包含经修饰的核苷酸的脂质纳米颗粒的制作方法

包含经修饰的核苷酸的脂质纳米颗粒
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背景技术：

3.由于其激活nk细胞和细胞毒性t细胞的能力，il12蛋白自1994年以来一直被研究作为一种有前途的抗癌治疗剂。参见nastala,c.l.et al.,j immunol 153:1697-1706(1994)。但尽管寄予厚望，然而早期的临床研究并没有取得令人满意的结果。lasek w.et al.,cancer immunol immunother 63:419-435,424(2014)。在大多数患者中，重复施用il12会导致适应性反应和血液中il12诱导的干扰素γ(ifn-γ)水平逐渐下降。同前。此外，虽然人们认识到il12诱导的抗癌活性主要由ifnγ的二次分泌介导，但由il12伴随诱导ifn-γ与其他细胞因子(例如tnf-α)或趋化因子(ip-10或mig)引起严重毒性。同前。
4.除了负反馈和毒性之外，il12疗法在临床环境中的边际功效可能是由人体中强烈的免疫抑制环境引起的。同前。为了最大限度地减少ifn-γ的毒性并提高il12的疗效，科学家们尝试了不同的方法，例如il12治疗的不同剂量和时间方案。参见sacco,s.et al.,blood 90:4473-4479(1997)；leonard,j.p.et al.,blood 90:2541-2548(1997)；coughlin,c.m.et al.,cancer res.57:2460-2467(1997)；asselin-paturel,c.et al.,cancer 91:113-122(2001)；和saudemont,a.et al.,leukemia 16:1637-1644(2002)。尽管如此，这些方法并未显著影响患者的生存。kang,w.k.,et al.,human gene therapy 12:671-684(2001)。因此，本技术领域需要使用il12的改进治疗方法以治疗肿瘤。


技术实现要素：

5.本公开提供了一种脂质纳米颗粒，其包含：(i)一种或多种类型的脂质；和(ii)经修饰的mrna，其包含编码白细胞介素(il)-12分子的序列；其中所述脂质纳米颗粒能够触发免疫原性细胞死亡。在一些方面，所述一种或多种类型的脂质包括阳离子脂质。在一些方面，所述阳离子脂质是式i化合物：
及其盐；其中每个r1独立地是未经取代的烷基；每个r2独立地是未经取代的烷基；每个r3独立地是氢或经取代或未经取代的烷基；并且每个m独立地为3、4、5、6、7或8。在一些方面，至少一个r1是c
11h23
。在一些方面，至少一个r3是氢。在一些方面，至少一个m为3。
6.在一些方面，所述阳离子脂质是具有以下结构的n1,n3,n5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(tt3)：及其盐，其中m为3。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含tt3、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、胆固醇和c14-peg2000。
7.在一些方面，所述经修饰的rna包含经修饰的5'-帽。在一些方面，所述经修饰的5'-帽选自m
27,2
′‑ogppspgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m
2(7,3
′‑
o)
gpppg、m
2(7,2
′‑
o)
gppspg(d1)、m
2(7,2
′‑
o)
gppspg(d2)、m
27,3
’‑ogppp(m
12
’‑o)apg、(m7g-3
′
mppp-g；其可等效地表示3
′
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g)、n7,2
′‑
o-二甲基鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧乙基)-g(5
′
)ppp(5
′
)g、n7-(4-氯苯氧乙基)-m3′‑og(5
′
)ppp(5
′
)g、7mg(5
′
)ppp(5
′
)n、pn2p、7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp、7mg(5
′
)-ppp(5
′
)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2
′
)apm(2
′
)apm(2
′
)cpm(2)(3,2
′
)up、肌苷、n1-甲基鸟苷、2
′
氟鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg及其组合。
8.在一些方面，所述经修饰的rna是环状rna。
9.在一些方面，所述经修饰的rna还包含半衰期延长部分。在一些方面，所述半衰期延长部分包括fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、pas序列、hap序列、转铁蛋白或其片段、xten或其任何组合。
10.在一些方面，所述il-12分子选自由il-12、il-12亚基或保留免疫调节功能的突变il-12分子组成的群组。在一些方面，所述il-12包含与seq id no:1有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述il-12分子包含il-12α和/或il-12β亚基。在一些方面，所述il-12a亚基包含与seq id no:2有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述il-12β亚基包含与seq id no:3有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
11.在一些方面，所述il-12α亚基和所述il-12β亚基通过接头连接。在一些方面，所述接头包含至少约2个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约8个、至少约约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。在一些方面，所述接头包含(gs)接头。在一些方面，所述gs接头具有通式(gly4ser)n或s(gly4ser)n，其中n是选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100组成的群组的正整数。在一些方面，所述(gly4ser)n接头是(gly4ser)3或(gly4ser)4。
12.在一些方面，所述il12分子包含与seq id no:4或seq id no:5有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述经修饰的mrna包含与seq id no:6有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述经修饰的rna包含与seq id no:7有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。
13.在一些方面，所述经修饰的rna还包含调控元件。在一些方面，所述调控元件选自由至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微rna结合位点或其种子、连接的核苷的3'尾区、富含au的元件(are)、转录后控制调节剂及其组合组成的群组。在一些方面，所述连接的核苷的3'尾区包含poly-a尾、polya-g四联体或茎环序列。
14.在一些方面，所述经修饰的rna包含至少一个经修饰的核苷。在一些方面，所述至少一个经修饰的核苷选自由6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、n1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假-尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合组成的群组。
15.在一些方面，所述经修饰的rna包含与seq id no:8有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述经修饰的rna包含与seq id no:9有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。
16.在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约30-500nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约50-400nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约70-300nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约100-200nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约100-175nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约100-120nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒和所述经修饰的rna具有约1:2至约2:1的质量比。在一些方面，所述脂质纳米颗粒和所述经修饰的rna具有1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1或2:1的质量比。在一些方面，所述脂质和所述经修饰的rna具有约1:1的质量比。
17.本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文公开的脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体。在一些方面，所述药物组合物被配制成用于瘤内、鞘内、肌肉内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻腔、经皮、舌下、粘膜下、透皮或经粘膜施用。
18.本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的所述脂质纳米颗粒或所述药物组合物。在一些方面，所述受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者。在一些方面，所述人类患者患有选自黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、原发性肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌和头颈癌组成的群组的癌症。在一些方面，所述脂质纳米颗粒或药物组合物以单次剂量施用于受试者。在一些方面，所述药物组合物通过瘤内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射施用于受试者。
附图说明
19.图1a显示了自我复制mrna和经修饰的rna之间的il-12表达水平。y轴显示了b16.f10细胞系中的表达水平，x轴显示了转染后的小时数。图1b显示了自我复制mrna和修饰rna之间的il-12表达水平。y轴显示了4t1细胞系中的表达水平。
20.图2a显示了经修饰的rna和自我复制rna在极难治疗的小鼠模型中的功效(肿瘤大小)。顶行用于对照，底部两行用于modrna-il-12和reprna-il-12。图2b显示了经修饰的rna-il-12和reprna-il-12之间的功效(肿瘤大小)。
21.图3显示了经修饰的rna和复制的rna中的il-12有效负载表达。
22.图4显示了在皮下引入b16-f10细胞后施用modrna-il12或reprna-il12的小鼠的存活概率。在约350mm3的肿瘤大小下，将mrna作为单剂量施用。
具体实施方式
23.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域
的普通技术人员普遍理解的相同含义。在冲突的情况下，以本技术(包括定义)为准。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
24.在整个本公开中，术语“一(a)”或“一个(an)”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“一个多核苷酸”被理解为表示一个或多个多核苷酸。因此，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
25.此外，本文所用的“和/或”应被视为两个指定特征或部件中的每一个在有或没有另一个的情况下的具体公开。因此，本文中诸如“a和/或b”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样，在诸如“a、b和/或c”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下各个方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
26.术语“约”在本文中用于表示大约、大致地、左右或在该区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将边界延伸到所列数值之上和之下来修改范围。一般而言，除非另有说明，否则术语“约”在本文中用于将数值修改为高于和低于所述值达向上或向下(更高或更低)变化10％。
27.在一个数字或一系列数字之前的术语“至少”被理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可以包括的所有后续数字或整数，如根据上下文显而易见的那样。例如，核酸分子中核苷酸的数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少18个核苷酸”是指18、19、20或21个核苷酸具有指定的特性。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰系列或范围中的每个数字。“至少”也不限于整数(例如，“至少5％”包括5.0％、5.1％、5.18％，不考虑有效数字的数量。
28.如本文所使用的，“多核苷酸”或“核酸”是指通过磷酸二酯键连接的核苷酸序列。多核苷酸在本文中以从5'到3'方向的方向呈现。本公开的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(dna)分子或核糖核酸(rna)分子。核苷酸碱基在本文中用单字母代码表示：腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、肌苷(i)和尿嘧啶(u)。
29.如本文所使用的，术语“多肽”包括肽和蛋白质，除非另有说明。
30.本文使用的术语“编码序列”或序列“编码”是指“编码”特定蛋白质(例如il-12)的dna或rna区域(转录区域)。当置于合适的调节区如启动子的控制下时，编码序列在体外或体内被转录(dna)和翻译(rna)为多肽。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。编码序列可包括但不限于来自原核生物或真核生物的cdna、来自原核生物或真核生物的基因组dna以及合成dna序列。转录终止序列可位于编码序列的3'端。
31.kozak共有序列、kozak共有序列或kozak序列被称为出现在真核mrna上并具有共有(gcc)gccrccaugg的序列，其中r是起始密码子上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)(aug)，后面跟着另一个“g”。在一些方面，多核苷酸包含与kozak共有序列具有至少95％、至少99％或更多序列同一性的核酸序列。在一些方面，多核苷酸包含kozak共有序列。
32.本文使用的术语“rna”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-d-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链rna、单链rna、分离的rna例如部分或完全纯化的rna、基本上纯的rna、合成rna、重组产生的rna(例如通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的rna不同的经修饰的rna)。术语“mrna”是指“信使-rna”并且涉及通过使用dna模板产生并编码肽或蛋白质的“转录物”。通常，mrna包含5'-utr、蛋白质编码区和3'-utr。mrna在细胞和体外仅拥有有限的半衰期。在本发明的上下文中，mrna可以通过从dna模板体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在多种可商购获得的体外转录试剂盒。在本公开的一些方面，rna，优选地mrna，被5'帽结构修饰。
33.本文使用的术语“序列同一性”是指两个或多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在某些方面，序列同一性是基于两个给定seq id no的全长或其部分计算的。其中的一部分可以表示两个seq id no的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或任何其他特定百分比。术语“同一性”还可以表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配所确定的。
34.在某些方面，确定同一性的方法被设计成给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法已编入公开可用的计算机程序中。
[0035]“基本同源性”或“基本相似性”是指，当提及核酸或其片段时，表示当在合适的核苷酸插入或缺失的情况下与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，在序列的至少约95％至99％中存在核苷酸序列同一性。
[0036]
如本文所使用的，术语“烷基”是具有1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基也可以是经取代的或未经取代的。烷基可以被一个或多个基团取代，所述基团包括但不限于烷基、卤代烷基、烷氧基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、亚砜、磺酰基、亚砜或硫醇。
[0037]
如本文所使用的，例如本文公开的包含多核苷酸的基因治疗组合物的术语“有效量”、“治疗有效量”和“足量”是指当施用至受试者(包括人)时足以影响有益或期望的结果，包括临床结果，因此，“有效量”或其同义词取决于其应用的背景。
[0038]
给定治疗剂或组合物的量将对应于这样的量，这样的量将根据各种因素而变化，所述因素例如给定剂、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、正在接受治疗的宿主或受试者的特性(例如，年龄、性别和/或体重)等。
[0039]
术语“半衰期”涉及消除一半活性、量或分子数量所需的时间段。在本发明的上下文中，rna的半衰期指示所述rna的稳定性。脂质纳米颗粒
[0040]
本公开涉及使用脂质纳米颗粒将生物活性分子递送至细胞。在一些方面，本公开涉及由脂质纳米颗粒包裹的表达il-12的经修饰的rna或环状rna、其组合物以及其组合物用于治疗患有癌症或疑似患有癌症的受试者的用途。
[0041]
如本文所使用的，脂质纳米颗粒(lnp)是指具有连续脂质双层的囊泡，例如球形囊泡。脂质纳米颗粒可用于将药物疗法递送至目标位置的方法。lnp的非限制性实例包括脂质体、双头基两亲分子(bolaamphihiles)、固体脂质纳米颗粒(sln)、纳米结构脂质载体(nlc)和单层膜结构(例如，古细菌脂质体(archaeosomes)和胶束)。
[0042]
在一些方面，脂质纳米颗粒包含一种或多种类型的脂质。如本文所使用的，脂质是
指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸酯，并且在一些方面的特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。它们通常至少分为三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂类”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”，例如类固醇。脂质的非限制性实例包括甘油三酯(例如三硬脂精)、甘油二酯(例如山嵛酸甘油酯(glycerol bahenate))、甘油单酯(例如甘油单硬脂酸酯)、脂肪酸(例如硬脂酸)、类固醇(例如胆固醇)和蜡(例如十六烷基棕榈酸酯)。在一些方面，lnp中的一种或多种类型的脂质包含阳离子脂质。
[0043]
如本文所使用的，阳离子脂质是指在选定的ph值(例如生理ph值)下携带净正电荷的多种脂质种类中的任一种。此类脂质包括但不限于n1,n3,n5-三(3-(二十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(tt3)、n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotap)；脂质体胺(lipofectamine)；1,2-二亚麻基氧基(dilinoleyloxy)-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亚麻烯氧基(dilinolenyloxy)-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)；双十八烷基二甲基铵(dodma)、二硬脂基二甲基铵(dsdma)、n,n-二油基-n,n,-二甲基氯化铵(dodac)；n-(2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)；n-n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)；3-(n-(n’,n
’‑
二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(dc-chol)和n-(1,2-二肉豆蔻基氧丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)。
[0044]
在一些方面，阳离子脂质由式i表示：及其盐；其中每个r1独立地是未经取代的烷基；每个r2独立地是未经取代的烷基；每个r3独立地是氢或经取代或未经取代的烷基；并且每个m独立地是3、4、5、6、7或8。在一些方面，每个r1独立地是未经取代的烷基；每个r2独立地是未经取代的烷基；r3是氢；并且每个m是3。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
1-24
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
1-18
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
1-12
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
6-18
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
6-12
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
8-12
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
10-12
烷基。在一些实施方案中，至少一个r1是未经取代的c
11
烷基。
[0045]
在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
1-24
烷基。在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
6-18
烷基。在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
6-12
烷基。在一些方面，至少
一个r2是未经取代的c
8-12
烷基。在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
10-12
烷基。在一些方面，至少一个r2是未经取代的c
11
烷基。
[0046]
在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
1-24
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
6-18
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
6-12
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
8-12
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
10-12
烷基。在一些方面，至少两个r1是未经取代的c
11
烷基。
[0047]
在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
1-24
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
6-18
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
6-12
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
8-12
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
10-12
烷基。在一些方面，至少两个r2是未经取代的c
11
烷基。
[0048]
在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
1-24
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
6-18
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
6-12
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
8-12
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
10-12
烷基。在一些方面，r1的所有实例都是未经取代的c
11
烷基。
[0049]
在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
1-24
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
6-18
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
6-12
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
8-12
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
10-12
烷基。在一些方面，r2的所有实例都是未经取代的c
11
烷基。
[0050]
在一些方面，至少一个r3是氢。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的烷基。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的c
1-18烷基。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的c
1-6
烷基。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的c
1-4
烷基。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的c
2-4
烷基。在一些方面，至少一个r3是经取代或未经取代的甲基。
[0051]
在一些方面，至少一个r3是经取代的烷基，其中该经取代的烷基被卤素取代。在一些方面，至少一个r3是经取代的烷基，其中经取代的烷基被氟取代。在一些方面，至少一个r3是经取代的烷基，其中经取代的烷基被卤代烷基取代。
[0052]
在一些方面，至少两个r3是氢。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的烷基。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的c
1-6
烷基。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的c
1-4
烷基。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的c
2-4
烷基。在一些方面，至少两个r3是经取代或未经取代的甲基。
[0053]
在一些方面，至少两个r3是经取代的烷基，其中经取代的烷基被卤素取代。在一些方面，至少两个r3是经取代的烷基，其中经取代的烷基被氟取代。在一些方面，至少两个r3是经取代的烷基，其中经取代的烷基被卤代烷基取代。
[0054]
在一些方面，r3的所有实例都是氢。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经
取代的烷基。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经取代的c
1-18
烷基。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经取代的c
1-12
烷基。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经取代的c
1-6
烷基。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经取代的c
1-4
烷基。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经取代的c
2-4
烷基。在一些方面，r3的所有实例都是经取代或未经取代的甲基。
[0055]
在一些方面，r3的所有实例都是经取代的烷基，其中经取代的烷基被卤素取代。在一些方面，r3的所有实例都是经取代的烷基，其中经取代的烷基被氟取代。在一些方面，r3的所有实例都是经取代的烷基，其中经取代的烷基被卤代烷基取代。
[0056]
在一些方面，至少一个m是3。在一些方面，至少一个m是4。在一些方面，至少一个m是5。在一些方面，至少一个m是6。在一些方面，至少一个m是7。在一些方面，至少一个m是8。在一些方面，至少两个m是3。在一些方面，至少两个m是4。在一些方面，至少两个m是5。在一些方面，至少两个m是6。在一些方面，至少两个m是7。在一些方面，至少两个m是8。
[0057]
在一些方面，m的所有实例都是3。在一些方面，m的所有实例都是4。在一些方面，m的所有实例都是5。在一些方面，m的所有实例都是6。在一些方面，m的所有实例都是7。在某些方面，m的所有实例都是8。
[0058]
在本公开的一些方面，阳离子脂质是tt3，其表示为：
[0059]
其中所有实例m＝3。式i和tt3的组成、合成和用途描述于wo2016187531a1中，其通过引用并入本文。
[0060]
如本文所使用的，tt3能够形成用于将各种生物活性剂递送到细胞中的脂质纳米颗粒。此外，本公开还证明了未加载的tt3-lnp可以在体内和体外诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡(icd)。如本文所述的免疫原性细胞死亡是指一种细胞死亡形式，它可以通过树突细胞(dc)的激活和随后的特异性t细胞反应的激活来诱导有效的免疫反应。在本公开的一些方面，经历免疫原性细胞死亡的细胞是肿瘤细胞。免疫原性肿瘤细胞死亡可以触发有效的抗肿瘤免疫反应。在本公开的一些方面，脂质纳米颗粒包含包封仅编码报告基因(tt3-lnp-modrna)的经修饰的rna(modrna)的tt3-lnp。与单独的tt3-lnp相比，经修饰的rna可以与tt3-lnp协同工作，在肿瘤细胞中诱导更高水平的icd。在本公开的一些方面，脂质纳米颗粒包含包封编码il-12分子的modrna的tt3-lnp。il-12是免疫调节细胞因子，其可引发针对局部肿瘤的有效免疫反应。tt3-lnp、modrna和il-12表达的结合，不仅能在原位有效协同抑制
肿瘤细胞，而且能引发全身抗肿瘤免疫反应，以杀死远端肿瘤细胞，并且防止肿瘤复发。
[0061]
在本公开的一些方面，阳离子脂质是dotap。如本文所使用的，dotap也能够形成脂质纳米颗粒。dotap可用于将包括酵母人工染色体(yac)在内的dna高效转染到真核细胞中进行瞬时或稳定的基因表达，也适用于高效转移其他带负电荷的分子，如rna、寡核苷酸、核苷酸、核糖核蛋白(rnp)复合物和蛋白质进入哺乳动物细胞的研究样本。
[0062]
在本公开的一些方面，阳离子脂质是脂质体胺(lipofectamine)。如本文所使用的，脂质体胺(lipfectamine)是一种常见的转染试剂，由invitrogen生产和销售，用于分子和细胞生物学。其用于提高rna(包括mrna和sirna)或质粒dna通过脂质转染法(lipofection)转染到体外细胞培养物中的转染效率。脂质体胺(lipofectamine)含有脂质亚基，其可以在水性环境中形成脂质体或脂质纳米颗粒，从而捕获转染有效载荷，例如modrna。由于中性共脂质介导脂质体与细胞膜的融合，含rna的脂质体(其表面带正电荷)可以与活细胞带负电荷的质膜融合，从而使核酸货物分子穿越进入用于复制或表达的细胞质。
[0063]
在本公开的一些方面，lnp主要由阳离子脂质和其他脂质成分组成。这些通常包括属于但不限于磷脂酰胆碱(pc)的其他脂质分子(例如，1,s-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、甾醇(例如胆固醇)和聚乙二醇(peg)-脂质结合物(例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[叶酸(聚乙二醇)-2000(dspe-peg2000)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙烯乙二醇)-2000(c14-peg2000))。表1显示了示例性lnp、tt3-lnp和dotap-lnp的配方。表1
[0064]
脂质纳米颗粒的粒度可以影响药物释放速率、生物分布、粘膜粘附、细胞对水的吸收和缓冲液与纳米颗粒内部的交换、以及蛋白质扩散。在本公开的一些方面，lnp的直径在30至500nm的范围内。在本公开的一些方面，lnp的直径的范围为约30至约500nm、约50至约400nm、约70至约300nm、约100至约200nm、约100至约175nm、或约100至约120nm。在本公开的一些方面，lnp的直径在100-120nm的范围内。在本公开的一些方面，lnp的直径可以是30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、101nm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、110nm、111nm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、118nm、119nm或120nm。
[0065]
ζ(zeta)电位是脂质纳米颗粒表面上有效电荷的量度。ζ电位的幅值提供了有关粒子稳定性的信息。在本公开的一些方面，lnp的ζ电位在3-6mv的范围内。在本公开的一些方面，lnp的ζ电位可以是3mv、3.1mv、3.2mv、3.3mv、3.4mv、3.5mv、3.6mv、3.7mv、3.8mv、3.9mv、4mv、4.1mv、4.2mv、4.3mv、4.4mv、4.5mv、4.6mv、4.7mv、4.8mv、4.9mv、5mv、5.1mv、5.2mv、5.3mv、5.4mv、5.5mv、5.6mv、5.7mv、5.8mv、5.9mv或6mv。
[0066]
在一些方面，本公开涉及用脂质纳米颗粒包封的modrna。在本公开的一些方面，
lnp和modrna之间的质量比在1:2至2:1的范围内。在一些方面，lnp和modrna之间的质量比可以是1:2、1:1.9、1:1.8、1:1.7、1:1.6、1:1.5、1:1.4、1:1.3、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1。在本公开的一些方面，lnp和modrna之间的质量比可以是1:1。经修饰的rna
[0067]
在一些方面，经修饰的rna是信使rna。如本文所使用的，术语“信使rna”(mrna)是指编码感兴趣的多肽并且能够被翻译以在体外、体内、原位或离体产生所编码的感兴趣的多肽的任何多核苷酸。在本公开的一些方面，经修饰的rna是合成的。
[0068]
在一些方面，经修饰的rna包含可翻译区和一个、两个或多于两个的修饰。在一些方面，相对于相应的未修饰的核酸，修饰的核酸在引入该核酸的细胞中表现出减少的降解。
[0069]
在一些方面，修饰可以位于核苷酸的糖部分上。在一些方面，修饰可以位于核苷酸的磷酸酯主链上。
[0070]
在一些方面，期望在细胞内降解引入细胞中的修饰核酸，例如，如果需要蛋白质产生的精确时间的话。因此，在一些方面，经修饰的rna包含降解结构域，其能够在细胞内以定向方式作用。
[0071]
在一些方面，经修饰的rna包含经修饰的5'-帽、半衰期延长部分或调控元件中的至少一种。
[0072]
在一些方面，与没有5'-帽结构的相同rna相比，经修饰的5'-帽增加了rna的稳定性，增加了rna的翻译效率，延长了rna的翻译，增加了rna的总蛋白质表达。
[0073]
在一些方面，经修饰的rna被环化(例如，环状mrna)或多联体化，以产生翻译能力分子，以协助poly-a结合蛋白和5'-末端结合蛋白之间的相互作用。环化或多联体化的机制可以通过至少3种不同的途径发生：1)化学的、2)酶促的、和3)核酶催化。新形成的5'-/3'-连接可以是分子内或分子间的。
[0074]
在第一种途径中，核酸的5'-末端和3'-末端含有化学反应基团，所述化学反应基团当接近一起时，在分子的5'-端和3'-端之间形成新的共价键。5'-末端可能含有nhs-酯反应基团，3'-末端可能含有3'-氨基末端核苷酸，使得在有机溶剂中，合成的mrna分子的3'-末端的3'-氨基末端核苷酸将对5'-nhs-酯部分进行的亲核攻击，从而形成新的5'-/3'-酰胺键。
[0075]
在第二条途径中，t4 rna连接酶可用于将5'-磷酸化核酸分子酶促连接至核酸的3'-羟基，从而形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将1μg核酸分子与1-10单位的t4 rna连接酶(new england biolabs,ipswich,mass.)在37℃下温育1小时。连接反应可以在能够与并列的5'-和3'-区域碱基配对以辅助酶促连接反应的分裂寡核苷酸存在下发生。
[0076]
在第三条途径中，cdna模板的5'-或3'-末端编码连接酶核酶序列，使得在体外转录过程中，所得核酸分子可含有活性核酶序列，其能够连接核酸分子的5'-末端至核酸分子的3'-末端。连接酶核酶可源自i组内含子，i组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶或可通过selex(指数富集的配体系统进化技术)选择。在介于0和37℃之间的温度下，核酶连接酶反应可能需要1到24小时。
[0077]
在一些方面，多个不同的核酸、经修饰的rna或初级构建体可以使用在3'-末端被
修饰的核苷酸通过3'-端连接在一起。化学缀合可用于控制递送到细胞中的化学计量。例如，乙醛酸循环酶、异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶可以1:1的比例供应到hepg2细胞中，以改变细胞脂肪酸代谢。该比例可以使用在一个核酸或经修饰的rna物质上的3'-叠氮基封端的核苷酸和在相反的核酸或经修饰的rna物质上的c5-乙炔基或含炔基的核苷酸通过化学连接核酸或经修饰的rna来控制。根据制造商的方案，使用末端转移酶(new england biolabs,ipswich,mass.)在转录后添加经修饰的核苷酸。添加3'-经修饰的核苷酸后，两种核酸或经修饰的rna物质可以在存在或不存在铜的情况下，在水溶液中结合，以通过文献中描述的点击化学机制来形成新的共价键。
[0078]
在一些方面，可以使用官能化的接头分子将多于两个的多核苷酸连接在一起。例如，官能化的糖类分子可以进行化学修饰以包含多个化学反应基团(sh-、nh2-、n3等...)以与3'-官能化的mrna分子(即，3'-马来酰亚胺酯，3'-nhs-酯，炔基)上的同源部分反应。可以以化学计量方式控制经修饰的糖上反应基团的数量，以直接控制缀合核酸或mrna的化学计量比。
[0079]
在一些方面，为了进一步增强蛋白质生产，可以将本公开的核酸、经修饰的rna、多核苷酸或初级构建体设计为缀合至其他多核苷酸、染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂烯、丝裂霉素c)、卟啉类(tppc4、德克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如edta)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、peg(例如peg-40k))、mpeg、[mpeg]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成核糖核酸酶、蛋白质(例如，糖蛋白)、或肽(例如，对共配体具有特定亲和力的分子)、或抗体(例如结合特定细胞类型的抗体，该特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)、激素和激素受体、非肽物质(例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅助因子)或药物。
[0080]
缀合可导致增加的稳定性和/或半衰期并且可特别用于将核酸、经修饰的rna、多核苷酸或初级构建体靶向细胞、组织或生物体中的特定位点。
[0081]
在一些方面，初级构建体被设计成编码一种或多种感兴趣的多肽或其片段。感兴趣的多肽可包括但不限于完整多肽、多个多肽或多肽片段，其可独立地由一个或多个核酸、多个核酸、核酸片段或任何上述项的变体编码。如本文所使用的，术语“感兴趣的多肽”是指被选择在本发明的初级构建体中编码的任何多肽。如本文所使用的，“多肽”是指最通常通过肽键连接在一起的(天然或非天然)氨基酸残基的聚合物。如本文所使用的，该术语指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在某些情况下，所编码的多肽小于约50个氨基酸，因此该多肽被称为肽。如果多肽是肽，则其长至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述项的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单个分子或可以是多分子复合物，例如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽，例如抗体或胰岛素，并且可以缔合或连接。最常见的二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
[0082]
术语“多肽变体”是指其氨基酸序列不同于天然或参考序列的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，优选地，它们与天然或参考
序列至少约80％相同(同源)，更优选至少约90％相同(同源)。
[0083]
因此，编码感兴趣的多肽的包含相对于参考序列的取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的多核苷酸包括在本发明的范围内。例如，序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)可以(例如，在n-末端或c-末端)添加到本发明的肽序列中。序列标签可用于肽纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽的溶解度或允许生物素化。替代地，可以任选地删除位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域的氨基酸残基，以提供截短的序列。根据序列的用途，某些氨基酸(例如，c端或n端残基)可以替代地被删除，以例如，将序列表达为可溶的或连接到固体支撑物的更大序列的一部分。
[0084]
正如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在本发明感兴趣的多肽的范围内。例如，本文提供的是长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个氨基酸的参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)。在另一个示例中，包括与本文描述的任何序列具有约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％同一性的约20、约30、约40、约50或约100个氨基酸的片段的任何蛋白质可以根据本发明使用。在某些实施方案中，根据本发明使用的多肽包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多突变，如本文提供或引用的任何序列所示。
[0085]
在一些方面，经修饰的rna包含经修饰的5'-帽、半衰期延长部分、调控元件或其组合。
[0086]
在一些方面，经修饰的5'-帽选自m
27,2
′‑ogppspgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m
2(7,3
′‑
o)
gpppg、m
2(7,2
′‑
o)
gppspg(d1)、m
2(7,2
′‑
o)
gppspg(d2)、m
27,3
’‑ogppp(m
12
’‑o)apg、(m7g-3
′
mppp-g；其可以等效地表示3
′
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g)、n7,2
′‑
o-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧乙基)-g(5')ppp(5')g、n7-(4-氯苯氧乙基)-m3′‑og(5
′
)ppp(5
′
)g、7mg(5
′
)ppp(5
′
)n,pn2p、7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp、7mg(5
′
)-ppp(5
′
)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2
′
)apm(2
′
)apm(2
′
)cpm(2)(3,2
′
)up、肌苷、n1-甲基鸟苷、2
′‑
氟鸟苷、7-脱氮杂鸟苷、8-氧代鸟苷、2-氨基鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg和它们的组合。
[0087]
本公开内容还包括包含本公开内容的5'帽和经修饰的rna的多核苷酸(例如，包含编码il12b多肽、il12a多肽和/或il12b和il12a融合多肽的核苷酸序列的多核苷酸)。
[0088]
天然mrna的5'帽结构参与核输出(从而增加mrna稳定性)，并结合mrna帽结合蛋白(cbp)，其通过cbp与poly(a)结合蛋白缔合而导致细胞中mrna的稳定性和翻译能力以形成成熟的环状mrna种类。该帽进一步有助于在mrna剪接过程中去除5'近端内含子。
[0089]
内源性mrna分子可以是5'-末端加帽的，从而在末端鸟苷帽残基和mrna分子的5'-末端转录的有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸键。然后可以将该5'-鸟苷酸帽甲基化以生成n7-甲基-鸟苷酸残基。mrna的5'末端的末端和/或前末端转录核苷酸的核糖也可以任选地被2'-0-甲基化。通过水解和裂解鸟苷酸帽结构的5'-脱帽可以靶向核酸分子，例如mrna分子，以进行降解。
[0090]
根据本公开，5'末端帽可以包括内源帽或帽类似物。根据本公开，5'末端帽可包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括但不限于肌苷、n1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
[0091]
在一些方面，5’末端帽结构是capo、cap1、arca、肌苷、n1-甲基-鸟苷、2’氟-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基鸟苷、cap2、cap4、5'甲基g帽或其类似物。
[0092]
非限制性附加帽包括2017年11月23日公开的wo/2017/201350中公开的5'帽，其通过引用方式并入本文。
[0093]
在一些方面，半衰期延长部分包含fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、pas序列、hap序列、转铁蛋白或其片段、xten或其任何组合。
[0094]
在一些方面，半衰期延长部分包含fc。在一些方面，半衰期延长部分包含白蛋白或其片段。
[0095]
在一些方面，调控元件选自至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微rna结合位点或其种子、连接核苷的3'尾区、富含au的元素(are)、转录后控制调节物及其组合。
[0096]
在一些方面，调控元件还包含聚腺苷酸(polya)区域。在一些方面，本公开的经修饰的rna(例如，包含编码il12b多肽、il12a多肽和/或il12b和il12a融合多肽的核苷酸序列的多核苷酸)还包含poly-a尾。在某些方面，可以并入poly-a尾上的末端基团以实现稳定。在其他实施方案中，poly-a尾包含des-3'羟基尾。在rna加工过程中，可以将长链腺嘌呤核苷酸(poly-a尾)添加到多核苷酸(例如mrna分子)中以增加稳定性。
[0097]
转录后，转录物的3'端可立即被切割以释放3'羟基。然后poly-a聚合酶将腺嘌呤核苷酸链添加到rna中。称为聚腺苷酸化的该过程添加poly-a尾，其长度可以在例如大约80至大约250个残基之间，包括长约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个残基。
[0098]
聚腺苷酸尾也可以在构建体从细胞核输出后添加。
[0099]
根据本公开，可以并入聚腺苷酸尾上的末端基团以实现稳定化。本公开的多核苷酸可以包括des-3'羟基尾。它们还可以包括结构部分或2'-o甲基修饰，如junjie li,et al.(current biology,vol.15,1501-1507,august 23,2005，其内容通过引用整体并入本文)所教导的。另见2017年11月23日公布的wo/2017/201350，其通过引用并入本文，以用于额外的poly-a尾。
[0100]
在一些方面，经修饰的rna包含本文描述的任何修饰或修饰的组合。终端架构修改：未翻译区域(utr)
[0101]
基因的非翻译区(utr)被转录但不被翻译。5
′
utr从转录起始位点开始，一直延伸到起始密码子，但不包括起始密码子；而3'utr在终止密码子之后立即开始并持续直到转录终止信号。越来越多的证据表明，utr在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥着调节作用。utr的调节特征可以并入本公开的修饰的rna中以增强分子的稳定性。还可以合并特定功能以确保转录本的受控下调，以防它们被误导到不期望的器官部位。5
′
utr和翻译起始
[0102]
天然5'utr具有在翻译起始中起作用的特征。它们具有像kozak序列这样的特征，众所周知，这些特征参与了核糖体启动许多基因翻译的过程。kozak序列具有共同的ccr(a/g)ccaugg，其中r是起始密码子(aug)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“g”。还已知5'utr形成参与延伸因子结合的二级结构。
[0103]
参与延伸因子结合的5'utr二级结构可以与5'utr或3'utr中的其他rna结合分子相互作用以调节基因表达。例如，与5'utr中的二级结构元件结合的延伸因子eif4a2是microrna介导的抑制所必需的(meijer h a et al.,science,2013,340,82-85，其通过引用整体并入本文)。5'utr中的不同二级结构可以并入侧翼区域，以稳定或选择性地破坏特定组织或细胞中的mrna。
[0104]
通过将通常存在于特定靶器官的大量表达的基因中的特征工程化，可以增强本发明的核酸或mrna的稳定性和蛋白质生产。例如，引入的肝脏表达的mrna(如白蛋白、血清淀粉样蛋白a、载脂蛋白a/b/e、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子viii)的5'utr可用于增强核酸分子(例如mmrna)在肝细胞系或肝脏中的表达。同样，使用来自其他组织特异性mrna的5'utr来改善该组织中的表达是可能的——对于肌肉(myod、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素、力蛋白(herculin))、内皮细胞(tie-1、cd36)、骨髓细胞(c/ebp、aml1、g-csf、gm-csf、cd11b、msr、fr-1、i-nos)，白细胞(cd45、cd18)、脂肪组织(cd36、glut4、acrp30、脂联素)和肺上皮细胞(sp-a/b/c/d)。
[0105]
其他非utr序列可以并入5'(或3'utr)utr。例如，可以将内含子或内含子序列的一部分掺入本发明的核酸或mrna的侧翼区域。掺入内含子序列可能会增加蛋白质产量和mrna水平。
[0106]
在本公开的一些方面，来自gtx基因的ires序列的至少一个片段可以包括在5'utr中。作为一个非限制性实例，该片段可以是来自gtx基因的ires的18个核苷酸序列。作为另一个非限制性示例，来自gtx基因的ires序列的18个核苷酸序列片段可以在本文描述的多核苷酸的5'utr中串联重复。18个核苷酸的序列可以在5'utr中重复至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或十次以上。
[0107]
核苷酸可以从5'(或3')utr突变、替换和/或去除。例如，起始密码子上游的一个或多个核苷酸可以用另一个核苷酸替换。待替换的一个或多个核苷酸可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或多于60个的核苷酸。作为另一个示例，起始密码子上游的一个或多个核苷酸可以从utr中去除。5
′
utr、3
′
utr和翻译增强元件(tee)
[0108]
在一些方面，经修饰的rna的5'utr包含至少一种翻译增强子多核苷酸、翻译增强子元件、翻译增强子元件(统称为“tee”)。在一些方面，tee位于转录启动子和起始密码子之间。在一些方面，在5'utr中具有至少一个tee的经修饰的rna在5'utr处包含帽。在一些方面，至少一个tee可以位于进行帽依赖性或帽非依赖性翻译的经修饰的rna的5'utr中。
[0109]
术语“翻译增强子元件”或“翻译增强子元件”(本文统称为“tee”)是指增加由mrna产生的多肽或蛋白质的量的序列。
[0110]
一方面，tee是utr中的保守元件，其可以促进核酸的翻译活性，例如但不限于帽依赖性或帽非依赖性翻译。这些序列的保守性先前已由panek et al(nucleic acids research,2013,1-10；其通过引用整体并入本文)在包括人类在内的14个物种中显示。
[0111]
在一些方面，经修饰的rna具有至少一个tee，其与美国申请号2014/0147454中公开的具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同，该申请的全部内容通过引用并入本文。在一些
方面，经修饰的rna包括至少一种tee，其与以下文献中所描述的tee具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性：美国专利公开号us20090226470,us20070048776、us20130177581和us20110124100,国际专利公开号wo1999024595、wo2012009644、wo2009075886和wo2007025008，以及欧洲专利公开号ep2610341a1和ep2610340a1，美国专利no.6,310,197，美国专利no.6,849,405，美国专利no.7,456,273，美国专利no.7,183,395，每一者的全部内容均通过引用方式并入本文。
[0112]
在一些方面，经修饰的rna的5'utr可以包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个，至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或多于60个的tee序列。在一些方面，经修饰rna的5'utr中的tee序列是相同或不同的tee序列。在一些方面，tee序列的模式是例如重复一次、两次或三次以上的ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。在这些模式中，每个字母a、b或c代表核苷酸水平上的不同tee序列。
[0113]
在一些方面，分隔两个tee序列的间隔子包括本领域已知的调节经修饰的rna(例如但不限于本文描述的mir序列(例如，mir结合位点和mir种子))的翻译的其他序列。在一些方面，用于分隔两个tee序列的每个间隔子包括不同的mir序列或mir序列的组分(例如，mir种子序列)。
[0114]
在一些方面，在本发明的经修饰的rna的5'utr中使用的tee是ires序列，例如但不限于美国专利no.7,468,275和国际专利公开号wo2001055369中所描述的那些，每一者的全部内容均通过引用并入本文。
[0115]
在一些方面，本文描述的tee位于经修饰的rna的5'utr和/或3'utr中。在一些方面，位于3'utr中的tee与位于5'utr中的tee和/或针对并入5'utr中所描述的tee相同和/或不同。
[0116]
在一些方面，经修饰的rna的3'utr可以包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个，至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或多于60个的tee序列。在一些方面，本公开的经修饰的rna的3'utr中的tee序列是相同或不同的tee序列。tee序列的模式是例如重复一次、两次或三次以上的ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。在这些模式中，每个字母a、b或c代表核苷酸水平上的不同tee序列。
[0117]
在一些方面，3'utr包括分隔两个tee序列的间隔子。在一些方面，间隔子是15个核苷酸的间隔子和/或本技术领域已知的其他间隔子。在一些方面，3'utr可以包括在3'utr中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次和至少9次或超过9次的tee序列间隔子模块。
[0118]
在一些方面，分隔两个tee序列的间隔子包括本领域已知的调节经修饰的rna(例如但不限于本文描述的mir序列(例如，mir结合位点和mir种子))的翻译的其他序列。在一
些方面，用于分隔两个tee序列的每个间隔子包括不同的mir序列或mir序列的组分(例如，mir种子序列)。整合microrna结合位点
[0119]
在一些方面，经修饰的rna还包含传感器序列。传感器序列包括，例如，微rna结合位点、转录因子结合位点、结构化mrna序列和/或基序、人工结合位点，这些人工结合位点被工程化以用作内源核酸结合分子的假受体。包含至少一个传感器序列的多核苷酸的非限制性示例在美国申请no.2014/0147454中有所描述，该申请的全部内容通过引用并入本文。
[0120]
在一些方面，进行靶细胞或组织的微rna(mirna)谱分析以确定细胞或组织中是否存在mirna。
[0121]
微rna(或mirna)是19-25个核苷酸长的非编码rna，其结合核酸分子的3'utr并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。在一些方面，经修饰的rna包含一种或多种微rna靶序列、微rna序列或微rna种子。此类序列可对应于任何已知的微rna，例如美国公布us2005/0261218和美国公布us2005/0059005中教导的那些，其内容通过引用整体并入本文。作为非限制性示例，人类基因组中已知的微rna、它们的序列和种子序列在美国申请no.2014/0147454中有所描述，该申请通过引用整体并入本文。
[0122]
微rna序列包含“种子”区域，即成熟微rna的位置2-8区域中的序列，该序列与mirna靶序列具有完美的watson-crick互补性。微rna种子包含成熟微rna的位置2-8或2-7。在一些方面，微rna种子包含7个核苷酸(例如，成熟微rna的第2-8位核苷酸)，其中相应mirna靶标中的种子互补位点侧接与微rna位置1相反的腺嘌呤(a)。在一些方面，微rna种子包含6个核苷酸(例如，成熟微rna的核苷酸2-7)，其中相应mirna靶标中的种子互补位点侧接与微rna位置1相对的腺嘌呤(a)。参见例如，grimson a,farh k k,johnston w k,garrett-engele p,lim l p,bartel d p；mol cell.2007 jul.6；27(1):91-105。微rna种子的碱基与靶序列具有完全互补性。通过将微rna靶序列工程化到本发明的核酸或mrna的3'utr中，可以靶向该分子以进行降解或减少翻译，前提是所讨论的微rna是可用的。该过程将降低核酸分子递送时脱靶效应的危险。microrna、microrna靶区域及其在生物学中的表达模式和作用的鉴定已经被报道(bonauer et al.,curr drug targets 2010 11:943-949；anand and cheresh curr opin hematol 2011 18:171-176；contreras and rao leukemia 2012 26:404-413(2011dec.20.doi:10.1038/leu.2011.356)；bartel cell 2009 136:215-233；landgraf et al,cell,2007 129:1401-1414；gentner and naldini,tissue antigens.2012 80:393-403及其中的所有参考文献；其中的每一者都通过引用整体并入本文)。
[0123]
例如，如果mrna不旨在被递送到肝脏但最终在那里结束，那么mir-122(一种在肝脏中丰富的微rna)可以抑制感兴趣的基因的表达，条件是mir-122被工程化到经修饰的核酸、经增强修饰的rna或核糖核酸的3'utr中。可以设计为不同的microrna引入一个或多个结合位点，以进一步降低经修饰的核酸、经增强修饰的rna或核糖核酸的寿命、稳定性和蛋白质翻译。如本文所使用的，术语“微rna位点”是指微rna靶位点或微rna识别位点、或微rna结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解，“结合”可遵循传统的watson-crick杂交规则或可反映微rna与在微rna位点处或附近的靶序列的任何稳定缔合。
[0124]
相反，为了本发明的经修饰的核酸、经增强修饰的rna或核糖核酸的目的，微rna结
合位点可以从它们天然存在的序列中工程化出来(即从中移除)以增加蛋白质在特定组织中的表达。例如，可以去除mir-122结合位点以改善肝脏中的蛋白质表达。
[0125]
在一些方面，经修饰的rna在3'utr中包括至少一个mirna结合位点，以便将细胞毒性或细胞保护性mrna治疗剂引导至特定细胞，例如但不限于正常细胞和/或癌细胞(例如，hep3b或snu449)。
[0126]
组织(其中已知microrna调节mrna从而调节蛋白质表达)的示例包括但不限于肝脏(mir-122)、肌肉(mir-133、mir-206、mir-208)、内皮细胞(mir-17-92、mir-126)、骨髓细胞(mir-142-3p、mir-142-5p、mir-16、mir-21、mir-223、mir-24、mir-27)、脂肪组织(let-7、mir-30c)、心脏(mir-1d、mir-149)、肾脏(mir-192、mir-194、mir-204)和肺上皮细胞(let-7、mir-133、mir-126)。
[0127]
具体而言，已知微rna在免疫细胞(也称为造血细胞)中差异表达，该免疫细胞例如抗原呈递细胞(apc)(例如树突细胞和巨噬细胞)、巨噬细胞、单核细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等。免疫细胞特异性微rna参与免疫原性、自身免疫、对感染、炎症的免疫反应、以及基因治疗和组织/器官移植后的不良免疫反应。免疫细胞特异性微rna还调节造血细胞(免疫细胞)的发育、增殖、分化和凋亡的许多方面。例如，mir-142和mir-146仅在免疫细胞中表达，在髓样树突状细胞中尤为丰富。本领域中已证明，通过将mir-142结合位点添加到递送基因构建体的3'utr可以关闭对外源核酸分子的免疫反应，从而能够在组织和细胞中实现更稳定的基因转移。mir-142有效地降解抗原呈递细胞中的外源mrna并抑制转导细胞的细胞毒性消除(annoni a et al.,blood,2009,114,5152-5161；brown b d,et al.,nat med.2006,12(5),585-591；brown b d,et al.,blood,2007,110(13):4144-4152，其中每一者都通过引用整体并入本文)。
[0128]
本技术领域进行了许多微rna表达研究以描述微rna在各种癌细胞/组织和其他疾病中的差异表达。一些微rna在某些癌细胞中异常过度表达，而另一些则表达不足。例如，微rna在癌细胞(wo2008/154098,us2013/0059015,us2013/0042333,wo2011/157294)；癌症干细胞(us2012/0053224)；胰腺癌和疾病(us2009/0131348,us2011/0171646,us2010/0286232,美国专利no.8,389,210)；哮喘和炎症(美国专利no.8,415,096)；前列腺癌(us2013/0053264)；肝细胞癌(wo2012/151212,us2012/0329672,wo2008/054828,美国专利号8,252,538)；肺癌细胞wo2011/076143,wo2013/033640,wo2009/070653,us2010/0323357)；皮肤t细胞淋巴瘤(wo2013/011378)；结直肠癌细胞(wo2011/0281756,wo2011/076142)；癌症阳性淋巴结(wo2009/100430,us2009/0263803)；鼻咽癌(ep2112235)；慢性阻塞性肺病(us2012/0264626,us2013/0053263)；甲状腺癌(wo2013/066678)；卵巢癌细胞(us2012/0309645,wo2011/095623)；乳腺癌细胞(wo2008/154098,wo2007/081740,us2012/0214699)、白血病和淋巴瘤(wo2008/073915,us2009/0092974,us2012/0316081,us2012/0283310,wo2010/018563，其内容均通过引用整体并入本文。)中差异表达。
[0129]
至少一个微rna位点可以被工程化到经修饰的rna的3'utr中。在一些方面，可以将至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个微rna位点工程化到经修饰的rna的3'utr。在一些方面，并入经修饰的rna中的微rna位点是相同或不同的微rna位点。在一些方面，并入经修饰的rna中的微rna位点靶向体内相同或不同的组织。作为一个非限制性示例，通过在经修饰的核酸mrna的3'utr中引
入组织-、细胞类型-或疾病-特异性的微rna结合位点，可减少在特定细胞类型(例如肝细胞、髓系细胞、内皮细胞、癌细胞等)中的表达程度。
[0130]
在一些方面，微rna位点被设计在3'utr的5'末端附近、在3'utr的5'末端和3'末端之间的大约一半处和/或在3'utr的3'末端附近。在一些方面，微rna位点被设计在3'utr的5'末端附近和3'utr的5'末端与3'末端之间的大约一半处。在一些方面，微rna位点被设计在3'utr的3'末端附近和在3'utr的5'末端与3'末端之间的大约一半处。在一些方面，微rna位点被设计在3'utr的5'末端附近和在3'utr的3'末端附近。
[0131]
在一些方面，经修饰的信使rna包含与已知种子序列具有100％同一性或与种子序列具有小于100％同一性的微rna结合区位点。可以部分突变种子序列以减少微rna结合亲和力，因此导致该mrna转录本的下调减少。本质上，靶mrna和微rna种子之间的匹配或不匹配程度可以充当变阻器，以更精细地调节微rna调节蛋白质表达的能力。此外，微rna结合位点的非种子区域的突变也可能影响微rna调节蛋白质表达的能力。rna结合蛋白(rbp)的rna基序
[0132]
rna结合蛋白(rbp)可以调节共转录基因表达和转录后基因表达的许多方面，例如但不限于rna剪接、定位、翻译、转换、聚腺苷酸化、加帽、修饰、输出和定位。rna结合域(rbd)，例如但不限于rna识别基序(rr)和hnrnpk同源(kh)域，通常调节rbp与其rna靶标之间的序列关联(ray et al.nature 2013.499:172-177；通过引用将其全部并入本文)。在一些方面，规范的rbd结合短的rna序列。在一些方面，规范的rbd识别rna结构。
[0133]
rna结合蛋白和相关核酸和蛋白质序列的非限制性示例在美国申请no.2014/0147454中有所描述，其通过引用整体并入本文。
[0134]
在一些方面，为了增加感兴趣的mrna的稳定性，将编码hur的mrna与感兴趣的mrna一起共转染或共注射到细胞或组织中。这些蛋白质也可以在体外与感兴趣的mrna相连，然后一起施用于细胞。polya尾部结合蛋白pabp与真核翻译起始因子eif4g相互作用以刺激翻译起始。将编码这些rbp的mrna与mrna药物共同施用和/或在体外将这些蛋白质拴在mrna药物上并将与蛋白质结合的mrna施用到细胞中可以提高mrna的翻译效率。相同的构思可以扩展到mrna与编码各种翻译因子和促进剂的mrna以及与蛋白质本身的共同施用，以影响rna稳定性和/或翻译效率。
[0135]
在一些方面，经修饰的rna包含至少一个rna结合基序，例如但不限于rna结合结构域(rbd)。
[0136]
在一些方面，连接的核苷的第一区域和/或至少一个侧翼区域包含至少一个rbd。在一些方面，连接的核苷的第一区域包含与剪接因子相关的rbd并且至少一个侧翼区域包含用于稳定性和/或翻译因子的rbd。3
′
utr中的其他调控元件
[0137]
除了微rna结合位点之外，天然mrna的3'-utr中调节mrna在不同组织和细胞中的稳定性和翻译的其他调节序列可以被去除或引入经修饰的信使rna中。此类顺式调控元件可包括但不限于顺式-rnp(核糖核蛋白)/rbp(rna结合蛋白)调控元件、富au元件(aue)、结构化茎环、组成性衰变元件(cde)、gc丰富度和其他结构化mrna基序(parker b j et al.,genome research,2011,21,1929-1943，其通过引用整体并入本文)。例如，cde是一类通过与roquin蛋白相互作用介导mrna降解的调节基序。具体而言，cde存在于许多编码发育和炎
症调节剂以限制巨噬细胞中细胞因子产生的mrna中(leppek k et al.,2013,cell,153,869-881，其通过引用整体并入本文)。
[0138]
在一些方面，经修饰的mrna是营养缺陷型的。如本文所使用的，术语“营养缺陷型”是指包含至少一种特征的mrna，所述特征触发、促进或诱导mrna的降解或失活以响应空间或时间线索，使得蛋白质表达基本上被阻止或减少。这种空间或时间线索包括要翻译的mrna的位置，例如特定的组织或器官或细胞环境。还考虑了涉及温度、ph、离子强度、水分含量等的线索。3
′
utr和富含au的元件
[0139]
已知3'utr具有嵌在其中的腺苷和尿苷片段。这些富含au的特征在具有高周转率的基因中特别普遍。根据它们的序列特征和功能特性，富含au的元素(are)可以分为三类(chen et al,1995)：i类are包含在富含u的区域内的auuua基序的几个分散副本。c-myc和myod包含i类are。ii类are拥有两个或多个重叠的uuauuua(u/a)(u/a)九聚体。含有此类are的分子包括gm-csf和tnf-a。iii类ares不太明确。这些富含u的区域不包含auuua基序。c-jun和myogenin是这种的类型的两个充分研究的示例。已知大多数与are结合的蛋白质会破坏信使的稳定性，而elav家族的成员，尤其是hur，已被证明可以增加mrna的稳定性。hur结合到所有三个类别的are。将hur特异性结合位点设计到核酸分子的3'utr中将导致hur结合，从而在体内稳定信息。
[0140]
3'utr au富集元件(are)的引入、去除或修饰可用于调节本发明的核酸或mrna的稳定性。当对特定核酸或mrna进行设计时，可以引入一个或多个拷贝的are以使本发明的核酸或mrna不太稳定，从而减少翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，可以鉴定和去除或突变are以增加细胞内的稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和生产。可以使用本发明的核酸或mrna在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的不同时间点检测蛋白质生产。例如，可以用不同的are工程分子转染细胞，并使用elisa试剂盒检测相关蛋白质，并检测转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。3
′
utr和三股螺旋
[0141]
在一些方面，经修饰的rna在经修饰的核酸、经增强修饰的rna或核糖核酸的3'端包含三股螺旋。在一些方面，经修饰的rna的3'端包括单独的三股螺旋或三股螺旋与poly-a尾的组合。
[0142]
在一些方面，经修饰的rna至少包含第一和第二富含u区、第一和第二区之间的保守茎环区以及富含a区。在一些方面，第一和第二富含u区和富含a区缔合以在核酸的3'端形成三股螺旋。该三股螺旋可以稳定核酸，提高核酸的翻译效率和/或保护3'端免于降解。示例性的三股螺旋包括但不限于转移相关肺腺癌转录本1(malat1)、men-β和聚腺苷酸化核(pan)rna的三螺旋序列(参见wilusz et al.,genes&development 2012 26:2392-2407；通过引用将其整体并入本文)。茎环
[0143]
在一些方面，经修饰的rna包括茎环，例如但不限于组蛋白茎环。在一些方面，茎环是长度为约25或约26个核苷酸的核苷酸序列，例如但不限于国际专利公开no.wo2013103659中描述的seq id no：7-17，其通过引用整体并入本文。组蛋白茎环可位于编码区的3'端(例如，在编码区的3'末端)。作为非限制性示例，茎环可位于本文所述核酸的
3'端。
[0144]
在一些方面，包含组蛋白茎环的经修饰的rna可以通过添加至少一个链终止核苷来稳定。不希望受理论束缚，添加至少一个链终止核苷可减缓核酸的降解并因此可增加核酸的半衰期。
[0145]
在一些方面，链终止核苷是国际专利公开no.wo2013103659中描述的一种核苷，其通过引用整体并入本文。在一些方面，链终止核苷是3'-脱氧腺苷(虫草素)、3'-脱氧尿苷、3'-脱氧胞嘧啶、3'-脱氧鸟苷、3'-脱氧胸腺嘧啶、2',3'-双脱氧核苷(例如2',3'-双脱氧腺苷)、2',3'-双脱氧尿苷、2',3'-双脱氧胞嘧啶、2',3'-双脱氧鸟苷、2',3'-双脱氧胸腺嘧啶、2'-脱氧核苷或-o-甲基核苷。
[0146]
在一些方面，经修饰的rna包括组蛋白茎环、polya尾序列和/或5'帽结构。在一些方面，组蛋白茎环在多聚腺苷酸尾序列之前和/或之后。包含组蛋白茎环和polya尾序列的核酸可包括本文所述的链终止核苷。
[0147]
在一些方面，修饰的rna包含组蛋白茎环和5'帽结构。5'帽结构可包括但不限于本文所述和/或本领域已知的那些。5'帽盖
[0148]
mrna的5'帽结构参与核输出，增加mrna稳定性并结合mrna帽结合蛋白(cbp)，其通过cbp与多聚糖(a)结合蛋白缔合而导致mrna在细胞和翻译能力中的稳定性以形成成熟的环状mrna种类。该帽还有助于在mrna剪接过程中去除的5'近端内含子的去除。
[0149]
内源性mrna分子可以是5'-末端加帽的，从而在末端鸟苷帽残基和mrna的5'-末端转录的有义核苷酸之间产生5'-ppp-5'-三磷酸键。然后可以将该5'-鸟苷酸帽甲基化以生成n7-甲基-鸟苷酸残基。mrna的5'端的末端和/或前末端转录核苷酸的核糖也可以任选地被2'-o-甲基化。通过鸟苷酸帽结构的水解和裂解进行的5'-脱帽可以靶向核酸分子，例如mrna分子，以进行降解。
[0150]
对本公开的rna的修饰可以产生不可水解的帽结构，从而防止脱帽并因此增加mrna半衰期。因为帽结构水解需要切割5'-ppp-5'磷酸二酯键，所以在加帽反应期间可以使用经修饰的核苷酸。例如，根据制造商的说明，可以将来自new england biolabs(ipswich,mass.)的牛痘加帽酶与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸酯键。可以使用额外的经修饰的鸟苷核苷酸，例如α-甲基-膦酸和硒代磷酸核苷酸。
[0151]
其他修饰包括但不限于糖环的2'-羟基上mrna(如上所述)的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖的2'-o-甲基化。多个不同的5'-帽结构可用于产生核酸分子(如mrna分子)的5'-帽。
[0152]
在本文中也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或结构或功能帽类似物的帽类似物与天然(即内源、野生型或生理)5'-帽的不同之处在于它们的化学结构，同时保留帽功能。帽类似物可以化学(即非酶促)或酶促合成和/连接至核酸分子。
[0153]
例如，抗反向帽类似物(arca)帽包含两个通过5'-5'-三磷酸基团连接的鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤包含n7甲基以及3'-o-甲基(即n7,3'-o-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷(m7g-3'mppp-g；其可等效地表示3'o-me-m7g(5')ppp(5')g)。另一个未经修饰的鸟嘌呤的3'-o原子与加帽核酸分子(例如mrna或mmrna)的5'-末端核苷酸连接。n7-和3'-o-甲基化鸟嘌呤提供加帽核酸分子(例如mrna或mmrna)的末端部分。
[0154]
另一个示例性帽是mcap，它类似于arca，但在鸟苷上具有2'-β-甲基(即，n7,2'-o-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7gm-ppp-g)。
[0155]
在一些方面，帽是二核苷酸帽类似物。在一些方面，二核苷酸帽类似物在不同的磷酸盐位置被硼磷酸基团或硒代磷酸基团修饰，例如美国专利no.8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物，其内容通过引用整体并入本文。
[0156]
在一些方面，帽是帽类似物，其是本领域已知和/或本文描述的帽类似物的n7-(4-氯苯氧乙基)取代的双核苷酸形式。n7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式的帽类似物的非限制性示例包括n7-(4-氯苯氧基乙基)-g(5')ppp(5')g和n7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-og(5')ppp(5')g帽类似物(参见例如k kore et al.bioorganic&medicinal chemistry 2013 21:4570-4574中描述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法；其内容通过引用整体并入本文)。在一些方面，本发明的帽类似物是4-氯/溴苯氧乙基类似物。
[0157]
虽然帽类似物允许在体外转录反应中同时对核酸分子进行加帽，但高达20％的转录物仍未加帽。这一点以及帽类似物与由内源性细胞转录机制产生的核酸的内源性5'-帽结构的结构差异可能导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。
[0158]
在一些方面，提供具有5'-帽或5'-帽类似物的rna是通过在所述5'-帽或5'-帽类似物存在下体外转录dna模板来实现的，其中所述5'-帽被共转录并入生成的rna链中，
[0159]
在一些方面，rna可以例如通过体外转录产生，并且5'帽可以使用加帽酶例如牛痘病毒的加帽酶在转录后连接到rna。在一些方面，经修饰的rna使用酶在转录后加帽，以产生更真实的5'-帽结构。如在本文中使用的短语“更真实”是指在结构上或功能上密切反映或模仿内源或野生型特征的特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物等相比，“更真实”的特征更好地代表了内源性、野生型、自然或生理细胞功能和/或结构，或者在一个或多个方面优于相应的内源性、野生型、自然或生理特征。本发明的更真实的5'帽结构的非限制性示例是那些与本领域已知的合成5'帽结构(或与野生型、自然或生理5'帽结构)相比具有增强的帽结合蛋白的结合、增加的半衰期、降低的对5'核酸内切酶的敏感性和/或减少的5'脱帽。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2'-o-甲基转移酶可以在mrna的5'-末端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生规范的5'-5'-三磷酸键，其中帽鸟嘌呤含有n7甲基化并且mrna的5'-末端核苷酸含有2'-o-甲基。与例如本领域已知的其他5'帽类似物结构相比，该帽导致更高的翻译能力和细胞稳定性以及活性降低的细胞促炎细胞因子。帽结构包括mg(5
′
)ppp(5
′
)n,pn2p、7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp、7mg(5
′
)-ppp(5
′
)nlmpn2 mp和m(7)gpppm(3)(6,6,2
′
)apm(2
′
)apm(2
′
)cpm(2)(3,2
′
)up。
[0160]
在一些方面，5'末端帽包括内源性帽或帽类似物。在一些方面，5'末端帽包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括肌苷、n1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
[0161]
在一些方面，5'帽包含5'至5'三磷酸键。在一些方面，5’帽包含5’至5’三磷酸键，其包括硫代磷酸修饰。在一些方面，5’帽包含2
’‑
o或3
’‑
o-核糖甲基化核苷酸。在一些方面，5’帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些方面，5’帽包含7-甲基鸟苷酸。示例性帽结构包括m7g(5’)ppp(5’)g、m7,2`o-mg(5’)ppsp(5’)g、m7g(5’)ppp(5’)2`o-mg和m7,3`o-mg(5’)ppp(5’)2`o-ma。
[0162]
在一些方面，经修饰的rna包含经修饰的5'帽。对5'帽的修饰可以增强mrna的稳定
性，增加mrna的半衰期，并可以提高mrna的翻译效率。在一些方面，经修饰的5'帽包含以下修饰中的一种或多种：在加帽的三磷酸鸟苷(gtp)的2'和/或3'位置处的修饰、糖环氧(其产生碳环环)与亚甲基部分(ch2)的置换、帽结构的三磷酸桥部分的修饰或核碱基(g)部分的修饰。
[0163]
可被修饰的5'帽结构包括但不限于美国申请no.2014/0147454和wo2018/160540中描述的帽，其通过引用整体并入本文。ires序列
[0164]
在一些方面，经修饰的rna包含内部核糖体进入位点(ires)。ires首先被鉴定为一种特征性的小核糖核酸病毒rna，在缺乏5'帽结构的情况下，ires在启动蛋白质合成方面起着重要作用。ires可以充当唯一的核糖体结合位点，或者可以充当mrna的多个核糖体结合位点之一。含有一个以上的功能性核糖体结合位点的核酸或mrna可以编码几种由核糖体独立翻译的肽或多肽(“多顺反子核酸分子”)。当核酸或mrna与ires一起提供时，还可选地提供第二个可翻译区。根据本发明可以使用的ires序列的示例包括但不限于，来自小核糖核酸病毒(例如fmdv)、害虫病毒(cffv)、脊髓灰质炎病毒(pv)、脑心肌炎病毒(ecmv)、口蹄疫病毒(fmdv)、丙型肝炎病毒(hcv)、经典猪瘟病毒(csfv)、鼠类白血病病毒(mlv)、猿猴免疫缺陷病毒(siv)或蟋蟀麻痹病毒(crpv)的那些。终端架构修改：poly-a尾
[0165]
在rna加工过程中，通常将长链腺嘌呤核苷酸(poly-a尾)添加到信使rna(mrna)分子以增强分子的稳定性。转录后，转录物的3'端立即被切割以释放3'羟基。然后poly-a聚合酶将腺嘌呤核苷酸链添加到rna中。称为聚腺苷酸化的该过程增加了长度在100到250个残基之间的聚腺苷酸尾。
[0166]
在一些方面，3'尾的长度是大于30个核苷酸的长度。在一些方面，poly-a尾的长度大于35个核苷酸。在一些方面，长度为至少40个核苷酸。在一些方面，长度是至少45个核苷酸。在一些方面，长度是至少55个核苷酸。在一些方面，长度是至少60个核苷酸。在一些方面，长度是至少60个核苷酸。在一些方面，长度为至少80个核苷酸。在一些方面，长度为至少90个核苷酸。在一些方面，长度为至少100个核苷酸。在一些方面，长度是至少120个核苷酸。在一些方面，长度是至少140个核苷酸。在一些方面，长度为至少160个核苷酸。在一些方面，长度是至少180个核苷酸。在一些方面，长度是至少200个核苷酸。在一些方面，长度为至少250个核苷酸。在一些方面，长度为至少300个核苷酸。在一些方面，长度为至少350个核苷酸。在一些方面，长度是至少400个核苷酸。在一些方面，长度为至少450个核苷酸。在一些方面，长度是至少500个核苷酸。在一些方面，长度是至少600个核苷酸。在一些方面，长度是至少700个核苷酸。在一些方面，长度为至少800个核苷酸。在一些方面，长度为至少900个核苷酸。在一些方面，长度是至少1000个核苷酸。在一些方面，长度是至少1100个核苷酸。在一些方面，长度是至少1200个核苷酸。在一些方面，长度是至少1300个核苷酸。在一些方面，长度是至少1400个核苷酸。在一些方面，长度是至少1500个核苷酸。在一些方面，长度是至少1600个核苷酸。在一些方面，长度是至少1700个核苷酸。在一些方面，长度为至少1800个核苷酸。在一些方面，长度是至少1900个核苷酸。在一些方面，长度是至少2000个核苷酸。在一些方面，长度是至少2500个核苷酸。在一些方面，长度为至少3000个核苷酸。
[0167]
在一些方面，经修饰的rna被设计成包括polya-g四联体。g四联体是四个鸟嘌呤核
苷酸的环状氢键阵列，其可由dna和rna中富含g的序列形成。在这方面，g-四联体被并入poly-a尾的末端。可以测定所得核酸或mrna的稳定性、蛋白质产量和其他参数，包括不同时间点的半衰期。已经发现，polya-g四联体产生的蛋白质产量相当于单独使用120个核苷酸的poly-a尾所得到的蛋白质产量的至少75％。
[0168]
在一些方面，经修饰的rna包含polya尾并且通过添加链终止核苷来稳定。在一些方面，具有多聚腺苷酸尾的经修饰的rna还包含5'帽结构。
[0169]
在一些方面，经修饰的rna包含polya-g四联体。在一些方面，具有polya-g四联体的经修饰的rna还包含5'帽结构。
[0170]
在一些方面，包含polya尾或polya-g四联体的经修饰的rna通过添加终止于3'-脱氧核苷、2',3'-双脱氧核苷、3'-0-甲基核苷、3'-0-乙基核苷、3'-阿拉伯糖苷和本领域已知和/或本文描述的其他修饰的核苷来稳定。经修饰的核苷
[0171]
在一些方面，经修饰的rna包含一种或多种经修饰的核苷。在一些方面，一种或多种经修饰的核苷包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、n1-甲基-伪尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代尿苷、4-硫代尿苷、6-氮杂尿苷、5-羟基尿苷、脱氧胸苷、假尿苷、肌苷、α-硫代鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合。
[0172]
在一些方面，经修饰的rna中的一个或多个尿苷被经修饰的核苷替代。在一些方面，取代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5u)。
[0173]
在一些方面，经修饰的rna包含如美国申请号2014/0147454、国际申请wo2018160540、国际申请wo2015/196118或国际申请wo2015/089511中所述的经修饰的rna，其通过引用整体并入本文。细胞毒性核苷
[0174]
在一些方面，经修饰的rna包含一种或多种细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以掺入多核苷酸，例如经双功能修饰的rna或mrna。细胞毒性核苷抗癌剂包括但不限于腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、(替加氟和尿嘧啶的组合)、替加氟((rs)-5-氟-1-(四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1h,3h)-二酮)和6-巯基嘌呤。
[0175]
许多细胞毒性核苷类似物作为抗癌剂在临床上使用，或者已经成为临床试验的对象。此类类似物的示例包括但不限于阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、地西他滨、替扎西他滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷(dmdc)、克拉屈滨、氯法拉滨、5-氮杂胞苷、4'-硫代阿拉伯胞苷，环戊烯基胞嘧啶和1-(2-c-氰基-2-脱氧-β-d-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶。这种化合物的另一个示例是磷酸氟达拉滨。这些化合物可以全身给药并且可能具有细胞毒剂典型的副作用，例如但不限于相比于增殖正常细胞，对肿瘤细胞的特异性小或没有。
[0176]
本技术领域还报道了许多细胞毒性核苷类似物的前药。示例包括但不限于n4-山嵛酰基-1-β-d-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶、n4-十八烷基-1-β-d-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶、n4-棕榈酰-1-(2-c-氰基-2-脱氧-β-d-阿拉伯-戊呋喃糖基)胞嘧啶和p-4055(阿糖胞苷5'-反油酸
酯)。一般来说，这些前药可能主要在肝脏和体循环中转化为活性药物，在肿瘤组织中显示很少或没有选择性释放活性药物。例如，卡培他滨(一种5'-脱氧-5-氟胞苷(最终为5-氟尿嘧啶)的前体药物)在肝脏和肿瘤组织中都被代谢。fujiu等人(美国专利no.4,966,891)要求保护一系列含有“在生理条件下易于水解的自由基”的卡培他滨类似物，该专利通过引用并入本文。fujiu描述的系列包括5'-脱氧-5-氟胞苷的氨基甲酸n4烷基酯和芳烷基酯，暗示这些化合物在正常生理条件下会通过水解被激活以提供5'-脱氧-5-氟胞苷。
[0177]
fadl等人(pharmazie.1995,50,382-7，其通过引用整体并入本文)已经报道了一系列阿糖胞苷n4-氨基甲酸酯，其中化合物被设计成在肝脏和血浆中转化为阿糖胞苷。wo2004/041203(其通过引用整体并入本文)公开了吉西他滨的前药，其中一些前药是n4-氨基甲酸酯。这些化合物被设计成克服吉西他滨的胃肠道毒性，并旨在通过在从胃肠道吸收完整的前药后在肝脏和血浆中水解释放来提供吉西他滨。nomura等人(bioorg med.chem.2003,11,2453-61，其通过引用整体并入本文)描述了1-(3-c-乙炔基-β-d-核糖-戊法拉糖基)胞嘧啶的缩醛衍生物，其在生物还原中产生了中间体，该中间体需要在酸性条件下进一步水解以产生细胞毒性核苷化合物。
[0178]
可以是化疗物的细胞毒性核苷酸还包括但不限于吡唑并[3,4-d]-嘧啶、别嘌呤醇、硫唑嘌呤、卡培他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿昔洛韦、阿糖腺苷(ara-adenosine)、利巴韦林、7-脱氮杂-腺苷、7-脱氮杂-鸟苷、6-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-胞苷、胸苷核糖核苷酸、5-溴脱氧尿苷、2-氯-嘌呤和肌苷或其组合。编码序列
[0179]
在本公开的一些方面，经修饰的rna包含编码白细胞介素(il)-12分子的序列。在一些方面，il-12分子包含il-12、il-12亚基或保留免疫调节功能的突变体il-12分子。
[0180]
在一些方面，il-12包含与seq id no:1有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％，至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
[0181]
在一些方面，il-12分子包含il-12α和/或il-12β亚基。在一些方面，il-12a亚基包含与seq id no:2有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
[0182]
在一些方面，il-12β亚基包含与seq id no:3有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
[0183]
在一些方面，il-12α亚基和il-12β亚基通过接头连接。在一些方面，接头包含至少约2个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。在一些方面，接头包含(gs)接头。在一些方面，gs接头具有式(gly4ser)n或s(gly4ser)n，其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100的正整数。在一些方面，(gly4ser)n接头是(gly4ser)3或(gly4ser)4。
[0184]
在一些方面，il12分子包含与seq id no:4或seq id no:5有至少约70％、至少约
75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
[0185]
在一些方面，经修饰的mrna包含与seq id no:6有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。
[0186]
在一些方面，经修饰的rna包含与seq id no:7有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。
[0187]
在一些方面，经修饰的rna包含与seq id no:8有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。
[0188]
在一些方面，经修饰的rna包含与seq id no:9有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。
[0189]
在一些方面，经修饰的rna包含核苷酸序列或编码与表2中的序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸。
[0190]
在国际申请号wo2017201350和wo2018/160540中公开了额外的序列，其通过引用整体并入本文。表2
[0191]
在一些方面，经修饰的rna包含一种或多种具有实验或治疗意义的基因。在一些方面，具有实验或治疗意义的基因编码除il-12之外的细胞因子、趋化因子或生长因子。细胞因子在本领域中是已知的，并且该术语本身是指由免疫系统内的某些细胞分泌并对其他细胞产生影响的小蛋白质的广义分组。已知细胞因子可增强细胞免疫反应，并且如本文所使用的，可包括但不限于tnfα、ifn-γ、ifn-α、tgfβ、il-1、il-2、il-4、il-10、il-13、il-17、il-18和趋化因子。趋化因子可用于研究感染反应、免疫反应、炎症、外伤、败血症、癌症和生殖等应用。趋化因子在本技术领域中是已知的，并且是一种细胞因子，其在附近的反应性细胞(通常是白细胞)中诱导对感染部位的趋化性。趋化因子的非限制性示例包括ccl14、ccl19、ccl20、ccl21、ccl25、ccl27、cxcl12、cxcl13、cxcl-8、ccl2、ccl3、ccl4、ccl5、ccl11,和cxcl10。生长因子是本技术领域已知的并且该术语本身有时可以与术语细胞因子互换。如
本文所使用的，术语“生长因子”是指能够在细胞之间发出信号并刺激细胞生长的天然存在的物质。虽然细胞因子可能是生长因子，但某些类型的细胞因子也可能对细胞生长具有抑制作用，因此区分了这两个术语。生长因子的非限制性示例包括肾上腺髓质素(am)、血管生成素(ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(bmp)、睫状神经营养因子(cntf)、白血病抑制因子(lif)、白细胞介素6(il-6)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、表皮生长因子(efg)、肝配蛋白(ephrin)a1、ephrin a2、ephrin a3、ephrin a4、ephrin a5、ephrin b1、ephrin b2、ephrin b3、促红细胞生成素(epo)、成纤维细胞生长因子-1(fgf1)、成纤维细胞生长因子2(fgf2)、成纤维细胞生长因子3(fgf3)、成纤维细胞生长因子4(fgf4)、成纤维细胞生长因子5(fgf5)、成纤维细胞生长因子6(fgf6)、成纤维细胞生长因子7(fgf7)、成纤维细胞生长因子8(fgf8)、成纤维细胞生长因子9(fgf9)、成纤维细胞生长因子10(fgf10)、成纤维细胞生长因子11(fgf11)、成纤维细胞生长因子12(fgf12)、成纤维细胞生长因子13(fgf13)、成纤维细胞生长因子14(fgf14)、成纤维细胞生长因子15(fgf15)、成纤维细胞生长因子16(fgf16))、成纤维细胞生长因子17(fgf17)、成纤维细胞生长因子18(fgf18)、成纤维细胞生长因子19(fgf19)、成纤维细胞生长因子20(fgf20)、成纤维细胞生长因子21(fgf21)、成纤维细胞生长因子22(fgf22)、成纤维细胞生长因子23(fgf23)、胎牛生长激素(fbs)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(gdnf)、神经突蛋白(neurturin)、peresphin、artemin、生长分化因子9(gdf9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝细胞衍生生长因子(hdgf)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(igf-1)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、白细胞介素1(il-1)、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、角质形成细胞生长因子(kgf)、迁移刺激因子(msf)、巨噬细胞刺激蛋白(msp)、肌肉生长抑制素(gdf-8)、神经调节蛋白1(nrg1)、神经调节蛋白2(nrg2)、神经调节蛋白3(nrg3)、神经调节蛋白4(nrg4)、脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养因子-3(nt-3)、神经营养因子-4(nt-4)、胎盘生长因子(tcgf)、血小板生成素(tpo)、转化生长因子α(tgf-α)、转化生长因子β(tgf-β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和血管内皮生长因子(vegf)。药物组合物
[0192]
在一些方面，本公开涉及包含本文所述的脂质纳米颗粒的药物组合物。在本公开的一些方面，药物组合物还包含药学上可接受的载体(赋形剂)以形成用于治疗目标疾病的药物组合物。如本文所使用的，“可接受”是指载体必须与组合物的活性成分相容并且对于待治疗的受试者无害。在一些方面，载体能够稳定活性成分。药学上可接受的赋形剂(载体)包括本技术领域公知的缓冲剂。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy 20th ed.(2000)lippincott williams and wilkoins,ed.k.e.hoover。
[0193]
用于体内给药的药物组合物必须是无菌的。这很容易经由例如穿过无菌过滤膜的过滤来实现。可将脂质纳米颗粒放入具有无菌入口的容器中，例如静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
[0194]
在本公开的一些方面，药物组合物可以被配制用于肿瘤内、鞘内、肌内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻腔、经皮、舌下、粘膜下、经皮或经粘膜给药。在本公开的一些方面，药物组合物可以配制用于瘤内注射。如本文所使用的，肿瘤内注射是指直接注射到肿瘤中。可以原位实现高浓度的组合物，同时使用少量药物。免疫疗法的局部递送允许多种联合疗法，同时防止显著的系统暴露和脱靶毒性。
[0195]
在本公开的一些方面，药物组合物可以配制用于肌内注射、静脉内注射或皮下注射。
[0196]
在本公开的一些方面，药物组合物包含呈冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、盐或稳定剂。参见，例如，remington:the science and practice of pharmacy 20th ed.(2000)lippincott williams and wilkins,ed.k.e.hoover。可接受的载体和赋形剂、或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，其包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，例如edta；糖类，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0197]
在一些方面，本文描述的药物组合物包含脂质纳米颗粒，其可以通过本技术领域已知的方法制备，例如在下列文献中描述的：epstein,et al.,proc.natl.acad.sci.usa 82:3688(1985)；hwang,et al.,proc.natl.acad.sci.usa 77:4030(1980)；和美国专利no.4,485,045和no.4,544,545，其通过引用整体并入本文。循环时间延长的脂质体公开于美国专利no.5,013,556，其全部内容通过引用并入本文。在一些方面，脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg-衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物产生。脂质体通过确定孔径的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
[0198]
在本公开的一些方面，药物组合物被配制成缓释形式。缓释制剂的合适示例包括含有脂质纳米颗粒的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的示例包括但不限于聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利no.3,773,919)、l-谷氨酸和7-l-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如luprom depot
tm
(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。
[0199]
在一些方面，合适的表面活性剂包括但不限于非离子试剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如，tween
tm 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨糖醇(例如，span
tm 20、30、60、80或85)。在一些方面，具有表面活性剂的组合物包含0.05至5％的表面活性剂。在一些方面，组合物包含0.1％和2.5％。应当理解，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。
[0200]
在一些方面，药物组合物是单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂、或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠给药，或通过吸入或吹入给药。
[0201]
为了制备固体组合物例如片剂，主要活性成分可以与药物载体混合，例如，常规的压片成分，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或胶和其他药物稀释剂，例如水，以形成含有本发明化合物或其无毒药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均质时，是指活性成分均匀地分
散在整个组合物中，以便可以容易地将组合物细分为同等有效的单位剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预配制组合物细分为上述类型的单位剂型，其含有0.1至约500mg本发明的活性成分。新组合物的片剂或丸剂可以包衣或以其他方式混合以提供具有延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量和外部剂量成分，后者呈包封在前者之上的形式。这两种成分可以被肠溶层隔开，肠溶层用于抵抗在胃中崩解，并允许内部成分完整地进入十二指肠或延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括多种聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素等材料的混合物。
[0202]
可以使用可商购的脂肪乳剂(例如intralipid
tm
、liposyn
tm
、infonutrol
tm
、lipofundin
tm
和lipiphysan
tm
)制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳液组合物中，或者替代地其可以溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和当与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合时形成的乳液中。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常将含有高达20％的油，例如5％和20％之间的油。脂肪乳剂可包含具有合适尺寸的脂肪滴并且可具有5.5至8.0范围内的ph。
[0203]
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可包含如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些方面，该组合物通过口腔或鼻腔呼吸途径给药以获得局部或全身效果。
[0204]
药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体雾化。雾化溶液可以直接从雾化装置吸入，或者雾化装置可以连接到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉末组合物可以从以适当方式递送制剂的设备施用。治疗应用
[0205]
在本公开的一些方面，本文描述的脂质纳米颗粒或药物组合物用于治疗癌症。
[0206]
在一些方面，有效量的本文所述的任何脂质纳米颗粒或药物组合物通过合适的途径施用给有需要的受试者，例如瘤内施用、静脉内施用(例如，作为丸剂或通过连续在一段时间内输注)，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径施用。可商购的用于液体制剂的喷雾器，包括喷射喷雾器和超声喷雾器可用于施用。液体制剂可以雾化，冻干粉末可以在重构后雾化。在一些方面，本文所述的药物组合物使用碳氟化合物制剂和定量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。在一些方面，本文所述的药物组合物被配制用于瘤内注射。在一些方面，本文所述的药物组合物通过局部途径施用于受试者，例如，注射到局部部位，例如肿瘤部位或感染部位。在一些方面，受试者是人。
[0207]
如本文所使用的，“有效量”是指单独或与一种或多种其他活性剂组合对受试者赋予治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些方面，治疗效果是降低肿瘤负荷、减少癌细胞或增加免疫活性。脂质纳米颗粒是否达到治疗效果的确定对于本领域技术人员来说是显而易见的。正如本领域技术人员所认识到的，有效量会有所不同，具体取决于所治疗的特定病症、病症的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别和体重)、治疗的持续时间、同时治疗(如果有的话)的性质、具体的给药途径和健康从业者专业知识范围内的类似因素。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的，并且仅需常规实验即可解决。通常优选使用最大剂量的单个组分或其组合，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。
[0208]
经验考虑，例如半衰期，通常将有助于剂量的确定。施用频率可以在治疗过程中确
定和调整，并且通常但不一定基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。替代地，脂质纳米颗粒的缓释制剂可能是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置是本技术领域已知的。
[0209]
在本公开的一些方面，治疗是单次注射本文公开的脂质纳米颗粒或药物组合物。在一些方面，单次注射是瘤内施用给有需要的受试者。
[0210]
在本公开的一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物的剂量可以在已经被提供脂质纳米颗粒一次或多次施用的个体中凭经验确定。给予个体增量剂量的本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物。为了评估本文的脂质纳米颗粒或药物组合物的功效，可以遵循疾病/病症的指标。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，持续治疗直至出现所需的症状抑制或直至达到足以减轻目标疾病或病症或其症状的治疗水平。
[0211]
在本公开的一些方面，给药频率是每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次，或每10周一次；或每月一次、每2个月一次、或每3个月一次或更长时间一次。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。所用脂质纳米颗粒的给药方案可随时间变化。
[0212]
在本公开的一些方面，该方法包括向有此需要的受试者施用一个或多个剂量的本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物。
[0213]
本文所述的脂质纳米颗粒的合适剂量将取决于具体的脂质纳米颗粒、疾病/病症的类型和严重程度、是否为预防或治疗目的施用脂质纳米颗粒、先前的治疗、受试者的临床病史和对脂质纳米颗粒的反应、以及主治医师的判断。临床医生可以施用本文公开的脂质纳米颗粒或药物组合物，直到达到实现期望结果的剂量。在一些方面，期望的结果是肿瘤负荷减少、癌细胞减少或免疫活性增加。确定剂量是否导致期望结果的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文所述的一种或多种脂质纳米颗粒或药物组合物的施用可以是连续的或间歇的，具体取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性以及技术人员已知的其他因素。本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物的施用可以在预选的时间段内基本上连续或可以以一系列间隔的剂量进行，例如，在患上目标疾病或病症之前、期间或之后。
[0214]
如本文所使用的，术语“治疗”是指将包含一种或多种活性剂的组合物施加或施用至患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状或针对疾病/病症的易染病体质的受试者，目的为治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响病症、疾病的症状或针对疾病或病症的易染病体质。
[0215]
如本文所使用的，减轻目标疾病/病症包括延缓疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。减轻疾病并不一定需要治愈的结果。如本文所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或延迟疾病的进展。这种延迟可以持续不同的时间长度，具体取决于疾病的病史和/或正在接受治疗的受试者。延迟或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是一种方法，与不使用该方法相比，该方法降低在给定时间范围内患上疾病的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内降低症状程度。这种比较通常基于临床研究，使用足够数量的受试者来给出具有统计学意义的结果。
[0216]
疾病的“发展”或“进展”是指疾病的初始表现和/或随后的进展。使用本领域众所周知的标准临床技术可以检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法预测的进展。如
本文所使用的，发展或进展是指症状的生物学过程。发展包括发生、复发和发作。如本文所使用的，目标疾病或病症的发作或发生包括初始发作和/或复发。
[0217]
在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物以足以减少体内肿瘤负荷或癌细胞生长至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更大的量施用于有需要的受试者。在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物以有效增加免疫活性至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高的量施用。
[0218]
在一些方面，受试者是人、家畜、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠或大鼠。在一些方面，受试者是人。在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物增强受试者的免疫活性，例如t细胞活性。
[0219]
在一些方面，受试者是患有、疑似患有癌症或处于患癌症风险中的人。在一些方面，癌症选自黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、消化道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌癌、原发性肝癌、胃癌和各种类型的头颈癌，包括鳞状细胞头颈癌。在一些方面，癌症可以是黑色素瘤、肺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。
[0220]
可以通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试、ct扫描或超声波来鉴定患有目标疾病或病症的受试者。怀疑患有目标疾病或病症的受试者可能表现出该疾病或病症的一种或多种症状。处于疾病或病症风险中的受试者可以是具有一种或多种与该疾病或病症相关的风险因素的受试者。也可以通过常规医疗实践来鉴定处于疾病或病症风险中的受试者。
[0221]
在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物与至少一种另外的合适的治疗剂共同施用。在一些方面，至少一种另外的合适的治疗剂是抗癌剂、抗病毒剂、抗菌剂或用于增强和/或补充本文所述的脂质纳米颗粒的免疫刺激作用的其他试剂。在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物和至少一种另外的治疗剂以顺序方式施用给受试者，即，每种治疗剂在不同时间施用。在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物和至少一种另外的治疗剂以基本上同时的方式施用给受试者。
[0222]
在一些方面，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物可以与其他生物活性成分(例如，不同的抗癌疗法)、非药物疗法(例如，手术)或其组合的施用组合。
[0223]
本领域技术人员应理解，本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物与另一种抗癌剂(例如化疗剂)的任何组合可以以任何顺序用于治疗癌症。可以基于许多因素来选择本文描述的组合，这些因素包括但不限于减少肿瘤形成或肿瘤生长、减少癌细胞、增加免疫活性和/或减轻至少一种与癌症相关的症状的有效性，或减轻组合的另一种药物的副作用的有效性。例如，本文所述的组合疗法可以减少与组合的每个单独成员相关的任何副作用，例如与抗癌剂相关的副作用。
[0224]
在一些方面，其他抗癌治疗剂是化学疗法、放射疗法、手术疗法、免疫疗法或其组合。在一些方面，化疗剂是卡铂、顺铂、多西紫杉醇、吉西他滨、nab-紫杉醇、培美曲塞、长春瑞滨或其组合。在一些方面，放射疗法是电离辐射、γ-辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离放射疗法、全身放射性同位素、放射增敏剂或其组合。在一些方面，手
术疗法是治愈性手术(例如，肿瘤切除手术)、预防性手术、拉帕手术镜手术、激光手术或它们的组合。在一些方面，免疫疗法是过继细胞转移、治疗性癌症疫苗或其组合。
[0225]
在一些方面，化疗剂为铂类药物，例如卡铂、奥沙利铂、顺铂、奈达铂、沙铂、洛铂、三铂、四硝酸盐、吡铂、脯氨酸、阿罗铂以及其他衍生物；拓扑异构酶i抑制剂，如喜树碱、托泊替康、伊立替康/sn38、鲁比替康、贝洛特康以及其他衍生物；拓扑异构酶ii抑制剂，例如依托泊苷(vp-16)、柔红霉素、多柔比星剂(例如，脂质体中的多柔比星、盐酸多柔比星、多柔比星类似物或多柔比星及其盐或类似物)、米托蒽醌、阿克拉比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星，安吖啶、吡柔比星、缬柔比星、佐柔比星、替尼泊苷以及其他衍生物；抗代谢药，例如叶酸家族(甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞、氨基蝶呤和相关药物)；嘌呤拮抗剂(硫鸟嘌呤、氟达拉滨、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、喷司他丁、氯法拉滨和相关药物)和嘧啶拮抗剂(阿糖胞苷、氟尿苷、阿扎胞苷、替加氟、卡莫氟、卡帕他滨、吉西他滨、羟基脲、5-氟尿嘧啶(5fu)和相关药物)；烷化剂，例如氮芥类(例如，环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、异环磷酰胺、托磷酰胺、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、尿拉莫司汀、雌莫司汀和相关药物)；亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷尼莫司汀、链脲佐菌素和相关药物)；三氮烯类(例如，达卡巴嗪、六甲蜜胺、替莫唑胺和相关药物)；烷基磺酸盐(例如，白消安、甘露硫丹、三硫丹和相关药物)；丙卡巴肼；米托溴尼醇和氮丙啶类(例如，卡波醌、三氮醌、硫代tepa、三乙烯丙胺和相关药物)；抗生素类，如羟基脲类、蒽环类(如多柔比星剂、柔红霉素、表柔比星以及其他衍生物)；蒽二酮类(例如，米托蒽醌及其类似物)；链霉菌家族(例如，博来霉素、丝裂霉素c、放线菌素、普利卡霉素)；紫外光线；及其组合。
[0226]
在一些方面，其他抗癌治疗剂是抗体。抗体(优选地单克隆抗体)通过多种机制实现其对癌细胞的治疗效果。它们可以直接影响细胞凋亡或程序性细胞死亡。它们可以阻断信号转导通路的组分，例如生长因子受体，有效地抑制肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可以导致抗独特型抗体的形成。间接作用包括募集具有细胞毒性的细胞，例如单核细胞和巨噬细胞。这种抗体介导的细胞杀伤称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。抗体还结合补体，导致直接细胞毒性，称为补体依赖性细胞毒性(cdc)。将手术方法与免疫治疗药物或方法相结合是一种成功的方法，例如在gadri et al.2009:synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-cd20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma.j immunother.32(4):333-40中证明。以下清单提供了抗癌抗体和可与本发明组合使用的潜在抗体靶标(括号内)的一些非限制性示例：阿巴戈单抗(ca-125)、阿昔单抗(cd41)、阿德卡木单抗(epcam)、阿夫珠单抗(cd20)、阿替珠单抗(vegfr2)、阿妥单抗喷替酸酯(cea)、阿马妥昔单抗(morab-009)、马安那莫单抗(tag-72)、阿波利珠单抗(hla-dr)、阿西莫单抗(cea)、巴维妥昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥单抗(cd22)、贝利尤单抗(baff)、贝伐珠单抗(vegf-a)、莫比伐珠单抗(cd44 v6)、布利那妥单抗(cd19)、维多汀布伦妥昔单抗(cd30 tnfrsf8)、坎妥珠单抗美坦辛(粘蛋白canag)、坎妥珠单抗(muc1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡鲁单抗(cnt0888)、卡妥索单抗(epcam、cd3)、西妥昔单抗(egfr)、泊西他组单抗(epcam)、西舒木单抗(igf-1受体)、克劳地昔单抗(claudin)、泰坦-克利妥珠单抗(muc1)、科那妥单抗(trail-r2)、达西珠单抗(cd40)、达洛珠单抗(胰岛素样生长因子i受体)、地诺单抗(rankl)、地莫单抗(b淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(dr5)、依美昔单抗(gd3神经节苷脂)、依决洛单抗(epcam)、埃罗妥珠单抗(slamf7)、依那
妥组单抗(pdl192)、恩司妥昔单抗(npc-1c)、依普拉珠单抗(cd22)、厄妥单抗(her2/neu、cd3)、依达西单抗(整合素αvβ3)、法来珠单抗(叶酸受体1)、fbta05(cd20)、非拉妥珠单抗(sch 900105)、菲吉珠单抗(igf-1受体)、弗兰沃妥单抗(糖蛋白75)、弗雷索木单抗(tgf-β)、加利昔单抗(cd80)、加尼单抗(igf-i)、吉妥珠单抗(cd33)、格沃珠单抗(il-1β)、吉仑妥昔单抗(碳酸酐酶9(ca-ix))、格伦巴尤单抗(gpnmb)、替伊莫单抗(cd20)、伊克鲁库单抗(vegfr-1)、伊戈沃玛(ca-125)、雷英妥昔单抗(sdc1)、因替珠单抗(cd51)、奥英妥珠单抗(cd22)、伊匹木单抗(cd152)、伊拉木单抗(cd30)、拉贝珠单抗(cea)、雷沙妥单抗(trail-r2)、利比韦鲁单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(cd33)、莫星-洛沃妥珠单抗(cd56)、鲁卡木单抗(cd40)、鲁米利昔单抗(cd23)、马帕图单抗(trail-r1)、马妥珠单抗(egfr)、美泊利珠单抗(il-5)、米拉妥珠单抗(cd74)、米妥单抗(gd3神经节苷脂)、莫加珠单抗(ccr4)、帕克莫单抗(cd22)、他那可单抗(c242抗原)、埃托-那普妥莫单抗(5t4)、那呐妥单抗(ron)、耐昔妥珠单抗(egfr)、尼妥珠单抗(egfr)、纳武单抗(igg4)、奥法妥单抗(cd20)、奥拉雷单抗(pdgf-rα)、奥妥珠单抗(人散射因子受体激酶)、莫妥组单抗(epcam)、奥雷戈单抗(ca-125)、奥塞芦单抗(ox-40)、帕尼单抗(egfr)、帕特鲁单抗(her3)、彭图单抗(pemtumoma)(muc1)、帕妥珠单抗(pertuzuma)(her2/neu)、平妥单抗(腺癌抗原)、普利妥单抗(波形蛋白(vimentin))、雷科图单抗(n-乙醇酰神经氨酸)、拉德妥单抗(纤连蛋白外域-b)、雷非维尤单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫西单抗(vegfr2)、利洛木单抗(hgf)、利妥昔单抗(cd20)、罗巴木单抗(igf-1受体)、沙马珠单抗(cd200)、西布妥珠单抗(fap)、西妥昔单抗(il-6)、他巴鲁单抗(baff)、四西坦他卡珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)(甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(cd19)、替那妥单抗(肌腱蛋白c)、替普罗单抗(cd221)、替西木单抗(ctla-4)、替加珠单抗(trail-r2)、tnx-650(il-13)、托西莫单抗(cd20)、曲妥珠单抗(her2/neu)、trbs07(gd2)、替西木单抗(tremelimumab)(ctla-4)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)(epcam)、乌布妥昔单抗(ms4a1)、尿鲁单抗(4-1bb)、沃洛昔单抗(整合素α5β1)、沃妥单抗(肿瘤抗原ctaa16.88)、扎鲁妥单抗(egfr)、扎诺木单抗(cd4)。
[0227]
在一些方面，其他抗癌治疗剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、融合蛋白或其组合。趋化因子的示例包括但不限于ccr7及其配体ccl19和ccl21，还有ccl2、ccl3、ccl5和ccl16。其他示例包括cxcr4、cxcr7和cxcl12。此外，共刺激或调节分子例如b7配体(b7.1和b7.2)是有用的。还有用的是其他细胞因子，例如尤其是白细胞介素(例如il-1至il17)、干扰素(例如ifnalpha1至ifnalpha8、ifnalpha10、ifnalpha13、ifnalpha14、ifnalpha16、ifnalpha17、ifnalpha21、ifnbeta1、ifnw、ifne1和ifnk)、造血因子、tgf(例如tgf-α、tgf-β，以及tgf家族的其他成员)，最后是肿瘤坏死因子受体家族的成员及其配体以及其他刺激分子，包括但不限于41bb、41bb-l、cd137、cd137l、ctla-4gitr、gitrl、fas、fas-l、tnfr1、trail-r1、trail-r2、p75ngf-r、dr6、lt.beta.r、rank、edar1、xedar、fn114、troy/trade、taj、tnfrii、hvem、cd27、cd30、cd40、4-1bb、ox40、gitr、gitrl、taci、baff-r、bcma、relt和cd95(fas/apo-1)，糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白，tnf受体相关细胞凋亡介导蛋白(tramp)和死亡受体6(dr6)。特别是cd40/cd40l和ox40/ox40l是联合免疫治疗的重要靶点，因为它们直接影响t细胞的存活和增殖。综述参见lechner et al.2011:chemokines,costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors.immunotherapy 3(11),1317-1340。
immunotherapy.hum vaccin.(9):976-81。
[0232]
在一些方面，其他抗癌治疗剂是基于病毒的疫苗。有许多可用的或正在开发的基于病毒的癌症疫苗，它们可以与本公开的制剂一起用于联合治疗方法。使用此类病毒载体的一个优势是它们具有启动免疫反应的内在能力，病毒感染会产生炎症反应，从而产生免疫激活所必需的危险信号。理想的病毒载体应该是安全的，并且不应引入抗载体免疫反应以允许增强抗肿瘤特异性反应。重组病毒，如痘苗病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和禽痘病毒已被用于动物肿瘤模型，并基于其令人鼓舞的结果，已启动人体临床试验。尤其重要的基于病毒的疫苗是病毒样颗粒(vlp)，即含有来自病毒外层的某些蛋白质的小颗粒。病毒样颗粒不含病毒的任何遗传物质，不会引起感染，但可以构建它们以在其外壳上呈递肿瘤抗原。vlp可以衍生自各种病毒，例如乙型肝炎病毒或其他病毒科，包括细小病毒科(例如腺相关病毒)、逆转录病毒科(例如hiv)和黄病毒科(例如丙型肝炎病毒)。有关一般综述，参见sorensen and thompsen 2007:virus-based immunotherapy of cancer:what do we know and where are we going？apmis 115(11):1177-93；对抗癌病毒样颗粒在以下文献中进行了综述：buonaguro et al.2011:developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer.expert rev vaccines 10(11):1569-83；以及guill
é
n et al.2010:virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants:application to chronic disease,cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies.procedia in vaccinology 2(2),128-133。
[0233]
在一些方面，其他抗癌治疗剂是基于肽的靶向疗法。肽可以结合细胞表面受体或影响肿瘤周围的细胞外基质。如果核素在细胞附近衰变，附着在这些肽上的放射性核素(例如rgd)最终会杀死癌细胞。这些结合基序的寡聚体或多聚体尤其令人感兴趣，因为这可以导致增强的肿瘤特异性和亲和力。关于非限制性示例，参见yamada 2011:peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer,bladder cancer,and malignant glioma.nihon rinsho 69(9):1657-61。用于治疗的试剂盒
[0234]
本公开还提供了用于针对癌症(例如，黑色素瘤、肺癌、结直肠癌或肾细胞癌)和/或治疗癌症或降低癌症风险的免疫疗法的试剂盒。在一些方面，该试剂盒包括一个或多个容器，容器包含本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物。
[0235]
在一些方面，试剂盒包括根据本文所述的任何方法使用的说明书。例如，所包含的说明书可以包括对施用本文所述的药物组合物以治疗、延缓发作或减轻目标疾病的描述。在一些方面，说明书包括将本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物施用于处于目标疾病/病症风险中的受试者的描述。
[0236]
在一些方面，说明书包括剂量信息、给药方案和给药途径。在一些方面，容器是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在一些方面，说明书是标签或包装插页(例如，试剂盒中包含的纸张)上的书面说明书。在一些方面，说明书是机器可读说明书(例如，在磁或光存储盘上携带的说明书)。
[0237]
在一些方面，标签或包装插页指示本文公开的脂质纳米颗粒或药物组合物用于治疗、延迟发作和/或减轻与癌症相关的疾病或病症，例如本文所述的那些。可以提供用于实
践本文描述的任何方法的说明。
[0238]
在一些方面，本文描述的试剂盒处于合适的包装中。在一些方面，合适的包装包括小瓶(vials)、瓶子(bottles)、广口瓶(jars)、软包装(例如，密封聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)或其组合。在一些方面，包装包括用于与特定装置例如吸入器、鼻腔给药装置(例如雾化器)或输液装置例如微型泵结合使用的包装。在一些方面，试剂盒包括无菌入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些方面，容器还可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些方面，至少一种活性剂是本文所述的脂质纳米颗粒或药物组合物。
[0239]
在一些方面，试剂盒还包含额外的组分，例如缓冲液和解释性信息。在一些方面，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。在一些方面，本公开提供了包含本文所述试剂盒内容物的制品。一般技术
[0240]
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些在本领域的技术范围内。molecular cloning:a laboratory manual,second edition(sambrook,et al.,1989)cold spring harbor press；oligonucleotide synthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology:a laboratory notebook(j.e.cellis,ed.,1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney,ed.1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather and p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle,j.b.giffiths,and d.g.newell,eds.,1993-8)j.wiley and sons；method of enzymology(academic press,inc.)；handbook of experimental immunology(d.m.weir and c.c.blackwell,eds.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller and m.p.calos,eds.,1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel,et al.,eds.,1987):pcr:the polymerase chain reaction,(mullis,et al.,eds.,1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan et al.,eds.,1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway and p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty,ed.,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd and c.dean,eds.,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow and d.lane,cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanette and j.d.capra,eds.,harwood academic publishers,1995)。无需赘述，据信本领域技术人员基于上述描述，能够充分利用本发明。本文引用的所有出版物均通过引用整体并入。实施例实施例1：经修饰的rna的构建
[0241]
为了构建本文公开的经修饰的rna，使用以下材料和方法：模板准备
[0242]
对于复制子rna，制备包含有效载荷的vee复制子载体。制备此类载体的方法是本
biolabs)并进行本文所述的修改。对于经修饰的rna(modrna)合成，试剂盒的utp组分被n1-甲基假尿苷-5'-三磷酸取代。为开始体外转录过程，将试剂盒组分在冰上解冻、混合并在微量离心机中脉冲离心。将样品置于冰上直至进一步使用。
[0247]
共转录加帽法：为了使用加帽模拟复制子质粒和modrna模板进行生产，将表6(见下文)中所示的组分混合，在微量离心机中脉冲旋转，然后在400rpm的thermomixer中在37℃下温育三小时。出于质量控制目的，取了1μl等分试样。表6.共转录加帽组分组分体积最终浓度无核酸酶水xμl 10x反应缓冲液(neb)2μl1xatp(100mm)2μl10mm最终gtp(100mm)2μl10mm最终utp或n1-甲基伪utp(100mm)2μl10mm最终ctp(100mm)2μl10mm最终cleancap au1μl 模板dnaxμl1μgt7 rna聚合酶混合物2μl superase inh.1μl 总反应体积20μl [0248]
转录后酶促加帽法：为了使用酶促复制子质粒进行生产，使用表7(见下文)中提供的组分在室温下组装反应。表7.转录后酶加帽组分组分体积最终浓度无核酸酶水xμl 10x反应缓冲液2μl1xatp(100mm)2μl10mm最终gtp(100mm)2μl10mm最终utp或n1-甲基伪utp(100mm)2μl10mm最终ctp(100mm)2μl10mm最终模板dnaxμl1μgt7 rna聚合酶混合物2μl superase inh.1μl 总反应体积20μl [0249]
dna酶处理：为了消化模板dna，使用turbo dnase酶。无需添加10x缓冲液，因为该酶在ivt反应中具有活性。用无核酸酶的水将反应稀释至50μl。然后，将5μl酶(2u/μl)添加到20μl ivt反应中。然后，将混合物在37℃下温育30分钟。之后，使用monarch rna清理试剂盒来纯化rna。出于质量控制目的，取了1μl等分试样。
[0250]
加帽和2'-o-甲基化：为了在使用上述转录后加帽方法制成的ivtmrna的5'-末端上制备具有2'-o-甲基化(cap1)结构的甲基化鸟嘌呤帽，使用以下方法。首先，将未加帽的
rna和无核酸酶的水混合至13μl的最终体积。然后，将混合物在65℃下加热5分钟。然后将混合物置于冰上另外5分钟。然后，将表8(见下文)中提供的组分添加到混合物中，并在37℃下温育60分钟。接下来，使用small monarch rna清理试剂盒纯化rna。表8.加帽和2'-o-甲基化组分组分体积变性未加帽的rna(来自上方)13.0μl10x加帽缓冲液2.0μlgtp(10mm)1.0μlsam(4mm,将32mm原液稀释至4mm)1.0μl牛痘加帽酶(10u/μl)1.0μlmrna cap 2
′‑
o-甲基转移酶(50u/μl)1.0μlsuperase inh1.0μl总计20ul
[0251]
poly(a)尾合成：为了将poly(a)尾添加到经修饰的rna，将表9(见下文)中提供的组分添加到反应管中。然后，将反应在37℃下温育30分钟。然后，通过使用小型monarch清理试剂盒直接纯化rna来终止反应。作为质量对照，在1.2％rna凝胶上运行200ng rna以确认rna的大小。为此，rna在65℃下用50％甲醛样品缓冲液变性5分钟，然后立即置于冰上至少一分钟。然后，将变性的rna加载到凝胶上并使用透照仪进行可视化。表9.poly(a)尾合成组分实施例2：表达动力学的体外分析
[0252]
为了评估本文公开的rna构建体的表达效率，使用本文描述的方法构建了编码il-12蛋白的自我复制mrna(reprna)和经修饰的mrna(modrna)(参见，例如，实施例1)。然后，使用messengermax将mrna构建体转染到两种不同的细胞系(即b16.f10和4t1)中，并在转染后24、48和72小时评估所编码的蛋白的表达水平。
[0253]
如图1a所示，早在24小时就在用reprna或modrna转染的b16.f10细胞中观察到il-12表达。到转染后48小时，与用modrna转染的细胞相比，在用reprna转染的b16.f10细胞中观察到il-12表达存在显著差异。增加的il-12表达至少持续到转染后72小时。在4t1细胞系中观察到类似的结果(参见图1b)。这些结果表明，本文公开的能够表达所编码的蛋白质的自我复制的mrna能够以比经修饰的mrna更高的水平和更长的持续时间表达所编码的蛋白质。实施例3：抗肿瘤功效的体内分析
[0254]
为了评估本文公开的rna构建体是否可以在体内发挥活性，使用黑色素瘤小鼠模型。简而言之，通过给动物接种b6-f10细胞(通过皮下给药)来诱导黑色素瘤。一旦肿瘤达到最佳大小(～350mm3)，将单次高剂量的以下物质之一注射到动物的肿瘤中：施用以下物质之一：(i)对照mrna；(ii)编码il-12的经修饰的mrna(modrna-il12)；以及(iii)编码il-12的自我复制的mrna(reprna-il12)。然后，在治疗后的不同时间点评估动物的肿瘤体积和存活率。
[0255]
正如预期的那样，用对照mrna治疗的动物未能控制肿瘤(见图2a和2b)。所有对照动物在治疗后约第25天死于肿瘤(见图4)。相比之下，用modrna-il12或reprna-il12治疗的动物肿瘤显著减小。两组之间肿瘤体积的总体减小相似。与接受modrna-il-12的动物相比，用reprna-il12构建体治疗的动物具有略高的存活率(参见图4)。这些结果表明，至少在体内，在治疗肿瘤中，当以高剂量施用时，本文公开的经修饰的mrna构建体(例如，编码il-12)与自我复制的mrna(例如，编码il-12)几乎一样有效。实施例4：自我复制的mrna和经修饰的mrna体内递送后有效载荷表达的比较
[0256]
为了进一步表征本文公开的rna构建体的体内活性，在实施例3的肿瘤动物中评估所编码的il-12蛋白的表达。如图3所示，在治疗后第4天，与对照相比，用reprna-il12或modrna-il12治疗的动物在递送部位(即肿瘤)表达更高水平的il-12。然而，il-12表达显著高于用modrna-il12治疗的动物。该结果似乎与实施例2中提供的体外数据一致，这表明与经修饰的mrna构建体相比，本文公开的自我复制的mrna构建体在表达编码蛋白方面更加有效。
[0257]
应当理解，详细描述部分而非发明内容和摘要部分旨在用于解释权利要求。发明内容和摘要部分可以阐述一个或多个但不是发明人所设想的本发明的所有示例性实施方案，因此，不旨在以任何方式限制本发明和所附权利要求。
[0258]
上文已经借助说明其特定功能及其关系的实现的功能构建块描述了本发明。为了描述的方便，这些功能构建块的边界在这里被任意定义。只要其指定的功能及其关系得到适当执行，就可以定义替代边界。
[0259]
上述特定实施方案的描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，以至于其他人在不脱离本发明的总体构思的情况下，可以通过应用本领域技术范围内的知识，容易地修改和/或改造此类特定实施方案的各种应用，而无需过度实验。因此，基于本文呈现的教导和指导，此类改造和修改旨在落入所公开实施方案的等同方案的含义和范围内。应当理解，本文的用语或术语是为了描述而非限制的目的，使得本说明书的术语或用语将由本领域技术人员根据教导和指导来解释。
[0260]
本发明的广度和范围不应受任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同方案来限定。
[0261]
本技术中的权利要求不同于母申请或其他相关申请的权利要求。因此，申请人撤销在母申请或与本技术相关的任何在先申请中作出的对权利要求范围的任何放弃。因此，建议审查员可能需要重新审视任何此类先前的放弃和避免引用的参考文献。此外，还提醒审查员，不应将本技术中作出的任何放弃解读成母申请或针对母申请。

技术特征：
1.一种脂质纳米颗粒，其包含：(i)一种或多种类型的脂质；和(ii)经修饰的mrna，其包含编码白细胞介素(il)-12分子的序列；其中所述脂质纳米颗粒能够触发免疫原性细胞死亡。2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其中所述一种或多种类型的脂质包括阳离子脂质。3.根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质是式i化合物：及其盐；其中每个r1独立地是未经取代的烷基；每个r2独立地是未经取代的烷基；每个r3独立地是氢或经取代或未经取代的烷基；每个m独立地为3、4、5、6、7或8。4.根据权利要求3所述的脂质纳米颗粒，其中至少一个r1是c
11
h
23
。5.根据权利要求3或4所述的脂质纳米颗粒，其中至少一个r3是氢。6.根据权利要求3至5中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中至少一个m为3。7.根据权利要求3至6中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中每个r1独立地是未经取代的烷基；每个r2独立地是未经取代的烷基，每个r3是氢；每个m是3。8.根据权利要求2至7中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质是具有以下结构的n1,n3,n5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(tt3)：及其盐，其中m为3。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含tt3、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、胆固醇和c14-peg2000。10.根据权利要求1-9中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna包含经修饰的5'-帽。11.根据权利要求10所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的5'-帽选自m
27,2
′‑
o
gpp
s
pgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m
2(7,3
′‑
o)
gpppg、m
2(7,2
′‑
o)
gppspg(d1)、m
2(7,2
′‑
o)
gppspg(d2)、m
27,3
’‑
o
gppp(m
12
’‑
o
)apg、(m7g-3
′
mppp-g；其能等效地表示3
′
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g)、n7,2
′‑
o-二甲基鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧乙基)-g(5
′
)ppp(5
′
)g、n7-(4-氯苯氧乙基)-m3′‑
o
g(5
′
)ppp(5
′
)g、7mg(5
′
)ppp(5
′
)n、pn2p、7mg(5
′
)ppp(5
′
)nlmpnp、7mg(5
′
)-ppp(5
′
)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2
′
)apm(2
′
)apm(2
′
)cpm(2)(3,2
′
)up、肌苷、n1-甲基鸟苷、2
′
氟鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg及其组合。12.根据权利要求1-9中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna是环状rna。13.根据权利要求1-12中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna还包含半衰期延长部分。14.根据权利要求1-13中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述半衰期延长部分包括fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、pas序列、hap序列、转铁蛋白或其片段、xten或其任何组合。15.根据权利要求1-14中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述il-12分子选自由il-12、il-12亚基或保留免疫调节功能的突变il-12分子组成的群组。16.根据权利要求15所述的脂质纳米颗粒，其中所述il-12包含与seq id no:1有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。17.根据权利要求16所述的脂质纳米颗粒，其中所述il-12分子包含il-12α和/或il-12β亚基。18.根据权利要求17所述的脂质纳米颗粒，其中所述il-12a亚基包含与seq id no:2有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。19.根据权利要求17所述的脂质纳米颗粒，其中所述il-12β亚基包含与seq id no:3有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。20.根据权利要求17所述的脂质纳米颗粒，其中所述il-12α亚基和所述il-12β亚基通过接头连接。21.根据权利要求20所述的脂质纳米颗粒，其中所述接头包含至少约2个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约8个、至少约约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。22.根据权利要求21所述的脂质纳米颗粒，其中所述接头包含(gs)接头。
23.根据权利要求22所述的脂质纳米颗粒，其中所述gs接头具有通式(gly4ser)n或s(gly4ser)n，其中n是选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100组成的群组的正整数。24.根据权利要求23所述的脂质纳米颗粒，其中所述(gly4ser)n接头是(gly4ser)3或(gly4ser)4。25.根据权利要求1-24中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述il12分子包含与seq id no:4或seq id no:5有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。26.根据权利要求1-25中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的mrna包含与seq id no:6有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。27.根据权利要求1-25中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna包含与seq id no:7有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。28.根据权利要求1-27中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna还包含调控元件。29.根据权利要求28所述的脂质纳米颗粒，其中所述调控元件选自由至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微rna结合位点或其种子、连接的核苷的3'尾区、富含au的元件(are)、转录后控制调节剂及其组合组成的群组。30.根据权利要求29所述的脂质纳米颗粒，其中所述连接的核苷的3'尾区包含poly-a尾、polya-g四联体或茎环序列。31.根据权利要求1-30中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna包含至少一个经修饰的核苷。32.根据权利要求31所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一个经修饰的核苷选自由6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、n1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假-尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合组成的群组。33.根据权利要求1-32中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna包含与seq id no:8有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。34.根据权利要求1-32中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述经修饰的rna包含与seq id no:9有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。35.根据权利要求1-34中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约30-500nm的直径。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约50-400nm的直径。37.根据权利要求1-36中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约70-300nm的直径。38.根据权利要求1-37中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约100-200nm的直径。39.根据权利要求1-38中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约100-175nm的直径。40.根据权利要求1-39中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有约100-120nm的直径。41.根据权利要求1-40中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒和所述经修饰的rna具有约1:2至约2:1的质量比。42.根据权利要求41所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒和所述经修饰的rna具有1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1或2:1的质量比。43.根据权利要求42所述的脂质纳米颗粒，其中所述脂质和所述经修饰的rna具有约1:1的质量比。44.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-43中任一项所述的脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体。45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成用于瘤内、鞘内、肌肉内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻腔、经皮、舌下、粘膜下、透皮或经粘膜施用。46.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-43中任一项所述的脂质纳米颗粒或根据权利要求44或45所述的药物组合物。47.根据权利要求46所述的方法，其中所述受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述人类患者患有选自黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、原发性肝癌、胃癌和头颈癌组成的群组的癌症。49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中，所述脂质纳米颗粒或药物组合物以单次剂量施用于受试者。50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中，所述药物组合物通过瘤内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射施用于受试者。

技术总结
本公开涉及脂质纳米颗粒，其包含(i)一种或多种类型的脂质；(ii)包含编码白细胞介素(IL)-12分子的序列的经修饰的mRNA，其中脂质纳米颗粒能够触发免疫原性细胞死亡，以及使用该mRNA的治疗方法。该mRNA的治疗方法。


技术研发人员：雅各布
受保护的技术使用者：斯特兰德生物科技公司
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2023/9/7