AuNSs@4-MBN@Ag/硅片基底及其应用的制作方法

au nss@4-mbn@ag/硅片基底及其应用
技术领域
1.本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种au nss@4-mbn@ag/硅片基底及其应用，尤其是检测牛奶中三聚氰胺的应用。


背景技术：

2.牛奶是一种有着悠久历史的天然乳制品。牛奶及其制品是膳食结构中蛋白质、钙、磷、维生素的主要来源之一，对婴幼儿和青少年的生长和发育很重要。除此之外牛奶还可有效降低食管括约肌压力，保护胃肠粘膜等有益作用。因其具有上述特点，人们广泛食用牛奶及其制品。
3.蛋白质是牛奶中最为重要的营养物质，其含量高低常用于评定牛奶等级优劣。目前针对牛奶中蛋白质含量的检测，主要集中在凯氏定氮法。该方法虽简单易行，但却是以测定体系中总的含氮量进而估算蛋白质含量，其缺点在于不能排除非蛋白含氮物质的干扰。
4.目前针对三聚氰胺的检测，主要有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附法、固相萃取与高效液相色谱联用法等方法。这些方法具有一定的检测准确性，但也存在如设备昂贵、操作复杂、检测时长等不足。因此寻找一种快速灵敏的三聚氰胺检测方法必要且有意义。
5.表面增强拉曼散射现象(sers)的出现或可为牛奶中三聚氰胺的检测提供一种新的思路。相较于上述几种三聚氰胺检测方法，sers可以实现对三聚氰胺灵敏检测。克服了传统检测方法灵敏度低、步骤复杂、检测时长、对实验人员要求高等缺点。近年来sers因其操作便捷、检测用量少、检测灵敏度高等优点而被用于食品中的农残检测。此外便携式拉曼仪的出现更为现场直接检测成为一种可能。
6.但是，一般的sers检测方法对三聚氰胺的检测灵敏度较低，且大多集中在对三聚氰胺的定性、半定量检测。因此需要针对性开发新的可供选择的技术，实现对三聚氰胺的灵敏准确检测。


技术实现要素：

7.发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种au nss@4-mbn@ag/硅片基底及其应用，通过引入4-巯基苯甲腈(4-mbn)做拉曼内标分子，可实现对三聚氰胺的灵敏准确检测，操作简单，检测快速。
8.技术方案：本发明的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：包括au nss@4-mbn@ag和硅片，该基底的制备方法包括如下步骤：
9.1)通过氧化还原法，在油浴条件下，通过柠檬酸钠还原氯金酸溶液，进而获得粒径13nm的球形的金纳米粒子au
13
；
10.2)通过种子生长法，将球形的金纳米粒子au
13
加入到氯金酸溶液中，搅拌混匀后向溶液中加入抗坏血酸和硝酸银，即得星状的金纳米粒子au nss；向溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮pvp，充分反应后将上述溶液离心洗涤后分散在水溶液中，即得纯化后的金纳米星溶
液；
11.3)将上述离心纯化后的金纳米星溶液与4-巯基苯甲腈4-mbn溶液搅拌混匀，离心洗涤纯化后重新分散在水溶液中即得au nss@4-mbn；
12.4)将上述制备的au nss@4-mbn加入到烧瓶中，同时向烧瓶中加入硝酸银、抗坏血酸、氨水后，搅拌反应若干时间后向溶液中加入十二烷基硫酸钠sds，反应若干时间后离心洗涤纯化后重新分散在水溶液中，即得au nss@4-mbn@ag；
13.5)吸取上述制备的au nss@4-mbn@ag溶液，直接滴加到洁净的硅片上，待其干燥后即得au nss@4-mbn@ag/硅片基底。
14.其中，所述的步骤1)中柠檬酸钠与氯金酸的体积比为3-10:50。
15.优选的，步骤1)中柠檬酸钠与氯金酸的体积比为5:50。
16.其中，所述的步骤2)中金纳米粒子au
13
与氯金酸的体积比为0-5:100；所述的聚乙烯吡咯烷酮pvp的体积为1ml-10ml；所述的离心转速为4000rpm-6000rpm，离心时间为15min-20min。
17.优选的，步骤2)中金纳米粒子au
13
与氯金酸的体积比为1:50；所述的聚乙烯吡咯烷酮pvp的体积为5ml；所述的离心转速为4500rpm，离心时间为16min。
18.其中，所述的步骤3)中金纳米星溶液与4-巯基苯甲腈4-mbn的体积比为0-10:500，搅拌时间为0.5h-2h。
19.优选的，步骤3)中金纳米星溶液与4-巯基苯甲腈4-mbn的体积比为1:500，搅拌时间为1h。
20.其中，所述的步骤4)中硝酸银、抗坏血酸、氨水的物质的量的比值为1-5:1:14.84；所述的十二烷基硫酸钠sds的浓度为0.005nm-0.1nm。
21.优选的，步骤4)中硝酸银、抗坏血酸、氨水的物质的量的比值为1:1:14.84；所述的十二烷基硫酸钠sds的浓度为0.01nm。
22.其中，所述的步骤5)中au nss@4-mbn@ag溶液滴加到硅片上的体积为5μl-15μl。
23.优选的，步骤5)中au nss@4-mbn@ag溶液滴加到硅片上的体积为10μl。
24.本发明的au nss@4-mbn@ag/硅片基底的应用。
25.本发明的au nss@4-mbn@ag/硅片基底在检测牛奶中三聚氰胺的应用。
26.应用时，将三聚氰胺溶液直接滴加在au nss@4-mbn@ag/硅片基底上，待干燥后即进行拉曼检测。
27.其中，三聚氰胺浓度与拉曼信号强度之间的线性关系方程为i＝21333.9611+9064.70916
×
lgc，其中i为在682cm-1
处的拉曼峰强度，c为三聚氰胺的浓度；所述三聚氰胺的浓度为0.01ppm-100ppm；当引入内标信号校正后，三聚氰胺浓度与拉曼信号强度之间的线性关系方程为i＝4.30278+1.98095
×
lgc，其中i为三聚氰胺在682cm-1
处的拉曼峰强度与4-巯基苯甲腈在2227cm-1
处拉曼峰强度的比值，c为三聚氰胺的浓度；所述三聚氰胺的浓度为0.01ppm-100ppm。
28.工作原理：本发明通过表面增强拉曼的原理实现对物质的快速检测。首先，合成了具有良好sers增强能力的au nss@4-mbn@ag纳米粒子，通过形成“核壳结构”，在保护内标分子4-巯基苯甲腈4-mbn不会干扰检测对象的同时，通过在外层包裹一定厚度的银纳米粒子，使得材料整体具有更强的sers效应。再将上述材料滴加到洁净硅片上，待其干燥后即可制
得au nss@4-mbn@ag/硅片基底。将含有检测物的溶液滴加到该复合基底上，待其干燥后富集在基底上的检测物会在au nss@4-mbn@ag/硅片基底的sers效应下而极大增强自身拉曼信号，从而实现对物质的检测。此外，本发明通过调控4-巯基苯甲腈的加入量，硝酸银和抗坏血酸的浓度来确保最终合成的au nss@4-mbn@ag粒子具有最佳sers增强效应，用于最终基底的制备。
29.有益效果：本发明具有以下显著优点：本发明au nss@4-mbn@ag/硅片基底制备简单且成本较低，操作便捷，适用性广，无需其它大型或贵重设备，可以规模化制备，具有较大的潜在商用价值。本发明通过引入内标分子4-巯基苯甲腈4-mbn，可以实现对检测对象的内标定量检测，有别于一般的定性、半定量拉曼检测。本发明通过干燥挥发的方法，合成的au nss@4-mbn@ag能于硅片紧密结合在一起，无需对硅片进行复杂的化学改性或化学修饰，整体更加环保安全。本发明在有效保证基底增强性能的同时还可重复多次使用。本发明制备的拉曼增强基底本身还具有背景噪音低、增强性能强、增强性能稳定等特点；在室温条件下，无需其它额外保存要求，该基底的拉曼增强性能保持30天而无显著变化。本发明的三聚氰胺检测限远低于一般方法和相关文献中报道，最低检测限为0.0084ppm。本发明不仅可以定性检测鉴别三聚氰胺，更可以定量分析残留三聚氰胺的具体含量。
附图说明
30.图1a为au nss@4-mbn@ag纳米粒子的透射电镜表征图；图1b为au nss，au nss@4-mbn，au nss@4-mbn@ag纳米粒子的紫外吸收光谱图；图1c为au nss，au nss@4-mbn，au nss@4-mbn@ag三种纳米粒子的拉曼光谱图；
31.图2a为本发明方法的制备流程图；图2b为本发明方法的检测流程图；
32.图3a为该基底检测罗丹明(r6g)的拉曼光谱图；图3b为r6g特征峰强度与浓度间的拟合方程图；图3c为引入内标分子后的吸收峰强度与r6g浓度间的拟合方程图；
33.图4a为三聚氰胺浓度梯度拉曼光谱图；图4b为三聚氰胺的对数坐标图；图4c为内标校正后的三聚氰胺的对数坐标图；
34.图5a为测试基底检测三聚氰胺重现性图；图5b为基底检测三聚氰胺的拉曼光谱图；图5c为同一基底上三聚氰胺在不同时间的拉曼光谱图；图5d为同一基底上三聚氰胺的特征峰强度随时间变化图。
具体实施方式
35.下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
36.本发明的硝酸银、抗坏血酸、柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、氯金酸(haucl4)、氯化钠、葡萄糖、氯化镁、氯化钾、氯化钙、葡萄糖购自麦克林公司(中国，上海)；三聚氰胺、盐酸、甲醇、氨水购自国药化学试剂公司(中国，上海)；实验中使用的牛奶、奶粉购自学校附近的超市(中国，南京)；共聚焦显微拉曼仪(雷尼绍公司，中国，上海)；透射电子显微镜(频率电子公司，中国，上海)；混匀仪(艾卡公司，中国，苏州)；冷冻离心机(赛默飞公司，中国，上海)。
37.1、纳米金星粒子的合成：通过种子生长法合成星状金纳米粒子(au nss)与表征测定：
38.首先，合成粒径13nm的球形的金纳米粒子：向烧瓶中加入50ml的浓度为0.25mm的haucl4溶液，此时溶液颜色为淡黄色，然后将其置于磁力搅拌器中加热搅拌。待溶液完全沸腾时，立即向溶液中加入7.5ml的质量分数为1％的柠檬酸钠水溶液，反应15min后，停止加热，即得球形的金纳米粒子溶液，此时溶液颜色为酒红色。取出烧瓶，待球形的金纳米粒子溶液自然冷却至室温即可使用。
39.其次，合成纳米金星粒子：先向烧瓶中加入50ml的浓度为0.25mm的haucl4溶液和50μl的浓度为1m的盐酸，搅拌3min后，向该烧瓶中加入0.5ml的新合成的直径为13nm的球形的金纳米粒子，继续搅拌3min；然后，同时向溶液中加入1ml浓度为0.50mm的硝酸银溶液和0.25ml的浓度为0.1m的抗坏血酸溶液，反应30s后，再加入5ml的5wt％的聚乙烯吡咯烷酮溶液；将该溶液用冷冻离心机在转速为45000rcf的条件下离心洗涤16min，除去上清液后，再分散于50ml去离子水中，即得浓度为0.01nm的纳米金星的水溶液。
40.2、au nss@4-mbn的合成制备：
41.取50ml上述制备合成的浓度为0.01nm的金纳米星溶液置于烧瓶中，室温条件下保持转速为400rpm，准确吸取100μl的浓度为0.05mm的4-巯基苯甲腈，快速加入到烧瓶中。保持搅拌反应1h后，停止搅拌，将该溶液用冷冻离心机在转速为5000rcf的条件下离心洗涤16min，除去上清液后，再分散于50ml去离子水中，即得浓度为0.01nm的偶联上4-巯基苯甲腈的纳米金星(au nss@4-mbn)溶液。
42.3、au nss@4-mbn@ag的合成制备：
43.首先，取50ml上述au nss@4-mbn溶液倒入烧瓶中，室温条件下保持转速为700rpm搅拌反应3分钟后，同时依次准确向烧瓶中加入50μl浓度为0.1m的硝酸银溶液和50μl浓度为0.1m的抗坏血酸溶液，搅拌反应30s后，立即向烧瓶中加入50μl的浓度为14.84m的氨水溶液。此时溶液颜色迅速由青黑色立即变为黄褐色，表明银包裹上了au nss@4-mbn。继续保持搅拌反应5分钟，待溶液颜色稳定后，向溶液中加入1ml的浓度为0.01m的十二烷基硫酸钠(sds)溶液，继续搅拌反应5分钟后，停止搅拌。将该溶液用冷冻离心机在转速为5000rcf的条件下离心洗涤16min，除去上清液后，再分散于5ml去离子水中，即得浓度为0.01nm的au nss@4-mbn@ag溶液。
44.4、au nss@4-mbn@ag制备sers基底：
45.将面积大小为0.5
×
0.5cm-2
的干净硅片取出，用乙醇清洗干净后，置于通风橱下，待其干燥后，准确吸取10μl上述合成的au nss@4-mbn@ag溶液，缓慢注入上述大小的硅片上。干燥后，即可制得具有sers效应的au nss@4-mbn@ag/硅片基底。
46.5、au nss@4-mbn@ag/硅片基底对标准样品中三聚氰胺的检测：
47.用计量天平准确称取三聚氰胺分别溶解于体积分数为20％的甲醇水溶液中，配置得到浓度为0.01ppm、0.1ppm、0.5ppm、1ppm、5ppm、10ppm、100ppm的三聚氰胺溶液。分别吸取上述10μl上述制备好的三聚氰胺的标准液缓慢滴加到au nss@4-mbn@ag/硅片基底上，待其干燥后即可用于检测。对三聚氰胺在682cm-1
处的特征拉曼峰进行检测。其中，仪器主要参数为拉曼激发光源波长选用785nm，检测波长范围为550cm-1-2500cm-1
。积分时间为10s，激光功率选用10％mw。每个测试结果都进行三次平行独立测试。如图所示，将三聚氰胺分子在682cm-1
的特征拉曼峰强度进行线性拟合，即得归一化方程i＝21333.9611+9064.70916
×
lgc，其中i代表三聚氰胺分子在682cm-1
处的拉曼峰强度，c代表三聚氰胺的浓度。将三聚氰
胺在682cm-1
的特征峰强度与4-mbn在2227cm-1
处的特征峰强度进行比值后，在以不同三聚氰胺浓度对应比值进行归一化拟合。即可得到内标校正后的归一化方程i＝4.30278+1.98095
×
lgc。其中i代表三聚氰胺分子在682cm-1
的拉曼特征峰强度除以对应4-mbn在2227cm-1
处的的特征拉曼峰后的强度比值。c代表三聚氰胺的浓度。测试结果表明，引入内标分子后，显著提升了三聚氰胺的标准曲线方程的拟合度，可实现对三聚氰胺在0.01ppm-100ppm的浓度范围内的内标定量检测，检测限为0.0084ppm。检测过程只需10s，可获得三聚氰胺的拉曼光谱。
48.6、验证au nss@4-mbn@ag/硅片基底检测的重现性和稳定性：
49.将同一批次制备的三批对应浓度为10ppm的三聚氰胺分别进行au nss@4-mbn@ag/硅片基底测试，验证基底的重现性。操作步骤、条件如上，从每个基底中任选5个区域进行测试，三个平行样共计15个点进行测试汇总，相对标准偏差是通过计算三聚氰胺分子在682cm-1
处拉曼特征峰强度进行计算。稳定性则是通过测试单个基底在不同时间的拉曼特征峰强度随时间的变化关系。如图5a和5b所示，对三个平行样的检测结果表明，整体数据的相对标准偏差值为3.80％，说明该基底具有误差范围小，数据重现好，数据可信度高等优点。如图5c所示，不同时间间隔内的三聚氰胺特征峰吸收强度并未发生明显的改变。即使间隔30天后，三聚氰胺信号强度并未发生改变。如图5d所示，间隔30天后三聚氰胺的信号强度依然能达到第一天时信号强度的94％，这说明制备的基底可以长时间保持增强性能，具有良好的稳定性。
50.7、验证au nss@4-mbn@ag/硅片基底检测实际样品的加标回收率：
51.取50ml从商场购买的牛奶中加入一定浓度的三聚氰胺标准溶液，充分混匀后在加入2ml浓度为2m的hcl，待溶液充分混匀后，即可得到含有不同浓度三聚氰胺的牛奶。取10克奶粉加入到50ml水中，完全溶解后加入一定浓度的三聚氰胺标准溶液，再加入2ml浓度为2m的hcl，待溶液充分混匀后，即可得到含有不同浓度三聚氰胺的奶粉溶液。待其完全溶解后将上述牛奶、奶粉溶液用冷冻离心机在转速为10000rpm的条件下离心洗涤10min，提取离心管内上层清液。分别吸取上述含有三聚氰胺的牛奶、奶粉溶液10μl滴加到au nss@4-mbn@ag硅片基底上待其干燥后即进行拉曼测试，并统计加标回收率(recovery)。如表1所示，这里我们选取0.1ppm，1.0ppm，10ppm三个量级进行实际样品的加标回收，测试结果表明最终的回收率在96.38％-107.79％范围内，相对标准偏差在1.41％-6.77％之间。回收率好，数据可信度高，说明该方法可用于实际样品的检测。
52.表1-测试基底检测牛奶及奶粉中三聚氰胺的加标回收情况表
[0053][0054]
本发明公开了一种基于au nss@4-mbn@ag/硅片基底用于检测牛奶中的三聚氰胺的方法，所述方法制备简单且成本较低，操作便捷，适用性广。无需其它大型或贵重设备，可实现对三聚氰胺的灵敏定量检测；整体更加安全环保；合成的au nss@4-mbn@ag粒子具有极强的表面增强拉曼活性，在有效提升三聚氰胺拉曼信号的同时，该材料自身所具有的拉曼特征峰可做为内标信号，进而实现对三聚氰胺的灵敏定量检测；在有效提升基底增强性能的同时还可重复多次使用。本发明还公开了由所述方法制备的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，所述基底无需其它额外保存要求，该基底的拉曼增强性能保持30天而无显著变化。本发明还公开了aunss@4-mbn@ag粒子在检测三聚氰胺中定量的应用，检测限远低于一般方法和相关文献中报道的最低检限，最低检测限可达0.0084ppm。

技术特征：
1.au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：包括au nss@4-mbn@ag和硅片，该基底的制备方法包括如下步骤：1)通过氧化还原法，在油浴条件下，通过柠檬酸钠还原氯金酸溶液，进而获得粒径13nm的球形的金纳米粒子au
13
；2)通过种子生长法，将球形的金纳米粒子au
13
加入到氯金酸溶液中，搅拌混匀后向溶液中加入抗坏血酸和硝酸银，即得星状的金纳米粒子au nss；向溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮pvp，充分反应后将上述溶液离心洗涤后分散在水溶液中，即得纯化后的金纳米星溶液；3)将上述离心纯化后的金纳米星溶液与4-巯基苯甲腈4-mbn溶液搅拌混匀，离心洗涤纯化后重新分散在水溶液中即得au nss@4-mbn；4)将上述制备的au nss@4-mbn加入到烧瓶中，同时向烧瓶中加入硝酸银、抗坏血酸、氨水后，搅拌反应若干时间后向溶液中加入十二烷基硫酸钠sds，反应若干时间后离心洗涤纯化后重新分散在水溶液中，即得au nss@4-mbn@ag；5)吸取上述制备的au nss@4-mbn@ag溶液，直接滴加到洁净的硅片上，待其干燥后即得au nss@4-mbn@ag/硅片基底。2.根据权利要求1所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：所述的步骤1)中柠檬酸钠与氯金酸的体积比为3-10:50。3.根据权利要求1所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：所述的步骤2)中金纳米粒子au
13
与氯金酸的体积比为0-5:100；所述的聚乙烯吡咯烷酮pvp的体积为1ml-10ml；所述的离心转速为4000rpm-6000rpm，离心时间为15min-20min。4.根据权利要求1所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：所述的步骤3)中金纳米星溶液与4-巯基苯甲腈4-mbn的体积比为0-10:500，搅拌时间为0.5h-2h。5.根据权利要求1所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：所述的步骤4)中硝酸银、抗坏血酸、氨水的物质的量的比值为1-5:1:14.84；所述的十二烷基硫酸钠sds的浓度为0.005nm-0.1nm。6.根据权利要求1所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底，其特征在于：所述的步骤5)中au nss@4-mbn@ag溶液滴加到硅片上的体积为5μl-15μl。7.根据权利要求1-6中任一项所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底的应用。8.根据权利要求1-6中任一项所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底在检测牛奶中三聚氰胺的应用。9.根据权利要求8所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底在检测牛奶中三聚氰胺的应用，其特征在于：将三聚氰胺溶液直接滴加在au nss@4-mbn@ag/硅片基底上，待干燥后即进行拉曼检测。10.根据权利要求9所述的au nss@4-mbn@ag/硅片基底在检测牛奶中三聚氰胺的应用，其特征在于：三聚氰胺浓度与拉曼信号强度之间的线性关系方程为i＝21333.9611+9064.70916
×
lgc，其中i为在682cm-1
处的拉曼峰强度，c为三聚氰胺的浓度；所述三聚氰胺的浓度为0.01ppm-100ppm；当引入内标信号校正后，三聚氰胺浓度与拉曼信号强度之间的线性关系方程为i＝4.30278+1.98095
×
lgc，其中i为三聚氰胺在682cm-1
处的拉曼峰强度与4-巯基苯甲腈在2227cm-1
处拉曼峰强度的比值，c为三聚氰胺的浓度；所述三聚氰胺的浓度为0.01ppm-100ppm。

技术总结
本发明公开了一种Au NSs@4-MBN@Ag/硅片基底，包括Au NSs@4-MBN@Ag和硅片，合成了具有良好SERS增强能力的Au NSs@4-MBN@Ag纳米粒子，通过形成“核壳结构”，在保护内标分子4-巯基苯甲腈(4-MBN)不会干扰检测对象的同时，通过在外层包裹一定厚度的银纳米粒子，使得材料整体具有更强的SERS效应。本发明通过引入4-巯基苯甲腈(4-MBN)做拉曼内标分子，可实现对三聚氰胺的灵敏准确检测，操作简单，检测快速。检测快速。检测快速。


技术研发人员：王勇 张宇生 刘松琴 王伟 王磊 李黎明
受保护的技术使用者：南京市公安局刑事侦查局
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/9/7