一种用于预测II期结直肠癌病人复发风险的DCBLD2基因检测试剂盒的制作方法

一种用于预测ii期结直肠癌病人复发风险的dcbld2基因检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种用于预测ii期结直肠癌病人复发风险的dcbld2基因检测试剂盒。


背景技术：

2.结直肠癌(crc)是全球第三大常见癌症。有研究显示，从2005 年～2014年的10年间，我国人均crc相关支出上升了近2倍，且一经确诊就为晚期的crc患者比例有所增加。来自中国国家癌症中心登记处的最新数据报告称，2015年新诊断的crc病例高达388,000例，使crc也成为了中国第三大常见癌症。我国大约一半的crc患者一经确诊即为晚期(iii期、iv期)crc；早期crc的比例(i期＜20％)低于推行crc筛查计划的国家。近年来，早期诊断技术的发展，和综合性治疗手段的应用，使结直肠癌的生存率较过去几十年明显升高，但是由于患者、肿瘤特征、宿主应答因素及治疗策略(药物，方案，手术方法和消融治疗)的差异，结肠癌患者存在一定的复发情况，也有部分患者肿瘤发生转移。肿瘤的复发和转移，将严重影响结直肠癌患者的生活质量和生存时间，也为临床工作带来很大的挑战。如果能在术后能有效的预测出患者的复发风险，则对患者的用药与治疗进行干预和指导，则能使结直肠癌的复发和死亡率显著降低，也可以对结直肠癌个性化治疗奠定基础。因此我们需要一种有效的方法能够较为准确地预测结直肠癌患者的复发风险并给予相应的治疗。
3.dcbld2基因是大肠癌组织中一种与膜相关的低丰度蛋白的基因，正常组织相比，从癌组织中分离到的dcbld2表达的蛋白质是上调或下调的，因此可能在癌症的发展中起重要作用
4.结直肠癌的复发风险评估系统是基于rt-qpcr的方法通过精确计算来检测肿瘤组织中与肿瘤相关的目的基因表达，即结直肠癌dcbld2 基因检测，可用于有效预测结直肠癌ii期患者的复发风险。
5.dcbld2基因检测需要从石蜡包埋切片中提取rna，逆转录成 cdna，再通过基因扩增技术准确的对dcbld2基因进行检测。
6.目前dcbld2基因检测的试剂盒一般采用taqman荧光pcr法、 sybr green法。taqman荧光pcr法，需要设计引物和探针，简单的 taqman法只需设计一对引物和一条探针即可，而多重荧光pcr需要设计多对引物和探针，并且要保证多重pcr的各个引物之间不相互干扰以及各个探针之间不相互干扰，这就对引物和探针的要求比较高，设计难度大、实验成本高。此外，多重pcr对pcr的缓冲液和qpcr仪器都有一定的要求。而sybr green法只需设计一对引物，在反应时需要加入sybr green荧光染料即可。最大优点是通用性强，适用于所有的荧光定量pcr反应。并且通过对pcr产物的熔解曲线进行分析，可以使非特异性扩增的问题得以解决，从而保证荧光信号的特异性。因此，我们需要找到一种特异性强、灵敏度高，操作简便，数据准确的dcbld2 基因检测试剂盒和方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于为了克服现有技术中存在的特异性灵敏度欠佳或操作复杂、实验成本高的缺陷，提供一种预测ii期结直肠癌病人复发风险的结直肠癌dcbld2基因检测试剂盒及其检测方法。
8.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
9.一种用于预测ii期结直肠癌病人复发风险的dcbld2基因检测试剂盒，所述试剂盒中包含1对dcbld2基因引物，基因引物序列如下：
10.dcbld2：
11.f：5
‘‑
ataatggaattggagtcagcag-3’(seq id no.1)
12.r：5
‘‑
ttccactcatgaacagcaatg-3’(seq id no.2)
13.优选的，所述试剂盒包括结直肠癌dcbld2基因引物预混液。
14.优选的，所述试剂盒内dcbld2基因引物的浓度稀释到1-500μm。
15.优选的，所述引预混液装入qpcr反应管中。
16.优选的，所述试剂盒中包括sybr green溶液；所述sybr green溶液包括含抗体介导热启动itaq dna聚合酶、dntp、mgcl2、 green i染料、强化剂、稳定剂和惰性参比染料混合物，通用的实时荧光定量pcr仪都可以兼容。
17.本发明的有益效果是：
18.1.本试剂盒采用的是sybr green法，sybr green法只需设计一对引物，在反应时需要加入sybr green荧光染即可。最大优点是通用性强，适用于所有的荧光定量pcr反应。并且通过对pcr产物的熔解曲线进行分析，可以使非特异性扩增的问题得以解决，从而保证荧光信号的特异性。
19.2.由于石蜡包埋样本的rna有部分是降解的，所以本试剂盒中 dcbld2基因设计了1对引物，引物段大小都小于200bp，这就提高了降解rna反转录后qpcr的扩增效率；
20.3.本试剂盒中基因的1组引物放在一个反应管中，在qpcr扩增过程中只需使用一种缓冲液，这就简化了实验操作；在扩增结束后每个基因都能在qpcr上看到1条扩增曲线，得到清晰精确的ct值，使计算结果更精确可信；
21.4.本试剂盒所涉及的引物，其退火温度都在56℃左右，这就可以使 9种基因使用同一程序进行扩增；通过添加溶解曲线，就能直接观察到pcr结果；
22.5.本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测都适用，单样品或多样品，都能使用本试剂盒，检测结果快速准确。
附图说明
23.图1：检测样品a的dcbld2基因qpcr扩增曲线图；
24.图2：检测样品a的dcbld2基因的ct值及根据模型计算得出的复发风险分数；
25.图3：检测样品a的dcbld2基因的ct值及根据模型计算得出的复发风险分数的统计学数字。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
27.一、石蜡样本rna的提取。
28.将结直肠癌样本的rna提取后就得到待测样本a；使用qiagen试剂盒。
29.1.把结直肠癌样本放入1.5ml离心管中，加入300-500μl的pkd和 10-30μl蛋白酶k，颠倒混匀，然后放置于50-60℃，1000-2000rpm的震荡金属浴内，孵育2h；
30.2.将1.5ml离心管震荡金属浴内取下，调整震荡金属浴温度为 70-90℃，待加热到该温度时再将1.5ml离心管放入，孵育15-20min；
31.3.将1.5ml离心管放入-20℃冰箱内，放置3-5min；
32.4.取出后，放入12700rpm的离心机内，离心15-20min；
33.5.准备2ml的离心管，将离心后1.5ml离心管内的上清液转入到2ml 离心管内；
34.6.然后分别加入dnase booster溶液20-50μl和dnase i stock溶液5-20μl，室温放置15min；
35.7.加入300-400μl的rbc和800-1200μl的无水乙醇，颠倒混匀；
36.8.将上述混合液每次700-800μl转入到rneasy minelute spin柱子内，然后10000rpm离心30s，丢弃离心下来的液体。直到混合液全部转入到rneasy minelute spin柱子为止；
37.9.在rneasy minelute spin柱子内加入400-600μl的rpe溶液，然后10000rpm离心30s，丢弃离心下来的液体，重复1遍；
38.10.将rneasy minelute spin柱子放到干净的收集管内， 12000rpm以上离心5min；
39.11.将rneasy minelute spin柱子放到新的1.5ml离心管内，加入适量的无rna酶的水，然后12000rpm以上离心1min，得到洗脱的rna 溶液；
40.12.检测rna溶液的浓度，260/280和260/230；
41.二、将提取的rna反转录成cdna。
42.1.dnase master混合液制备：按照dnase：dnase溶液＝1：3的比例制备成dnase master混合液，将2μl dnase master混合液与14μl rna 模板混合(rna总量1pg-1μl)
43.2.振荡混匀，简短离心，按如下程序反应：
44.步骤温度(℃)时间dna消化255mindna酶失活755min存储4室温
45.3.cdna合成混合液配置：
46.[0047][0048]
4.逆转录反应程序：
[0049]
步骤温度时间启动255逆转录4640逆转录失活951存储4-[0050]
三、引物预混液的配置。
[0051]
根据dcbld2基因的mrna序列设计其引物序列，目的片段都小于100bp，具体序列如下：
[0052]
dcbld2：
[0053]
f：5
‘‑
ataatggaattggagtcagcag-3’(seq id no.1)
[0054]
r：5
‘‑
ttccactcatgaacagcaatg-3’(seq id no.2)
[0055]
将dcbld2基因的引物的浓度稀释到1-500μm；
[0056]
将dcbld2基因的1对引物f和r进行1：1混合，混匀后取出1u1 加入到1个qpcr反应管的底部，盖上盖子，离心后放入铝箔塑封袋，待用时取出即可，其他的放在-20℃保存。
[0057]
四、反应液的配制。
[0058]
反应体系(10μl)
[0059][0060][0061]
1将sybr green和引物预混液直接从试剂盒中取出，并离心；
[0062]
2取出反转录后的待测样本cdna；
[0063]
3计算需要检测的反应数，按反应体系取出相应量的sybr green、 ddh2o和待测样本cdna，然后将其充分混匀，离心，每个反应管分装 9u1；
[0064]
4将反应管的盖子盖上，一定要将盖子盖紧(防止pcr过程中蒸发)，然后离心数秒；
[0065]
5打开荧光定量pcr仪，将加好的反应管放置到荧光定量pcr仪上。
[0066]
五、扩增程序。
[0067][0068]
六、qpcr检测结果。
[0069]
通过荧光定量pcr扩增后获得的扩增曲线和所得的ct值来计算风险评估值。
[0070]
1.待测样本a的扩增曲线和ct值(如图1、图2)
[0071]
2.图2的统计学数字(如图3)
[0072]
如图所示，待测样本a的dcbld2基因的引物都有扩增曲线和ct 值。通过数据建模显示，此dcbld2基因是与疾病进展时间有较强关联的基因，对预测ii期结直肠癌病人复发风险的效果比较好。
[0073]
以上实施例的先后顺序仅为便于描述，不代表实施例的优劣。
[0074]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种用于预测ii期结直肠癌病人复发风险的dcbld2基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含1对dcbld2基因引物，基因引物序列如下：dcbld2：f：5
‘‑
ataatggaattggagtcagcag-3’(seq id no.1)r：5
‘‑
ttccactcatgaacagcaatg-3’(seq id no.2) 。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括结直肠癌dcbld2基因引物预混液。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内dcbld2基因引物的浓度稀释到1-500μm。4.根据权利要求1至3中任意一项中所述的试剂盒，其特征在于，所述引预混液装入qpcr反应管中。5.据权利要求1至3中任意一项中所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括sybr green溶液；所述sybr green溶液包括含抗体介导热启动itaq dna聚合酶、dntp、mgcl2、green i染料、强化剂、稳定剂和惰性参比染料混合物，通用的实时荧光定量pcr仪都可以兼容。

技术总结
本发明公开了一种用于预测II期结直肠癌病人复发风险的结直肠癌DCBLD2基因检测试剂盒，试剂盒包括检测DCBLD2基因的引物，试剂盒中设计了DCBLD2的引物，将DCBLD2基因的引物放在一个反应管中，在QPCR上扩增时使用同一种缓冲液和程序，操作简便、节省检测时间并得到清晰准确的结果；本试剂盒适用广泛，对于科研和临床检测适用广泛，检测结果快速准确。检测结果快速准确。检测结果快速准确。


技术研发人员：陈利民 张雨时 史嘉敏 孙西予
受保护的技术使用者：天津云检医疗器械有限公司
技术研发日：2022.02.28
技术公布日：2023/9/7