多糖蛋白缀合物的制作方法

1.本发明属于疫苗领域，具体涉及荚膜多糖蛋白缀合物及其应用。


背景技术：

2.肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)是一种具有荚膜包被的革兰氏阴性菌(g-)。根据荚膜多糖结构的不同，肺炎克雷伯氏菌可以分成至少77个血清型，荚膜多糖也被称为k抗原或k型。肺炎克雷伯菌主要定植于消化道、呼吸道，当机体抵抗力降低时可引起肺部感染、泌尿道感染、甚至血流感染，也是导致院内呼吸道感染最常见的细菌之一。荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子，是治疗或预防肺炎克雷伯菌感染的重要保护性抗原。
3.肺炎克雷伯菌引发的感染目前已成为全球严重的公共卫生问题之一。据统计，肺炎克雷伯菌感染的病死率极高，肺炎克雷伯菌引起的血流感染的病死率为20％至30％，而肺炎克雷伯菌血症合并肺炎的病死率可达50％以上。肺炎克雷伯菌的治疗主要依靠抗生素，但近年来由于各种抗菌药物的广泛使用，产超广谱β-内酰胺酶以及碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌对几乎所有可用的β-内酰胺类(包括碳青霉烯类)药物都具有抗性。在过去10年中，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯氏菌(crkp)比率在世界范围内急剧增加。因此，开发一种新型治疗或预防药物或生物制品，对耐药性肺炎克雷伯菌的防控及临床应用具有重要的意义。
4.肺炎克雷伯菌的荚膜多糖是胸腺非依赖性抗原，免疫原性低，没有免疫记忆和免疫加强作用，特别是对于免疫力弱的人群免疫效果更低，因而不能起到免疫保护作用。由于肺炎克雷伯菌荚膜多糖分子量大、结构复杂不均一以及多糖-蛋白化学偶联反应的复杂性，载体蛋白的选择、多糖-蛋白的偶联方法将直接影响结合物的免疫效果及其保护作用。本领域仍需提高肺炎克雷伯菌荚膜多糖免疫原性和保护力的新方法。


技术实现要素：

5.为了解决肺炎克雷伯菌荚膜多糖免疫原性低和保护力差问题，以及肺炎克雷伯菌荚膜多糖与载体蛋白难结合及免疫原性低问题，本发明提供了一种保护哺乳动物不受肺炎克雷伯菌感染的免疫原性组合物。
6.本发明第一方面提供一种免疫原性组合物，含有式(i)和/或式(ii)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖和载剂：
7.[
→
4)-α-d-glca-(1
→
3)-α-d-manp-(1
→
3)-β-d-glcp-(1
→
4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1
→
2)]-[α-l-rhap-(1
→
3)]-α-d-manp-(1
→
]m[0008]
(i)，
[0009]
[
→
3)-β-d-galp-(1
→
4)-[β-l-rhap-(1
→
4)-β-d-glca-(1
→
3)]-α-l-rhap-(1
→
]n[0010]
(ii)。
[0011]
在一个或多个实施方案中，所述多糖的平均分子量为50-800kd，优选 100-700kd，更优选150-650kd。
[0012]
在一个或多个实施方案中，m为50-800的数字，优选100-700，更优选 150-650；n为80-1200的数字，优选160-1100，更优选250-1000。
[0013]
在一个或多个实施方案中，所述载剂选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种。
[0014]
在一个或多个实施方案中，所述免疫原性组合物还含有佐剂。
[0015]
在一个或多个实施方案中，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂a、qs21、cpg、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。
[0016]
本发明还提供一种具有免疫原性的多糖蛋白缀合物，含有式(i)和/或式 (ii)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖以及与其缀合的载体蛋白，
[0017]
[
→
4)-α-d-glca-(1
→
3)-α-d-manp-(1
→
3)-β-d-glcp-(1
→
4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1
→
2)]-[α-l-rhap-(1
→
3)]-α-d-manp-(1
→
]m[0018]
(i)，
[0019]
[
→
3)-β-d-galp-(1
→
4)-[β-l-rhap-(1
→
4)-β-d-glca-(1
→
3)]-α-l-rhap-(1
→
]n[0020]
(ii)。
[0021]
在一个或多个实施方案中，所述多糖的平均分子量为50-800kd，优选 100-700kd，更优选150-650kd。
[0022]
在一个或多个实施方案中，m为50-800的数字，优选100-700，更优选 150-650；n为80-1200的数字，优选160-1100，更优选250-1000。
[0023]
在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白选自crm197、tent、或tthc。
[0024]
在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白具有seq id no:1-3中任一项所述序列，或与其具有至少70％、至少80％、至少90％序列相同性的变体。
[0025]
在一个或多个实施方案中，所述载体蛋白与多糖共价连接。
[0026]
在一个或多个实施方案中，所述多糖与载体蛋白的重量比为0.2-3.0，例如 0.5-2.0。
[0027]
本发明还提供制备本文任一实施方案所述的多糖蛋白缀合物的方法，包括步骤：
[0028]
(1)获得分子量为50-800kd的克雷伯荚膜多糖，
[0029]
(2)通过氧化使所述多糖活化，
[0030]
(3)将活化的多糖与载体蛋白在氰基硼氢化钠存在的条件下孵育，获得多糖蛋白缀合物。
[0031]
在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：使用冰醋酸或盐酸或高压匀质处理克雷伯荚膜多糖使其分子量降低至约50-800kd范围内。
[0032]
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：使用高碘酸钠处理步骤(1) 获得的多糖，并分离活化的多糖，例如通过超滤。优选地，高碘酸钠与所述多糖的当量比为0.1-10、优选0.1-5、更优选为0.1-2。
[0033]
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中活化的多糖与载体蛋白的重量比为0.5-2.0。优选地，步骤(3)还包括分离多糖蛋白缀合物的过程，例如超滤或层析。在一个或多个实施方案中，氰基硼氢化钠的浓度为10-200mm，优选 50-150mm，更优选约100mm。在一个或多个实施方案中，多糖与载体蛋白孵育至少2小时，优选至少12小时，更优选16-48小时。
[0034]
本发明还提供一种免疫原性组合物，其包含本文任一实施方案所述的多糖蛋白缀合物以及佐剂。
[0035]
在一个或多个实施方案中，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂a、qs21、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。
[0036]
在一个或多个实施方案中，所述免疫原性组合物还含有载剂。所述载剂优选选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种。
[0037]
本发明还提供一种导致被动免疫的免疫组合物，包括来自肺炎克雷伯菌的杀菌抗体，所述抗体是由本文任一实施方案所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物而获得。在一个或多个实施方案中，所述杀菌抗体存在于血清、γ球蛋白部分或纯化的抗体制剂中。
[0038]
本发明还提供一种疫苗，其含有本文任一实施方案所述的免疫原性组合物和药学上可接受的辅料。
[0039]
本发明还提供本文任一实施方案所述的多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物在制备用于提供对抗肺炎克雷伯菌感染的保护的药物中的用途。
[0040]
本发明还提供一种免疫哺乳动物对抗肺炎克雷伯菌感染的方法，该方法包括给予个体致免疫量的本文任一实施方案所述的免疫原性组合物或多糖蛋白缀合物。在一个或多个实施方案中，所述哺乳动物是小鼠、大兔或人。
[0041]
本发明优点：
[0042]
(1)提供一种免疫途径解决肺炎克雷伯菌感染及多重耐药性问题
[0043]
(2)提供一种免疫原可诱导特异性抗肺炎克雷伯菌表面多糖抗体，从而起到预防或治疗作用，
[0044]
(3)提供一种免疫缀合物，其中使用的载体蛋白可以有效地提高克雷伯荚膜多糖的免疫原性，诱导针对肺炎克雷伯菌荚膜多糖特异性抗体
[0045]
(4)提供一种方法可以将肺炎克雷伯菌荚膜多糖有效地偶联到载体蛋白上，从而使得偶联物具有良好的免疫原性，可诱导良好特异性抗体。
[0046]
(5)本发明提供一种方法将肺炎克雷伯菌荚膜多糖分子量控制在 50kd～800kd之间，制备得到的多糖蛋白缀合物，其免疫原性较高、保护力好。
[0047]
(6)本发明制备的肺炎克雷伯菌荚膜多糖缀合物可预防相应的肺炎克雷伯菌的感染。
[0048]
(7)本发明肺炎克雷伯菌荚膜多糖-蛋白缀合物制备的免疫抗血清或特异性多糖抗体，可以治疗肺炎克雷伯菌的感染。
附图说明
[0049]
图1：k47多糖经降解处理后不同分子量图谱。
[0050]
图2：不同分子量k47多糖制备的k47-tthc缀合物免疫原性。
[0051]
图3：k47-crm197缀合物小鼠免疫血清滴度。
[0052]
图4：k47-tthc缀合物大白兔免疫血清滴度。
[0053]
图5：k47-crm197缀合物大白兔免疫血清滴度。
[0054]
图6：k47-tthc缀合物免疫血清对hvkp4菌株的杀菌曲线。
[0055]
图7：k47-tthc缀合物免疫血清对2226菌株的杀菌曲线。
[0056]
图8：k47-tthc和k47-crm197结合疫苗对hvkp4菌株的保护力实验 (生存曲线)。
[0057]
图9：k47-tthc和k47-crm197结合疫苗对hvkp4菌株的保护力实验 (小鼠体重变化)。
[0058]
图10：k64多糖经降解处理后不同分子量图谱。
[0059]
图11：不同分子量k64多糖制备缀合物的免疫原性比较。
[0060]
图12：k64-tent缀合物小鼠免疫血清滴度。
[0061]
图13：k64-crm197缀合物大白兔免疫血清滴度。
[0062]
图14：k64-tthc缀合物大白兔免疫血清滴度。
[0063]
图15：k64-crm197缀合物免疫血清对y8菌株的杀菌曲线。
[0064]
图16：k64-tthc缀合物免疫血清对y8菌株的杀菌曲线。
[0065]
图17：k64-crm197缀合物免疫血清对2410菌株的杀菌曲线。
[0066]
图18：k64-tthc缀合物免疫血清对2410菌株的杀菌曲线。
[0067]
图19：k64-tthc缀合物兔抗血清的对y8菌株的保护力。
[0068]
图20：k64-tthc缀合物对y8菌株的保护力。
具体实施方式
[0069]
本发明提供一种新型的肺炎克雷伯菌荚膜多糖-蛋白缀合物。缀合物的制备是通过对纯化提取的肺炎克雷伯菌外膜多糖经过处理得到的多糖片段通过化学偶联方式连接到载体蛋白上。该缀合物能有效诱导肺炎克雷伯菌k64或 k47血清型多糖的免疫原性，对克雷伯菌的感染有较好的保护作用，对预防肺炎克雷伯菌引起的感染有重要作用，对新一代肺炎克雷伯菌的疫苗研制有重要价值。
[0070]
本发明首先提供一种保护哺乳动物不受肺炎克雷伯菌感染的免疫原性组合物。该免疫原性组合物含有致免疫量的分离的肺炎克雷伯菌荚膜多糖。所述多糖具有下列化学结构：
[0071]
k64型：
[0072]
[
→
4)-α-d-glca-(1
→
3)-α-d-manp-(1
→
3)-β-d-glcp-(1
→
4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1
→
2)]-[α-l-rhap-(1
→
3)]-α-d-manp-(1
→
]m[0073](i)[0074]
分子量为1040.9，多糖末端可以是单元结构中主链上的任一个糖，即葡萄糖或甘露糖，包括glca、manp、glcp。
[0075]
或者，k64型多糖可以表示为
[0076]
[0077][0078]
k47型：
[0079]
[
→
3)-β-d-galp-(1
→
4)-[β-l-rhap-(1
→
4)-β-d-glca-(1
→
3)]-α-l-rhap-(1
→
]n[0080]
(ii)
[0081]
分子量为630.5，多糖末端可以是单元结构中主链上的任一个糖，即半乳糖或鼠李糖，包括glap、rhap。
[0082]
或者，k47型多糖可以表示为
[0083][0084]
此处所用的多糖一词是指包括任何糖类多聚物，包括二糖、寡糖等。产生上述多糖结构的肺炎克雷伯菌分离自患者，并被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期：20211217，分类命名：klebsiellapneumoniae，保藏地址：中国(k64型多糖源自肺炎克雷伯菌2410株的保藏号为gdmcc no：62131，k47型多糖源自肺炎克雷伯菌2226株的保藏号为gdmcc no：62132)。多糖应具有合适大小以诱导个体的免疫原应答。例如，适用于本文多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物的上述式(i)或式(ii)所示多糖的平均分子量是30、50、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800kd，或上述任意两个数值之间的范围。更优选的式(i)或式(ii)多糖平均分子量是约为 30-800kd、较佳为100-700kd、更佳为150-650kd。在一些实施方案中，适用于本文多糖蛋白缀合物或免疫原性组合
物的肺炎克雷伯菌荚膜多糖的平均分子量为30-100kd、100-200kd、300-500kd、或600-700kd。
[0085]
具体的，在式(i)的实施方案中，式(i)多糖的平均分子量选自以下的一种或多种：600-650kd、350-480kd、130-180kd；优选选自以下的一种或多种：600-650kd、430-480kd、350-400kd、130-180kd。在优选的实施方案中，式(i)多糖的平均分子量为约635kd、约450kd、约362.2kd、约149.3 kd。
[0086]
在式(i)的实施方案中，m为50-800的数字，优选100-700，更优选150-650。在一个或多个实施方案中，m为选自以下的一个或多个数字：570-625、330-460、 120-170；优选地，m为选自以下的一个或多个数字：570-625、410-460、330-380、 120-170。
[0087]
具体的，在式(ii)的实施方案中，式(ii)多糖的平均分子量选自以下的一种或多种：600-650kd、150-200kd、30-80kd。在优选的实施方案中，式(ii)多糖的平均分子量为约635kd、约164kd、约51kd。
[0088]
在式(ii)的实施方案中，n为80-1200的数字，优选160-1100，更优选 250-1000。在一个或多个实施方案中，n为选自以下的一个或多个数字： 950-1030、230-320、45-130。
[0089]
存在于免疫原性组合物中的肺炎克雷伯菌荚膜多糖可以是游离多糖的形式，或作为缀合物的一个组分，在缀合物中多糖与蛋白质共价相连。天然或重组细菌蛋白如破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、或crm197都是可用作缀合物的适宜蛋白质的实例。除了多糖或多糖蛋白缀合物之外，免疫原性组合物还可以包含载剂，例如盐水、林格氏溶液或磷酸盐缓冲盐水。
[0090]
在本发明优选的实施方案中，肺炎克雷伯菌荚膜多糖与蛋白质共价相连形成缀合物。因而，个体可接受的、并能诱导免疫细胞(例如t-细胞)依赖性应答的任何蛋白质或其片段都适宜与肺炎克雷伯菌荚膜多糖缀合。基本上任何蛋白质都能作为缀合蛋白。特别是所选择的蛋白质必须具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合。优选蛋白质是任何天然或重组细菌蛋白，并且其本身是诱导年轻和成年哺乳动物中t-细胞依赖性应答的免疫原。这样的蛋白质的例子包括，但不限制于，破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素和crm197。其它缀合蛋白的候选物包括假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。
[0091]
肺炎克雷伯菌荚膜多糖与之缀合的蛋白质(即载体蛋白)可以是天然毒素或去毒后的毒素(即类毒素)，例如tt、dt。另外，还可以使用蛋白毒素的非毒性突变形式。优选这样的突变保留了天然毒素的表位。这些突变后的毒素被称作“交叉反应物质”或crm。crm197载体蛋白是白喉杆菌素(dt)的无毒变异体，该蛋白没有毒性，但保留了白喉毒素的免疫原性。crm17比活性白喉毒素有一个氨基酸不同并且与之在免疫学上不可区分，crm17是流感嗜血杆菌缀合疫苗的一个组分，在公开的文章和专利中可获得其发酵和纯化方法 (us5614382)。还可以用这些蛋白质的片段与肺炎克雷伯菌荚膜多糖缀合，其条件是这些片段应足够长，即优选至少10个氨基酸以确定t-细胞表位。
[0092]
破伤风类毒素蛋白(tent)及其变异体(tthc)在公开文献中有很多报道。tthc是tent的片段蛋白，没有毒性，但保留了tent蛋白的免疫原性。 tthc可以通过重组表达纯化得到(immunobiology,vol.216,issue 4，2011,p 485-490)。
[0093]
在优选的实施方案中，本发明的缀合物分子含有一个蛋白质核心，肺炎克雷伯菌
biochemistryand biophysics 163,426-428(1974))。
[0100]
本文中，制备多糖蛋白缀合物的方法包括步骤：获得分子量为50-800kd 的克雷伯荚膜多糖；活化多糖；将活化的多糖与缓冲液(例如氰基硼氢化钠溶液)中的蛋白质合并，从而获得多糖蛋白缀合物。然后从缓冲液中分离多糖蛋白缀合物。
[0101]
本文中，k64型多糖源自肺炎克雷伯菌2410株，平均分子量2081kd； k47型多糖源自肺炎克雷伯菌2226株，平均分子量2432.5kd。发明人发现，只有分子量在50-800kd之间的克雷伯荚膜多糖才能与载体蛋白形成有效的缀合物用于免疫原性组合物。优选地，适用于本发明的克雷伯荚膜多糖的分子量为50-100kd、100-200kd或600-700kd。
[0102]
可采用本领域周知的方法从肺炎克雷伯菌中获得荚膜多糖。通常包括：将细菌灭活后经过滤(例如微滤或超滤)获得粗糖液，之后加入多糖沉淀剂(例如乙醇、ctab)并纯化(例如沉淀、解离、离心、超滤、层析)获得精制多糖。对所得多糖进行质量分析的方法本领域已知，例如通过核磁共振。
[0103]
然后，可使用化学或物理方法处理克雷伯荚膜多糖以降低分子量。示例性地，可使用冰醋酸(例如至少0.1m)或盐酸或高压匀质(例如压力至少800bar) 处理克雷伯荚膜多糖使其分子量降低至约50-800kd范围内。在一些实施方案中，还可进一步使用层析等方法将50-100kd、100-200kd和600-700kd的多糖分别纯化。
[0104]
具有免疫原型的多糖在与蛋白缀合前通常需要活化。常用的多糖活化方法有溴化氰法(us6375846b1)、1-氰基-4-二甲氨基砒啶四氟硼酸酯(cdap) (ep0720485)、高碘酸氧化法(us4711779)。活化的多糖可经过超滤与其他杂质分离。
[0105]
例如，用高碘酸钠或其等同物的选择性氧化反应来氧化先前糖部分的羟基而形成醛基。这形成了活化的肺炎克雷伯菌荚膜多糖，其现在能与选择的蛋白质载体共价相连。例如在室温，用约1ml约20mm的高碘酸钠溶液适宜地氧化约10mg的多糖约10-15分钟。反应时间可随其它数量的高碘酸盐而变化以得到同等的氧化。糖的还原和开环使得还原糖的邻位羟基活化成醛基。然后在氰基硼氢化物离子或另一种还原剂的存在下，通过将载体蛋白的氨基与肺炎克雷伯菌荚膜多糖的醛基偶联使活化的肺炎克雷伯菌荚膜多糖与所选择的缀合蛋白缀合。得自还原性氨基化过程的肺炎克雷伯菌荚膜多糖-蛋白缀合物优选能溶于水溶液。这使本发明的肺炎克雷伯菌荚膜多糖-蛋白缀合物成为用作疫苗的优选候选物。
[0106]
将活化的多糖与载体蛋白孵育，获得多糖蛋白缀合物。孵育的条件可根据多糖的分子量和具体蛋白进行调整。例如，孵育的缓冲液可以是氰基硼氢化钠溶液；孵育温度可以是室温，孵育时间例如至少12小时。优选地，步骤(3) 还包括分离多糖蛋白缀合物的过程，例如超滤或层析。
[0107]
本发明提供可用于增加具有预防和诊断目的用途的抗体的免疫原性组合物。本发明另一个目的是提供一种通过给予致免疫量的克雷伯荚膜多糖使哺乳动物对肺炎克雷伯菌免疫的方法。本文所述多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物的用途，用于制备用于提供对抗肺炎克雷伯菌感染的保护的药物。
[0108]
本发明提供了使用本文所述的多糖蛋白缀合物或免疫原性组合物保护哺乳动物，特别是人，抵抗肺炎克雷伯菌感染的免疫方法。该多糖蛋白缀合物是通过将肺炎克雷伯菌荚膜多糖与适宜的蛋白质共价连接而构成的。
[0109]
本发明的免疫原性组合物可用作增加用于预防和诊断目的的抗体的手段。诊断尤
其适用于监视和检测各种由肺炎克雷伯菌引起的感染和疾病。本发明的另一个实施方案用免疫原性组合物作为免疫原，用于对有危险患肺炎克雷伯菌感染或疾病的个体进行主动的和被动的免疫原性保护。用于被动保护的免疫原性抗体如下产生：用本发明的任意免疫原性组合物免疫哺乳动物，然后从哺乳动物回收γ-球蛋白部分中的杀菌抗体，或者作为血清或作为特异性抗体。此处所用的本发明的疫苗能诱导用于提供对肺炎克雷伯菌感染的保护的抗体。
[0110]
另外，肺炎克雷伯菌荚膜多糖本身可以用作免疫剂，优选与佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、cpg、单磷酰基脂a、qs21、硬脂酰酪氨酸或弗氏佐剂缔合为免疫原性组合物。本发明进一步的实施方案是用该免疫原性组合物作为对抗肺炎克雷伯菌感染的免疫原性保护。
[0111]
本发明的免疫原性组合物和疫苗可通过将肺炎克雷伯菌荚膜多糖或缀合物分散到适宜的药学上可接受的辅料而典型地形成，所述辅料例如生理盐水、磷酸盐缓冲的盐水或其它可注射的液体。疫苗可胃肠外给药，例如皮下、腹膜内、或肌内给药。也可以存在疫苗中常用的添加剂，例如稳定剂如乳糖或山梨糖醇和佐剂如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、cpg、单磷酰基脂a、qs21或硬脂酰酪氨酸。
[0112]
免疫原性组合物的剂量应是能达到致免疫作用效果的剂量。剂量通常在每千克体重约0.01μg至约10μg之间的范围。可以给出一系列最佳免疫剂量。单位剂型的疫苗可含有与约0.01μg至约10μg相当量的肺炎克雷伯菌荚膜多糖或缀合物。
[0113]
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
[0114]
实施例
[0115]
实验方法
[0116]
肺炎克雷伯菌的分离及分型
[0117]
k64型肺炎克雷伯菌的分离及分型
[0118]
肺炎克雷伯菌2410株(gdmcc no：62131)作为荚膜多糖提取的来源菌株，分离自复旦大学附属华山医院一位呼吸道感染病人的痰液，经16s基因测序鉴定为肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌y8株为高毒力菌株，用于疫苗保护性实验，分离自复旦大学附属华山医院一位尿路感染病人的尿液，经16s基因测序鉴定为肺炎克雷伯菌y8。根据brisse(wzi gene sequencing,a rapid methodfor determination of capsular type for klebsiella strains.j.clin.microbiol.51, 4073
–
4078.)的方法，采用wzi测序法测定菌株荚膜类型，上述两株菌株荚膜型均为k64型。
[0119]
k64型外膜多糖由含有6个单糖的重复结构组成(α-l-鼠李糖，α-d-甘露糖、β-d-葡萄糖、α-d-葡萄糖醛酸、α-d-甘露糖、β-d葡萄糖)，其结构与已知的k64型多糖结构是一致的。
[0120][0121]
k47型肺炎克雷伯菌的分离及分型
[0122]
肺炎克雷伯菌2226株(gdmcc no：62132)作为荚膜多糖提取的来源菌株，分离自复旦大学附属华山医院2015年一位呼吸道感染病人的痰液，经 16s基因测序鉴定为肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌hvkp4株为高毒力菌株，用于疫苗保护性实验，分离自浙江大学第二附属医院2016年icu患有严重肺炎的病人的样本，经16s基因测序鉴定为肺炎克雷伯菌hvkp4(gu d,dong n, zheng z,lin d,huang m,wang l,chan ew,shu l,yu j,zhang r,chen s.a fatal outbreak of st11 carbapenem-resistant hypervirulentklebsiella pneumoniae ina chinese hospital:a molecular epidemiological study.lancet infect dis.2018 jan；18(1):37-46.)。根据brisse的方法，采用wzi测序法测定菌株荚膜类型，上述两株菌株荚膜型均为k47型。
[0123]
2226菌株产生的k47型的多糖结构式如下，由4个单糖的重复结构组成：一个β-d-半乳糖，两个α-l-鼠李糖，一个β-d-葡萄糖醛酸，其结构与已知的 k47型多糖结构是一致的。k47型的多糖结构式如下(h,lindberg b,j,rosell kg,nimmich w.structural studies of the klebsiella type 47 capsular polysaccharide.carbohydr res.1973apr；27(2):373-8.)：
[0124][0125]
肺炎克雷伯菌荚膜多糖k64和k47的培养发酵与提取
[0126]
将肺炎克雷伯菌2410株、肺炎克雷伯菌2226株分别接种至固体培养基中，35～37℃，培养箱中培养至菌苔肉眼可见，之后刮取菌苔转入含液体培养基的摇瓶中，35～37℃培养箱中培养过夜，培养结束后，镜检，结果正常就将培养液接种至10l发酵罐中，培养6-10小时。培养完成后，加入灭活剂灭活，然后通过离心获得澄清的培养液，之后通过微滤、超滤的工艺获得粗糖培养液。向粗糖培养液中加入多糖沉淀剂ctab得到复合多糖，之后通过一系列的沉淀、解离、超滤、层析等工艺得到精制多糖。通常精制多糖的纯化工艺包括并不限于乙醇沉淀，解离，离心，超滤，层析等步骤，其中层析法可根据不同的多糖采用不同的层析法得到精制多糖。得到的多糖通过质量分析确认肺炎克雷伯菌荚膜多糖有效成分，另外将主要杂质如核酸、蛋白等指标控制在1％以内。
[0127]
载体蛋白制备
[0128]
白喉杆菌素无毒变异蛋白(crm197)制备
[0129]
crm197载体蛋白(seq id no:1，ncbi编号：amv91693.1)是白喉杆菌素无毒变异体，该蛋白没有毒性，但保留了白喉毒素的免疫原性。在公开的文章和专利中都有报道其发酵和纯化方法(us5614382)。通常通过将 corynebacterium diphtheriae菌种(atcc)接种到培养基中，在37℃下，搅拌 20-30小时，然后通过离心去除菌体，保留上清。将发酵上清通过超滤换液后，加入硫酸铵沉淀，收取沉淀物。然后将沉淀物溶解，换液，再通过柱层析，纯化得crm197蛋白，其纯度在95％以上，用于结合反应。
[0130]
破伤风类毒素蛋白(tent)及其变异体(tthc)制备
[0131]
破伤风类毒素蛋白(tent)及其变异体(tthc)在公开文献中有很多报道。破伤风类毒素蛋白(tent，seq id no:2，ncbi编号:p04958.2)是通过培养破伤风毒素菌种(clostridium tetani)(atcc)，收取培养发酵液的上清，加入甲醛，搅拌脱毒后，通过硫酸铵沉淀，凝胶过滤或离子交换层析后得到(]. applied and environmental microbiology,1985,49(4):939-43)。tthc(seq idno:3)是tent的片段蛋白，没有毒性，但保留了tent蛋白的免疫原性。tthc 可以通过重组表达纯化得到(immunobiology,vol.216,issue 4，2011,p 485-490)。将tthc基因序列克隆到表达载体中，构建重组大肠杆菌菌株。通过发酵后，离心收集菌体，然后将菌体液通过高压均质仪，再离心收集上清。上清液通过流酸铵沉淀、离子交换柱层析、复合介质等层析后得到纯化蛋白，蛋白纯度在95％以上。
[0132]
肺炎克雷伯菌荚膜多糖-蛋白缀合物的制备
[0133]
根据多糖的特点，可以选择不同的化学偶联方法，常用的多糖活化方法有溴化氰法(us6375846b1)、1-氰基-4-二甲氨基砒啶四氟硼酸酯(cdap) (ep0720485)、高碘酸氧化法(us4711779)。在多糖-蛋白结合反应过程中，通过控制多糖的分子量、多糖活化反应、多糖-蛋白的反应比例、反应温度、反应时间及反应液ph值等参数，得到最终多糖-蛋白缀合物。所得的多糖-蛋白缀合物通过进一步纯化，去除未反应物及杂质，通过质量分析，定量其多糖
ꢀ‑
蛋白交联度及残留杂质，确保批次的一致性和可比性。
[0134]
k64型或k47型克雷伯荚膜多糖与载体蛋白结合反应采用上述类似的方法进行。从k47型或k64型克雷伯菌通过发酵纯化分离得到的荚膜多糖与载体蛋白的直接偶联结合效果差，诱导的抗多糖的特异性抗体滴度低，保护率差。为了提高多糖与蛋白的结合效率，提高缀合物的免疫原性，我们对分离得到的克雷伯菌荚膜多糖进行处理，将多糖的分子量控制在一定范围内，有效地提高多糖与蛋白的结合，制备得到的缀合物具有良好的免疫原性及保护效果。
[0135]
在处理过程时，先将纯化提取的克雷伯荚膜多糖通过0.2m冰醋酸或盐酸水解或高压匀质(压力1000bar)的方法使其分子量降低至约50～700kd范围内。然后在经过处理的克雷伯荚膜多糖溶液中加入当量比为0.1-2的高碘酸钠进行氧化，将氧化产物通过膜包超滤去除氧化剂及杂质获得多糖活化物。将多糖活化物与的载体蛋白混合后，再加入100mm的氰基硼氢化钠溶液在室温进行反应16-48小时，得到多糖-蛋白缀合物。多糖-蛋白缀合物通过超滤或层析去除杂质以及未反应的多糖和蛋白，最终制备得到多糖-蛋白缀合物，用于动物免疫原性评价。通常情况下，每批制备的多糖-蛋白缀合物稳定性和可溶性好，多糖与蛋白的比例(重量比)控制在0.5-2.0范围内(优选0.8-1.5)，缀合物分子大小通过层析法分析或激光衍射仪分析确定。
[0136]
多糖-蛋白缀合物的免疫原性评价
[0137]
elisa法评价多糖免疫原性：将多糖-蛋白缀合物免疫动物，收集抗血清后进行elisa检测。将肺炎多糖用包被缓冲液稀释，包被到6块96孔酶标板， 100μl/孔，并在37℃孵育后洗板。将小鼠、大兔抗血清通过吸附剂处理后，血清先以1：200稀释，后2.5倍梯度稀释，稀释8个梯度，再加入酶标板中，每孔50μl，孵育过夜。洗板后，将二抗以1：1万稀释后加入酶标板中，每孔100μl，孵育2小时后洗板，然后加入1mg/ml的pnpp-na显色底物,每孔100μl，孵育2小时后,以50μl/孔加入3m naoh中止反应，上机读取od405数值。测定孔od值与阴性孔od值比值大于或等于2.1判定为阳性，以稀释最大倍数为阳性的稀释度定为每个血清的抗体滴度，并计算每组免疫动物的抗体滴度几何平均值。
[0138]
肺炎克雷伯菌荚膜多糖特异性抗体杀菌试验(opa)
[0139]
肺炎克雷伯菌荚膜多糖特异性抗体调理吞噬杀菌试验：将肺炎克雷伯菌 y8株或2410株稀释105cfu/ml，以10μl/孔加入到96孔细胞工作板中。将灭活的血清样品梯度稀释后以20μl/孔加入到上述细胞工作板中，使菌体与抗血清在700rpm/min孵育30min，将经dmf分化的hl-60细胞经hbss缓冲液洗涤后调整到浓度1
×
107个/ml，再将1
×
107个/ml的细胞液与稀释好的补体按1： 4体积比混合，混合液以50μl/孔加入到96孔细胞工作中。将96孔细胞工作板置混匀仪上，放入5％co2、温度为37℃的co2培养箱中，振荡培养45min。经中止调理吞噬后，点样到血平板中，于co2培养箱中培养过夜。计算各稀释血清下的杀菌率。
[0140]
实施例1，不同分子量的k47多糖与载体蛋白偶联缀合物的免疫原性评价
[0141]
先将纯化提取的克雷伯荚膜多糖用高压匀质方法使其分子量降低，并通过分离和超滤方式回收不同分子大小的多糖，多糖的分子量用多角度激光衍射仪测定。如下图1所示，kp47-a(处理前多糖样品)分子量均值为2081kd，处理后kp47-b分子量均值为989kd，kp47-c分子量均值为635kd，kp47-d 分子量均值为164kd，kp47-e分子量均值为51kd。
[0142]
表1：不同分子量的k47多糖信息
[0143][0144][0145]
将以上5组不同分子量的多糖与载体蛋白偶联，制备缀合物。结果发现分子量均值为2081kd和989kd的多糖经氧化后，与蛋白偶联后形成不可溶的凝胶，无法制备疫苗；分子量635kd、164kd、51kd的多糖组分分别经氧化后可以有效地与tthc载体蛋白结合。分别将上述三种缀合物加入磷酸铝佐剂，制备成结合疫苗a组、b组、c组，免疫balb/c小鼠，每组8个小鼠，并以生理盐水作为阴性对照组(d组)，每次免疫剂量为2微克，分别在0天、 14天、21天进行免疫，并在35天抽血评价比较其多糖蛋白结合疫苗的免疫原性(图2)。
[0146]
结果上述三种缀合物都能诱导特异性抗体，与阴性对照组比都有显著性差异，p＜0.05。其中均分子量为164kd和635kd多糖制备的缀合物a和b具有更好的免疫原性，而且a、b
两组缀合物的免疫原性没有显著差别(p＞0.05)。结果说明控制多糖的分子量对控制免疫原的重要性。对于k47多糖来说，将多糖分子量控制在50-800kd，更确切地说控制在150-650kd制备缀合物可以产生较好的免疫原性。
[0147]
实施例2，k47多糖缀合物在动物中的免疫原性
[0148]
k47多糖-crm197缀合物在小鼠中的免疫原性：选用分子量为635kd的 k47多糖降解物与crm197蛋白偶联制备k47-crm197缀合物，加入磷酸鋁佐剂，配制成免疫抗原，选择6-8周龄的balb/c小鼠进行腹腔免疫，每组5-8 个小鼠，每次免疫剂量为2微克，分别在0天、14天、21天进行免疫，以pbs 作为阴性对照，并在35天抽血评价其多糖的免疫原性(图3)。
[0149]
结果k47-crm197缀合物免疫35天balb/c小鼠血清具有较好的免疫原性，与阴性对照pbs比，经t检验具有显著性差异，p＜0.05。
[0150]
k47多糖蛋白缀合物在大兔中的免疫原性：将k47-tthc(635kd)和 k47-crm197(635kd)缀合物加入弗氏佐剂，配制成免疫抗原，选择2～2.5kg 的新西兰大白兔进行免疫，每组2只兔。首次以弗氏完全佐剂与抗原乳化混合，皮下免疫，剂量为200微克；第14天以弗氏不完全佐剂与抗原乳化混合，皮下第二次免疫，剂量为200微克；第28天以100微克抗原静脉免疫。并在第 42天抽血评价其多糖的免疫原性(如图4和5)。结果显示k47-tthc和k47-crm197缀合物都有较好的免疫原性。
[0151]
实施例3，k47多糖蛋白免疫兔血清的opa杀菌试验
[0152]
将实施例2中的k47-tthc组42天的兔免疫血清进行opa试验(图6与图7)。结果如图所示：k47-tthc 42天免疫血清对hvkp4菌株ic50为100776，对普通菌株2226的ic50为16588。结果表明k47-tthc缀合物能诱导产生的 k47型多糖特异性抗体，对肺炎克雷伯菌高毒力hvkp4和普通菌株2226具有较好的杀菌效果。
[0153]
实施例4，肺炎克雷伯菌k47多糖结合疫苗的保护性实验
[0154]
将实施例2中的k47多糖-蛋白缀合物加入磷酸铝佐剂，配制成免疫抗原，以生理盐水作为阴性对照。选择6-8周龄的balb/c小鼠进行腹腔免疫，每组6 个小鼠，每次免疫剂量为2微克，分别在第0天、第14天、第21天进行免疫，并在第21天和第35天抽血评价其多糖的免疫原性。末次免疫14天后，腹腔注射肺炎克雷伯菌hvkp4，数量3
×
105cfu，监测小鼠存活率(如图8)、体重 (如图9)。
[0155]
实施例5，不同分子量的k64多糖与载体蛋白偶联缀合物的免疫原性评价
[0156]
先将纯化提取的克雷伯荚膜多糖用高压匀质方法使其分子量降低，并通过分离和超滤方式回收不同分子大小的多糖，多糖的分子量用多角度激光衍射仪测定。如图10所示，kp64-a(处理前多糖样品)分子量均值为2432.5kd，处理后kp64-b分子量均值为623kd，kp64-c分子量均值为362.2kd，kp64-d 分子量均值为149.3kd。
[0157]
表2：不同分子量的k64多糖信息
[0158]
[0159]
将以上4组不同分子量的多糖分别与载体蛋白偶联，制备缀合物。结果发现分子量均值为2432.5kd的多糖经氧化后，与蛋白偶联后形成不可溶的凝胶，无法制备疫苗；分子量635kd、362.2kd、149.3kd的多糖组分分别经氧化后可以有效地与tthc载体蛋白结合。分别将上述三种缀合物加入磷酸铝佐剂，制备成结合疫苗(k64缀合物-b、k64缀合物-c、k64缀合物-d)，免疫balb/c 小鼠，每组8个小鼠，并以生理盐水作为阴性对照组，每次免疫剂量为2微克，分别在0天、14天、21天进行免疫，并在35天抽血评价比较其多糖蛋白结合疫苗的免疫原性(图11)。
[0160]
图11显示，k64缀合物-b、k64缀合物-c、k64缀合物-d三种缀合物都能诱导特异性抗体，与阴性对照组比都有显著性差异，p＜0.05。其中k64缀合物-c和k64缀合物-d具有更好的免疫原性，但与k64缀合物-b没有显著差别(p＞0.05)。结果说明控制多糖的分子量对控制免疫原的重要性。对于k64 多糖来说，将多糖分子量控制在150-635kd，制备缀合物可以产生较好的免疫原性。
[0161]
实施例6，k64多糖蛋白缀合物在动物中的免疫原性
[0162]
k64-tent多糖蛋白缀合物小鼠免疫原性：k64-tent缀合物(多糖分子量是362.2kd。)加入磷酸铝佐剂，配制成免疫抗原，选择6-8周龄的balb/c 小鼠进行腹腔免疫，每组5-8个小鼠，每次免疫剂量为2微克，分别在0天、 14天、21天进行免疫，并35天抽血评价其多糖的免疫原性(如图12)。
[0163]
结果k64-tent缀合物免疫小鼠第35天血清具有较好的抗体水平，与阴性生理盐水组相比，经t检验分析，有显著差异，p＜0.05.
[0164]
k64多糖蛋白缀合物大兔免疫原性：将k64-crm197和k64-tthc(多糖分子量362.2kd)缀合物加入弗氏佐剂，配制成免疫抗原，选择2～2.5kg的新西兰大白兔进行免疫，每组2只兔。首次以弗氏完全佐剂与抗原乳化混合，皮下免疫，剂量为200微克；第14天以弗氏不完全佐剂与抗原乳化混合，皮下第二次免疫，剂量为200微克；第28天以100微克抗原静脉免疫。并在第 21天与42天抽血评价其多糖的免疫原性(如图13和14)。
[0165]
实施例7，k64多糖缀合物大兔免疫血清对y8菌株的opa试验
[0166]
将实施例6中的k64-tthc和k64-crm197二组42天的免疫血清进行 opa试验(图15与图16)。结果如图所示：k64-tthc和k64-crm197 42 天免疫血清ic
50
分别为14161与533.7；结果表明k64-tthc与k64-crm197 缀合物均能诱导产生的k64型多糖特异性抗体，对肺炎克雷伯菌高毒力y8株具有较好的杀菌效果。
[0167]
实施例8，k64-多糖缀合物大兔免疫血清对2410菌株的opa试验
[0168]
将实施例6中的k64-tthc和k64-crm197二组42天的免疫血清进行 opa试验(图17与图18)。结果如图所示：k64-tthc和k64-crm197 42 天免疫血清ic
50
分别为23148与1022；结果表明k64-tthc与k64-crm197 缀合物均能诱导产生k64型多糖特异性抗体，对肺炎克雷伯菌2410株具有较好的杀菌效果。
[0169]
实施例9，肺炎克雷伯菌k64-tthc多糖抗血清保护力试验
[0170]
取6～8周体重约20g左右的雌性balb/c小鼠，随机分成两组，每组8只。腹腔注射k64-tthc(实施例6)免疫的兔抗血清250μl/只，以生理盐水作为对照。2小时后，每只小鼠腹腔攻毒肺炎克雷伯菌y8，剂量为2.5
×
106cfu。每天观察小鼠存活率。生存曲线如图19所示：
[0171]
结论:小鼠注射免疫血清250μl/只后，攻毒2.5
×
106cfu肺炎克雷伯菌。注射生理
盐水对照组在第二天开始有小鼠死亡，第7天全部死亡，与抗血清保护组有明显区别。
[0172]
实施例10，肺炎克雷伯菌k64-tthc多糖结合疫苗保护力试验
[0173]
如实施例6所述，将k64-tthc多糖-蛋白缀合物加入磷酸铝佐剂，配制成免疫抗原，以生理盐水作为阴性对照。选择6-8周龄的balb/c小鼠进行腹腔免疫，每组6个小鼠，每次免疫剂量为2微克，分别在第0天、第14天、第21 天进行免疫，并在第21天和第35天抽血评价其多糖的免疫原性。末次免疫14 天后，腹腔注射肺炎克雷伯菌y8，数量2.5
×
106cfu，监测小鼠存活率，如图 20所示。
[0174]
结论：k64-tthc疫苗免疫三针后以克雷伯k64型菌(菌编号y8)量2.5x10
6 cfu攻毒，结果如图20所示，保护力100％。未免疫疫苗组在第8天死亡率 100％。
[0175]
以上详细描述了本技术的实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。

技术特征：
1.一种免疫原性组合物，含有式(i)和/或式(ii)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖和载剂：[
→
4)-α-d-glca-(1
→
3)-α-d-manp-(1
→
3)-β-d-glcp-(1
→
4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1
→
2)]-[α-l-rhap-(1
→
3)]-α-d-manp-(1
→
]
m
(i)，[
→
3)-β-d-galp-(1
→
4)-[β-l-rhap-(1
→
4)-β-d-glca-(1
→
3)]-α-l-rhap-(1
→
]
n
(ii)，优选地，所述多糖的平均分子量为50-800kd，和/或m为50-800的数字，和/或n为80-1200的数字。2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述载剂选自盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水中的一种或多种，和/或所述免疫原性组合物还含有佐剂；优选地，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂a、qs21、cpg、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。3.一种具有免疫原性的多糖蛋白缀合物，含有式(i)和/或式(ii)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖以及与其缀合的载体蛋白，[
→
4)-α-d-glca-(1
→
3)-α-d-manp-(1
→
3)-β-d-glcp-(1
→
4)-[(4,6-(s)-pyruvat e)-β-d-glcp-(1
→
2)]-[α-l-rhap-(1
→
3)]-α-d-manp-(1
→
]
m
(i)，[
→
3)-β-d-galp-(1
→
4)-[β-l-rhap-(1
→
4)-β-d-glca-(1
→
3)]-α-l-rhap-(1
→
]
n
(ii)，优选地，所述多糖的平均分子量为50-800kd，和/或m为50-800的数字，和/或n为80-1200的数字。4.如权利要求3所述的多糖蛋白缀合物，其特征在于，所述载体蛋白选自crm197、tent、dt、或tthc；优选地，所述载体蛋白具有seq id no:1-3中任一项所述序列，或与其具有至少70％、至少80％、至少90％序列相同性的变体，和/或所述载体蛋白与多糖共价连接，和/或所述多糖与载体蛋白的重量比为0.2-3.0。5.制备权利要求3或4所述的多糖蛋白缀合物的方法，包括步骤：(1)获得所述克雷伯荚膜多糖，(2)通过氧化使所述多糖活化，(3)将活化的多糖与载体蛋白在氰基硼氢化钠存在的条件下孵育，获得多糖蛋白缀合物，优选地，所述多糖的平均分子量为50-800kd。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：使用冰醋酸或盐酸或高压匀质处理克雷伯荚膜多糖使其分子量降低至50-800kd范围内，和/或步骤(2)包括：使用高碘酸钠处理步骤(1)获得的多糖，并分离活化的多糖；优选地，高
碘酸钠与所述多糖的当量比为0.1-10，和/或步骤(3)中活化的多糖与载体蛋白的重量比为0.5-2.0；优选地，氰基硼氢化钠的浓度为10-200mm，和/或，多糖与载体蛋白孵育至少2小时。7.一种免疫原性组合物，其包含权利要求3或4所述的多糖蛋白缀合物以及佐剂，优选地，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂a、qs21、cpg、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。8.一种导致被动免疫的免疫组合物，包括来自肺炎克雷伯菌的杀菌抗体，所述抗体是由权利要求1或2或7所述的免疫原性组合物免疫哺乳动物而获得，优选地，所述杀菌抗体存在于血清、γ球蛋白部分或纯化的抗体制剂中。9.一种疫苗，其含有权利要求1或2或7所述的免疫原性组合物和药学上可接受的辅料。10.权利要求3或4的多糖蛋白缀合物或权利要求1或2或7所述的免疫原性组合物在制备用于提供对抗肺炎克雷伯菌感染的保护的药物中的用途。

技术总结
本发明涉及多糖蛋白缀合物，具体地，本发明提供一种具有免疫原性的多糖蛋白缀合物，含有式(I)和/或式(II)所示的肺炎克雷伯菌荚膜多糖以及与其缀合的载体蛋白。本发明的多糖蛋白缀合物可以有效地提高克雷伯荚膜多糖的免疫原性，诱导针对肺炎克雷伯菌荚膜多糖特异性抗体。抗体。


技术研发人员：祝先潮 陈华根 何平 李颖 张诗琴 石星辉
受保护的技术使用者：上海博钒生物科技有限公司
技术研发日：2022.02.24
技术公布日：2023/9/7