基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于新型功能纳米材料检测技术领域，特别涉及一种基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默症zalzheimer’s disease，adz是一种起病隐匿的神经系统退行性疾病。我国的ad患者居世界首位，确诊人数已超过600万，且随着人口老龄化不断加重，患者人数还会迅速增长，给社会带来巨大负担。到目前为止，阿尔茨海默症还没有治愈方法，临床试验的失败率高达99.6％。研究表明，这可能是因为临床诊断方法有限，一旦确诊，患者的不可逆脑损伤已形成，药物难以发挥功效。因此，早期诊断对预防和治疗ad具有重要意义。
3.研究发现，血清中的疏水性的β-淀粉样肽zaβz在ad患者出现明显症状前10-15年就表现出异常，是ad早期诊断的有效生物标志物。目前，基于抗原抗体反应的免疫分析法与质谱、表面等离子体共振、表面增强拉曼光谱等分析仪器相结合，是量化血清aβ的最常用手段。然而，抗体稳定性差、设备昂贵、专业操作复杂耗时，限制了该方法的普及应用。
4.相较而言，小分子荧光探针价格便宜、物化性质稳定、易于储存，且信号便于检测，具有优势。但由于血清成分复杂，且aβ丰度低，多数小分子荧光探针靶向性有限，通常只能在缓冲液或稀释后的血清样品中发挥作用。例如，现有研究z a simple approach to quaztitative determizatioz of soluble amyloid-βpeptides usizg a ratiometric fluorescezce probe.biosezs.bioelectroz.,2019,142,111518z公开了将n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰zbpnsz与zz
2+
结合作为荧光探针用于检测可溶性aβ物种，然而，该方法所得探针灵敏度欠佳，检测限相对较高。


技术实现要素：

5.本发明提出一种基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针及其制备方法和应用，所得荧光探针抗干扰性强，可用于未稀释血清中可溶性aβ的定量检测，检测限低，该检测方法操作简便、低成本、稳定可靠，对于ad的早期诊断具有重要意义。
6.本发明提出一种基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
7.将zzzⅱz盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液、n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液混合，超声处理后，反应，收集沉淀，真空干燥，得荧光探针。
8.进一步地，所述n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液的浓度为3～7mm。
9.进一步地，所述n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液的浓度为5mm。
10.进一步地，所述反应的时间为12-30h；优选的，所述反应的时间为24h。
11.进一步地，zzzⅱz盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液、n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液摩尔浓度比为z1-2z：z1-2z：
12.z0.5-1.5z。
13.进一步地，超声处理的时间为15-30miz；优选的，超声处理的时间为25miz。
14.进一步地，真空干燥的时间为5-10h；优选的，真空干燥的时间为6h。
15.进一步地，所述zzzⅱz盐为六水合硝酸锌、七水合硫酸锌或氯化锌；优选的，所述zzzⅱz盐为六水合硝酸锌。
16.本发明还提出上述任一所述制备方法制备得到的基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针。
17.本发明还提出上述基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针在检测血清中可溶性aβ中的应用。
18.本发明具有以下优势：
19.本发明以荧光小分子bpns、二甲基咪唑为双有机配体，利用自组装技术，制备出锌基荧光探针zz-mofs，其中，2-甲基咪唑与锌离子可形成多种金属有机框架形态，加入n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰zbpnsz后，2-吡啶基苯并噻唑可与锌离子发生配位，以自组装方式参与zz-mofs的形成，所得zz-mofs金属有机框架结构花型完整适中，具有疏水性孔腔，能够通过疏水作用和尺寸排阻效应靶向富集血清aβ，提升探针的抗干扰性。
20.所得探针可直接用于未稀释血清中可溶性aβ的检测限低至3.22zm，相比bpns在80倍稀释血清中下降两个数量级，且aβ与zz-mofs之间的荧光响应迅速快，可在10miz内完成，该设计在低成本、快速、准确地检测血清或其他复杂体液中的微量目标物质方面具有潜在的应用价值。
附图说明
21.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
22.图1为本发明实施例1所得荧光探针的扫描电子显微镜zsemz图；
23.图2为本发明实施例1所得荧光探针的透射电子显微镜ztemz和能谱分析zedsz检测结果图；
24.图3为本发明实施例1和对比例2所得荧光探针的傅里叶红外光谱图zftirz图；
25.图4为本发明实施例1和对比例2所得荧光探针的zx射线衍射图zxrdzaz和zx射线光电子能谱zxpszbz图；
26.图5为本发明实施例4～6所得荧光探针的扫描电子显微镜zsemz图；
27.图6为本发明对比例1所得荧光探针的扫描电子显微镜zsemz图；
28.图7为本发明实施例1aβ单体与荧光强度的线性关系曲线；
29.图8为本发明实施例1所得荧光探针的水蒸气吸附等温线；
30.图9为本发明实施例1所得荧光探针的n2吸附-解吸等温线zaz和dft法计算zz-mofs中孔分布zbz。
具体实施方式
31.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
32.本发明一实施例提出一种基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
33.将zzzⅱz盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液，n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰zbpnsz的乙腈溶液混合，超声处理后，反应，收集沉淀，真空干燥，得荧光探针zzz-mofsz。
34.本发明实施例以荧光小分子bpns、二甲基咪唑为双有机配体，利用自组装技术，制备出锌基荧光探针zz-mofs，充分发挥mofs靶向富集特性，提升探针的抗干扰性。2-甲基咪唑与锌离子可形成多种金属有机框架形态，加入n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰zbpnsz后，2-吡啶基苯并噻唑可与锌离子发生配位，以自组装方式参与zz-mofs的形成，所得zz-mofs金属有机框架结构花型更完整，尺寸适中，形成疏水性孔腔，能够通过疏水作用和尺寸排阻效应靶向富集血清aβ，大大提升探针的抗干扰性，使探针免受血清中的干扰物质影响。并且，bpns作为自带荧光的有机配体参与了zz-mofs探针的形成，不仅制备简便，并且能够有效避免繁琐的化学修饰或由于包埋或共价结合而造成的荧光小分子泄漏，大大提升探针的稳定性和准确性。
35.本发明一实施例中，反应时间为12-30h；优选的，反应时间为24h。
36.本发明一实施例中，反应在室温条件下进行；更具体地，反应的温度为15～30℃。
37.本发明一实施例中，n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液的浓度为3～7mm；优选的，n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液的浓度为5mm。
38.本发明一实施例中，zzzⅱz盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液、n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液摩尔浓度比为1-2：
39.z1-2z：z0.5-1.5z。
40.本发明实施例中，选用乙腈作为溶剂，因为bpns在乙腈中具有良好的溶解度。若采用其他溶剂，如甲醇等，bpns溶解度欠佳，故不易形成反应形成完整的花状结构。
41.本发明一实施例中，超声处理的时间为15-30miz；优选的，超声处理的时间为25miz。
42.本发明一实施例中，真空干燥的时间为5-10h；优选的，真空干燥的时间为6h。
43.本发明一实施例中，所述zzzⅱz盐为六水合硝酸锌、七水合硫酸锌或氯化锌。优选的，所述zzzⅱz盐为六水合硝酸锌。所述zzzⅱz盐为二价锌盐。
44.本发明一实施例中，采用离心方式收集沉淀。
45.本发明一实施例还提出一种利用上述制备方法制备得到的基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针。相比于普通荧光探针，本发明中，2-甲基咪唑与锌离子可形成多种金属有机框架形态，加入n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰zbpnsz后，2-吡啶基苯并噻唑还可与锌离子发生配位，以自组装方式参与zz-mofs的形成，所得zz-mofs金属有机框架结构花型更完整，尺寸适中，形成疏水性孔腔，能够通过疏水作用和尺寸排阻效应靶向富集血清aβ，大大提升探针的抗干扰性，使探针免受血清中的干
扰物质影响。所得荧光探针的完整花型结构、疏水性孔腔等均为后续检测血清中可溶性aβ奠定了基础，使得荧光探针的检测限更低，检测速度更快。
46.本发明一实施例还提出上述基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针在检测血清中可溶性aβ中的应用。本发明实施例所得探针具有良好的抗干扰性能，可直接应用于未稀释血清样品的检测，对未稀释血清中可溶性aβ的检测限低至3.22zm，相比bpns在80倍稀释血清中下降两个数量级，有效提高检测的准确性。此外，aβ与zz-mofs之间的荧光响应迅速，整个检测过程可在10miz内完成。该设计在低成本、快速、准确地检测血清或其他复杂体液中的微量目标物质方面具有潜在的应用价值，为新型靶向检测aβ的高效荧光探针的设计和提供方法和原理支持。
47.具体地，所述应用包括如下步骤：
48.将荧光探针与添加了不同浓度梯度aβ的空白血清共孵育，使用酶标仪记录体系荧光强度的变化，根据荧光强度与可溶性aβ浓度之间的线性关系，建立标准曲线，根据标准曲线计算最低检测限。
49.具体地，计算检测限的公式为：lod＝3σ/s；式中：σ为空白血清的标准差，s为线性曲线的斜率。
50.本发明一实施例中，共孵育的时间为10-15miz；优选10miz。
51.本发明一实施例中，共孵育的温度为30-40℃；优选37℃。
52.本发明一实施例中，固定激发波长为332zm，收集526zm处的荧光强度值。
53.本发明一实施例中，aβ溶液的不同浓度梯度可以为10、20、30、40、50、60zm。根据具体需要，本发明实施例可通过测试待测血清样品的荧光强度，将其结果代入标准曲线，计算得待测血清样品的浓度。
54.下面将参考附图来详细说明本发明。
55.实施例1基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
56.将六水硝酸锌zzzzno3z
·
6h2oz和2-甲基咪唑z2-mimz分别溶解在乙腈中，得终浓度均为20mm的zzzno3z
·
6h2o溶液、2-mim溶液；将5mm bpns乙腈溶液与zzzno3z
·
6h2o溶液混合，加入2-mim溶液，混合后超声处理25miz，然后将混合物室温静置24h，最后将沉淀物离心，用乙腈洗涤三次，沉淀物室温条件下真空干燥6h，得到荧光探针zz-mofs。使用常规sem、ftir、eds、xrd和xps的测定方法，对荧光探针结构进行表征。结果见图1～4。
57.图1显示了荧光探针zz-mofs呈现花瓣紧凑的花状结构，形态完整，分散均一，而传统方法制备得到的zz-mofs微观形态单一。
58.图2为tem和eds能谱元素检测结果，图2显示zz-mofs在透射电子显微镜下表现为粒径约10-12μm的花状结构，这与sem结果一致。根据元素成分表明，c、n、o和s元素反应了该荧光探针表面含有的元素，zz-mofs中检测到s元素和o元素的存在，并且在花瓣上均分布，其主要来源于bpns，而c、n元素也均匀分布于花状结构上，其来源于bpns和2-甲基咪唑。overlay为所有元素叠加图谱。此结果也验证了bpns参与了zz-mofs花状结构的形成。
59.图3为ftir图，图3横坐标为透光率。同时测定对比例2所得bpns-zz
2+
配合物、bpns的ftir结果进行对比。图3显示bpns和zz-mofs在1590cm-1
处都有明显的吸收峰，此峰为噻唑环的伸缩振动峰，在1463-1473cm-1
和600-1000cm-1
范围内的吸收对应噻唑和萘环的伸缩振
动，由此可以说明，bpns和zz-mofs成功结合。再结合zz-mofs和bpns-zz
2+
可知，两者均在421cm-1
处有特异吸收峰，此峰归属于锌氮伸缩振动，表明bpns是以与zz
2+
配位的方式参与zz-mofs的形成。
60.图4为xrdzaz和xpszbz图。图4zaz的横坐标为衍射谱仪扫描的角度，纵坐标为衍射强度；图4zbz的横坐标为结合能，纵坐标为衍射强度。同时测定对比例2所得bpns-zz
2+
配合物、bpns的xrd结果进行对比，测定bpns-zz
2+
配合物的xps结果进行对比。xrd结果显示zz-mofs峰强度降低，与bpns有较多重合峰，说明zz-mofs结合机制主要为bpns与zz
2+
的作用；xps结果显示bpns是以与zz
2+
配位的方式参与zz-mofs的形成。
61.实施例2基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
62.将六水硝酸锌zzzzno3z
·
6h2oz和2-甲基咪唑z2-mimz分别溶解在乙腈中，使zzzno3z
·
6h2o终浓度为20mm，2-mim终浓度为10mm。将5mm bpns乙腈溶液与zzzno3z
·
6h2o溶液混合，加入2-mim溶液，混合后超声处理25miz，然后将混合物室温静置24h，最后将沉淀物离心，用乙腈洗涤三次，沉淀物室温条件下真空干燥6h，得到荧光探针zz-mofs。
63.实施例3基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
64.将六水硝酸锌zzzzno3z
·
6h2oz和2-甲基咪唑z2-mimz分别溶解在乙腈中，使之终浓度均为20mm，将5mm bpns乙腈溶液与zzzno3z
·
6h2o溶液混合，加入2-mim溶液，混合后超声处理15miz，然后将混合物室温静置24h，最后将沉淀物离心，用乙腈洗涤三次，沉淀物室温条件下真空干燥8h，得到zz-mofs。
65.实施例4-6
66.同实施例1，不同之处在于，荧光探针制备时bpns的乙腈溶液终浓度改为3，4和7mm，其他条件不变。所得结果分别见图5zaz、图5zbz、图5zcz。结果显示，随着bpns浓度的增加，zz-mofs呈花瓣更密集的花状。由图1和图5对比可得，当bpns浓度为5mm时，zz-mofs花瓣稀疏，且结构完整、分散性更好。
67.对比例1
68.同实施例1，不同之处在于，将荧光探针合成溶剂由乙腈溶液均替换为甲醇溶液。结果见图6。图中显示，在甲醇溶液中无法形成规则晶体。
69.对比例2
70.将10mm zzzno3z2·
6h2o和5mm bpns在乙腈中25℃孵育30miz，得到bpns-zz
2+
配合物。
71.试验例1基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针在检测血清中可溶性aβ中的应用
72.将实施例1所得zz-mofs固体溶于tris-hcl缓冲液，得zz-mofs缓冲液，备用，其中，tris-hcl缓冲液；在空白血清中分别配制10、20、30、40、50、60zm aβ溶液，与zz-mofs血清(zz-mofs在血清中的浓度为2mg/ml)在37℃下孵育10miz，用酶标仪测定上清液在526zm处的荧光强度zλex＝332zmz。根据荧光强度与可溶性aβ浓度之间的线性关系，建立标准曲线，由origizpro 8.5软件拟合，结果见图7，其中图7横坐标为aβ浓度，纵坐标为荧光强度。根据公式计算检测限：lod＝3σ/s；式中：σ为空白血清的标准差，s为线性曲线的斜率。由图7可
得，线性关系较好，根据公式计算检测限为3.22zm。
73.使用bca法验证zz-mofs检测aβ标准曲线，结果见表1。zz-mofs在未稀释的血清中检测可溶性aβ，具有较好的回收率和低于5％的相对标准偏差。因此，该探针可用于未稀释血清中可溶性aβ的定量检测。
74.表1
[0075][0076]
为了进一步探究荧光探针自身特性及可检测低检测限性能，分别测试了荧光探针的水蒸气吸附等温线以及荧光探针的n2吸附-解吸等温线和中孔分布。
[0077]
具体为：通过动态水蒸气分析仪zdvs advezturez分析zz-mofs分子内部亲疏水情况。首先将样品放入干净的坩埚内，设置相应的参数，每隔相同时间检测一次质量随水蒸气压增加的变化，得到吸附等温线，结果见图8，其中，图8的横坐标为相对压力，纵坐标为吸水率。
[0078]
图8荧光探针的水蒸气吸附等温线显示，随着p/p0的增加，zz-mofs的吸水速率基本不变，结果表明zz-mofs有较强疏水性。一般来说，aβ与血清中大多数本质亲水的干扰物质相比是疏水的。强疏水性使zz-mofs选择性地与疏水aβ相互作用，而与干扰物质相互作用很小。综上，zz-mofs可选择性富集aβ，从而显著降低检测限。
[0079]
通过asap2460进行了孔隙度分析仪测定。该仪器测试了样品在77.3k时的n2吸附/脱附等温线，其次称取一定样品放到测试专用样品管中先对样品进行预处理，脱去样品杂质，用密度泛函理论zdezsity fuzctiozal theory，dftz模型计算了中孔尺寸分布。结果见图9，图9zaz的横坐标为相对压力，纵坐标为n2吸附量；图9zbz的横坐标为孔隙宽度，纵坐标为孔面积。
[0080]
图9荧光探针的n2吸附-解吸等温线zaz和dft法计算zz-mofs中孔分布zbz显示，zz-mofs表现出iv型等温线的特征，存在明显的滞后环，表明介孔的存在。利用密度泛函理论zdftz计算了zz-mofs的中孔尺寸分布。结果显示zz-mofs花瓣上的孔径主要分布在10和13zm，从而使aβ而不是hsa、trf或bsa进入内部。通过阻挡干扰物质，尺寸排阻效应也有助于aβ的选择性富集，提高了检测精准度。
[0081]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将zzzⅱz盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液、n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液混合，超声处理后，反应，收集沉淀，真空干燥，得荧光探针。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液的浓度为3～7mm。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液的浓度为5mm。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为12-30h；优选的，所述反应的时间为24h。5.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，zzzⅱz盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液、n-z6-z苯并噻唑-2-基z吡啶-3-基z-5-z二甲氨基z萘-1-磺酰的乙腈溶液摩尔浓度比为z1-2z：z1-2z：z0.5-1.5z。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，超声处理的时间为15-30miz；优选的，超声处理的时间为25miz。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，真空干燥的时间为5-10h；优选的，真空干燥的时间为6h。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述zzzⅱz盐为六水合硝酸锌、七水合硫酸锌或氯化锌；优选的，所述zzzⅱz盐为六水合硝酸锌。9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针。10.权利要求9所述的基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针在检测血清中可溶性aβ中的应用。

技术总结
本发明提出一种基于双有机配体锌基金属有机框架材料的荧光探针及其制备方法和应用，属于新型功能纳米材料检测技术领域。所述制备方法包括：将ZZZⅡZ盐的乙腈溶液、2-甲基咪唑的乙腈溶液、N-Z6-Z苯并噻唑-2-基Z吡啶-3-基Z-5-Z二甲氨基Z萘-1-磺酰的乙腈溶液混合，超声处理后，反应，收集沉淀，真空干燥，得荧光探针。所得探针主要用于血清中可溶性Aβ的检测，其检测限低至3.22ZM，Aβ与ZZ-MOFs之间的荧光响应迅速快，可在10miZ内完成，该设计在低成本、快速、准确地检测血清或其他复杂体液中的微量目标物质方面具有潜在的应用价值。微量目标物质方面具有潜在的应用价值。微量目标物质方面具有潜在的应用价值。


技术研发人员：王梓源 焦祎 柴慈曼 冯玉晓 崔建东 贾士儒
受保护的技术使用者：天津医科大学第二医院
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/9/7