细胞外核酸的储存和/或运输的制作方法

1.本发明提供了一种包含样品的可逆交联水凝胶，其中样品包含细胞外核酸。本文还提供了制备、运输和/或储存含核酸水凝胶的相应方法及其用途。


背景技术：

2.细胞外核酸在社会上发挥着越来越重要的作用，最近的covid-19疫苗试验和新出现的covid-19诊断实验都突显了这一点。它们可以用于多种情况，包括科学研究、药物开发、再生医学、诊断分析和疫苗开发。
3.可以产生和/或制备基于核酸的产品，如基于核酸的疫苗，以在地理上经常与其使用点分离的位置使用。此外，核酸样品(例如，用于病毒检测的患者样本)可以在与诊断发生地不同的位置获得。因此，包含核酸的样品被常规地存储和/或从第一地理位置运输到第二地理位置。然而，在英国或全球范围内运输此类材料可能需要数小时或数天的时间，并且很容易出现延误，而且这种材料需要在一定条件下按照匹配目的的条件交付到使用点。核酸(特别是rna)的有效运输和回收已被证明是困难的，而许多方法会随着时间的推移导致核酸降解和/或功能丧失。因此，核酸的储存和/或运输在，例如，实验室供应(研究分配)和诊断或治疗方面是一个重要的障碍。
4.核酸储存和运输的常规方法包括冷链运输(例如，2-8℃)或在运输前和运输期间冷冻样品。然而，这种方法通常需要在运输之前进行许多处理步骤，并且这些处理可能会对所运输的材料产生不利影响或显著增加成本。因此，核酸储存和运输的常规方法具有许多缺点。当细胞外核酸用于人类用途(例如，作为疫苗)或用于诊断目的时，这些缺点是特别显著的问题，其中保持核酸结构完整性和/或功能是关键。
5.仍然存在对于储存和/或运输细胞外核酸的简单而有效的方法的需要。


技术实现要素：

6.发明人开发了一种用于储存和/或运输细胞外核酸的新方法。
7.发明人出乎意料地证实，将细胞外核酸引入可逆交联水凝胶中保护细胞外核酸免受储存的机械和环境应力的影响，并保持细胞外核酸的结构完整性和/或功能性。有利的是，包含细胞外核酸的水凝胶可以包装于密封容器中，用于有效储存或输送到其使用点，同时将材料保持于适合用途的条件下。此外，包装的材料的储存和/或运输可以有效地进行更长的时间段，而不会显著影响核酸的结构完整性和/或功能。
8.本发明的方法可以特别适用于在发生任何劣化之前立即储存细胞外核酸(如分离或制造的细胞外核酸，包括病毒载体和病毒)，这为使用者提供了灵活性，因为细胞外核酸(例如，分离/制造的细胞外核酸，包括病毒载体和病毒)可以安全储存，直到有合适的工作人员，可以进入gmp实验室，或直到样品可以批量处理，而不会影响最终性能。
9.本发明使用藻酸盐水凝胶进行举例说明。然而，本发明同样适用于具有等效机械性能的其他可逆交联水凝胶。以下更详细地描述了本发明上下文中可以等效使用的替代水
凝胶。
10.此外，本发明已经使用病毒，特别是人类冠状病毒229e举例说明。本发明人在本文中显示，冠状病毒229e核酸在本文所述的水凝胶中储存后被保存并保持其功能。出乎意料的是，即使在水凝胶中储存7-14天后，储存的冠状病毒也显示保持了功能(当测定病毒细胞病变效应(cpe)时)。这表明，与储存此类核酸的常规方法相比(例如，与中的病毒核酸储存相比)，本文提供的水凝胶对核酸功能的保存得到了改善。水凝胶可以用于保留任何细胞外核酸的功能，包括例如存在于病毒颗粒内的细胞外核酸，和/或存在于脂质胶囊如脂质膜内的细胞外核酸。
11.在一个方面中，提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中样品包含细胞外核酸。
12.适当地，该细胞外核酸可以处于脂质胶囊(荚膜，capsule)内。
13.适当地，该细胞外核酸可以处于病毒载体中。
14.适当地，该细胞外核酸可以处于病毒颗粒中。
15.适当地，该样品可以还包括水性缓冲液。
16.合适地，该水性缓冲液可以是盐类缓冲液。
17.适当地，该水凝胶可以包含交联的藻酸盐。
18.合适地，该水凝胶可以包括交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁和/或藻酸钠。
19.适当地，该交联的海藻酸盐可以包含约0.1％(w/v)-约5.0％(w/v的)藻酸钙。
20.适当地，该细胞外核酸可以是rna或dna。
21.适当地，水凝胶可以包装于密封容器中。
22.适当地，该密封的容器可以是小瓶、管、烧瓶、盘、皿(vessel)或板。
23.在另一个方面中，提供了一种制备包含细胞外核酸的样品以用于存储和/或从第一位置运输到第二位置的方法，该方法包括以下步骤：
24.i)使样品与成水凝胶聚合物接触；和
25.ii)聚合该聚合物而形成可逆交联的含核酸的水凝胶。
26.适当地，该方法可以还包括在步骤(i)之前将细胞外核酸与水性缓冲液混合。可选地，水性缓冲液可以是盐类缓冲液。
27.适当地，该方法可以包括将含核酸水凝胶密封于容器中，用于储存或从第一位置运输到第二位置。可选地，该密封容器可以是小瓶、管、烧瓶、盘、皿或板。
28.适当地，该方法可以还包括：
29.iii)将密封容器从第一位置运输到第二位置。
30.在另一个方面中，提供了一种将含细胞外核酸的样品从第一位置运输到第二位置的方法，该方法包括以下步骤：
31.(a)获得根据本发明的方法产生的可逆交联的含核酸的水凝胶；或获得本发明的可逆交联的含核酸的水凝胶；
32.(b)将该水凝胶从第一位置运输到第二位置。
33.适当地，该方法可以还包括在第二位置从水凝胶中释放出核酸。
34.在另一个方面中，提供了一种储存含细胞外核酸的样品的方法，该方法包括以下步骤：
35.(a)获得根据本发明的方法产生的可逆交联的含核酸的水凝胶；或获得本发明的
可逆交联的含核酸的水凝胶；和
36.(b)储存水凝胶。
37.适当地，该方法可以还包括在储存后从水凝胶中释放出核酸。
38.在另一个方面中，本文提供了一种用于履行细胞外核酸的订单或请求的方法，该方法包括以下步骤：
39.a)接收细胞外核酸的订单或请求；
40.b)获得根据本发明的方法产生的可逆交联的含核酸的水凝胶；或获得本发明的可逆交联的含核酸的水凝胶；和
41.c)发送样品以运输；或将样品运输到订单或请求中指定的位置。
42.适当地，该细胞外核酸可以处于脂质胶囊内。
43.适当地，该细胞外核酸可以处于病毒载体中。
44.适当地，该细胞外核酸可以处于病毒颗粒中。
45.适当地，该样品可以还包含水性缓冲液。
46.适当地，该水性缓冲液可以是盐类缓冲液。
47.适当地，该水凝胶可以包括交联藻酸盐。
48.适当地，该水凝胶可以包括交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁和/或藻酸钠。
49.适当地，该交联藻酸盐可以包含约0.1％(w/v)-约5.0％(w/v)的藻酸钙。
50.适当地，该细胞外核酸可以是rna或dna。
51.在另一个方面中，提供了可逆交联水凝胶用于保存细胞外核酸的用途。
52.在本说明书的整个说明书和权利要求书中，单词“包含”和“含有”及其变体是指“包括但不限于”，并且它们并非旨在(也并不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。
53.在本说明书的说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。具体而言，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应该被理解为考虑复数和单数。
54.结合本发明的具体方面、实施方式或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团，除非与之不相容，应该理解为可以应用于本文描述的任何其他方面、实施方式或实施例。
55.本发明的各个方面将在下文中进行进一步详细描述。
附图说明
56.下文将参考附图进一步描述本发明的实施方式，其中：
57.图1显示了人类冠状病毒229e(cov 229e)在atelerix swabready
tm
和病毒运输培养基中培养至多达14天后的log tcid50/ml。检测限为1.5log。
58.图2显示了腺病毒(v型)在atelerix swabready
tm
和磷酸盐缓冲盐水(pbs)中培养至多达14天后的平均回收率。黑色虚线表示检测限(1.5log)。
59.图3显示了维斯纳(visna)病毒在atelerix swabready
tm
中培养3、7和14天后与第0天的磷酸盐缓冲盐水对照相比的平均回收率。黑色虚线表示检测限(1.5log)。pbs＝磷酸盐缓冲盐水。
60.本文提及的专利、科学和技术文献确立了本领域技术人员在提交申请时可获得的
知识。在本文中引用的已授权专利、已发布和待决专利申请以及其他出版物的全部公开内容通过引用结合于本文中，其程度与具体和单独指示通过引用并入的程度相同。在任何不一致的情况下，以本公开为准。
61.本发明的各个方面将在下文中进行进一步详细描述。
具体实施方式
62.本文提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含细胞外核酸。
63.如本文所用，“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核苷酸分子”及其变体可以互换使用，是指规则或不规则序列中的多个核苷酸。多核苷酸通常是单链或双链(复链)，但可以采用包含三条(三链)或四条(四链/i-基序)链的高阶结构，或可以在合适的条件下在不同的基因座中包含这些构型的混合物。多核苷酸可以是短的或长的。它们至少有两个相邻的核苷酸。
64.核苷酸序列可以是基因组、合成或重组来源，并且可以是双链或单链(代表正义或反义链)。术语“核酸”包括基因组dna、cdna、合成dna、rna(例如，mrna)、嵌合dna/rna分子以及，例如，通过使用核苷酸类似物产生的dna或rna的类似物。换句话说，修饰的dna或rna碱基也包括在内。因此，多核苷酸可以包括一个或多个修饰的dna或rna碱基。本领域已知有几种修饰的碱基，因此本领域技术人员可以很容易识别合适的修饰碱基。在特定位点携带多个修饰的多核苷酸在合成生物学、纳米材料制造、生物分析和测序应用中具有应用。例如，dna可以在其三个组成部分中的任何一个或全部进行化学修饰——磷酸酯连接键、糖环或核碱基。多种修饰核苷酸可以作为脱氧核苷酸三磷酸盐(dntp)或亚磷酰胺衍生物在商业上获得。这些和其他修饰的核苷酸可以作为dntp酶促合成并插入dna或rna中，或作为亚磷酰胺通过自动化dna合成。产生核酸的方法在本领域内是众所周知的，并且包括重组dna技术(即，重组dna)。
65.核苷酸残基通常来源于天然嘌呤碱基，即腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、次黄嘌呤(i)和黄嘌呤(x)，以及嘧啶碱基，即胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)。核苷酸类似物可以用于多核苷酸序列内的一个或多个位置，这种核苷酸类似物在例如碱基部分和/或糖部分和/或者磷酸键中被修饰。可以使用任何核苷酸类似物，只要它不阻止多核苷酸杂交，并且它被聚合酶接受为模板和底物。
66.本文中可以使用任何合适的核酸。在一个实施例中，核酸是dna。在另一个例子中，核酸是rna(例如单链或双链rna)。dna或rna核酸可用于疫苗，例如作为病毒载体或病毒颗粒的一部分。在一个特定的例子中，核酸是rna。在一个具体的例子中，核酸是单链rna(例如，单链rna病毒)。
67.在一个具体实例中，该核酸是mrna。mrna可以特别适用于作为疫苗的核酸组分(例如，其中mrna可以封装于脂质纳米颗粒中)。因此，在一个具体实施例中，提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含细胞外mrna。
68.如本文所用，“细胞外”是指位于或发生于一个或多个细胞外。细胞外核酸不位于细胞内。
69.术语“细胞外核酸”包括“无细胞”核酸(即，与细胞无关的核酸)。正如本文所用，“与
…
相关的”是指两个实体之间的物理位置和/或相互作用。在核酸和细胞的上下文中，当
核酸位于细胞内或附着于细胞表面(即与细胞或细胞内物理相互作用)时，核酸可能与细胞“相关”。无细胞核酸不与细胞相关，因此并不位于细胞内，也不附着于细胞表面。
70.为避免疑义，本文中的术语“细胞外”或“无细胞”是指核酸被引入水凝胶时的物理状态(即，核酸直接或间接与水凝胶接触时的物理态)。在这种情况下，“直接接触”是指核酸本身与水凝胶物理接触的情况(例如，当核酸不在脂质胶囊内时)，而“间接接触”指核酸本身不与水凝胶直接接触的情况，例如，当核酸处于脂质胶囊内时(在本文其他地方将进行更详细描述)。
71.因此，术语“细胞外”(或“无细胞”)包括起源于细胞内但不再位于细胞内或与细胞(包括它们起源的细胞)相关的核酸。换句话说，细胞外核酸(或无细胞核酸)包括在细胞内产生的核酸，然后在核酸与水凝胶接触之前从细胞释放或分离出来。在一些实施例中，细胞外核酸可以是外来核酸(换句话说，外部来源的核酸，即并非源于细胞的核酸)。例如，核酸可以是合成核酸。
72.本文所述的细胞外核酸可以用于任何合适的应用。几个合适的应用对于本领域技术人员而言是众所周知的。
73.例如，细胞外核酸可以用作疫苗，例如，包含核酸的疫苗。此类疫苗的实施例可以是mrna疫苗(例如，其中mrna处于脂质纳米颗粒内)，或病毒载体疫苗(例如，其中核酸处于病毒载体内)，包括基于病毒的疫苗(其中核酸处于合成或重组病毒颗粒内，或天然病毒颗粒如灭活病毒粒子内)。
74.在另一个实施例中，细胞外核酸可以用于诊断。例如，细胞外核酸可以存在于从受试者获得的样品中(例如，使用拭子从受试人的喉咙和/或鼻子获得)。作为非限制性实例，受试者可能怀疑患有或怀疑具有感染、疾病或病症的风险，该感染、疾病和病症可以通过从受试者获得的样品中细胞外核酸的存在进行鉴定。例如，受试者可能被怀疑患有或具有感染病毒的风险，如但不限于，新冠肺炎感染。因此，样本中存在病毒(例如，covid-19)核酸或病毒颗粒蛋白(例如，covid突刺蛋白n-蛋白或m-蛋白)可能指示感染。在这种情况下，将核酸保存于样本中直到可以进行诊断是特别重要的。
75.作为进一步的非限制性实例，细胞外核酸可以处于病毒颗粒内，其中病毒颗粒的存在可用于诊断。例如，病毒颗粒可以存在于从受试者获得的样品中(例如，使用拭子从受试者的喉咙和/或鼻子获得)。作为一个非限制性的实施例，受试者可能被怀疑患有或具有可能患有可以通过从受试者获得的样品中病毒颗粒的存在而鉴定出的感染、疾病或病症的风险。例如，受试者可能被怀疑患有或具有感染病毒如但不限于covid-19感染的风险。因此，样品中存在病毒(例如，covid-19)核酸或病毒颗粒蛋白(例如covid突刺蛋白n-蛋白或m-蛋白)可以指示感染。在这种情况下，病毒颗粒保存在于样品中直到可以进行诊断是特别重要的。
76.本文中使用的术语“受试者”是指哺乳动物。因此，受试者是指，例如，狗、猫、马、牛、猪、豚鼠等。受试者可以是人。当受试者是人时，受试者在本文中可以称为患者。术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可以互换使用。
77.受试者可以是有症状的(例如，受试者表现出与感染、疾病或障碍症相关的症状，例如，病毒感染，如covid-19)，也可以是无症状的(如，受试人没有表现出与传染、疾病或障碍症相关的症状(例如，病毒感染，如covid-19)。
78.如上所述，在一个具体实例中，核酸可以处于载体中。
79.载体是允许或促进实体从一个环境转移到另一个环境的工具。例如，在重组核酸技术中使用的一些载体允许实体，如核酸片段(例如，异源dna片段，如异源cdna片段)转移到靶细胞中并由靶细胞表达。载体可以促进所关注的核酸/核苷酸(noi)整合，而维持noi及其在靶细胞内的表达。或者，载体可以通过在瞬态系统中表达noi而促进载体的复制。载体可以用于将异源核酸(dna或rna)维持于细胞内，或促进包含dna或rna片段的载体的复制或由核酸片段编码的蛋白质的表达。载体可以促进所关注的核酸/核苷酸(noi)整合，而维持noi及其在靶细胞内的表达。或者，载体可以通过在瞬态系统中表达noi而促进载体的复制。
80.在一个具体实例中，核酸可以处于载体如病毒载体内。因此，在一个实施例中，提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含在病毒载体中的细胞外核酸。
81.使用病毒载体递送治疗性基因是众所周知的，基因疗法产品现在是我们全球医疗保健市场的重要组成部分。这样的病毒载体作为病毒疫苗可能特别有用。病毒载体的实施例包括逆转录病毒载体(如慢病毒载体，如维斯纳病毒)、腺病毒和腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体和痘苗病毒载体。这些载体组每组的具体实例在本领域中是众所周知的(参见，例如，coffin et al.(1997)“retroviruses”,cold spring harbour laboratory press eds:jm coffin,sm hughes,he varmus pp 758-763，以了解逆转录病毒的进一步细节)。
82.例如，本文所述的可逆交联水凝胶可以包含样品，其中所述样品包含腺病毒载体中的细胞外核酸。
83.术语“病毒载体”包括病毒颗粒(因为病毒颗粒也允许或促进核酸从一个环境转移到另一个环境)。它包括天然、合成和重组病毒颗粒。
84.术语“病毒的颗粒”、“病毒颗粒”和“病毒”在本文中可以互换使用。病毒颗粒包括编码一种或多种病毒组分的核酸(dna或rna)，被称为衣壳的保护性蛋白质外壳包围。衣壳也可以被称为包膜的其他外壳包围，产生“包膜病毒颗粒”。包膜通常来源于宿主细胞膜的部分(磷脂和蛋白质)，并添加了一些病毒糖蛋白。因此，包膜病毒颗粒通常包括保护衣壳内核酸的脂质胶囊。
85.因此，在一个实施例中，提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含在病毒颗粒中的细胞外核酸。在另一个实施例中，提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含在包膜病毒颗粒中的细胞外核酸。
86.病毒颗粒可以是任何病毒颗粒，包括感染人类的病毒，包括但不限于，人类冠状病毒(例如，人类冠状病毒229e(cov 229e))、人类鼻病毒和人类腺病毒。它也可以是，例如，维斯纳病毒。
87.冠状病毒是一种可导致人类多种上呼吸道疾病的包膜单链rna病毒。这些疾病包括从轻度疾病如普通感冒到最近covid-19大流行中出现的严重急性呼吸综合征不等。冠状病毒被认为主要通过呼吸道飞沫传播，一些证据表明该病毒可以在传染媒介上保持几天的活性。预防性和治疗性的干预措施对于减缓和/或阻止冠状病毒的传播至关重要。
88.人类鼻病毒是一种正义单链rna病毒。它们是导致人类普通感冒的主要原因。鼻病毒感染在33-35℃的温度，即在鼻子中发现的温度下繁殖。鼻病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。
89.人类腺病毒是具有双链dna的二十面体病毒。已经发现50多种独特腺病毒血清型
会导致多种疾病，从幼儿的轻度呼吸道感染(称为普通感冒)到免疫系统变弱的人中危及生命的多器官疾病。
90.感染人类的病毒的其他非限制性实例(其可以在本文所述的水凝胶中储存和/或运输)包括来自以下科的病毒；细小病毒科(parvoviridae)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、托加病毒科(togaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、痘病毒科(poxviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、丝状病毒科(fiioviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)，嗜肝病毒科(hepadnaviride)、腺病毒科(adenoviridae)、星形病毒科(astroviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、肺炎病毒科(pneumoviridae)、阿瑞那韦病毒科(arenaviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、指环病毒科(anelloviridae)等。
91.术语“病毒颗粒”包括合成或重组病毒颗粒，或天然病毒颗粒。它还包括非传染性和传染性病毒。传染形式也被称为病毒粒子。因此，本文还提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含在病毒粒子(例如包膜病毒粒子)中的细胞外核酸。
92.感染性病毒粒子可以被灭活而形成灭活病毒粒子(例如，用作疫苗)。因此，本文还提供了包含样品的可逆交联水凝胶，其中所述样品包含在灭活病毒体(例如，灭活的sars-cov-2病毒粒子)中的细胞外核酸。
93.如本领域技术人员清楚的，病毒颗粒的亚组包括包膜，因此可以认为具有“脂质胶囊”。在这种情况下，核酸处于本文其他地方更详细定义的脂质胶囊内。因此，为避免疑义，本文中提及“脂质胶囊内”的细胞外核酸还包括在包膜病毒颗粒内的核酸，以及不同类型脂质胶囊(例如，脂质体、脂质纳米颗粒、细胞外囊泡、胶束、脂滴等)内的细胞外核苷酸。
94.本文所述的细胞外核酸可以位于脂质胶囊内。因此，本文所述的可逆交联水凝胶可以包含样品，其中所述样品包含在脂质胶囊内的细胞外核酸。
95.如本文所用，“脂质胶囊”是指包裹或包封核酸的脂质结构。如本领域技术人员清楚的，在本发明的上下文中，术语“脂质胶囊”不包括细胞本身(因为这与术语细胞外核酸不相容)。因此，本文所述的脂质胶囊可以被认为是与细胞不同的不能独立复制的脂质胶囊。合适的脂质胶囊在本领域技术人员内是众所周知的，并且包括任何细胞外脂质结构，包括包含脂质双层的结构(如脂质体、包膜病毒颗粒、含脂质双层的纳米颗粒和细胞外囊泡，如外泌体、核外颗粒体，微囊泡、微粒、癌小体(oncosome)等)和具有脂质单层的结构(如胶束、脂滴、含脂质单层的纳米颗粒等)。如本领域技术人员清楚的，包括脂质单层(或脂质双层)的脂质胶囊包括连续的和不连续的脂质单层(或连续的和非连续的脂质双层)，如在一些脂质纳米颗粒中发现的那些。
96.在一个具体实例中，脂质胶囊包括包膜病毒颗粒。
97.如本文所用，术语“脂质双层”是指包括两个平行的脂质分子层的结构。通常，脂质双层中的每个脂质分子包括亲水性头部和疏水性尾部。在脂质双层中，两层脂质分子排列成使其疏水性尾部向内指向彼此而形成疏水性内部，并且其亲水性头部向外朝向水性环境。几乎所有生物体和许多病毒的细胞膜都是由脂质双层构成，包括作为包被细胞核的核膜的磷脂和细胞中膜结合细胞器的膜。在这种情况下，包膜病毒颗粒(如病毒粒子)可以被
认为具有包含脂质双层的脂质胶囊(因为病毒颗粒包膜通常在出芽期间来源于宿主细胞)。
98.本文使用的术语“脂质体”是指由来源于天然来源或化学合成的极性脂质分子制备的颗粒。脂质形成球形/椭圆形的封闭结构，其中外部弯曲的脂质双层围绕水性核而形成。脂质体可以包括包围水性核的一个或多个脂质双层。脂质体可以用作递送货物例如治疗剂的载体。例如，脂质体可以用于递送药物和/或细胞外核酸，包括病毒载体。脂质体可以包括磷脂，特别是磷脂酰胆碱，但只要它们与脂质双层结构相容，也可以包括其他脂质，如磷脂酰乙醇胺。脂质体的主要类型是多层囊泡(mlv，具有几个片层相脂质双层)、小单层脂质体囊泡(suv，具有一个脂质双层)，大单层囊泡(luv)和蜗形囊泡(cochleate vesicle)。根据本发明，可以使用任何合适的脂质体。在一个实施例中，本文所述的可逆交联水凝胶因此可以包含样品，其中所述样品包含在脂质体内的细胞外核酸。
99.在一个实施例中，本文所述的可逆交联水凝胶可以包含样品，其中样品包含在含脂质纳米颗粒内的细胞外核酸。如本文所用，术语“含脂质纳米颗粒”是指包含脂质的纳米颗粒，可选地添加其他组分，如蛋白质。本文使用的术语“脂质单层纳米颗粒”是指包含脂质单层的纳米颗粒。本文使用的术语“脂质双层纳米颗粒”是指包含脂质双层的纳米颗粒。如本文所使用的，术语“纳米颗粒”是指具有至少一个纳米级尺寸(例如，1-1000nm)的颗粒。
100.如本文所用，“细胞外囊泡”(或“ev”)是指从细胞中释放的脂质双层限定的颗粒，与细胞不同，这些颗粒不能复制。如本文所述，细胞外囊泡的实施例包括外泌体、核外颗粒体，微囊泡、微粒、癌小体等。本领域已知几种细胞外囊泡包括外泌体、核外颗粒体，微囊泡、微粒和癌小体。
101.细胞外囊泡已经被很好地表征，并且在本领域中具有明确的意义(综述于andaloussi et al.,nature reviews drug discovery,vol 12,may 2013,page 347-357,extracellular vesicles；biology and emerging therapeutic opportunities中)。细胞外囊泡已经从几种体液中分离出来。它们已被证明在生理过程调节中发挥着关键作用，包括干细胞维持、免疫监测和凝血。它们也被证明在几种疾病的病理学中发挥着至关重要的作用。
102.细胞外囊泡可以从来源于内体的多泡体(mvb)中脱落，或可以直接从质膜中出芽。当它们被释放到细胞外空间时，它们被称为外泌体或核外颗粒体(或微囊泡)，这取决于它们是从细胞内膜还是外膜形成，并通过内吞或融合被其他细胞摄取。
103.细胞外囊泡根据其细胞源、生物功能或基于其生物起源进行分类(综述于andaloussi et al.,2013)。根据它们的生物起源确定，三类主要的细胞外囊泡是外泌体、微囊泡和凋亡体，其中前两类在生物样品中最为主要。ev标记物在本领域中是众所周知的。外泌体标记物的实施例包括四跨膜蛋白(如tspan29和tspan30)、escrt组分、pdcd6ip、tsg101、筏蛋白(flotillin)和mfge8。微泡标记物的实施例包括整合素、选择素和cd40配体。
104.尽管最近取得了进展，但在许多已发表的研究中，“外泌体”和“微囊泡”这两个术语已经互换使用。本文中，术语“细胞外囊泡”用于指代这两种囊泡类型。
105.本文使用的术语“脂质单层”是指包含单层脂质分子的膜。具有脂质单层的众所周知的结构的例子包括胶束、脂滴、脂质单层纳米颗粒等。
106.如本文其他地方所述，细胞外核酸可以被包埋或包封于脂质胶囊内。例如，“包埋
核酸”可以结合(或吸附或束缚于)脂质胶囊的外表面。如本文所用，术语“包埋的”是指被脂质胶囊物理捕获/陷入的细胞外核酸，使得其不从脂质胶囊中释放。细胞外核酸可以通过被脂质胶囊完全包围而被包埋，或它可以通过大部分(但不是全部)细胞外核酸被脂质胶囊包围而被包埋。在该上下文中，“大部分”是指被脂质胶囊包围的细胞外核酸(按序列计)的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
107.在细胞外核酸处于脂质胶囊中的实施例中，其通常被脂质胶囊包封。术语“包封”是指将细胞外核酸封闭于脂质胶囊中。当细胞外核酸完全被脂质胶囊包围时，它就被脂质胶囊“包封”。细胞外核酸可以位于脂质胶囊的水性核内。可替换地，细胞外核酸可以通过共价键、静电或疏水相互作用而位于脂质胶囊的脂质结构内(例如，脂质双层内)。可替换地，细胞外核酸(例如疏水性药物)可以引入到脂质胶囊的纳米结构域中。
108.在一些实施例中，脂质胶囊可以包括额外的内容物(除了细胞外核酸)。额外的内容物也可以被包封于脂质胶囊内。额外的内容物可以包括药用载体、稀释剂或赋形剂，或一种或多种活性药物成分。
109.在一些实施例中，细胞外核酸可以存在于(例如，吸附或吸收于)吸收材料或染菌物(fomite)之内或上(例如，当细胞外核酸从受试者获得时)。在一些实施例中，吸收材料或染菌物可以是拭子。在这样的实施例中，吸收材料或染菌物可以部分或完全包封于水凝胶中，可以被水凝胶包埋，或可以部分或全部浸入水凝胶中。通常而言，在聚合之前或期间，吸收材料或染菌物与成水凝胶聚合物接触，而使之一旦水凝胶形成，吸收材料或染菌物至少一部分处于水凝胶内(核酸存在于其中或其上)。
110.在一个实施例中，包含于可逆交联水凝胶内的样品除了细胞外核酸之外还包含水性缓冲液。术语“水性缓冲液”和“缓冲溶液”在本文中可互换使用。水性缓冲液是ph缓冲液(或氢离子缓冲液)。缓冲溶液是指当向其中加入少量酸或碱时可以抵抗ph值变化的溶液。在各种化学应用中，缓冲溶液被用作将ph值保持于几乎恒定值的手段。
111.本领域技术人员已知几种合适的水性缓冲液。作为非限制性实例，水性缓冲液可以是盐类缓冲液，例如，0.1％-2.0％(w/v)盐类缓冲液。任何合适的盐类缓冲液都可以使用，并且这种缓冲液是本领域技术人员容易确定的。
112.在一些实施例中，水性缓冲液(例如，盐类缓冲液)可以包括血清，如胎牛血清(fcs)或胎牛血清(fbs)，和/或可以包括另外的组分，例如抗生素。例如，当细胞外核酸处于脂质胶囊内时，fbs或fcs的添加可能是有用的，因为血清可以有助于保护脂质膜。合适的血清和/或抗生素浓度对于本领域技术人员来说是容易确定的。
113.合适的盐类缓冲液的非限制性实例包括hank平衡盐溶液(或hank缓冲盐水溶液)、磷酸盐缓冲盐水、氯化钠等。如本领域技术人员清楚的，任何这些缓冲液都可以用作样品内的另外的药剂(以帮助维持存在核酸的样品的ph)。合适的盐类缓冲液的一个进一步的实施例是广泛使用的病毒转运介质
114.因此，在一个实施例中，本文所述的可逆交联水凝胶可以包含样品，其中样品包含细胞外核酸(例如，处于脂质胶囊如包膜病毒颗粒内)和盐类溶液。例如，该可逆交联水凝胶可以包括样品，其中样品包含细胞外核酸(例如，处于脂质胶囊如包膜病毒颗粒内)和病毒转运介质(例如)。盐-基溶液(例如，病毒转运介质，例如或类似物)可
以是约0.1％-约2.0％(w/v)的盐类溶液，例如，该盐类溶液可以是约0.4％-约0.9％(w/w)的盐类溶液。
115.如本文所用，“可逆交联水凝胶”是指通过可逆交联而形成的水凝胶(即，交联可以逆转，使水凝胶恢复为溶液)。交联的逆转使细胞外核酸可以(例如，在使用时/运输或储存完成后)从水凝胶中释放。可逆交联水凝胶的实施例在本领域中是众所周知的。因此，本领域技术人员可以很容易确定出合适的水凝胶。
116.本文所指的水凝胶包括具有交联或网络结构或基质的成水凝胶聚合物(即，至少一种成水凝胶聚合物)；具有间隙液体。水凝胶可以保持其中所含的细胞外核酸的结构完整性和/或功能性。优选所述水凝胶是半渗透的。
117.术语“成水凝胶聚合物”是指可以在适当条件下形成交联或网络结构或基质的聚合物，其中间质液体和细胞外核酸可以保留于这种结构或基质内。水凝胶可以包括内部孔隙。
118.交联或网络结构或基质的形成可以通过任何合适的方式起始，这取决于聚合物的性质。
119.聚合物通常是亲水性聚合物。它能够在水性液体中溶胀。在一个实施例中，成水凝胶聚合物是胶原蛋白。在本实施例中，胶原水凝胶包括胶原纤维基质，其在间质液体和细胞外核酸周围形成连续支架。溶解的胶原可以通过加入稀碱诱导聚合/聚集，以形成交联胶原纤维的凝胶网络。原纤维的凝胶网络支持所溶解的胶原纤维的原始体积，保留间质液体。生产这种胶原凝胶的一般方法在本领域内是众所周知的(例如，wo2006/003442、wo2007/0060459和wo2009/004531)。
120.在胶原凝胶中使用的胶原可以是任何成原纤维胶原。
121.成纤维胶原蛋白的实施例为i型、ii型、iii型、v型、vi型、ix型和xi型。凝胶可以包括所有一种类型的胶原或不同类型的胶原的混合物。优选地，凝胶包括i型胶原或由i型胶原组成。在本发明的一些实施例中，凝胶完全或基本上由胶原纤维形成，即胶原纤维是凝胶中唯一或基本上唯一的聚合物。在本发明的其他实施例中，该胶原凝胶可以另外包含其他天然存在的聚合物，例如，丝、纤连蛋白、弹性蛋白、壳聚糖和/或纤维素。通常而言，非胶原天然聚合物的量将小于凝胶的5％，优选小于4％、3％、2％或1％(wt/wt)。凝胶中也可以存在类似量的非天然聚合物，例如，肽两亲物、聚内酯、聚乳酸、聚甘氨酸(polyglycone)、聚己内酯和/或磷酸盐玻璃。
122.在一些实施例中，该成水凝胶聚合物是藻酸或金属离子藻酸盐。优选金属是第1族金属(例如，藻酸锂、钠或钾)或第2族金属(例如，藻酸钙、镁、钡或锶)。优选聚合物是藻酸钙或藻酸钠或藻酸锶，最优选藻酸钙。
123.决定藻酸盐凝胶渗透性的一个因素是凝胶中甘露糖醛酸(m)和古洛糖醛酸(g)的含量。具有高m:g比率的凝胶具有小的固有孔径。根据改善细胞外核酸在水凝胶内的保存之需，可以操纵m:g比率而增加凝胶的渗透性。在一些实施例中，藻酸盐凝胶的g含量为0-30％。在一些实施例中，m含量优选为30％-70％。在一些优选的实施例中，该凝胶是m含量为50％-70％或60％-70％的藻酸盐凝胶，并且该凝胶另外包含或孔增强剂(本文也称为成孔剂)。在一些实施例中，孔径增大剂是羟乙基纤维素(hec)。在本实例中，hec可以用于水凝胶的制备；然后在使用之前将其完全、基本上完全或部分地从水凝胶中去除。水凝胶中hec的
优选浓度(在制备期间)包括0.5％-3.0％ hec，更优选1.0％-2.5％，更加优选1.2％-2.4％ hec。在一些优选的实施方式中，水凝胶中hec的浓度(在制备期间)为1.2％或2.4％(浓度以wt％给出)。hec可以作为胶束悬浮于凝胶中。hec去除可以通过在合适的水性溶剂或缓冲液(例如，组织培养基)中洗涤水凝胶而实现。
124.在一些实施例中，成水凝胶聚合物是藻酸盐。在一些实施例中，细胞外核酸可以首先用本文所述的不同成水凝胶聚合物涂覆，然后进一步涂覆藻酸盐。在其他实施例中，成水凝胶聚合物是藻酸盐和另一种成水凝胶聚合物的混合物。在一些实施例中，该藻酸盐(例如，用肽)进行了改性。
125.在还有的其他实施例中，该成水凝胶聚合物是交联丙烯酸类(例如，聚丙烯酰胺)聚合物。
126.在还有的进一步的实施例中，该成水凝胶聚合物是可交联纤维素衍生物、羟基醚聚合物(例如，泊洛沙姆)、果胶或天然树胶。
127.在一些实施例中，该水凝胶在生理温度下是不可逆的，即水凝胶的溶胶-凝胶转变不能在0-40℃温度下获得。
128.水凝胶的结构可以通过改变水凝胶中成水凝胶聚合物的浓度而改变。该结构会影响凝胶的坚固性及其处理性能。水凝胶中的成水凝胶聚合物的优选浓度为0.1％-5％(聚合物重量与间质液体积之比)，并且包括，例如，0.1％-0.4％、0.2％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.7％、0.7％-1.1％、1.1％-1.3％、1.3％-2.2％、2.2％-2.6％、2.6％-3.0％、3.0％-3.5％、3.5％-4.0％、4.0％-4.5％和4.5％-5.0％(或其任意组合，例如，0.1％-0.5％、0.2％-0.7％等)。
129.在一个实施例中，未胶凝水凝胶溶液的粘度至多达500mpa.s，可选地，该未胶凝水凝胶溶液的粘度为5-200mpa.s(优选5-100mpa.s)。
130.在其他实施例中，水凝胶中的成水凝胶聚合物的浓度高于0.25％、0.3％、0.4％、0.5％或0.6％。在其他实施例中，水凝胶内成水凝胶聚合物的浓度低于5％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.6％、2.4％、1.5％、1.4％、1.3％或1.2％。在一些优选的实施例中，水凝胶中的成水凝胶聚合物的浓度为约0.3％，约0.6％或约1.2％。在一些特别优选的实施例中，水凝胶中的成水凝胶聚合物的浓度为约1％。在一些特别优选的实施例中，水凝胶由约1％藻酸钠或约1％藻酸钙形成。
131.在一些实施例中，使用包含多价金属阳离子的化合物，例如，使用氯化钙，会促进水凝胶的胶凝。具体而言，氯化钙(例如，50-200mm氯化钙，优选75-120mm氯化钙)可以用于使藻酸盐水凝胶凝胶化。
132.在其他实施例中，使用替代的金属氯化物，例如，氯化镁或氯化钡或氯化锶。或者，可以使用其他多价阳离子，例如，la
3+
或fe
3+
。
133.本发明还提供了一种制备水凝胶的方法，包括在选自镁盐和钙盐的第2族金属盐存在下使水凝胶形成聚合物胶凝化的步骤。
134.在一些实施例中，该水凝胶包含交联的藻酸盐。例如，该水凝胶可以包括交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁和/或藻酸钠。
135.在一个实施例中，该水凝胶可以包含交联的藻酸钙，可选地其中该水凝胶包含交联的藻酸钙和藻酸钠。因此，在一个实施例中，提供了可逆交联的藻酸钙水凝胶(可选地具
有藻酸钠)，其中该水凝胶包含样品，其中所述样品包含细胞外核酸。
136.在本文所述的任何实施例中，交联的藻酸盐可以是约0.1％(w/v)-约5.0％(w/w)藻酸钙。例如，交联的藻酸盐可以是约0.5％(w/v)-约3.0％(w/v)、1.0％(w/v)-约2.5％(w/v)、约1.5％(w/v)-约2.0％(w/v)的藻酸钙，或其间的任何范围。
137.间隙液体可以是聚合物可以溶解于其中并且聚合物可以胶凝化于其中的任何液体。通常，其是水性液体，例如水性缓冲液。合适的水性缓冲液在本文其他地方进行了描述。这种液体可以含有抗生素。优选该水凝胶是灭菌的，即无菌的。
138.该水凝胶可以以任何合适的尺寸进行生产。
139.在一些实施例中，该水凝胶为薄层、盘或片材的形式。优选该凝胶是盘或薄层的形式。例如，该盘可以具有5-50mm或10-50mm，优选10-30mm，更优选15-25mm，而最优选约19mm的直径。薄层、盘或片材的厚度通常为0.1-5mm，优选0.5-2.0mm，更优选约1.0或1.5mm，或约1、2、3、4或5mm。在一些实施例中，该盘中水凝胶的最终体积优选为200μl-1ml，优选200-600μl，优选300-500μl而更优选400-450μl。
140.本文所述的水凝胶可以使用任何合适的手段形成。如以下实施例部分所述，形成本文水凝胶的一种非限制性手段是使用本领域可用的试剂，例如，swabready
tm
。在该实施例中，使用了包含藻酸钙的凝胶珠，并将另外的藻酸盐与样品一起添加而诱导进一步的交联。这些水凝胶包括两种成水凝胶聚合物(藻酸钠和藻酸钙)。这种水凝胶明确涵盖于权利要求中，因为它们包括可逆交联的水凝胶。
141.如以下详细描述，该可逆交联水凝胶(包括细胞外核酸)可以包装于密封容器中。
142.如本文所用，“密封容器”是指可以对气体或液体的连续流动保持密封的容器。例如，密封容器可以是水密性和/或气密性容器，例如，塑料容器。合适的密封容器的非限制性实例包括密封小瓶或冷冻或组织培养烧瓶，可选地与合适的缓冲液(例如，盐类缓冲液)一起。在其他实施例中，该水凝胶可以盛装于密封袋内。
143.在一个实施例中，密封容器选自管、烧瓶、盘、皿或板(例如，包括多个孔的孔板)。例如，该板可以选自4、6、8、12、24、48、96、384、1536孔板。适当的容器在本领域中是众所周知的。
144.该容器可以使用盖子(例如，螺丝接头的盖子)或其他方式(例如，粘合膜或胶带等)密封。
145.本发明人已经出乎意料地表明，将细胞外核酸引入可逆交联水凝胶中可以保护细胞外核酸免受储存的机械和环境应力的影响，并保持细胞外核酸的结构完整性和/或功能性。本文所述的可逆交联水凝胶可以用于保存细胞外核酸(即，通过在储存和/或运输期间保持其结构完整性和/或功能性)。
146.如本文所用，短语“保持细胞外核酸的结构完整性”是指在水凝胶中的指定储存和/或运输期间(与核酸在与水凝胶接触之前的结构完整性相比)，核酸的全部或绝大部分不变。类似地，短语“维持细胞外核酸的功能”是指核酸原始功能的绝大部分在水凝胶中的指定储存和/或运输期间被维持(其中原始功能测量为与水凝胶接触之前的功能)。绝大部分可以为至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。用于确定核酸的结构完整性和功能性的合适测试在本领域是众所周知的。例如，核酸定量测试如qpcr可以用于量化所述指定时间段内保存的核酸量。序列完整性的保存也可以使用下一代测序或焦磷酸测序法进行评价。
作为另一个实施例，可以使用确定病毒细胞病变效应(cpe)的测试(例如，当核酸在病毒载体、病毒颗粒或病毒粒子内时)。以下“实施例”部分提供了此类分析的进一步细节。
147.制备用于储存和/或运输的含细胞外核酸样品的方法
148.本发明还提供了一种制备用于存储或从第一位置运输到第二位置的含细胞外核酸样品的方法。该方法包括以下步骤：
149.i)使样品与成水凝胶聚合物接触；和
150.ii)聚合所述聚合物而形成可逆交联的含核酸水凝胶。
151.在一个实施例中，该方法可以包括在步骤(i)之前将细胞外核酸(例如，脂质胶囊内的细胞外核酸，如包膜病毒颗粒)与水性缓冲液混合。本文在其他地方描述了几种合适的缓冲液，并且在此处同样适用。例如，该方法可以包括在步骤(i)之前将细胞外核酸(例如，脂质胶囊内的细胞外核酸，如包膜病毒颗粒)与盐类缓冲液混合。
152.该方法可以还包括将含核酸水凝胶密封到容器中，用于储存或从第一位置运输到第二位置。在其中形成含核酸水凝胶的容器可以是适合于储存或从第一位置运输到第二位置的容器——在本实施例中，该方法可以仅包括将水凝胶密封到形成该水凝胶的容器中。在另一个实施例中，该方法可以包括在容器密封之前将形成的水凝胶置于合适容器中。在这种情况下，该方法可以包括将含核酸水凝胶包装并密封于容器中，用于储存或从第一位置运输到第二位置。合适容器的实施例在其他地方讨论，并包括小瓶、管、烧瓶、盘、皿或板。将含核酸水凝胶密封于容器中的几种手段在本领域是已知的(例如，使用盖子、粘合膜或胶带等)。
153.因此，细胞外核酸可以在该方法的步骤i)之前置于容器内，例如，成水凝胶聚合物可以与细胞外核酸接触，同时细胞外核酸位于适合于储存或运输的容器内。
154.另外，在该方法的步骤(i)之后可以将细胞外核酸置于容器内，例如，在将细胞外核苷酸放置于适于储存或运输的容器内之前，可以使成水凝胶聚合物与细胞外核酸接触(并可选地按照步骤ii)进行聚合)。
155.因此，本文提供了一种制备包含细胞外核酸的样品(例如，脂质胶囊如病毒颗粒内的细胞外核酸)用于储存或从第一位置运输到第二位置的方法，该方法包括以下步骤：
156.i)使样品与成水凝胶聚合物接触；和
157.ii)聚合所述聚合物而形成可逆交联的含核酸水凝胶，并将所述含核酸水凝胶密封于适于储存或从第一位置运输到第二位置的容器中。
158.该方法还可以包括iii)发送密封容器用于从第一位置运输到第二位置。如本文所用，“发送”是指放出容器进行运输(例如，将容器放出给快递进行运输/递送至预期目的地)。因此，发送本身不包括将密封容器运输到第二位置。
159.细胞外核酸可以使用任何合适的手段与成水凝胶聚合物接触。例如，细胞外核酸可以与含成水凝胶聚合物的溶液混合(在聚合/聚结之前或在成水凝胶聚合物交联之前)。如本领域技术人员清楚的，与“成水凝胶聚合物”接触包括将细胞外核酸与一种成水凝胶聚合物，或一种以上(例如，两种)成水凝胶聚合物接触。例如，在水凝胶形成期间，样品可以与藻酸锶和藻酸钙接触。
160.细胞外核酸可以在处于可密封容器内的同时与成水凝胶聚合物接触(使得例如一旦水凝胶形成，容器可以被密封以备储存和/或运输)，或可以在细胞外核酸放置于可密封
容器中之前与成水凝胶聚合物接触。合适的容器在本文的其他地方描述。
161.然后该方法包括使细胞外核酸聚合物聚合而形成可逆交联的含核酸水凝胶，其中细胞外核酸处于水凝胶内。使细胞外核酸聚合物聚合而形成可逆交联的含核酸水凝胶的方法在本领域内是众所周知的，并根据所使用的聚合物而不同。例如，藻酸盐溶液聚合(而形成藻酸盐水凝胶)可以通过化学试剂如氯化钙进行诱导。
162.如本文所用，术语“聚合”和“胶凝化”水凝胶可以互换使用，是指成水凝胶聚合物从液体到水凝胶的状态变化。
163.该水凝胶在合适的细胞相容条件，即对细胞外核酸的结构完整性和/或功能没有损害或没有显著损害的条件下进行胶凝化。
164.在一些实施例中，该水凝胶在cgmp(动态药品生产管理规范)条件下制备。
165.运输/储存细胞外核酸/履行细胞外核酸订单的方法
166.本文还提供了将含细胞外核酸的样品从第一位置运输到第二位置的方法。该方法包括以下步骤：
167.(a)获得根据本文其他地方描述的方法产生的可逆交联的含核酸水凝胶；或获得本文别处所述的可逆交联的含核酸水凝胶；
168.(b)将水凝胶从第一位置运输到第二位置；
169.和可选地
170.(c)在所述第二位置处从水凝胶中释放出核酸。
171.其他地方描述的本发明的各方面(例如，合适的容器、水凝胶、核酸、缓冲液)同样适用于此处。
172.此外，还提供了一种储存包含细胞外核酸样品的方法，该方法包括以下步骤：
173.(a)获得根据本文其他地方描述的方法产生的可逆交联的含核酸水凝胶；或获得本文其他地方描述的可逆交联的含核酸水凝胶；和
174.(b)储存该水凝胶。
175.其他地方描述的本发明的各方面(例如，合适的容器、水凝胶、核酸、缓冲液)同样适用于此处。
176.该方法可以用于储存和/或运输含核酸水凝胶任何合适的时间段。例如，含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少6小时、至少12小时、至少24小时。通常，含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天等。例如，含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少3天，或至少5天。该含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少7天等。
177.含细胞外核酸水凝胶可以储存和/或运输至多达10或20周。优选该细胞外核酸在从水凝胶释放之前在水凝胶中储存至多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周。更优选该细胞外核酸在从水凝胶中释放出来之前在水凝胶中储存至多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。
178.在一个实施例中，其中细胞外核酸处于脂质胶囊内，如包膜病毒颗粒，该方法可以用于储存和/或运输该含核酸水凝胶至多达任何合适的时间段。例如，该含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少6小时、至少12小时、至少24小时。通常，该含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天等。例如，该含核酸水凝胶可以储存和/或运输至
少3天或至少5天。该含核酸水凝胶可以储存和/或运输至少7天等。
179.本文所述的细胞外核酸可以通过任何合适的方式，例如，通过邮寄或快递，在水凝胶(和密封容器)内运输，这可能包括通过机动车方式，例如，通过汽车、货车、卡车、摩托车、飞机等进行运输。优选该运输通过邮寄或快递进行。
180.第二位置优选是远离第一位置的位置，例如，距离第一位置至少1英里，优选大于5英里。
181.从第一位置运输到第二位置可以花费至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时、至少24小时等。
182.本领域技术人员可以容易确定用于储存和/或运输本文所述的含核酸水凝胶的适当条件，并且包括将含核酸水凝胶保持于所需温度(例如，如在实施例中使用的，18-22℃下)。例如，用于储存和/或运输含核酸水凝胶的合适条件，其中核酸处于脂质胶囊如包膜病毒颗粒内，包括将含核酸水凝胶保持于所需温度(例如，在实施例中使用的18-22℃下)。
183.细胞外核酸可以在-80℃至45℃，优选4-45℃范围内的温度之下水凝胶(和密封容器)内储存和/或运输。在一个实施例中，细胞外核酸在环境温度下储存和/或运输。
184.在一些实施例中，水凝胶(和密封容器)内的细胞外核酸在冷却条件，例如，4-6℃，优选约4℃下储存和/或运输。在一个具体实例中，它们在储存和/或运输时进行冷藏(定义为2-8℃(美国药典(eu pharmacopoeia))。在另一个实施例中，它们进行冷储存和/或运输(定义为8-15℃)。
185.在其他实施例中，它们在环境条件，例如，10-25℃，优选15-22℃，例如，18-22℃下储存和/或运输。在某些实施例中，环境温度可能至多达30℃(即，10-30℃)，或甚至至多达40℃。在还有的其他实施例中，它们在约37℃下储存和/或运输。
186.在某些实施例中，它们在受控室温(crt)(定义为15-25℃)下储存和/或运输。它们可以在冷却或crt条件(即，8-25℃)下储存或运输。
187.在其他实施例中，它们在低热(即，低于约35℃，通常0-32℃范围)下储存和/或运输。在一个实施例中，它们在crt和32℃(即，15-32℃)下储存和/或运输。在另一个实施例中，它们在crt或至多达32℃(即，8-32℃)温度下冷却储存和/或运输。
188.在一些实施例中，含细胞外核酸的水凝胶在储存和/或运输之前进行冷冻。这可以延长细胞外核酸在解冻后保持其结构完整性和/或功能的时间，和/或可以增加可用的转运时间。因此，水凝胶可以以这种方式用作冷冻后保护剂。例如，含细胞外核酸的水凝胶的温度可以降低至0℃以下，-15℃以下，或-80℃以下。含细胞外核酸的水凝胶可以或不可以允许解冻或融化，即在储存和/或运输期间，优选以缓慢、可控或不可控的温升速率将其温度升高到0℃以上。在其他实施例中，本发明的水凝胶没有进行冷却或冷冻。
189.本文还提供了一种用于履行细胞外核酸的订单或请求的方法，该方法包括以下步骤：
190.a)接收细胞外核酸的订单或请求；
191.b)获得根据本文其他地方描述的方法产生的可逆交联的含核酸的水凝胶；或获得根据本文其他地方所述的可逆交联的含核酸的水凝胶；和
192.c)发送样品以运输；或将样品运输到订单或请求中指定的位置。
193.该订单或请求可以通过任何合适的方式接收，例如，通过互联网、电子邮件、短信、
电话或邮件。
194.其他地方描述的本发明的各方面(例如，合适的容器、水凝胶、核酸、缓冲液)同样适用于此处。
195.本文所指的水凝胶是可以从中释放出细胞外核酸的水凝胶。换言之，在保存或储存和/或运输其中所含的细胞外核酸之后，该水凝胶可以解离，从而允许释放或去除此前保留于其中的所有或基本所有的细胞外核酸。
196.该水凝胶在合适的核酸相容条件，即对核酸和/或核酸可以位于其中的脂质胶囊的完整性无害或不显著有害的条件下进行解离。
197.优选该水凝胶通过化学崩解或溶解而解离。例如，藻酸盐凝胶可以在合适的溶藻酸盐缓冲液中崩解(例如，0.055m柠檬酸钠，0.15m nacl，ph 6.8)。本领域技术人员熟知另一种合适的溶藻酸盐缓冲液。
198.优选至少50％、60％或70％的细胞外核酸在储存和/或运输后保留其结构完整性和/或功能性，更优选至少80％、85％、90％或95％的细胞外核苷酸在储存和/或运输后保持其结构完整性和/或功能性。用于评价细胞外核酸结构完整性和/或功能性的分析测试法在本文其他地方进行讨论。
199.除非本文中另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，singleton and sainsbury,dictionary of microbiology and molecular biology,2d ed.,john wiley and sons,ny(1994)；and hale and marham,the harper collins dictionary of biology,harper perennial,ny(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管与本文所述方法和材料相似或等效的任何方法和材料在本发明的实践中找到了用途，但本文描述了优选的方法和材料。因此，通过参考整个说明书，更全面地描述了下面直接定义的术语。此外，如本文所用，除非上下文另有明确指示，单数术语“一种”、“一个”和“该”包括复数指示物。除非另有说明，核酸以5'-3'的方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。应当理解的是，本发明不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以根据本领域技术人员使用的环境而变化。
200.本发明的各方面通过以下非限制性实施例验证。
201.实施例
202.材料
203.细胞类型：mrc-5(ccl-171
tm
)
204.病毒：人类冠状病毒229e(cov 229e)(vr-740
tm
)
[0205][0206]
表1.研究过程中使用的测试试剂
[0207]
试剂：
[0208]
凝胶基珠(gelbase beads)：0.55％藻酸钙珠
[0209]
atelerix swabready
tm
改良病毒运输介质：1％藻酸钠virocult培养基溶液
[0210]
方法
[0211]
swabready
tm
生产概述：
[0212]
1)将粉状低藻酸钠与汉克斯(hank)缓冲盐水溶液组合混合至0.55％的浓度。
[0213]
2)将0.4ml的这种0.55％藻酸钠溶液滴加到1ml 0.1摩尔氯化钙溶液中。氯化钙中的二价阳离子ca
2+
与聚合物主链中古洛糖醛酸基团的羧酸根交联，形成凝胶珠。将其温育过夜，使该过程完成。之后除去氯化钙溶液，并用盐水溶液洗涤珠粒。这形成了我们的0.55％藻酸钙珠。
[0214]
3)将粉状藻酸钠与汉克斯缓冲盐水溶液组合混合至5％的浓度。
[0215]
4)将0.1ml的5％藻酸钠溶液加入0.4ml病毒培养基中而形成1％atelerix swabready
tm
改良病毒运输介质溶液。
[0216]
5)将0.2mol柠檬酸三钠溶于磷酸盐缓冲盐水溶液中而形成我们的溶解缓冲液。
[0217]
swabready
tm
使用概述：
[0218]
1)将0.5ml atelerix swabready
tm
改良病毒运输培养基加入0.4ml的0.55％藻酸钙珠(gelbase珠)中。0.55％微珠贡献出其一些二价阳离子ca
2+
至atelerix swabready
tm
改良病毒运输介质1％溶液的聚合物主链中古洛糖醛酸基团的羧酸根基团。
[0219]
2)当仍然是液体时，可以使用拭子插入该凝胶溶液中，凝胶化/交联通常需要2小时。
[0220]
3)拭子试剂盒现在可以运输到实验室进行检测。
[0221]
4)为了从凝胶中释放所述拭子，向试管中加入0.3ml溶解缓冲液。柠檬酸三钠从聚合物骨架中去除钙阳离子，逆转交联过程。
[0222]
细胞维护和测试设置
[0223]
mrc-5细胞用作人类冠状病毒229e(cov 229e)繁殖的宿主细胞系。mrc-5细胞维持于补充20％胎牛血清(fbs)(gibco
tm
,usa)和1％青霉素-链霉素(thermofisher scientific，uk)的伊戈尔最低必需培养基(eagle'sminimum essential medium)(emem；uk)(完全培养基)中，在37
±
2℃和5％ co2下。在病毒滴定的准备中，将mrc-5细胞以2
×
105个细胞/ml接种于96孔板中，并在37
±
2℃和5％ co2下培养24小时，或直到达到80％-90％的汇合度。
[0224]
使用hela细胞作为腺病毒5型繁殖的宿主细胞系。在37
±
2℃和5％co2的条件下，将hela细胞维持于补充10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的伊戈尔最低必需培养基(emem)(完全培养基)中。在病毒滴定的准备过程中，将hela细胞接种于96孔板中，并在37
±
2℃和5％ co2下培养24小时，或直到达到80％-90％的汇合度。
[0225]
使用scp细胞作为维斯纳病毒繁殖的宿主细胞系。在37
±
2℃的温度和5％ co2下将细胞维持于补充10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的伊戈尔最低必需培养基(emem)(完全培养基)中。在准备病毒滴定中，将scp细胞接种到96孔板中，并在37
±
2℃和5％ co2下培养24小时，或直到达到80％-90％的汇合度。
[0226]
活力测试设置
[0227]
根据制造商关于atelerix swabready
tm
和病毒运输培养基的用法说明，对细胞和人类冠状病毒的活力进行评价。试验一式三份，在20
±
2℃的受控室温下进行。将200μl 5.5
×
105tcid
50
/ml人冠状病毒229e等分试样添加到500μl中。将等分试样的500μl atelerix swabready
tm
改良病毒运输培养基加入到凝胶基珠中，并强烈反转管
而将珠分布于整个改良病毒培养基中。一旦混合完全，使内容物沉降到试管底部，并在添加改良病毒培养基的5分钟内将200μl 5.5
×
105tcid
50
/ml人冠状病毒229e添加到每个试管中。样品在层流柜中20
±
2℃下培养14天。
[0228]
tcid50的病毒活力定量
[0229]
人类冠状病毒229e(cov 229e)：
[0230]
根据上述“活力分析测试设置”制备测试样品后，在含有2％ fbs和1％青霉素-链霉素的emem(分析测试培养基)中进行10倍系列稀释。从预接种的mrc-5细胞板的孔中吸出培养基，并用含有钙和镁的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs；gibco
tm
，uk)洗涤细胞。将等分试样的100μl每个测试样品稀释液加入到相应测试孔中。将试验板在35
±
2℃和5％ co2下培养7天。每个测试重复样实施六个重复孔。培养后，使用motic ae 2000倒置式显微镜测定病毒细胞病变效应(cpe)。使用spearman-方法计算病毒滴度。
[0231]
腺病毒：
[0232]
在培养0、3、7和14天后对样品进行分析。将等分试样的400μlswabready
tm
溶解缓冲液加入到atelerix swabredy
tm
样品中并培养15分钟而使凝胶溶解。采集100μl等分试样的atelerix swabredy
tm
样品和pbs对照，并在补充有2％ fbs和1％青霉素-链霉素的emem(完全分析测试培养基)中稀释10倍。从预接种的hela细胞板的孔中吸出培养基，并用含钙和镁的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)洗涤细胞。将100μl等分试样的每种稀释液加入到相应的细胞板中。将试验板在37
±
2℃和5％ co2下培养5天。每个试验重复样实施8个重复孔。培养后，使用motic ae 2000倒置式显微镜测定病毒细胞病变效应(cpe)。使用spearman-方法计算病毒滴度。
[0233]
维斯纳病毒：
[0234]
在培养3、7和14天后对样品进行分析。将等分试样的400μlswabready
tm
溶解缓冲液加入到atelerix swabredy
tm
样品中并培养15分钟而使凝胶溶解。采集100μl等分试样的atelerix swabredy
tm
样品和pbs对照，并在补充有2％ fbs和1％青霉素-链霉素的emem(完全分析测试培养基)中稀释10倍。从预接种的scp细胞板的孔中吸出培养基，并用含钙和镁的dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs)洗涤细胞。将100μl等分试样的每种稀释液加入到相应的细胞板中。将试验板在37
±
2℃和5％ co2下培养7天。培养后，使用motic ae 2000倒置式显微镜测定病毒细胞病变效应(cpe)。使用spearman-方法计算病毒滴度。
[0235]
结论
[0236]
基于水凝胶的样品储存技术的病毒保存效果
[0237]
人类冠状病毒229e
[0238]
培养3天后，从atelerix swabready
tm
水凝胶储存中回收平均3.67log
10
tcid
50
/ml的活cov 229e。从病毒运输培养基中回收平均2.28log
10
tcid
50
/ml的活cov 229e。经过5天、7天、10天和14天的培养后，从atelerix swabready
tm
水凝胶储存中回收平均2.5log
10
tcid
50
/ml的活cov 229e。7天后，从病毒运输培养基中回收平均1.67log
10
tcid
50
/ml的活cov 229e。在5天、10天和14天后，由于未观察到病毒cpe，从病毒运输培养基中回收的活cov 229e低于1.50log
10
tcid
50
/ml。(表2，图1)。
[0239][0240]
表2.在atelerix swabready
tm
和病毒运输培养基中培养至多达14天后的人类冠状病毒229e(cov 229e)的log tcid
50
/ml。
[0241]
腺病毒
[0242]
培养0天后，从atelerix swabready
tm
中回收平均7.67log tcid
50
ml-1
的活腺病毒，而从pbs对照中回收平均7.79log tcid
50
ml-1
的活腺病毒。经过3天、7天和14天的培养后，从atelerix swabready
tm
中分别回收平均7.04、6.92和6.75log tcid
50
ml-1
的活腺病毒。经过3天、7天和14天的培养，分别从pbs对照中回收平均6.92、7.13和6.92log tcid
50
ml-1
的活腺病毒(表3，图2)。
[0243][0244]
表3.腺病毒在atelerix swabready
tm
和磷酸盐缓冲盐水中培养至多达14天后的平均log tcid
50
ml-1
回收率
[0245]
维斯纳病毒
[0246]
培养0天后，从pbs对照中回收平均5.04log
10
tcid
50
ml-1
的活维斯纳病毒。维斯纳病毒在pbs中培养3、7和14天后，未观察到活病毒，因此在atelerix swabready
tm
中所有时间点的维斯纳病毒回收率与第0天pbs对照进行比较。经过3、7和14天的培养后，从atelerix swabready
tm
中回收平均3.50log
10
tcid
50
ml-1
的活维斯纳病毒，证明atelerix swabready
tm
可以维持可检测水平的活维斯纳病毒至多达至少14天(表4，图3)。
[0247][0248]
表4.维斯纳病毒在atelerix swabready
tm
中培养至多达14天后与第0天磷酸盐缓冲盐水对照相比的平均log
10
tcid
50
ml-1
回收率。*第0天之后，磷酸盐缓冲盐水对照中没有存留活病毒
[0249]
讨论
[0250]
对atelerix swabready
tm
水凝胶与病毒运输介质相比的14天内病毒保存效果进行了评价。在5个时间点评价了人类冠状病毒229e的活力。
[0251]
atelerix swabready
tm
与病毒运输培养基相比，证明可以增强保存人类冠状病毒活力至多达14天的能力。保持病毒随时间的活力对大规模病毒检测提出了重大挑战，而这些结果表明atelerix swabready
tm
可以稳定维持可检测水平的活人类冠状病毒229e至多达至少14天。使用tcid
50
滴定法测定了病毒检测，该方法的最低检测水平为
1.50log
10
tcid
50
/ml，并量化溶液中存在的完整传染性病毒粒子。
[0252]
原始数据
[0253][0254]
表5：人类冠状病毒229e(cov 229e)在atelerix swabready
tm
中培养至多达14天后的log tcid
50
/ml
[0255][0256][0257]
表6：人类冠状病毒229e(cov 229e)在病毒运输培养基中培养至多达14天后的log tcid
50
/ml
[0258]
读者的注意力集中于与本技术相关的与本说明书同时或之前提交的所有论文和文件上，并且这些论文和文件与本说明书一起公开供公众检查，而所有此类论文和文件的内容通过引用结合于本文中。
[0259]
本说明书中公开的所有特征(包括任何随附的权利要求书、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或工艺的所有步骤可以以任何组合进行组合，除非至少一些这些特征和/或步骤是互斥的组合。
[0260]
除非另有明确说明，否则本说明书中公开的每个特征(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征所取代。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等效或类似特征的通用系列的一个实施例。
[0261]
本发明并不限于任何前述实施方式的细节。本发明会拓展到本说明书(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或拓展到如此公开的任何方法或工艺的步骤的任何新颖一个或任何新颖的组合。

技术特征：
1.一种包含样品的可逆交联水凝胶，其中，所述样品包含细胞外核酸。2.根据权利要求1所述的水凝胶，其中，所述细胞外核酸处于脂质胶囊内。3.根据权利要求1或权利要求2所述的水凝胶，其中，所述细胞外核酸处于病毒载体中。4.根据前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中，所述细胞外核酸处于病毒颗粒中。5.根据前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中，所述样品还包含水性缓冲液。6.根据权利要求5所述的水凝胶，其中，所述水性缓冲液是盐类缓冲液。7.根据前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中，所述水凝胶包含交联的海藻酸盐，可选地其中所述水凝胶包含交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁和/或藻酸钠。8.根据权利要求7所述的水凝胶，其中，所述交联的海藻酸盐包含约0.1％(w/v)-约5.0％(w/w)的藻酸钙。9.根据前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中，所述细胞外核酸是rna或dna。10.根据前述权利要求中任一项所述的水凝胶，其中，所述水凝胶包装于密封容器中。11.根据权利要求10所述的水凝胶，其中，所述密封容器是小瓶、管、烧瓶、盘、皿或板。12.一种制备包含细胞外核酸的样品用于储存和/或从第一位置运输到第二位置的方法，所述方法包括以下步骤：i)使所述样品与成水凝胶聚合物接触；和ii)聚合所述聚合物以形成可逆交联的含核酸水凝胶。13.根据权利要求12所述的方法，还包括在步骤(i)之前将所述细胞外核酸与水性缓冲液混合，可选地其中所述水性缓冲液是盐类缓冲液。14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述方法包括将所述含核酸水凝胶密封于容器中用于储存或从所述第一位置运输到所述第二位置，可选地其中密封的所述容器是小瓶、管、烧瓶、盘、皿或板。15.根据权利要求14所述的方法，还包括：iii)将密封的所述容器从所述第一位置运输到所述第二位置。16.一种将包含细胞外核酸的样品从第一位置运输到第二位置的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得根据权利要求12-14中任一项所述的方法产生的可逆交联的含核酸水凝胶；或获得根据权利要求1-11中任一项所述的可逆交联的含核酸水凝胶；(b)将所述水凝胶从所述第一位置运输到所述第二位置。17.根据权利要求16所述的方法，还包括在所述第二位置从所述水凝胶释放所述核酸。18.一种储存包含细胞外核酸的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得根据权利要求12-14中任一项所述的方法产生的可逆交联的含核酸水凝胶；或获得根据权利要求1-11中任一项所述的可逆交联的含核酸水凝胶；和(b)储存所述水凝胶。19.根据权利要求18所述的方法，其还包括在储存后从所述水凝胶释放所述核酸。20.一种用于履行细胞外核酸的订单或请求的方法，所述方法包括以下步骤：a)接收细胞外核酸的订单或请求；b)获得根据权利要求12-14中任一项所述的方法产生的可逆交联的含核酸水凝胶；或获得根据权利要求1-11中任一项所述的可逆交联的含核酸水凝胶；和
c)发送样品以运输；或将样品运输到所述订单或请求中指定的位置。21.根据权利要求12-20中任一项所述的方法，其中，所述细胞外核酸处于脂质胶囊内。22.根据权利要求12-21中任一项所述的方法，其中，所述细胞外核酸处于病毒载体中。23.根据权利要求12-22中任一项所述的方法，其中，所述细胞外核酸处于病毒颗粒中。24.根据权利要求12-23中任一项所述的方法，其中，所述样品还包含水性缓冲液。25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述水性缓冲液是盐类缓冲液。26.根据权利要求12-25中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶包含交联的海藻酸盐，可选地其中所述水凝胶包含交联的藻酸钙、藻酸锶、藻酸钡、藻酸镁和/或藻酸钠。27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述交联的海藻酸盐包含约0.1％(w/v)-约5.0％(w/w)的藻酸钙。28.根据权利要求12-27中任一项所述的方法，其中，所述细胞外核酸是rna或dna。29.可逆交联的水凝胶用于保存细胞外核酸的用途。

技术总结
本发明提供了一种包含样品的可逆交联水凝胶，其中样品包含细胞外核酸。本文还提供了制备、运输和/或储存含核酸水凝胶的相应方法及其用途。及其用途。及其用途。


技术研发人员：迪安
受保护的技术使用者：阿特里克斯有限公司
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2023/9/7