一种调节抗体电荷异质性的方法与流程

1.本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种调节抗体电荷异质性的方法。


背景技术：

2.在单克隆抗体生产工艺的开发中，电荷异质性的控制具有较大的挑战性。为了避免电荷异质性导致的药效的损失或者其他副作用，该质量属性需要控制在一定的范围内且保证批次间的一致性和稳定性。
3.下游纯化工艺对电荷异质体的去除能力有限，且往往需以降低产物收率为代价，故一般主要依靠上游工艺开发和优化对其进行调控。细胞株特性、培养工艺参数和培养基组分等因素都可能会影响产物的电荷异质性。
4.细胞株的改变往往对产品的整体开发进度以及申报策略具有重大的影响，培养基组分的筛选或者定向开发对时间和成本都是巨大的挑战，因此对细胞培养工艺进行优化是控制电荷异质性的首选策略。补料批次培养是应用最广泛的动物细胞培养工艺，其中温度、do、ph、培养过程中代谢废物累积以及培养时间等工艺参数均可能对电荷异质性产生影响。目前这些参数对电荷异质性的影响机理尚不完全明确，对不同产品的调节作用也不完全一致，导致难以形成适用性较广的控制策略。
5.因此，开发一种稳定的电荷异质性调节方法具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种电荷异质性的调节方法，采用本发明方法生产抗体，产物主峰比例明显增加，酸性峰比例明显降低，且蛋白产量明显提高。
7.为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
8.本发明提供了一种调节抗体电荷异质性的方法，其在抗体的生产过程中包括以下一种或多种条件：
9.(1)采用连续灌流培养表达抗体的cho细胞，其中培养基置换的速率为0.5-3.5vvd；
10.(2)当cho细胞的密度达到初始密度的2倍以上例如10倍时，每天以0.05-0.1vvd的速率对细胞进行废弃；
11.(3)当细胞密度和活率处于稳态时，培养的温度从36-37℃降低至31-33℃。
12.在一些实施方案中，所述抗体在摇瓶中生产，或者生物反应器中生产。
13.在一些实施方案中，所述抗体在以下任一培养基中培养：
14.a)hycell基础培养基；
15.b)hycell基础培养基和5％的cell boost 7a以及0.5％的cell boost 7b的混合培养基；
16.c)cytiva f3灌流培养基；
17.d)maxa灌流培养基。
18.在一些实施方案中，当所述抗体在摇瓶中生产时，所述方法包括以下条件的一种或多种：
19.i)培养的温度为37℃、125rpm、80％湿度和5％ co2，所述置换的速率为0.05vvd；
20.ii)所述初始密度为10-20
×
106cells/ml；
21.iii)当cho细胞的密度达到(20-50)
×
106cells/ml，优选30
×
106cells/ml时，每天以0.05-0.1vvd的速率对细胞进行废弃；
22.iv)第11天时，培养的温度降至33℃，第14天时培养的温度降至31℃，直至第17天培养结束。
23.在一些实施方案中，当所述抗体在生物反应器中生产时，所述方法包括以下条件的一种或多种：
24.培养基为hycell基础培养基；
25.培养的温度为36.5℃；
26.溶氧水平为20％-60％；
27.ph值为6.8-7.2；
28.搅拌速度为250-300rpm。
29.在一些实施方案中，所述方法包括：
30.第1天开始，置换的速率为0.5vvd；
31.第2天开始，将灌流速率提高至1vvd，连续灌流培养至第5天；
32.第5天开始，将灌流速率提高至1.5vvd，连续灌流培养至第7天；
33.第7天开始，将灌流速率提高至2.5vvd，连续灌流培养至第26天；
34.第26天开始，将灌流速率提高至3.5vvd，连续灌流培养至第36天。
35.在一些实施方案中，所述方法包括：
36.第8天，开始维持细胞密度和活率的稳态；同时降温将反应器温度降低至33℃后继续灌流培养至培养结束。
37.在一些实施方案中，所述方法包括：
38.第12天，开始废弃cho细胞，废弃的速率为0.1vvd。
39.在一些实施方案中，所述方法包括：
40.培养基的置换通过离心或者0.2μm膜过滤来进行。
41.在一些实施方案中，所述抗体为igg1类抗体。
42.在一些具体的实施方案中，所述抗体为奥马珠单抗。
43.在一些具体的实施方案中，所述cho细胞为cho-k1细胞。
44.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
45.本发明所用试剂和原料均市售可得。
46.本发明的积极进步效果在于：
47.本发明提供了一种基于连续灌流培养的调节抗体电荷异质性的方法。采用本发明的方法生产igg1类抗体，抗体的电荷异质性得到明显改善，其主峰和酸性峰可以分别实现至少11.0％和20.2％、最高16.3％和22.6％的调节作用，并且产物表达量也有2.6倍的提升。
附图说明
48.图1a是在摇瓶培养中培养基a对抗体大小异质性的影响。
49.图1b是在摇瓶培养中培养基a对抗体电荷异质性的影响。
50.图1c是在摇瓶培养中培养基b对抗体大小异质性的影响。
51.图1d是在摇瓶培养中培养基b对抗体电荷异质性的影响。
52.图1e是在摇瓶培养中培养基c对抗体大小异质性的影响。
53.图1f是在摇瓶培养中培养基c对抗体电荷异质性的影响。
54.图1g是在摇瓶培养中培养基d对抗体大小异质性的影响。
55.图1h是在摇瓶培养中培养基d对抗体电荷异质性的影响。
56.图2a是生物反应器培养中本发明方法对抗体大小异质性的影响。
57.图2b是生物反应器培养中本发明方法对抗体电荷异质性的影响。
58.图2c是生物反应器培养中本发明方法对活细胞密度的影响。
59.图2d是生物反应器培养中本发明方法对细胞活率的影响。
具体实施方式
60.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。所用耗材或仪器，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
61.实施例1在摇瓶中，使用本发明方法在不同培养基中对cho-k1细胞系表达的奥马珠单抗进行电荷异质性调节
62.1.1细胞培养
63.将重组的cho-k1细胞株复苏于actipro培养基中，经过数次传代扩增细胞，细胞扩增用125-3000ml的摇瓶置于37℃、125rpm、80％湿度和5％co2的sartorius摇床中进行，旋转半径50mm。待细胞密度达到(2.0-3.0)
×
106cells/ml时进行下一步接种。
64.接种前在125ml摇瓶中提前预热4种化学限定培养基，然后通过离心浓缩种子细胞并以13
×
106cells/ml的初始密度接种至4种培养基中。离心条件为(200-300)
×
g，5分钟。培养基a为hycell基础培养基；培养基b为hycell基础培养基和5％的cell boost 7a以及0.5％的cell boost 7b的混合培养基；培养基c为cytiva f3灌流培养基；培养基d为maxa灌流培养基。以初始培养体积25ml在125ml摇瓶中培养。培养条件为：37℃、125rpm、80％湿度和5％ co2。
65.从第1天开始，以1vvd的速率开始置换灌流培养基，直至第17天培养结束。培养基置换通过离心实现，每次离心后分别使用上述新鲜的化学限定培养基重新悬浮细胞，保持培养体积不变，于125ml摇瓶中继续培养。离心条件为(200-300)
×
g，5分钟。
66.培养至第5天，细胞密度达到30
×
106cells/ml时，开始废弃细胞以维持细胞密度和活率的稳定，细胞废弃速率为0.05vvd，直至第17天。
67.第11天时，培养温度降至33℃，第14天时培养温度降至31℃，直至第17天培养结束。
68.本实施例同时设置了一组摇瓶作为对照组，对照组使用hycell基础培养基，采用分批补料方式培养，该培养方式为目前最常用的细胞培养方式。上述经过数次传代扩增的
细胞，以(0.9-1.1)
×
106cells/ml的初始密度接种于hycell基础培养基中，于第2、7、9、11和13天补加3％体积分数的cell boost 7a和0.3％体积分数的cell boost 7b，于第3天和第5天补加5％体积分数的cell boost 7a和0.5％体积分数的cell boost 7b。培养过程中，当培养液葡萄糖水平低于4g/l时，通过补加400g/l葡萄糖溶液将培养液葡萄糖水平补加至(6-8)g/l。培养至第5天时降温至33℃，后继续培养至第14天，结束培养。
69.1.2检测方法与仪器
70.用于电荷异质性和大小异质性分析的上清液样品，首先需经过蛋白a亲和层析一步纯化法进行纯化。分别通过icief(全柱成像毛细管等电聚焦)法和sec-hplc(分子排阻-高效液相色谱)法对样品电荷异质性和大小异质性进行分析。
71.本实施例中，细胞密度和活率由贝克曼的vi-cell细胞计数仪进行检测，葡萄糖采用罗氏的生化分析仪检测。
72.1.3结果
73.图1a-图1h展示了在4种培养中本发明方法对产物电荷异质性和大小异质性的影响。
74.与对照组相比，本发明方法可明显增加产物的主峰比例，同时降低酸性峰比例。
75.在培养基a中，37℃时，产物主峰比例增加19.3％，酸性峰比例降低10.6％；33℃时，主峰比例增加14.4％，酸性峰比例降低15.5％；31℃时，主峰比例增加6.9％，酸性峰比例降低17.9％。
76.在培养基b中，37℃时，产物主峰比例增加16.4％，酸性峰比例降低9.5％；33℃时，主峰比例增加7.9％，酸性峰比例降低14.0％；31℃时，主峰比例降低1.4％，酸性峰比例降低15.5％。
77.在培养基c中，37℃时，产物主峰比例增加17.7％，酸性峰比例降低12.3％；33℃时，主峰比例增加6.1％，酸性峰比例降低16.8％；31℃时，主峰比例降低0.1％，酸性峰比例降低18.5％。
78.在培养基d中，37℃时，产物主峰比例增加13.5％，酸性峰比例降低10.0％；33℃时，主峰比例增加5.4％，酸性峰比例降低16.6％；31℃时，主峰比例增加5.8％，酸性峰比例降低18.4％。使用本发明方法时，酸性峰和主峰均随温度降低而降低，碱性峰随温度降低而升高。
79.由上述结果可见，在培养基a中产物的主峰增加比例更高，因此反应器培养优选的培养基为培养基a。
80.与对照组相比，本发明方法对产物的大小异质性无明显影响，在上述4种培养基中的表现一致。
81.综上，本发明方法对抗体的电荷异质性有明显调节作用，对抗体大小异质性基本没有影响。该调节作用在上述4种培养基中表现一致，表明了本发明方法在不同培养基中的普遍适用性。
82.表1本发明方法不同培养基中对抗体电荷异质性的影响
[0083][0084]
表2本发明方法不同培养基中对抗体大小异质性的影响
[0085][0086]
实施例2在生物反应器中，使用本发明方法对cho-k1细胞系表达的单克隆抗体进行电荷异质性调节
[0087]
2.1细胞培养
[0088]
将重组的cho-k1细胞株复苏于actipro培养基中，经过数次传代扩增细胞，细胞扩增用125-1000ml的摇瓶置于37℃、125rpm、80％湿度和5％co2的sartorius摇床中进行，旋转半径50mm。待细胞密度达到(2.0-3.0)
×
106cells/ml时进行下一步接种。
[0089]
将applikon 3l生物反应器与repligen的0.2μm中控纤维柱连接，于121℃条件下高温灭菌40min。灭菌完成后将反应器和atf组件一起取出，并置于天平1上。同时取出提前配置的新鲜的hycell基础培养基(培养基a)置于天平2上。天平1和天平2的信号将接入applikon 3l生物反应器的控制器，用于调节培养基置换的速率，维持反应器工作体积稳
定。
[0090]
将培养基和反应器无菌连接，开启进液泵，泵入上述新鲜培养基，反应器设定需要的参数，将atf组件连接repligen的控制器，所有参数开启培养过夜。
[0091]
确认培养基过夜培养无异常后，将扩增的细胞以1.0
×
106cells/ml的初始密度接种至反应器中，初始培养体积1.5l。反应器参数的设定为：温度为36.5℃，溶氧水平为20％-60％，ph值为6.8-7.2，搅拌速度为250-300rpm；气体(空气、氧气、二氧化碳)由生物反应器自动控制。
[0092]
从第1天开始，开始交换hycell灌流培养基，灌流速率为0.5vvd，使用进液泵向反应器内泵入新鲜的培养基，同时以相同的vvd使用出液泵将等量的培养液上清泵出反应器。上述进液泵的速率由使用者根据需求设定，出液泵的速率由applikon反应器整合的控制软件根据天平1的重量实时调节。
[0093]
第2天开始，将灌流速率提高至1vvd；
[0094]
第5天开始，将灌流速率提高至1.5vvd；
[0095]
第7天开始，将灌流速率提高至2.5vvd，连续灌流培养至第26天；
[0096]
第26天开始，将灌流速率提高至3.5vvd，连续灌流培养至第36天；
[0097]
第8天开始，将反应器温度降低至33℃，继续灌流培养至第36天。
[0098]
第12天开始，开始废弃细胞，细胞废弃速率为0.1vvd。本实施例同时设置了一个3l反应器作为对照组。对照组反应器组装后，于121℃条件下高温灭菌40min。灭菌完成后将反应器与培养基连接，开启蠕动泵，泵入上述相同的新鲜hycell培养基。反应器设定需要的参数，所有参数开启培养过夜。
[0099]
对照组采用分批补料方式培养，该培养方式为目前最常用的细胞培养方式。上述经过数次传代扩增的细胞，以1.0
×
106cells/ml的初始密度接种至反应器中，初始培养体积1.5l。反应器参数的设定为：温度为36.5℃，溶氧水平为20％-60％，ph值为6.8-7.2，搅拌速度为250-300rpm；气体(空气、氧气、二氧化碳)由生物反应器自动控制。
[0100]
培养至第2、7、9、11和13天补加3％体积分数的cell boost 7a和0.3％体积分数的cell boost 7b，于第3和第5天补加5％体积分数的cell boost 7a和0.5％体积分数的cell boost 7b。培养过程中，当培养液葡萄糖水平低于4g/l时，通过补加400g/l葡萄糖溶液将培养液葡萄糖水平补加至(6-8)g/l。培养至第5天时降温至33℃，后续培养至第16天，结束培养。
[0101]
2.2检测方法与仪器
[0102]
同实施例1的1.2。
[0103]
2.3结果
[0104]
图2a和图2b展示了在生物反应器中本发明方法对产物电荷异质性和大小异质性的影响。
[0105]
与对照组相比，本发明方法可明显增加产物的主峰比例，同时降低酸性峰比例。降温至33℃后，第11天、21天和36天的产物主峰比例分别增加12.3％、11.0％和16.3％，酸性峰比例分别降低22.3％、20.2％和22.6％。
[0106]
降温后培养过程中(第8天-第36天)，产物电荷异质性保持稳定。如图2c和图2d所示，细胞培养周期也明显延长(16天延长至36天)，蛋白日产量明显增加，提升了约2.6倍(见
表5)。
[0107]
与对照组相比，本发明方法对产物的大小异质性无明显影响。
[0108]
本发明方法在生物反应器内对产物电荷异质性和大小异质性的影响与在摇瓶中的表现一致。
[0109]
表3本发明方法反应器中对抗体电荷异质性的影响
[0110][0111]
表4本发明方法反应器中对抗体大小异质性的影响
[0112][0113]
表5本发明方法对细胞培养周期和蛋白产量的影响
[0114][0115]
综上，本发明方法对抗体的电荷异质性有明显调节作用，对抗体大小异质性基本没有影响。结论与实施例1的结论一致，表明了本发明方法在不同培养容器中的普遍适用性及可放大性。另外，本发明方法对延长细胞培养周期，提升蛋白产量也有明显的促进作用。

技术特征：
1.一种调节抗体电荷异质性的方法，其特征在于，其在抗体的生产过程中包括以下一种或多种条件：(1)采用连续灌流培养表达抗体的cho细胞，其中培养基置换的速率为0.5-3.5vvd；(2)当cho细胞的密度达到初始密度的2倍以上例如10倍时，每天以0.05-0.1vvd的速率对细胞进行废弃；(3)当细胞密度和活率处于稳态时，培养的温度从36-37℃降低至31-33℃。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体在摇瓶中生产，或者生物反应器中生产。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗体在以下任一培养基中培养：a)hycell基础培养基；b)hycell基础培养基和5％的cell boost 7a以及0.5％的cell boost 7b的混合培养基；c)cytiva f3灌流培养基；d)maxa灌流培养基。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述抗体在摇瓶中生产时，所述方法包括以下条件的一种或多种：i)培养的温度为37℃、125rpm、80％湿度和5％co2，所述置换的速率为0.05vvd；ii)所述初始密度为10-20
×
106cells/ml；iii)当cho细胞的密度达到(20-50)
×
106cells/ml，优选30
×
106cells/ml时，每天以0.05-0.1vvd的速率对细胞进行废弃；iv)第11天时，培养的温度降至33℃，第14天时培养的温度降至31℃，直至第17天培养结束。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述抗体在生物反应器中生产时，所述方法包括以下条件的一种或多种：培养基为hycell基础培养基；培养的温度为36.5℃；溶氧水平为20％-60％；ph值为6.8-7.2；搅拌速度为250-300rpm。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：第1天开始，置换的速率为0.5vvd；第2天开始，将灌流速率提高至1vvd，连续灌流培养至第5天；第5天开始，将灌流速率提高至1.5vvd，连续灌流培养至第7天；第7天开始，将灌流速率提高至2.5vvd，连续灌流培养至第26天；第26天开始，将灌流速率提高至3.5vvd，连续灌流培养至第36天。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：第8天，开始维持细胞密度和活率的稳态；同时降温将反应器温度降低至33℃后继续灌流培养至培养结束。8.如权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
第12天，开始废弃cho细胞，废弃的速率为0.1vvd。9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：培养基的置换通过离心或者0.2μm膜过滤来进行。10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体为igg1类抗体，优选为奥马珠单抗；和/或，所述cho细胞为cho-k1细胞。

技术总结
本发明公开了一种调节抗体电荷异质性的方法，其在抗体的生产过程中包括以下一种或多种条件：(1)采用连续灌流培养表达抗体的CHO细胞，其中培养基置换的速率为0.5-3.5VVD；(2)当CHO细胞的密度达到初始密度的2倍以上例如10倍时，每天以0.05-0.1VVD的速率对细胞进行废弃；(3)当细胞密度和活率处于稳态时，培养的温度从36-37℃降低至31-33℃。采用本发明的方法生产IgG1类抗体，抗体的电荷异质性得到明显改善，其主峰和酸性峰可以分别实现至少11.0％和20.2％的调节作用，并且产物表达量也有2.6倍的提升。的提升。的提升。


技术研发人员：唐伟 李刚 何茜 秦缘 郑子荣
受保护的技术使用者：鼎康（武汉）生物医药有限公司
技术研发日：2023.01.13
技术公布日：2023/9/7