一种地特胰岛素的分离方法与流程

1.本发明属于多肽合成分离领域，具体涉及一种地特胰岛素的分离方法。


背景技术：

2.糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其基本病理特征为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱。糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病，尤其是它所带来的视网膜病变、周围神经病变、糖尿病肾病等并发症严重影响了人们的生活质量。
3.地特胰岛素(insulin detemir)是一种中性、可溶的长效胰岛素。它是原型胰岛素去除了b链第30位苏氨酸，通过酰化作用在b29位赖氨酸侧链ε-氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，是一种胰岛素类似物。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆性结合，使地特胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能减少低血糖的风险。
4.现有由胰岛素前体通过酰化反应制备地特胰岛素或其类似物的方法中不同程度的存在酰化效率低、副产物多、成本高等缺点。因此，开发一种新的可产业化的酰化效率高、副产物少，生产成本低的地特胰岛素或其类似物的高效制备方法，将为工业化应用奠定重要的基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种收率高、纯度高的地特胰岛素的合成方法。
6.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种地特胰岛素的分离方法，包括：将缺苏胰岛素前体desb30与活化酯进行酰化反应，然后分离纯化，得到地特胰岛素；活化酯为肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯；分离纯化中至少采用磁性聚苯乙烯微球或磺化磁性聚苯乙烯微球；磁性聚苯乙烯微球由改性磁性纳米粒子于含有苯乙烯的烯类试剂溶液中聚合形成，改性磁性纳米粒子由改性剂对磁性纳米粒子改性形成；改性剂包括苯乙烯磺酸钠或n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺。本发明通过将苯乙烯磺酸钠或n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺作为改性剂用于制备改性磁性纳米粒子，然后以改性磁性纳米粒子作为核，使苯乙烯等含烯类试剂通过共价结合于改性磁性纳米粒子上，形成磁性聚苯乙烯微球；通过本发明方法制备的磁性聚苯乙烯微球与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，可以用于地特胰岛素的纯化分离，本发明中制备的磁性聚苯乙烯微球上具有孔隙结构，使用磁性聚苯乙烯微球内部改性剂的基团与外部聚合物的基团可以相互作用，在核壳结构下，可以更好分离纯化地特胰岛素，提高地特胰岛素的收率及纯度。
[0007]
优选地，磁性纳米粒子由三价铁试剂与二价铁试剂于酸性溶液制成；和/或，改性磁性纳米粒子由三价铁试剂与二价铁试剂于含有改性剂的酸性溶液制成。
[0008]
优选地，改性磁性纳米粒子由六水氯化铁和四水氯化亚铁、改性剂制备得到；和/
或，改性剂的使用量为六水氯化铁的3-12wt%；和/或，四水氯化亚铁的使用量为六水氯化铁的30-50wt%。
[0009]
优选地，烯类试剂溶液中含有交联剂；和/或，烯类试剂溶液中含有异戊酸烯丙酯；和/或，烯类试剂溶液中含有引发剂；和/或，烯类试剂溶液中含有聚乙烯醇。
[0010]
更优选地，交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为苯乙烯的10-20wt%；和/或，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为苯乙烯的1-3wt%；和/或，改性磁性纳米粒子的使用量为苯乙烯的5-15wt%；和/或，聚乙烯醇的使用量为苯乙烯的1-3wt%；和/或，异戊酸烯丙酯的使用量为苯乙烯的30-50wt%。
[0011]
优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球由磁性聚苯乙烯微球与浓硫酸在催化剂作用下制备形成。
[0012]
更优选地，催化剂为硫酸银，硫酸银的使用量为磁性聚苯乙烯微球的1-5wt%；和/或，浓硫酸的使用量为磁性聚苯乙烯微球的400-600wt%。
[0013]
更优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，使用的溶剂为二氯乙烷，磁性聚苯乙烯微球的使用量为二氯乙烷的60-80wt%。
[0014]
优选地，分离纯化中还使用了聚丙烯酸型阳离子交换树脂。
[0015]
本发明公开了磺化磁性聚苯乙烯微球和聚丙烯酸型阳离子交换树脂在制备地特胰岛素中的用途，磺化磁性聚苯乙烯微球由磁性聚苯乙烯微球与浓硫酸在催化剂作用下制备形成；磁性聚苯乙烯微球由改性磁性纳米粒子于含有苯乙烯的烯类试剂溶液中聚合形成，改性磁性纳米粒子由改性剂对磁性纳米粒子改性形成；改性剂包括苯乙烯磺酸钠或n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺。
[0016]
优选地，地特胰岛素的制备中，将制备的缺苏胰岛素前体desb30冻干粉末溶于磷酸氢二钠溶液中，搅拌溶解，得到缺苏胰岛素前体desb30溶液，调节ph至9-10，加入乙腈，搅拌混合，然后加入活化酯溶液，在20-30℃下搅拌反应30-120min，反应完成后调节ph至7.0，终止酰化反应，分离纯化，制备得到地特胰岛素。
[0017]
更优选地，地特胰岛素的制备中，磷酸氢二钠溶液由磷酸氢二钠与去离子水混合而成，磷酸氢二钠溶液中磷酸氢二钠的含量为1-3wt%。
[0018]
更优选地，地特胰岛素的制备中，缺苏胰岛素前体desb30的使用量为磷酸氢二钠溶液的0.3-0.9wt%。
[0019]
更优选地，地特胰岛素的制备中，乙腈的使用量为磷酸氢二钠溶液的80-120wt%。
[0020]
更优选地，地特胰岛素的制备中，活化酯溶液由肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯与乙腈混合而成，活化酯溶液中肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯的含量为0.5-2wt%，活化酯溶液的使用量以其中肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯为计量基准，肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯的使用摩尔量为缺苏胰岛素前体desb30的使用摩尔量的40-60%。
[0021]
更优选地，地特胰岛素的制备中，磷酸氢二钠溶液由磷酸氢二钠与去离子水混合而成，磷酸氢二钠溶液的使用量为100g，其中，磷酸氢二钠的含量为2g；缺苏胰岛素前体desb30的使用量为0.5g；乙腈的使用量为100g；活化酯溶液由肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯与乙腈混合而成，活化酯溶液中肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯的含量为1wt%，活化酯溶液的使用量以其中肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯为计量基准，肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯的使用摩尔量为缺苏胰岛素前体desb30的使用摩尔量的50%。
[0022]
优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入盐酸溶液中，在氮气氛围下，搅拌下加入氨水，在20-40℃下反应15-60min，随后加入改性剂，在70-90℃下处理15-60min，处理完成后，过滤，依次用乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，得到改性磁性纳米粒子。
[0023]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，盐酸溶液的浓度为0.2-0.8mol/l。
[0024]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，六水氯化铁的使用量为盐酸溶液的10-30wt%。
[0025]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，四水氯化亚铁的使用量为六水氯化铁的30-50wt%。
[0026]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，氨水的使用量为盐酸溶液的900-1000wt%。
[0027]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，改性剂为苯乙烯磺酸钠，改性剂的使用量为六水氯化铁的3-12wt%。
[0028]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，改性剂为n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺，n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的使用量为六水氯化铁的3-12wt%。
[0029]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，盐酸溶液的浓度为0.5mol/l，盐酸溶液的使用量为100g，六水氯化铁的使用量为20g，四水氯化亚铁的使用量为8g，氨水的使用量为900g，苯乙烯磺酸钠的使用量为1.5g。
[0030]
更优选地，改性磁性纳米粒子的制备中，n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的使用量为1.5g。
[0031]
优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，将苯乙烯、交联剂和引发剂混合，氮气氛围下，加入改性磁性纳米粒子，混合搅拌30-120min，然后加入聚乙烯醇，在60-80℃下处理12-24h，处理完成后，得到磁性聚苯乙烯微球。
[0032]
更优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为苯乙烯的10-20wt%。
[0033]
更优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为苯乙烯的1-3wt%。
[0034]
更优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，改性磁性纳米粒子的使用量为苯乙烯的5-15wt%，聚乙烯醇的使用量为苯乙烯的1-3wt%。
[0035]
更优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，异戊酸烯丙酯的使用量为苯乙烯的30-50wt%。在使用了n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺或苯乙烯磺酸钠作为改性剂用于制备核的磁性纳米粒子，然后在壳层使用含有异戊酸烯丙酯与苯乙烯等试剂聚合而成的聚合物，在n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺或苯乙烯磺酸钠的结构下，异戊酸烯丙酯的使用，使磁性聚苯乙烯微球对地特胰岛素的分离纯化效果更佳，提高地特胰岛素的收率及纯度。
[0036]
更优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，苯乙烯的使用量为100g，交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为15g，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为2g，改性磁性纳米粒子的使用量为10g，聚乙烯醇的使用量为2g。
[0037]
更优选地，磁性聚苯乙烯微球的制备中，异戊酸烯丙酯的使用量为40g。
[0038]
优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，将磁性聚苯乙烯微球加入二氯乙烷中，在50-70℃下溶胀5-30min，搅拌下在70-90℃下加入催化剂硫酸银，加入浓硫酸，在70-90℃下磺化30-60min，磺化完成后，过滤，冰水浸泡10-30min，然后过滤，丙酮洗涤除去二氯乙烷，水洗至中性，过滤，干燥，得到磺化磁性聚苯乙烯微球。
[0039]
更优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，磁性聚苯乙烯微球的使用量为二氯乙烷的60-80wt%。
[0040]
更优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，硫酸银的使用量为磁性聚苯乙烯微球的1-5wt%。
[0041]
更优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，浓硫酸的使用量为磁性聚苯乙烯微球的400-600wt%。
[0042]
更优选地，磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，二氯乙烷的使用量为100g，磁性聚苯乙烯微球的使用量为70g，硫酸银的使用量为2.1g，浓硫酸的使用量为350g。
[0043]
本发明通过得到高纯度的地特胰岛素，本发明中进一步可以对磁性聚苯乙烯微球进行磺化处理，然后将其与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，得到的地特胰岛素的收率更高，表明分离出地特胰岛素的量更高。
[0044]
本发明由于采用了将六水氯化铁和四水氯化亚铁在酸性溶液中混合，然后加入改性剂，制备得到改性磁性纳米粒子，然后以改性磁性纳米粒子作为核，使苯乙烯等含烯类试剂通过共价结合于改性磁性纳米粒子上，形成磁性聚苯乙烯微球，然后将磁性聚苯乙烯微球与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，用于地特胰岛素的纯化分离中，改性剂包括苯乙烯磺酸钠或n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺；进一步地，可以对磁性聚苯乙烯微球进行磺化处理，然后将其与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合使用，因而具有如下有益效果：地特胰岛素的收率高，地特胰岛素的纯度高。因此，本发明是一种收率高、纯度高的地特胰岛素的合成方法。
附图说明
[0045]
图1为磁性聚苯乙烯微球的电镜图；图2为地特胰岛素收率图；图3为地特胰岛素纯度图；图4为交换当量图。
具体实施方式
[0046]
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：本技术中使用的缺苏胰岛素前体desb30的制备参考如下文献：李泾，德谷胰岛素的纯化、修饰工艺及其生物效价分析[d]，浙江大学，2019。
[0047]
实施例1：一种地特胰岛素的分离方法改性磁性纳米粒子的制备：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入盐酸溶液中，在氮气氛围下，搅拌下加入氨水，在30℃下反应30min，随后加入苯乙烯磺酸钠，在80℃下处理30min，处理完成后，过滤，依次用乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，得到改性磁性纳米粒子。盐酸溶
液的浓度为0.5mol/l，盐酸溶液的使用量为100g，六水氯化铁的使用量为20g，四水氯化亚铁的使用量为8g，氨水的使用量为900g，苯乙烯磺酸钠的使用量为1.5g。
[0048]
磁性聚苯乙烯微球的制备：将苯乙烯、交联剂和引发剂混合，氮气氛围下，加入改性磁性纳米粒子，混合搅拌60min，然后加入聚乙烯醇，在70℃下处理16h，处理完成后，得到磁性聚苯乙烯微球。苯乙烯的使用量为100g，交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为15g，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为2g，改性磁性纳米粒子的使用量为10g，聚乙烯醇的使用量为2g。
[0049]
地特胰岛素的制备：将缺苏胰岛素前体desb30冻干粉末溶于磷酸氢二钠溶液中，搅拌溶解，得到缺苏胰岛素前体desb30溶液，调节ph至9，加入乙腈，搅拌混合，然后加入活化酯溶液，在25℃下搅拌反应60min，反应完成后调节ph至7.0，终止酰化反应，分离纯化，制备得到地特胰岛素。磷酸氢二钠溶液由磷酸氢二钠与去离子水混合而成，磷酸氢二钠溶液的使用量为100g，其中，磷酸氢二钠的含量为2g；缺苏胰岛素前体desb30的使用量为0.5g；乙腈的使用量为100g；活化酯溶液由肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯与乙腈混合而成，活化酯溶液中肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯的含量为1wt%，活化酯溶液的使用量以其中肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯为计量基准，肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯的使用摩尔量为缺苏胰岛素前体desb30的使用摩尔量的50%。
[0050]
地特胰岛素的纯化中，将磁性聚苯乙烯微球与d113树脂混合于纯化柱中，纯化柱上层与下层均为d113树脂，中层为磁性聚苯乙烯微球与d113树脂的混合层；将地特胰岛素粗产物加到纯化柱中，通过洗脱液洗脱，分离，得到纯化后的地特胰岛素。洗脱液为含有0.1wt%tfa的乙腈及水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水的使用量相同。d113树脂的使用量为磁性聚苯乙烯微球的100wt%。
[0051]
实施例2：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例1相比，不同之处在于，地特胰岛素的纯化中使用经过磺化处理后的磁性聚苯乙烯微球。
[0052]
磺化磁性聚苯乙烯微球的制备：将磁性聚苯乙烯微球加入二氯乙烷中，在60℃下溶胀20min，搅拌下在80℃下加入催化剂硫酸银，加入浓硫酸，在80℃下磺化50min，磺化完成后，过滤，冰水浸泡20min，然后过滤，丙酮洗涤除去二氯乙烷，水洗至中性，过滤，干燥，得到磺化磁性聚苯乙烯微球。二氯乙烷的使用量为100g，磁性聚苯乙烯微球的使用量为70g，硫酸银的使用量为2.1g，浓硫酸的使用量为350g。
[0053]
地特胰岛素的纯化中，将磺化磁性聚苯乙烯微球与d113树脂混合于纯化柱中，纯化柱上层与下层均为d113树脂，中层为磺化磁性聚苯乙烯微球与d113树脂的混合层；将地特胰岛素粗产物加到纯化柱中，通过洗脱液洗脱，分离，得到纯化后的地特胰岛素。洗脱液为含有0.1wt%tfa的乙腈及水的混合溶液，混合溶液中乙腈与水的使用量相同。d113树脂的使用量为磺化磁性聚苯乙烯微球的100wt%。
[0054]
实施例3：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例1相比，不同之处在于改性磁性纳米粒子。
[0055]
改性磁性纳米粒子的制备：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入盐酸溶液中，在氮气氛围下，搅拌下加入氨水，在30℃下反应30min，随后加入n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺，在80℃下处理30min，处理完成后，过滤，依次用乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，得到
改性磁性纳米粒子。盐酸溶液的浓度为0.5mol/l，盐酸溶液的使用量为100g，六水氯化铁的使用量为20g，四水氯化亚铁的使用量为8g，氨水的使用量为900g，n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的使用量为1.5g。
[0056]
实施例4：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例2相比，不同之处在于改性磁性纳米粒子。
[0057]
改性磁性纳米粒子的制备：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入盐酸溶液中，在氮气氛围下，搅拌下加入氨水，在30℃下反应30min，随后加入n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺，在80℃下处理30min，处理完成后，过滤，依次用乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，得到改性磁性纳米粒子。盐酸溶液的浓度为0.5mol/l，盐酸溶液的使用量为100g，六水氯化铁的使用量为20g，四水氯化亚铁的使用量为8g，氨水的使用量为900g，n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的使用量为1.5g。
[0058]
实施例5：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例1相比，不同之处在于磁性聚苯乙烯微球的制备。
[0059]
磁性聚苯乙烯微球的制备：将苯乙烯、异戊酸烯丙酯、交联剂和引发剂混合，氮气氛围下，加入改性磁性纳米粒子，混合搅拌60min，然后加入聚乙烯醇，在70℃下处理16h，处理完成后，得到磁性聚苯乙烯微球。苯乙烯的使用量为100g，异戊酸烯丙酯的使用量为40g，交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为15g，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为2g，改性磁性纳米粒子的使用量为10g，聚乙烯醇的使用量为2g。
[0060]
实施例6：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例2相比，不同之处在于磁性聚苯乙烯微球的制备。
[0061]
磁性聚苯乙烯微球的制备：将苯乙烯、异戊酸烯丙酯、交联剂和引发剂混合，氮气氛围下，加入改性磁性纳米粒子，混合搅拌60min，然后加入聚乙烯醇，在70℃下处理16h，处理完成后，得到磁性聚苯乙烯微球。苯乙烯的使用量为100g，异戊酸烯丙酯的使用量为40g，交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为15g，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为2g，改性磁性纳米粒子的使用量为10g，聚乙烯醇的使用量为2g。
[0062]
实施例7：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例5相比，不同之处在于磁性聚苯乙烯微球的制备。
[0063]
改性磁性纳米粒子的制备：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入盐酸溶液中，在氮气氛围下，搅拌下加入氨水，在30℃下反应30min，随后加入苯乙烯磺酸钠，在80℃下处理30min，处理完成后，过滤，依次用乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，得到改性磁性纳米粒子。盐酸溶液的浓度为0.5mol/l，盐酸溶液的使用量为100g，六水氯化铁的使用量为20g，四水氯化亚铁的使用量为8g，氨水的使用量为900g，苯乙烯磺酸钠的使用量为1.5g。
[0064]
实施例8：一种地特胰岛素的分离方法本实施例与实施例6相比，不同之处在于磁性聚苯乙烯微球的制备。
[0065]
改性磁性纳米粒子的制备：将六水氯化铁和四水氯化亚铁加入盐酸溶液中，在氮气氛围下，搅拌下加入氨水，在30℃下反应30min，随后加入n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺，在80℃下处理30min，处理完成后，过滤，依次用乙醇和蒸馏水洗涤，干燥，得到改性磁性纳米粒子。盐酸溶液的浓度为0.5mol/l，盐酸溶液的使用量为100g，六水氯化铁的使用量为20g，四水氯化亚铁的使用量为8g，氨水的使用量为900g，n-[2-(3,4-二羟基苯基)
乙基]-2-丙烯酰胺的使用量为1.5g。
[0066]
对比例1：一种地特胰岛素的分离方法本对比例与实施例1相比，不同之处在于地特胰岛素的纯化。
[0067]
地特胰岛素的纯化中，纯化柱中仅使用d113树脂；将地特胰岛素粗产物加到纯化柱中，通过洗脱液洗脱，分离，得到纯化后的地特胰岛素。
[0068]
试验例：1.电镜表征本发明制备得到的磁性聚苯乙烯微球的电镜表征如图1所示，本发明制备得到的磁性聚苯乙烯微球具有大小不等，形状各异的特点，本发明制备的磁性聚苯乙烯微球中具有大大小小的孔隙。
[0069]
2.地特胰岛素的收率本发明通过对上述各实施例的方法制备得到的地特胰岛素的收率进行统计，其结果如图2所示，其中，s1为实施例1，s2为实施例2，s3为实施例3，s4为实施例4，s5为实施例5，s6为实施例6，s7为实施例7，s8为实施例8，d1为对比例1，本发明通过将六水氯化铁和四水氯化亚铁在酸性溶液中混合，然后加入改性剂苯乙烯磺酸钠，制备得到改性磁性纳米粒子，然后以改性磁性纳米粒子作为核，使苯乙烯等含烯类试剂通过共价结合于改性磁性纳米粒子上，形成磁性聚苯乙烯微球，然后将磁性聚苯乙烯微球与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，用于地特胰岛素的纯化分离中，得到高纯度的地特胰岛素，本发明中进一步可以对磁性聚苯乙烯微球进行磺化处理，然后将其与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，得到的地特胰岛素的收率更高，表明分离出地特胰岛素的量更高；本发明在制备改性磁性纳米粒子时，还可以使用n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺作为改性剂，用后续步骤处理与制备，得到的地特胰岛素的收率高，并且n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的使用效果优于苯乙烯磺酸钠的使用效果；在使用了改性剂制备得到改性磁性纳米粒子后，进一步在制备磁性聚苯乙烯微球的步骤中，还可以加入异戊酸烯丙酯与苯乙烯等烯类试剂混合，制备得到含有有异戊酸烯丙酯的磁性聚苯乙烯微球，提高了地特胰岛素的收率；并且异戊酸烯丙酯与n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的结合使用优于异戊酸烯丙酯与苯乙烯磺酸钠的结合使用。
[0070]
3.地特胰岛素的纯度本发明通过对上述各实施例的方法制备得到的地特胰岛素的纯度进行测试分析，其结果如图3所示，其中，s1为实施例1，s2为实施例2，s3为实施例3，s4为实施例4，s5为实施例5，s6为实施例6，s7为实施例7，s8为实施例8，d1为对比例1，本发明通过将六水氯化铁和四水氯化亚铁在酸性溶液中混合，然后加入改性剂苯乙烯磺酸钠，制备得到改性磁性纳米粒子，然后以改性磁性纳米粒子作为核，使苯乙烯等含烯类试剂通过共价结合于改性磁性纳米粒子上，形成磁性聚苯乙烯微球，然后将磁性聚苯乙烯微球与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，用于地特胰岛素的纯化分离中，得到高纯度的地特胰岛素，本发明中进一步可以对磁性聚苯乙烯微球进行磺化处理，然后将其与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，得到的地特胰岛素的纯度更高，表明可以更好的将地特胰岛素分离出来；本发明在制备改性磁性纳米粒子时，还可以使用n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺作为改性剂，用后续步骤处理与制备，得到的地特胰岛素的纯度高，并且n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰
胺的使用效果优于苯乙烯磺酸钠的使用效果；在使用了改性剂制备得到改性磁性纳米粒子后，进一步在制备磁性聚苯乙烯微球的步骤中，还可以加入异戊酸烯丙酯与苯乙烯等烯类试剂混合，制备得到含有有异戊酸烯丙酯的磁性聚苯乙烯微球，提高了地特胰岛素的纯度；并且异戊酸烯丙酯与n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的结合使用优于异戊酸烯丙酯与苯乙烯磺酸钠的结合使用。
[0071]
4.磺化磁性聚苯乙烯微球的交换当量本发明实施例中制备的磺化磁性聚苯乙烯微球具有阳离子交换树脂的性能，其交换当量按磺化的聚苯乙烯树脂（阳离子交换树脂）的测试方法进行测试，其结果如图4所示，其中，s2为实施例2中制备的磺化磁性聚苯乙烯微球，s4为实施例4中制备的磺化磁性聚苯乙烯微球，s6为实施例6中制备的磺化磁性聚苯乙烯微球，s8为实施例8中制备的磺化磁性聚苯乙烯微球，本发明制备和磺化磁性聚苯乙烯微球具有高的交换当量，其中，改性剂的使用中，n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的使用效果优于苯乙烯磺酸钠的使用效果；在使用了改性剂后，进一步在磁性聚苯乙烯微球的制备中加入异戊酸烯丙酯后，得到的磺化磁性聚苯乙烯微球的交换当量更高，并且异戊酸烯丙酯与n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺的结合使用优于异戊酸烯丙酯与苯乙烯磺酸钠的结合使用。
[0072]
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

技术特征：
1.一种地特胰岛素的分离方法，包括：将缺苏胰岛素前体desb30与活化酯进行酰化反应，然后分离纯化，得到地特胰岛素；所述活化酯为肉豆蔻酸丁二酰亚胺酯；所述分离纯化中至少采用磁性聚苯乙烯微球或磺化磁性聚苯乙烯微球；所述磁性聚苯乙烯微球由改性磁性纳米粒子于含有苯乙烯的烯类试剂溶液中聚合形成，改性磁性纳米粒子由改性剂对磁性纳米粒子改性形成；所述改性剂包括苯乙烯磺酸钠或n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺。2.根据权利要求1所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述磁性纳米粒子由三价铁试剂与二价铁试剂于酸性溶液制成；和/或，所述改性磁性纳米粒子由三价铁试剂与二价铁试剂于含有改性剂的酸性溶液制成。3.根据权利要求1所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述改性磁性纳米粒子由六水氯化铁和四水氯化亚铁、改性剂制备得到；和/或，改性剂的使用量为六水氯化铁的3-12wt%；和/或，四水氯化亚铁的使用量为六水氯化铁的30-50wt%。4.根据权利要求1所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述烯类试剂溶液中含有交联剂；和/或，所述烯类试剂溶液中含有异戊酸烯丙酯；和/或，所述烯类试剂溶液中含有引发剂；和/或，所述烯类试剂溶液中含有聚乙烯醇。5.根据权利要求4所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述交联剂为二乙烯苯，交联剂的使用量为苯乙烯的10-20wt%；和/或，引发剂为偶氮二异丁腈，引发剂的使用量为苯乙烯的1-3wt%；和/或，改性磁性纳米粒子的使用量为苯乙烯的5-15wt%；和/或，聚乙烯醇的使用量为苯乙烯的1-3wt%；和/或，异戊酸烯丙酯的使用量为苯乙烯的30-50wt%。6.根据权利要求1所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述磺化磁性聚苯乙烯微球由磁性聚苯乙烯微球与浓硫酸在催化剂作用下制备形成。7.根据权利要求6所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述催化剂为硫酸银，硫酸银的使用量为磁性聚苯乙烯微球的1-5wt%；和/或，浓硫酸的使用量为磁性聚苯乙烯微球的400-600wt%。8.根据权利要求6所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述磺化磁性聚苯乙烯微球的制备中，使用的溶剂为二氯乙烷，磁性聚苯乙烯微球的使用量为二氯乙烷的60-80wt%。9.根据权利要求1所述的一种地特胰岛素的分离方法，其特征是：所述分离纯化中还使用了聚丙烯酸型阳离子交换树脂。10.磺化磁性聚苯乙烯微球和聚丙烯酸型阳离子交换树脂在制备地特胰岛素中的用途，所述磺化磁性聚苯乙烯微球由磁性聚苯乙烯微球与浓硫酸在催化剂作用下制备形成；所述磁性聚苯乙烯微球由改性磁性纳米粒子于含有苯乙烯的烯类试剂溶液中聚合形成，改性磁性纳米粒子由改性剂对磁性纳米粒子改性形成；所述改性剂包括苯乙烯磺酸钠或n-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺。

技术总结
本发明公开了一种地特胰岛素的分离方法，属于多肽合成分离领域，具体涉及将六水氯化铁和四水氯化亚铁在酸性溶液中混合，然后加入改性剂，制备得到改性磁性纳米粒子，然后以改性磁性纳米粒子作为核，使苯乙烯等含烯类试剂通过共价结合于改性磁性纳米粒子上，形成磁性聚苯乙烯微球，然后将磁性聚苯乙烯微球与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合，用于地特胰岛素的纯化分离中，改性剂包括苯乙烯磺酸钠或N-[2-(3,4-二羟基苯基)乙基]-2-丙烯酰胺；进一步地，可以对磁性聚苯乙烯微球进行磺化处理，然后将其与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合使用。与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合使用。与聚丙烯酸基阳离子交换树脂混合使用。


技术研发人员：王辉平 王佳炜 邢海英
受保护的技术使用者：杭州湃肽生化科技有限公司
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/9/7