ph为7.4；丙谷丙转氨酶的催化底物2包括丙氨酸、α-酮戊二酸和nadh；孵育体系中，丙氨酸、α-酮戊二酸和nadh的终浓度分别为400mm、15mm和1mm，ldh的终浓度为300～1000u/l，谷丙转氨酶的终浓度为5～180u/l；孵育体系的ph为7.4；碱性磷酸酶的催化底物3为抗坏血酸磷酸酯；孵育体系中，抗坏血酸磷酸酯的终浓度为200mm，碱性磷酸酶的终浓度为5～110u/l；孵育体系的ph为8；步骤(b)中，检测谷草转氨酶时，检测体系中，天冬氨酸、α-酮戊二酸、nadh的终浓度分别为600mm、15mm和1mm，mdh的终浓度为300～1000u/l；检测体系的ph为7.4；检测谷丙转氨酶时，检测体系中，丙氨酸、α-酮戊二酸、nadh的终浓度分别为400mm、15mm和1mm，ldh的终浓度为300～1000u/l；检测体系的ph为7.4；检测碱性磷酸酶时，检测体系中，抗坏血酸磷酸酯的终浓度为200mm；检测体系的ph为8。

技术总结
本发明属于生物化学检测领域，公开了一种便携式肝炎标志物检测试剂盒，所述的检测试剂盒含有水凝胶；所述的水凝胶是以空心二氧化锰分散在水中得到H-MnO2分散液，H-MnO2分散液与海藻酸钠溶液混合得到混合液，加入钙盐溶液得到的水凝胶；空心二氧化锰由锰普鲁士蓝类似物纳米粒子经氢氧化钠刻蚀得到的；锰普鲁士蓝类似物纳米粒子是以铁氰化钾和聚乙烯吡咯烷、锰盐为原料制得的。本发明利用空心二氧化锰对TMB的颜色变化，构建了一种使用智能手机捕获信号用于检测肝炎标志物的方法。本发明试剂盒降低了肝炎标志物的检测成本，不需要大型仪器，并且便携性强、适用范围广，具有作为新型即时检验设备的巨大潜力。时检验设备的巨大潜力。时检验设备的巨大潜力。


技术研发人员：岳婉晴 李帅文
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/9/7