针对冠状病毒的抗体及其用途

1.本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是冠状病毒(coronavirus)感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及用于治疗冠状病毒(例如sars-cov-2和/或sars-cov-1)感染及其相关疾病的抗体，包含所述抗体的组合物(例如，治疗剂和诊断剂)。此外，本发明还涉及所述抗体的用途。
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：：2.冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎，威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物，一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类，可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。例如，由严重急性呼吸道综合征冠状病毒(sars-cov，也可称为sars-cov-1)感染导致严重急性呼吸综合征(sars)以及由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)感染导致的covid-19都给人类经济社会发展带来巨大的影响和负担。3.目前，尚无批准用于预防或治疗sars-cov-2感染的特效药物。应对sars-cov-2感染引起的肺炎患者仅给予一般的支持性治疗，氧疗措施和抗病毒治疗，如干扰素β-1b、洛匹那韦/利托那韦、瑞德西韦、地塞米松等，这些措施带来的临床效果有限。研究发现，在新冠肺炎的恢复者体内通常伴随着较高水平的sars-cov-2中和抗体产生。在国家卫健委发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)中，对病情进展较快、重型和危重型患者推荐进行康复者血浆治疗。有研究数据表明，对确证患有covid-19并同时伴有严重呼吸窘迫综合征(ards)的危重症患者使用含有中和抗体的康复期血浆治疗后，病人体内的病毒载量迅速降低，患者的临床症状得到有效改善。这些研究表明了体液免疫在sars-cov-2中的重要性，且表明了除了疫苗研发外，应当研制一种或者多种能够高效和特异性中和sars-cov-2的单克隆抗体，通过单独使用或者联合使用，可以应用于covid-19的短期预防和有效治疗，这对我国乃至全球防治covid-19具有重要意义，与此同时，可以预见的是，随着病毒的不断突变以及人类发展速度的加快和交流高度广泛，不难预测，更新型的冠状病毒可能会源源不断的出现，也正因为如此，使得开发针对广谱β-cov-bs的中和抗体(nabs)成为具有重要战略意义的项目。4.sars-cov-1和sars-cov-2都是β属冠状病毒，在进化树中处于同一分支，二者皆是含包膜的单链正义rna病毒。二者皆至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。sars-cov-2的受体与sars-cov-1一样，均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后介导了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。因此，通过干扰s蛋白与ace2的结合就能中和病毒的感染。所以，s蛋白尤其是rbd区域是冠状病毒中和抗体的主要来源和识别区域，针对rbd区域的中和抗体的发展是优选。5.目前，sars-cov-2以及其相关的突变病毒株正在席卷全球，极大的影响了人类社会经济发展，给人民生命安全造成巨大的威胁。因此，发展能够治疗或预防冠状病毒(例如sars-cov-2)感染的的抗体等药物对防控相关疫情具有重要意义。技术实现要素：6.本发明提供了能中和冠状病毒(例如sars-cov-2和/或sars-cov-1)的单克隆抗体。这些单克隆抗体与冠状病毒的s蛋白rbd区域上的表位结合并中和冠状病毒，抑制冠状病毒rbd蛋白与受体ace2的结合，并且在动物模型中可以在一定程度上保护动物免受冠状病毒的攻击。特别地，本发明的单克隆抗体对当前世界流行的sars-cov-2主流突变株保持了稳定的中和效果。因此，本发明的抗体具有用于预防和/或治疗冠状病毒(例如sars-cov-1和sars-cov-2)感染或相关疾病的潜力，具有重大的临床价值。7.本发明的抗体8.本发明第一方面提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：9.(a)包含下述3个互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：10.(i)vhcdr1，其由下述序列组成：seqidno:7、seqidno:13或seqidno:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，11.(ii)vhcdr2，其由下述序列组成：seqidno:8、seqidno:14或seqidno:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和12.(iii)vhcdr3，其由下述序列组成：seqidno:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；13.和/或，14.(b)包含下述3个互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：15.(iv)vlcdr1，其由下述序列组成：seqidno:10、seqidno:16或seqidno:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，16.(v)vlcdr2，其由下述序列组成：seqidno:11、seqidno:17或seqidno:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和17.(vi)vlcdr3，其由下述序列组成：seqidno:12、seqidno:18或seqidno:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。18.在某些实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。19.在某些实施方案中，上述cdr根据kabat编号系统定义。20.在某些实施方案中，本发明所述抗体或其抗原结合片段源自单克隆抗体10e9，所述抗体或其抗原结合片段包含：21.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno:7或其变体的vhcdr1，序列为seqidno:8或其变体的vhcdr2，序列为seqidno:9或其变体的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno:10或其变体的vlcdr1，序列为seqidno:11或其变体的vlcdr2，序列为seqidno:12或其变体的vlcdr3；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；22.或，23.(b)如seqidno:1所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:2所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。24.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于鼠免疫球蛋白的框架区(fr)。25.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:1或其变体所示的序列的vh和包含如seqidno:2或其变体所示的序列的vl；所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，例如保守置换)。所述变体基本保留了其所源自的序列的生物学功能。26.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的至少一项：27.(1)特异性结合冠状病毒s蛋白的rbd；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株；28.(2)以小于约50ng/ml，例如小于约40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml或更小的ec50结合sars-cov-2(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))的s蛋白的rbd，和/或，以小于约100ng/ml，例如小于约90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、65ng/ml或更小的ec50结合sars-cov-1(例如，cuhk-w1株(genbank:ay278554.2))的s蛋白的rbd；优选地，所述ec50可以通过elisa法测定；29.(3)以小于约10nm，例如小于约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm或更低的kd结合sars-cov-2(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))的s蛋白的rbd；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如biacore)测定；30.(4)以小于约0.1nm，例如小于约0.09nm、0.08nm、0.07nm、0.06nm、0.05nm、0.04nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-2假病毒(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；31.(5)以小于约0.1nm，例如小于约0.09nm、0.08nm、0.07nm、0.06nm、0.05nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-1假病毒(例如，cuhk-w1株(genbank:ay278554.2))，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；32.(6)以小于约2nm，例如小于约1.5nm、1.4nm、1.3nm、1.2nm、1.1nm、1nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-2关切突变株假病毒(例如，d614g、b.1.1.7、b.1.351、p.1、b.1.617.2)，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；33.(7)在受试者(例如人)体内中和冠状病毒、预防和/或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株。34.在某些实施方案中，本发明所述抗体或其抗原结合片段源自单克隆抗体30a4-2，所述抗体或其抗原结合片段包含：35.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno:13或其变体的vhcdr1，序列为seqidno:14或其变体的vhcdr2，序列为seqidno:15或其变体的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno:16或其变体的vlcdr1，序列为seqidno:17或其变体的vlcdr2，序列为seqidno:18或其变体的vlcdr3；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；36.或，37.(b)如seqidno:3所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:4所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。38.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于鼠免疫球蛋白的框架区(fr)。39.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:3或其变体所示的序列的vh和包含如seqidno:4或其变体所示的序列的vl；所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，例如保守置换)。所述变体基本保留了其所源自的序列的生物学功能。40.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的至少一项：41.(1)特异性结合冠状病毒s蛋白的rbd；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株；42.(2)以小于约50ng/ml，例如小于约40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、15ng/ml或更小的ec50结合sars-cov-2(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))的s蛋白的rbd，和/或，以小于约100ng/ml，例如小于约90ng/ml或更小的ec50结合sars-cov-1(例如，cuhk-w1株(genbank:ay278554.2))的s蛋白的rbd；优选地，所述ec50可以通过elisa法测定；43.(3)以小于约10nm，例如小于约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm或更低的kd结合sars-cov-2(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))的s蛋白的rbd；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如biacore)测定；44.(4)以小于约1nm，例如小于约0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-2假病毒(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；45.(5)以小于约1nm，例如小于约0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm、0.3nm、0.2nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-1假病毒(例如，cuhk-w1株(genbank:ay278554.2))，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；46.(6)以小于约1nm，例如小于约0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-2关切突变株假病毒(例如，d614g、b.1.1.7、b.1.351、p.1、b.1.617.2)，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；47.(7)在受试者(例如人)体内中和冠状病毒、预防和/或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株。48.在某些实施方案中，本发明所述抗体或其抗原结合片段源自单克隆抗体1c5-2，所述抗体或其抗原结合片段包含：49.(a)如下3个重链cdrs：序列为seqidno:19或其变体的vhcdr1，序列为seqidno:20或其变体的vhcdr2，序列为seqidno:21或其变体的vhcdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seqidno:22或其变体的vlcdr1，序列为seqidno:23或其变体的vlcdr2，序列为seqidno:24或其变体的vlcdr3；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；50.或，51.(b)如seqidno:5所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seqidno:6所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义。52.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于鼠免疫球蛋白的框架区(fr)。53.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seqidno:5或其变体所示的序列的vh和包含如seqidno:6或其变体所示的序列的vl；所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，例如保守置换)。所述变体基本保留了其所源自的序列的生物学功能。54.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段具备以下特征中的至少一项：55.(1)特异性结合冠状病毒s蛋白的rbd；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株；56.(2)以小于约50ng/ml，例如小于约40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml或更小的ec50结合sars-cov-2(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))的s蛋白的rbd，和/或，以小于约500ng/ml，例如小于约400ng/ml、300ng/ml、250ng/ml或更小的ec50结合sars-cov-1(例如，cuhk-w1株(genbank:ay278554.2))的s蛋白的rbd；优选地，所述ec50可以通过elisa法测定；57.(3)以小于约10nm，例如小于约9nm、8nm、7nm、6nm、5nm或更低的kd结合sars-cov-2(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))的s蛋白的rbd；优选地，所述kd通过表面等离子共振技术(例如biacore)测定；58.(4)以小于约1nm，例如小于约0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-2假病毒(例如，wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947))，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；59.(5)以小于约1nm，例如小于约0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-1假病毒(例如，cuhk-w1株(genbank:ay278554.2))，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；60.(6)以小于约20nm，例如小于约19nm、18nm、17nm、16nm、15nm、14nm、13nm、12nm、11nm或更小的半抑制浓度(ic50)在体外中和sars-cov-2关切突变株假病毒(例如，d614g、b.1.1.7、b.1.351、p.1、b.1.617.2)，例如通过实施例6中所述的中和实验测定；61.(7)在受试者(例如人)体内中和冠状病毒、预防和/或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株。62.在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段可以是人源化的，以减少对人的免疫原性。对非人抗体进行人源化的方法是本领域已知的，例如可以使用本领域已知的方法将本发明抗体或其抗原结合片段的cdr区移植入人源框架序列。在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段可以包含来源于人免疫球蛋白的框架区(fr)。63.在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列。64.在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的重链恒定区。在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区。65.在某些实施方案中，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。66.在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗原结合片段可以选自fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdab)。67.在某些实施方案中，上述任一实施方案中的抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。68.在本文中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包括这样的变体，所述变体与其所源自的抗体或其抗原结合片段相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换，或者与其所源自的抗体或其抗原结合片段具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，且基本保留了其所源自的抗体或其抗原结合片段的上述生物学功能。69.抗体的制备70.本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或pcr扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的dna分子。将所得dna分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。71.本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见morimotoetal.,j.biochem.biophys.methods24:107-117(1992)andbrennanetal.,science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewedinhudson,curr.opin.immunol.11:548-557(1999)；littleetal.,immunol.today,21:364-370(2000))。比如，fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将fab’片段化学偶联形成f(ab’)2片段(carteretal.,bio/technology,10:163-167(1992))。另外，fv、fab或f(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。72.因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。73.在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。74.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。75.在某些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。76.在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是微生物，例如原核细胞或酵母细胞。77.在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。78.治疗应用79.本发明的抗体或其抗原结合片段可用于体外或在受试者体内中和冠状病毒，阻断或抑制冠状病毒对细胞的感染，从而达到预防和/或治疗受试者的冠状病毒感染或相关疾病的目的。特别地，本发明第一方面所提供的源自10e9、30a4-2和1c5-2的抗体或其抗原结合片段可以联合使用用于预防和/或治疗冠状病毒感染。80.因此，在另一个方面，本发明提供的一种组合物，其包含选自本发明第一方面所提供的源自10e9的抗体或其抗原结合片段、源自30a4-2的抗体或其抗原结合片段以及源自1c5-2的抗体或其抗原结合片段中的至少两个。在某些实施方案中，所述组合物包含第一方面所提供的源自10e9的抗体或其抗原结合片段、源自30a4-2的抗体或其抗原结合片段以及源自1c5-2的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述组合物所包含的各种抗体作为分离的组分提供或作为混合的组分提供。因此，所述组合物所包含的各种抗体可以同时、分开或相继施用。81.在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有第一方面所述的抗体或其抗原结合片段或上述组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。82.在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂(例如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、瑞德西韦、地塞米松等)。83.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段或组合物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段或组合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。84.在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。85.在另一个方面，本发明提供了用于中和样品中冠状病毒的方法，其包括将包含冠状病毒的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或药物组合物接触。在某些实施方案中，所述方法在体外实施。在某些实施方案中，所述方法用于非诊断治疗目的。86.在某些实施方案中，所述冠状病毒为β属冠状病毒。在某些实施方案中，所述冠状病毒sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13。在某些实施方案中，所述冠状病毒sars-cov-2和/或sars-cov-1。87.在某些实施方案中，所述sars-cov-2包括突变株。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白含有突变，例如一个或几个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸置换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合。88.在另一个方面，本发明提供了用于在受试者中中和冠状病毒或预防和/或治疗冠状病毒感染或与冠状病毒感染相关的疾病的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或药物组合物。89.在某些实施方案中，向所述受试者施用本发明的组合物，其中所述组合物所包含的各种抗体可以同时、分开或相继施用。90.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。91.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、组合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、瑞德西韦、地塞米松等)联合使用。92.在某些实施方案中，所述冠状病毒为β属冠状病毒。在某些实施方案中，所述冠状病毒sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13。在某些实施方案中，所述冠状病毒sars-cov-2和/或sars-cov-1。93.在某些实施方案中，所述sars-cov-2包括突变株。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白含有突变，例如一个或几个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸置换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合。94.在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段、组合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：(1)在体外或受试者(例如人)体内中和冠状病毒；和/或，(2)用于预防和/或治疗受试者的冠状病毒感染或与冠状病毒感染相关的疾病。95.在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、组合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、瑞德西韦、地塞米松等)联合使用。96.在某些实施方案中，所述冠状病毒为β属冠状病毒。在某些实施方案中，所述冠状病毒sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13。在某些实施方案中，所述冠状病毒sars-cov-2和/或sars-cov-1。97.在某些实施方案中，所述sars-cov-2包括突变株。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白含有突变，例如一个或几个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸置换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合。98.本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。99.本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。100.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体或其抗原结合片段或组合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。101.在本文中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。102.在本文中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。103.缀合物104.本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对冠状病毒s蛋白的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(peg)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。105.因此，本发明还提供了一种缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段以及与其连接的可检测标记。106.在本文中，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。107.在某些实施方案中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，所述可检测的标记可以选自酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白，如fitc、tritc或pe)、放射性核素或生物素。108.在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。109.检测应用110.本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合冠状病毒s蛋白的rbd，从而可用于检测冠状病毒或其s蛋白或s蛋白的rbd，以及任选地根据上述检测结果来诊断受试者是否感染了冠状病毒。111.因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的缀合物。112.在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的缀合物。113.在另一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。114.在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如鼠或人)的抗体是特异的。115.在某些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人或鼠的免疫球蛋白)抗体，例如抗igg抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗鼠igg抗体或抗人igg抗体。116.在某些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(opd)、四甲基联苯胺(tmb)、abts或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-npp)或amppd。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。117.在另一个方面，本发明提供了检测冠状病毒或其s蛋白或s蛋白的rbd、或被冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。118.在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。119.在一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的缀合物。120.在另一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在某些实施方案中，所述方法还包括使用带有可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。121.在某些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如鼠或人)的抗体是特异的。122.在某些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人或鼠的免疫球蛋白)抗体，例如抗igg抗体。在某些实施方案中，所述第二抗体是抗鼠igg抗体或抗人igg抗体。123.在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在冠状病毒或被冠状病毒感染的细胞。124.在某些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据冠状病毒在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了冠状病毒。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。125.在某些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。126.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。127.在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测冠状病毒或其s蛋白或s蛋白的rbd、或被冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了冠状病毒。128.在某些实施方案中，所述方法是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如elisa)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。129.在某些实施方案中，所述检测试剂通过如上所述的检测方法来检测冠状病毒或其s蛋白或s蛋白的rbd、或被冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了冠状病毒。130.在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。131.在某些实施方案中，上述任一方面中所述的冠状病毒为β属冠状病毒。在某些实施方案中，上述任一方面中所述的冠状病毒为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13。在某些实施方案中，上述任一方面中所述的冠状病毒为sars-cov-2和/或sars-cov-1。在某些实施方案中，所述sars-cov-2包括突变株。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白含有突变，例如一个或几个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸置换、缺失或添加。在某些实施方案中，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换。在某些实施方案中，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合。132.术语定义133.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。134.如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，sars-cov-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-ncov”。由sars-cov-2所导致的疾病称为新型冠状病毒性肺炎(covid-19)。在本文中，术语“sars-cov-2”包含已知的各种分离株，例如既包括原始毒株(例如第一个被测序的分离株genbank：mn908947.3)，也包括后续被发现的突变株，例如关切突变株(variantsofconcern,voc)。在某些实施方案中，所述突变株包括d614g(如genbank：mn908947)、alpha(b.1.1.7andqlineages，如genbank：mw624725.1)、beta(b.1.351anddescendentlineages，如genbank:mz314998.1)、gamma(p.1anddescendentlineages，如genbank:mz427312.1)以及delta(b.1.617.2andaylineages，如genbank:om444216.1)。在某些实施方案中，术语“sars-cov-2”既包含其spikeprotein不包含突变(例如与参照株mn908947.3相比)的分离株，也包含在其spikeprotein中包含突变(例如与参照株mn908947.3相比的氨基酸置换，例如d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k或其任意组合)的分离株。在某些实施方案中，所述突变株优选地选自在其spikeprotein中包含突变(例如氨基酸置换，例如d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k或其任意组合)的分离株。在某些示例性实施方案中，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)。135.如本文中所使用的，“严重急性呼吸道综合征冠状病毒(sars-cov)”也可称为“sars-cov-1”，为severeacuterespiratorysyndrome(sars)的病原体。在本文中，术语“sars-cov-1”包含已知的各种分离株，例如cuhk-w1株(genbank:ay278554.2)或genbank:aap13567.1。由sars-cov-1所导致的疾病称为严重急性呼吸综合征(sars)。136.sars-cov-1和sars-cov-2均属于β冠状病毒属，为含包膜的单链正义rna病毒。它们至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(s)、整合膜蛋白(m)和膜蛋白(e)。两者均是通过s蛋白上的受体结合结构域(receptorbindingdomain,rbd)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ace2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。137.如本文中所使用的，“ratg13”为一种蝙蝠冠状病毒，可参加例如genbank:mn996532.1。138.本文所用的术语“抗体”是指能够特异性结合靶抗原的源自免疫球蛋白的分子，所述源自免疫球蛋白的分子通过位于其可变区中的至少一个抗原结合位点来结合所述靶抗原。当提及术语“抗体”时，除非上下文明确指出，其不仅包括完整抗体，而且包括能够特异性结合靶抗原的抗原结合片段。“完整抗体”典型地由两对多肽链(每对具有一条轻链(lc)和一条重链(hc))组成。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗原结合部位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循kabat,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定义。139.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991)、chothia编号系统(chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883)或imgt编号系统(lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见lefrancetal.,dev.comparat.immunol.27:55-77,2003)。140.在本发明中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr可根据本领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat、chothia或imgt编号系统确定。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的cdr优选地通过kabat编号系统确定。141.如本文中所使用的，术语“构架区”或“fr”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的cdr残基以外的那些氨基酸残基。142.术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。143.如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.,ed.,第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、互补决定区(cdr)片段、scfv、双抗体(diabody)、单域抗体(singledomainantibody)、嵌合抗体、线性抗体(linearantibody)、纳米抗体(技术来自domantis)、、probody和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；natbiotechnol,23:1126-1136中。144.如本文中所使用的，术语“全长抗体”意指，由两条“全长重链”和两条“全长轻链”组成的抗体。其中，“全长重链”是指这样的多肽链，其在n端到c端的方向上由重链可变区(vh)、重链恒定区ch1结构域、铰链区(hr)、重链恒定区ch2结构域、重链恒定区ch3结构域组成；并且，当所述全长抗体为ige同种型时，任选地还包括重链恒定区ch4结构域。优选地，“全长重链”是在n端到c端方向上由vh、ch1、hr、ch2和ch3组成的多肽链。“全长轻链”是在n端到c端方向上由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在cl和ch1之间的二硫键和两条全长重链的hr之间的二硫键连接在一起。本发明的全长抗体可以来自单一物种，例如人；也可以是嵌合抗体或人源化抗体。本发明的全长抗体包含分别由vh和vl对形成的两个抗原结合部位，这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。145.如本文中所使用的，术语“fd”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward等人,nature341:544546(1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段；术语“fab’片段”意指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1结构域组成)组成。146.如本文中所使用的，术语“fv”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段。fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个cdr赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的cdr)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。147.如本文中所使用的，术语“fc”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。148.如本文中所使用的，术语“scfv”是指，包含vl和vh结构域的单个多肽链，其中所述vl和vh通过接头(linker)相连(参见，例如,bird等人,science242:423-426(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)；和pluckthun，thepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，roseburg和moore编，springer-verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，proteineng.8:725-731，choi等人(2001)，eur.j.immunol.31:94-106，hu等人(1996)，cancerres.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancerimmunol.描述。在一些情况下，scfv的vh与vl之间还可以存在二硫键。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成di-scfv，其指的是两个或两个以上单个scfv串联而形成抗体。在本发明的某些实施方案中，scfv可形成(scfv)2，其指的是两个或两个以上单个scfv并联而形成抗体。149.如本文中所使用的，术语“双抗体”意指，其vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,holligerp.等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)，和poljakr.j.等人,structure2:1121-1123(1994))。150.如本文中所使用的，术语“单域抗体(single-domainantibody,sdab)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。151.上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。152.可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。153.如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(chimericantibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(u.s.p4,816,567tocabillyetal.；morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:68516855(1984))。在某些实施方案中，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链恒定区来自第二抗体(例如人抗体)。154.如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非cdr区(例如，可变区fr和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。典型地，人源化抗体的至少一个或两个但通常所有三个(重和/或轻免疫球蛋白链的)受体cdr被供体cdr替换。提供cdr的免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，供体免疫球蛋白是非人源(例如鼠)抗体，受体框架可以天然存在的人框架，或与其相比具有约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。155.在本技术中，本发明抗体的预期性质包括：(1)特异性结合冠状病毒(例如sars-cov-2和/或sars-cov-1)的s蛋白的rbd；(2)在体外或受试者(例如人)体内中和冠状病毒(例如sars-cov-2和/或sars-cov-1)；(3)预防和/或治疗冠状病毒(例如sars-cov-2和/或sars-cov-1)感染或相关疾病。本发明的抗体具有上述预期性质中的一项或多项。156.本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据免疫动物(例如鼠)所产生的单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的dna可以从来自免疫动物的目标杂交瘤或特异性b细胞中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含人免疫球蛋白序列。157.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定，例如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定。158.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。159.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。160.如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个dna分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地进行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。161.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。162.本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，immunology-asynthesis(2ndedition,e.s.golubandd.r.gren,eds.,sinauerassociates,sunderland,mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a或ala表示。163.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences.editedbygennaroar,19thed.pennsylvania:mackpublishingcompany,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，spga，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。164.如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，冠状病毒感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。165.如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有冠状病毒感染或相关疾病，或者，具有患有上述疾病的风险。166.如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如冠状病毒感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如冠状病毒感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。167.如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。168.发明的有益效果169.本发明提供了能够中和冠状病毒的单克隆抗体，其至少具有以下优势：(1)具有强中和sars-cov-2和sars-cov-1的能力；(2)针对当前世界的sars-cov-2关切突变株保持稳定的中和效果；(3)能够交叉结合sars-cov-1，sars-cov-2和ratg13的rbd，具有广谱性；(4)在动物模型中展现出对sars-cov-2关切突变株b.1.351攻击的保护。本发明的抗体对冠状病毒感染的预防/治疗以及诊断具有重要临床价值。170.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明171.图1显示了小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2、sars-cov和ratg13-cov病毒rbd重组蛋白的elisa反应性。172.图2a显示了biacore亲和力测定中的配体偶联水平计算公式。173.图2b显示了小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2病毒rbd重组蛋白的亲和力测定结果。174.图3显示了sars-cov-2vsvpp和sars-covvsvpp感染bhk21-hace2细胞的荧光检测结果。175.图4显示了鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2在sars-cov-2和sars-covvsvpp假病毒感染模型中的中和活性测定。176.图5显示了鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2在sars-cov-2对sars-cov-2关切突变株(variantsofconcern,voc)的中和活性测定。177.图6显示了鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2对关切突变株beta(b.1.351)株真病毒的中和活性测定。178.图7显示了鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合对接种beta(b.1.351)的仓鼠治疗效果评估。179.图8显示了鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合治疗后仓鼠肺部组织病理情况。180.序列信息181.本发明涉及序列的信息提供于下面的表1中。182.表1：序列的描述183.184.185.186.187.188.189.具体实施方式190.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。191.除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。192.实施例1.基于vsv载体的sars-cov及sars-cov-2的假病毒构建193.1.1表达sars-cov以及sars-cov-2spike基因的质粒构建194.将新型冠状病毒wuhan-hu-1病毒株(genbank:mn908947)的spike蛋白基因c端18个氨基酸截短突变后进行密码子优化克隆至真核表达质粒载体pcag获得pcag-ncovs-del18质粒(wuhan-hu-1-spike基因序列如seqidno:25所示，ncovs-del18基因序列如seqidno:26所示)；将冠状病毒sars-cov的cuhk-w1株(genbank:ay278554.2)的spike蛋白基因c端18个氨基酸截短突变后进行密码子优化克隆至真核表达质粒载体pcag获得pcag-sars-sdel18质粒(sarscovcuhk-w1spike基因序列如seqidno:27所示，sars-sdel18基因序列如seqidno:28所示)。195.1.2基于vsv载体的sars-cov以及sars-cov-2的假病毒包装196.利用vsv反向遗传操作系统，本研究成功构建了重组vsv：vsvdg-egfp-g。vsvdg-egfp-g是一种重组病毒形式，其基因组的g基因被荧光报告基因egfp所取代，可以用来生成包含异源包膜蛋白的rvsv假病毒，这些异源蛋白可以是一些生物防护需求高的病毒蛋白，因为vsvdg-egfp-g假病毒的复制能力被限定于单代次复制，因而可以在bsl-2实验室研究bsl-3/bsl-4实验室要求的病毒如sars-cov以及sars-cov-2等。vero-e6细胞转染pcag-ncovs-del18质粒，24小时后感染病毒vsvdg-egfp-g，感染后一小时细胞上清替换为含anti-vsv-g大鼠血清的5％fbsdmem，用于阻断残余vsvdg-egfp-g的感染，24小时后收获细胞上清，获得基于vsv载体携带sars-cov-2-spike-del18的假病毒，分装冻存于-80℃备用；以相同的包装方式，利用pcag-sars-sdel18质粒获得基于vsv载体携带sars-cov-spike-del18的假病毒，分装冻存于-80℃备用。197.实施例2.同时中和sars-cov和sars-cov-2的单克隆抗体的筛选198.2.1小鼠免疫199.2.1.1免疫原准备：免疫原为实施例1中获得的基于vsv载体携带sars-cov-2-spike-del18以及携带sars-cov-spike-del18的假病毒，免疫剂量为5×106pfu/dose，与弗氏佐剂等体积混合，在注射乳化器中充分混匀，使其形成油包水状乳剂。初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂。200.2.1.2小鼠免疫：使用上述准备好的免疫原对6-8周龄balb/c雌鼠进行双侧腹股沟皮下多点注射免疫，注射体积为300μl/只/次，免疫的程序采用序贯免疫的方式，1、3、5周免疫基于vsv载体携带sars-cov-spike-del18的假病毒，2、4、6周免疫vsv载体携带sars-cov-2-spike-del18的假病毒，每次免疫前采集约200μl眼眶静脉血以备滴度测定，利用假病毒中和的方法检测血清对sars-cov以及sars-cov-2假病毒的中和滴度，第7周进行融合实验。201.2.2抗体筛选202.2.2.1融合前准备：复苏小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)，用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基养至对数生长期，以备融合使用。203.2.2.2融合杂交瘤的制备与筛选204.取小鼠脾脏制成细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，以获得杂交瘤细胞。并制备饲养细胞与杂交瘤细胞共同培养，因为在杂交瘤细胞的培养过程中，大量未融合的的骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞在rpmi1640-hat筛选培养基中死亡，极少数的杂交瘤细胞不易存活，须加入其它细胞方能使之生存，这种加入的细胞为饲养细胞。本实验室使用小鼠腹腔巨噬细胞和小周龄的小鼠胸腺细胞作为饲养细胞。205.2.2.2.1小鼠腹腔巨噬细胞的制备：(i)将一只6周龄的balb/c小鼠引颈处死，浸泡于75％酒精中消毒3-5min，然后放入超净工作台中，使小鼠腹部朝上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，用2个止血钳在剪开处上下方向死开小鼠外皮，使小鼠腹膜露出；(ii)用一个无菌的镊子将腹膜提起，用注射器向小鼠腹腔内注射5mlrpmi1640培养基，然后晃动小鼠使培养基在腹腔内混匀，然后再用注射器小心吸出腹腔内的培养基；(iii)将含巨噬细胞的培养液加至含20％胎牛血清的rpmi1640-hat筛选培养基中与融合细胞混合。206.2.2.2.2小鼠胸腺细胞的制备：(i)将一只3周龄的balb/c小鼠引颈处死，浸泡于75％酒精中消毒3-5min，然后放入超净工作台中，使小鼠腹部朝上，用镊子提起小鼠胸腔处皮肤，剪一小口，用2个止血钳在剪开处上下方向死开小鼠外皮，使小鼠胸部内皮露出；(ii)用另一无菌镊子夹住胸部，用剪子剪开胸腔；(iii)用干净无菌的镊子将胸腔内的乳白色胸腺取出，置于70μm细胞筛网中研磨，得到胸腺饲养细胞，将胸腺细胞加至含20％胎牛血清的rpmi1640-hat筛选培养基中与融合细胞混合。207.2.2.2.3小鼠骨髓瘤细胞的制备：选择生长至对数生长期的sp2/0细胞进行融合。融合前从培养瓶移出骨髓瘤细胞于离心管，用rpmi-1640培养液洗1遍(1500rpm×5min)。用rpmi-1640培养液重悬细胞，并计数。208.2.2.2.4免疫小鼠脾细胞制备：(i)取3.1.3中加强免疫的balb/c小鼠，采集小鼠全血，收集小鼠血清。(ii)然后引颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中消毒3-5min，然后放入超净工作台中，使小鼠右侧卧位；(iii)用无菌镊子和手术剪打开小鼠腹腔，剪出小鼠脾脏，将脾剪成小块状置于70μm细胞筛网中研磨，得到脾脏细胞；(iv)将脾脏细胞置于50ml离心管中，用玻璃移液管(弯管)吸去脂肪组织，然后补加rpmi-1640培养基至30ml，1500rpm离心5min，重复3遍；(v)rpmi-1640培养液重悬脾脏细胞，并计数。209.2.2.2.5peg融合制备杂交瘤：(i)融合前将1mlpeg1450(购自sigma)和40mlrpmi1640培养基温育至37℃备用；(ii)将制备好的骨髓瘤细胞和脾细胞混合于50ml离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，轻轻弹管底使细胞松散成糊状；(iii)将温育好的peg慢慢滴加至细胞中，边加边晃动细胞，然后混匀细胞，1min后用温育好的rpmi1640培养基终止融合；(iv)1500rpm离心5min，将细胞加至含饲养细胞和20％胎牛血清的rpmi1640-hat筛选培养基中，然后加到96孔板中，每孔200μl，放入5％co2培养箱中培养；(v)培养5天后，吸去20％胎牛血清rpmi1640-hat培养基，用含10％胎牛血清的rpmi1640-ht培养基替代，继续培养5天后，吸取细胞上清检测。210.2.2.2.6杂交瘤的筛选：假病毒中和筛选，利用实施例1中基于vsv载体的sars-cov及sars-cov-2的假病毒，取50μl融合细胞培养上清进行假病毒中和实验，挑选出可以同时抑制sars-cov及sars-cov-2的假病毒感染的阳性克隆孔，进行克隆化筛选出单克隆杂交瘤细胞。211.2.3小鼠单抗腹水生产212.取balb/c小鼠5只，经腹腔注射0.5ml液体石蜡油进行致敏，小鼠致敏3天后可以使用。将对数生长期的杂交瘤细胞1500rpm离心5min，弃上清，用pbs重悬至1-2x10^6cells/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞。7天后，小鼠腹部明显胀大，引颈处死小鼠，剖开小鼠腹腔，小心吸出小鼠腹腔内全部腹水。213.2.4单抗腹水的纯化214.将单抗腹水高速离心后取上清，加入等体积饱和硫铵溶液，在冰上沉淀30min后，25000rpm离心10min，沉淀用0.2m十二水合磷酸氢二钠缓冲液溶解起来，然后用proteina亲和层析柱纯化(购自美国ge公司)，获得纯化的小鼠单克隆抗体。最终获得三株抗体10e9(型别igg2a)、30a4-2(型别igg1)、1c5-2(型别igg1)。215.实施例3.单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2的轻重链可变区基因的扩增测序216.杂交瘤rna准备：将培养至对数生长期的10e9、30a4-2和1c5-2杂交瘤细胞吹起来转移至15ml离心管中，1500rpm离心3min收集细胞，重悬于200μl无菌pbs(ph7.45)中，并转移到一新的无rna酶的1.5ml离心管中，加入800μltrizol溶液(invitrogen)，剧烈震荡30s后4℃静置10min。冻存于-80℃冰箱后寄送测序公司进行测序。217.经测序，确定10e9、30a4-2和1c5-2的重链和轻链可变区氨基酸序列。10e9的vh和vl序列分别如seqidno:1和2所示，30a4-2的vh和vl序列分别如seqidno:3和4所示，1c5-2的vh和vl序列分别如seqidno:5和6所示。218.进一步，还使用kabat等人描述的方法(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2的cdr序列。10e9重链可变区和轻链可变区的cdr的氨基酸序列分别如seqidno:7-12所示，30a4-2重链可变区和轻链可变区的cdr的氨基酸序列分别如seqidno:13-18所示，1c5-2重链可变区和轻链可变区的cdr的氨基酸序列分别如seqidno:19-24所示。219.实施例4.单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2、sars-cov-1和ratg13的elisa结合活性220.4.1sars-cov、sars-cov-2和ratg13的rbd蛋白的表达和纯化221.分别参考genebank上已经公布的病毒基因组序列sars-cov-2wuhan-hu-1(genbank:mn908947)，sars-cov(aap13567.1)、ratg13(mn996532.1)，将上述3种冠状病毒的rbd序列构建各自rbd蛋白表达克隆，制备重组蛋白，其中sars-cov-2的rbd重组蛋白命名为sars-cov-2-rbd，sars-cov的rbd重组蛋白命名为sars-cov-rbd，ratg13-cov的rbd重组蛋白命名为ratg13-rbd。222.4.2反应板的制备223.将上述获得的sars-cov-2-rbd，sars-cov-rbd和ratg13-rbd蛋白用ph9.6的50mmcb缓冲液(nahco3/na2co3缓冲液，终浓度为50mm，ph值为9.6)稀释，终浓度为2μg/ml；在96孔酶标板每孔中加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时后再37℃包被2小时；用pbst洗涤液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的ph值为7.4的20mmna2hpo4/nah2po4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。224.4.3小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2的elisa检测225.取实施例3中获得的小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2以含20％新生牛血清的pbs溶液稀释至10μg/ml，然后按3倍或5倍梯度稀释8个梯度，按如下步骤进行elisa检测：226.(1)样品反应：取已分别包被sars-cov-2-rbd，sars-cov-rbd和ratg13-rbd蛋白的酶标板，每孔加入100μl已稀释的样品，置于37℃温箱反应30分钟。227.(2)酶标记物反应：完成样品反应步骤后，将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入100μlhrp标记的羊抗鼠igg(gam)反应液，置于37℃温箱反应30分钟。228.(3)显色反应：完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用pbst洗液(20mmpb7.4，150mmnacl，0.1％tween20)洗涤5遍，每孔加入tmb显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。229.(4)终止反应及读值测量：完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μl，并于酶标仪上检测各孔的od450/630值。230.小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2与sars-cov-2-rbd，sars-cov-rbd和ratg13-rbd的反应性判定：根据反应后的读值进行判定。若检测值/本底值大于5，则判定为阳性。231.(5)结果分析：elisa反应性结果如图1所示，小鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2-rbd、sars-cov-rbd均具有较强的结合活性(图1-a、1-b)；其中10e9和1c5-2对ratg13-rbd也有一定的反应性(图1-c)，具有一定的谱性，相应的反应性ec50汇总如图1-d所示。232.实施例5.鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2的rbd重组蛋白的biacore亲和力测定233.本研究使用表面等离子共振(surfaceplasmonresonance,spr)技术检测实施例2中获得的3株针对sars-cov以及sars-cov-2的单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2与sars-cov-2的rbd抗原的亲和力。本实施例使用的检测方法为捕获法，使用proteing芯片(ge公司)对鼠单克隆抗体进行捕获。234.5.1配体响应值(ru)的确定235.配体偶联水平计算公式如图2a所示，根据鼠单抗分子量及三种rbd分析物的分子量计算可知，配体响应值约1000ru左右。236.3株抗体10e9、30a4-2和1c5-2分别用pbs稀释至合适的浓度，其中30a4-2为50μg/ml，30a4-2为40μg/ml，1c5-2为40μg/ml使其与proteing芯片结合的响应值稳定在1000ru左右。237.5.2亲和力检测238.sars-cov-2rbd抗原分别从1000nm的初始浓度开始依次往下进行2倍稀释(共测试10个稀释梯度，最高测试浓度为1000nm，最低测试浓度为1.6nm)，使用表面等离子共振检测仪biacore8000(ge公司)对抗原抗体亲和力进行检测。结果如图2b所示。239.5.3结果分析240.3株抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2病毒rbd抗原具有较好的亲和力，其中10e9单抗对sars-cov-2的rbd抗原亲和力最高，解离常数kd＝0.99nm，30a4-2和1c5-2对sars-cov-2病毒rbd抗原解离常数为kd＝2.79nm和kd＝4.69nm。说明鼠单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对两种冠状病毒rbd具有较好的交叉结合活性。241.实施例6.单克隆抗体10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov和sars-cov-2的假病毒中和实验242.6.1基于sars-covvsvpp和sars-cov2vsvpp的假病毒中和系统的构建243.为构建携带sars-cov-2spike蛋白的vsv假病毒，对wuhan-hu-1strain毒株的spike基因(序列来源genbank：mn908947)进行密码子优化以在人细胞中表达，并将c末端截短18个氨基酸的sars-cov-2的spike基因克隆到真核表达载体pcag中，获得pcag-ncovsde18。将质粒pcag-ncovsde18转染到vero-e6中。转染48小时后，将vsvdg-egfp-g(addgene，31842)病毒接种到表达sars-cov-2sde18截短蛋白的细胞中，孵育1小时。然后去除上清液中的vsvdg-egfp-g病毒，并加入抗vsv-g大鼠血清以阻断残留的vsvdg-egfp-g的感染。子代病毒将携带sars-cov-2sde18截短蛋白，获得假病毒vsv-sars-cov-2vsvpp。并用相同的方式构建sars-cov-1假病毒sars-covvsvpp。vsvdg-egfp-g感染后24小时后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45-μm，millipore，slhp033rb)以去除细胞碎片，并在-80℃下保存备用。通过梯度稀释的上清感染bhk21-hace2后gfp阳性细胞的数目来确定病毒滴度。通过piggybac转座子系统在bhk21细胞中整合hace2的基因。将含有hace2基因的转座子载体(sbisystembiosciences，pb514b-2)和转座酶质粒共转染到bhk21细胞中，通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选，获得稳定表达hace2的细胞bhk21-hace2。假病毒sars-cov-2vsvpp和sars-covvsvpp感染bhk21-hace2细胞的荧光图如图3a所示。244.结果分析：如图3b所示，sars-cov-2vsvpp和sars-covvsvpp感染bhk21-hace2细胞时，gfp阳性细胞数随着感染稀释倍数的增加而相应减少，在gfp阳性细胞数范围1000-20000内，假病毒感染后，阳性细胞数与感染稀释倍数呈现较好相关性(sars-cov-2vsvpp：r2＝0.98,sars-covvsvpp:r2＝0.98)。根据病毒滴度＝阳性细胞数×稀释倍数/病毒液体积，计算出相应的病毒滴度：sars-cov-2vsvpp＝2.97×107pfu/ml；sars-covvsvpp＝2.73×107pfu/ml。245.6.2对sars-covvsvpp和sars-cov2vsvpp的假病毒中和实验246.将抗体10e9、30a4-2和1c5-2分别稀释到666.7nm作为梯度1，3倍往下梯度稀释，共11个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的vsvpp病毒(moi＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％fbs-dmem稀释。将80μl混合物加入预先铺板的bhk21-hace2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(operaphenix或operettacls，购自perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的gfp阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。利用非线性回归分析计算抗体的ic50。247.结果如图4所示，10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2vsvpp和sars-covvsvpp均有较强的中和活性，其中10e9中和活性更优，对sars-covvsvpp的中和ic50达0.03nm，对sars-covvsvpp中和ic50达0.04nm；单抗30a4-2对sars-cov和sars-cov-2假病毒的中和ic50分别为0.11nm和0.29nm，单抗1c5-2对sars-cov和sars-cov-2假病毒的中和ic50分别为0.34nm和0.37nm。248.6.3对当前世界流行的新型冠状病毒sars-cov-2关切突变株(variantsofconcern,voc)假病毒中和实验249.为检测本专利生产的单克隆抗体对当前世界流行的新型冠状病毒sars-cov-2关切突变株(variantsofconcern,voc)的中和效果，本研究根据实施例6.1.1的假病毒的生产方式，以sars-cov-2关切突变病毒株的spike基因克隆到真核表达载体pcag中，获得相应的质粒，以之替代质粒pcag-ncovsde18，生产出相应的假病毒，包含了d614g(序列来源genbank：mn908947)、alpha(b.1.1.7andqlineages,genbank：mw624725.1)、beta(b.1.351anddescendentlineages,genbank:mz314998.1)、gamma(p.1anddescendentlineages,genbank:mz427312.1)以及delta(b.1.617.2andaylineages,genbank:om444216.1)五种假病毒，将10e9、30a4-2和1c5-2分别稀释到66.67nm作为梯度1，3倍往下梯度稀释，共11个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的vsvpp病毒(moi＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％fbs-dmem稀释。将80μl混合物加入预先铺板的bhk21-hace2细胞中。孵育12小时后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(operaphenix或operettacls，购自perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用columbus图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的gfp阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。利用非线性回归分析计算抗体的ic50。250.检测结果如图5及表2所示，10e9、30a4-2、1c5-2以及三抗体联合，对当前世界流行的新型冠状病毒sars-cov-2关切突变株(variantsofconcern,voc)的具有稳定较强的中和效果，其中和效果并未因为病毒的突变而受到影响，其中和效果相应的ic50汇总于下表。251.表2：10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2关切突变株(variantsofconcern,voc)的中和ic50汇总[0252][0253]实施例7.鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2对新冠关切突变株beta(b.1.351)株真病毒的中和效果[0254]为更进一步评估鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2对sars-cov-2的中和效果，本实施例检测了抗体对新冠关切突变株beta(b.1.351)株真病毒的中和效果，方法如下：[0255]将10e9、30a4-2和1c5-2分别稀释到6666.67nm作为梯度1，5倍往下梯度稀释，共5个梯度，梯度稀释的抗体与新冠关切突变株beta(b.1.351)株真病毒混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％fbs-dmem稀释，将混合物加入预先铺板的vero细胞中，后续利用病毒空斑的形成数表征病毒滴度。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的空斑数量减少(％)，计算抑制率。利用非线性回归分析计算抗体的ic50。[0256]结果分析：结果如图6所示，10e9、30a4-2和1c5-2对新型冠状病毒关切突变株beta(b.1.351)株真病毒均有较强的中和活性，其中10e9中和活性最好，对新型冠状病毒关切突变株beta(b.1.351)株真病毒的中和ic50达30.2nm，单抗30a4-2和1c5-2中和ic50分别为103.4nm和132.9nm。[0257]实施例8.鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合使用在仓鼠模型上对新型冠状病毒攻毒后的治疗保护效果评估[0258]为评估鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2的治疗效果，本实施例使用滴鼻攻毒的方式在仓鼠接种1×104pfu新型冠状病毒关切突变株beta(b.1.351)24小时后，鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合使用，按35mg/kg的剂量腹腔注射1ml抗体，持续观察抗体治疗后仓鼠体征其相关肺部炎症的发生以及呼吸道中的病毒载量和组织病理学特征。[0259]结果如图7所示。如图7a所示，18只仓鼠中，12只仓鼠接种1×104pfu新型冠状病毒关切突变株beta(b.1.351)24小后，其中6只仓鼠接受三抗体联合单针剂注射治疗，治疗剂量为35mg/kg/dose，另外6只仓鼠在接种病毒后不做处理作为未治疗组，余下6只仓鼠不接受任何处理作为空白对照组。从体重的监测数据(图7b)可以看出，空白对照组在不接受任何处理的情况下，仓鼠正常生长，体重随时间逐渐增加，第五天时仓鼠体重平均增加了9.43％，相比之下，未治疗组仓鼠在攻毒后体重随时间持续下降，在攻毒后第五天仓鼠体重平均减少了13.76％，而三抗体联合注射治疗组仓鼠体重随时间变化仅有微弱减轻，在攻毒后第五天仓鼠体重平均仅减少了2.28％，显著低于未治疗组(第二天：p＝0.0022；第三天：p＝0.0043；第四天：p＝0.0022；第五天：p＝0.0043)，与此同时，未治疗组中的所有仓鼠都表现出明显的虚弱、立毛、驼背或腹部呼吸的症状，这在接受抗体治疗组和空白对照组中没有出现；从仓鼠的生存率来看(图7c)，未治疗组中的仓鼠在第4天出现1只死亡、第5天出现2只死亡的情况，5天生存率为50％，而抗体治疗组和空白对照组未出现仓鼠死亡情况，生存率为100％，此结果说明的情况鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合治疗对接种beta(b.1.351)的仓鼠有显著的治疗效果。[0260]更进一步，在攻毒后的第五天，选择牺牲仓鼠，以评估呼吸道中的病毒载量和组织病理学特征，通过荧光定量pcr定量sars-cov-2病毒rna。orf-ab1基因和n基因的检测结果分别如图7d和图7e所示。结果显示，与未治疗组相比，接受抗体治疗的仓鼠肺组织中的病毒rna水平显著降低，下降了2.80个log10(orf-ab1copies/ml)以及1.57个log10(ncopies/ml)；在气管和鼻甲组织中，接受抗体治疗的仓鼠与未治疗组相比表现出更明显的病毒rna减少，在鼻甲组织中治疗组组下降了1.30个log10(orf-ab1copies/ml)以及1.31个log10(ncopies/ml)；气管组织中降低1.90个log10(orf-ab1copies/ml)以及1.83个log10(ncopies/ml)。[0261]10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合治疗后仓鼠肺部组织病理情况如图8所示。肺部大体图片显示未治疗的肺部呈现多灶性弥漫性充血和实变，而接受抗体治疗组肺部组织病变减少(图8a)。组织病理学可以观察到未治疗组出现100％的仓鼠肺实变、肺泡破坏和弥漫性炎症，而接受抗体治疗组仅在有限的肺部区域表现出轻微的炎症，并且在大部分肺部区域的肺炎病理很少。接受抗体治疗组的仓鼠的病理严重程度评分高于未感染仓鼠的病理严重程度评分(平均评分2.83对0.88)，但显著低于未治疗组(平均评分为10.68，图8b，p＝0.0022)。这些结果表明鼠单抗10e9、30a4-2和1c5-2三抗体联合治疗对接种beta(b.1.351)的仓鼠有显著的治疗效果。[0262]尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)包含下述3个互补决定区(cdrs)的重链可变区(vh)：(i)vh cdr1，其由下述序列组成：seq id no:7、seq id no:13或seq id no:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，(ii)vh cdr2，其由下述序列组成：seq id no:8、seq id no:14或seq id no:20，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和(iii)vh cdr3，其由下述序列组成：seq id no:5，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和/或，(b)包含下述3个互补决定区(cdrs)的轻链可变区(vl)：(iv)vl cdr1，其由下述序列组成：seq id no:10、seq id no:16或seq id no:22，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，(v)vl cdr2，其由下述序列组成：seq id no:11、seq id no:17或seq id no:23，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和(vi)vl cdr3，其由下述序列组成：seq id no:12、seq id no:18或seq id no:24，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)如下3个重链cdrs：序列为seq id no:7或其变体的vh cdr1，序列为seq id no:8或其变体的vh cdr2，序列为seq id no:9或其变体的vh cdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seq id no:10或其变体的vl cdr1，序列为seq id no:11或其变体的vl cdr2，序列为seq id no:12或其变体的vl cdr3；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；或，(b)如seq id no:1所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seq id no:2所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seq id no:1或其变体所示的序列的vh和包含如seq id no:2或其变体所示的序列的vl；所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，例如保守置换)。3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)如下3个重链cdrs：序列为seq id no:13或其变体的vh cdr1，序列为seq id no:14
或其变体的vh cdr2，序列为seq id no:15或其变体的vh cdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seq id no:16或其变体的vl cdr1，序列为seq id no:17或其变体的vl cdr2，序列为seq id no:18或其变体的vl cdr3；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；或，(b)如seq id no:3所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seq id no:4所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seq id no:3或其变体所示的序列的vh和包含如seq id no:4或其变体所示的序列的vl；所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，例如保守置换)。4.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)如下3个重链cdrs：序列为seq id no:19或其变体的vh cdr1，序列为seq id no:20或其变体的vh cdr2，序列为seq id no:21或其变体的vh cdr3；和/或，如下3个轻链cdrs：序列为seq id no:22或其变体的vl cdr1，序列为seq id no:23或其变体的vl cdr2，序列为seq id no:24或其变体的vl cdr3；其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加，例如保守置换)；或，(b)如seq id no:5所示的重链可变区(vh)中含有的3个cdr；和/或，如seq id no:6所示的轻链可变区(vl)中含有的3个cdr；优选地，所述vh中含有的3个cdr和/或所述vl中含有的3个cdr由kabat、imgt或chothia编号系统定义；优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：包含如seq id no:5或其变体所示的序列的vh和包含如seq id no:6或其变体所示的序列的vl；所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)，或者具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，例如保守置换)。5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含来源于鼠或人免疫球蛋白的恒定区；优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如igg1、igg2、igg3或igg4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于鼠或人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区是igg重链恒定区，例如igg1、igg2、igg3或igg4重链恒定区。6.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自fab、fab’、(fab’)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdab)；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。8.载体，其包含权利要求7所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸分子或权利要求8所述的载体。10.制备权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。11.组合物，其包含选自权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段以及权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段中的至少两种；优选地，所述组合物包含权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段以及权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述组合物中的各组分分开提供或作为混合的组分提供。12.药物组合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的组合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；优选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如另外的抗病毒剂(例如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、瑞德西韦、地塞米松等)。13.用于中和样品中冠状病毒的方法，其包括，将包含冠状病毒的样品与权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11所述的组合物接触；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株；优选地，所述突变株的s蛋白含有突变，例如氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换；优选地，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合。14.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述的组合物或权利要求12所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中中和冠状病毒、或预防和/或治疗冠状病毒感染或与冠状病毒感染相关的疾病；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株；优选地，所述突变株的s蛋白含有突变，例如一个或几个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换；优选地，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合；优选地，所述受试者是哺乳动物，例如人；优选地，所述抗体或其抗原结合片段、组合物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂，如干扰素、洛匹那韦、利托那韦、瑞德西韦、地塞米松等)联合使用。15.缀合物，其包含权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记；
优选地，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。16.权利要求1-6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求15所述的缀合物在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂用于检测冠状病毒在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了冠状病毒；优选地，所述冠状病毒为β属冠状病毒，例如为sars-cov-2、sars-cov-1和/或ratg13；优选地，所述sars-cov-2包括突变株；优选地，所述突变株的s蛋白含有突变，例如一个或几个(例如1个、2个、3个、4个或5个)氨基酸置换、缺失或添加；优选地，所述突变株的s蛋白包含选自d614g、k417n/t、e484k、n501y、l452r、t478k中的一个或多个氨基酸置换；优选地，所述突变株选自d614g毒株、alpha毒株(如b.1.1.7)、beta毒株(如b.1.351)、gamma毒株(如p.1)、delta毒株(如b.1.617.2)或其任意组合；优选地，所述检测试剂通过免疫学检测(例如酶免疫测定法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法)来检测冠状病毒在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了冠状病毒；优选地，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。

技术总结
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是冠状病毒(Coronavirus)感染的预防和治疗领域。具体地，本发明涉及用于治疗冠状病毒(例如SARS-CoV-2和/或SARS-CoV-1)感染及其相关疾病的抗体，包含所述抗体的组合物(例如，治疗剂和诊断剂)。此外，本发明还涉及所述抗体的用途。途。途。


技术研发人员：张天英 熊华龙 朱雨荷 张金蕾 江尧 颜思平 袁伦志 罗文新 袁权 张军 夏宁邵
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2023.03.01
技术公布日：2023/9/7