一种胶孢炭疽菌及其胞外多糖作为植物免疫诱抗剂的应用

1.本发明属于微生物技术和植物免疫诱抗剂研发领域，具体涉及一种胶孢炭疽菌phxp3，其产生的胞外多糖可作为新型植物免疫诱抗剂应用于农业植物病害的防控。


背景技术：

2.多糖是生物体内广泛存在的一类天然大分子物质，其在维持机体的生理平衡和稳定中发挥重要作用。同时，多糖具有免疫调节、抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性，已被广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。其中，微生物产生的胞外多糖因生产周期短、产量高、活性好、易于大规模制备等优点而备受关注。例如，由黄单胞杆菌产生的胞外多糖黄原胶具有独特的流变性，良好的水溶性、对热及酸碱的稳定性、与多种盐类有很好的相容性，已作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂，应用于食品、石油、医药等20多个行业，是目前世界上生产规模最大且用途极为广泛的微生物胞外多糖。
3.植物免疫诱抗剂是一类通过调节植物本身的免疫、代谢系统来增强植物对有害生物的抗性，提高植物抗逆性，促进植物生长的新型药剂。植物免疫诱抗剂因具有作用谱广、对人畜毒性低、环境相容性好等优点，已成为当前绿色农药研发的热点，具有广阔的应用前景。
4.胶孢炭疽菌（colletotrichum gloeosporioides）属于半知菌亚门黑盘孢目炭疽菌属，是一种广泛分布的真菌，能够产生化学结构多样和生物活性良好的次级代谢产物。本发明涉及的一株胶孢炭疽菌phxp3来源自植物内生菌，在发酵过程中发现其具有大量产生胞外多糖的能力。进一步研究发现，该菌株产生的胞外多糖不具有直接的抑菌活性，而具有显著的诱导植物抗病活性，可作为新型植物免疫诱抗剂应用于植物病害的防控。因此，本发明重点阐明一株胶孢炭疽菌phxp3、其胞外多糖的分离纯化以及明确其免疫诱抗活性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株胶孢炭疽菌phxp3及其胞外多糖的应用，菌株phxp3的胞外多糖具有良好的诱导植物抗病活性，为植物病害防治提供了新的思路。
6.第一方面，本发明提供了一种胶孢炭疽菌phxp3，分类命名：胶孢炭疽菌colletotrichum gloeosporioides，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.23858，保藏时间为2021年11月22日。
7.第二方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂含有前文所述的胶孢炭疽菌phxp3或含有前文所述的胶孢炭疽菌phxp3的培养物。
8.第三方面，本发明还保护前文所述的胶孢炭疽菌phxp3、前文所述的菌剂在如下（a1）（a3）任一中的应用：
9.（a1）在制备胞外多糖cpeps-2中的应用；
10.（a2）在植物免疫诱抗中的应用；
11.（a3）在制备含有胞外多糖cpeps-2的植物免疫诱抗剂中的应用。
12.第四方面，本发明提供了一种胞外多糖cpeps-2，所述胞外多糖cpeps-2通过前文所述的胶孢炭疽菌phxp3的发酵液得到。
13.在具体的实施方案中，所述胞外多糖cpeps-2通过如下方法制备：
14.（1）挑取前文所述的胶孢炭疽菌phxp3菌落，接种进入液体培养基进行发酵；
15.（2）过滤除去步骤（1）发酵液中菌丝体，得到黑色粘稠状发酵液，减压浓缩；
16.（3）采用醇沉、离心、冻干的手段从步骤（2）浓缩发酵液中获得胞外粗多糖cpeps-t；
17.（4）分离纯化步骤（3）所得胞外粗多糖cpeps-t，获得胞外多糖cpeps-2。
18.更优选的，所述步骤（1）所用液体发酵温度为28℃，转速150 rpm，时间12~14 d，液体发酵培养基组成按重量百分比计为土豆汁20%，葡萄糖2%，余量为水。
19.更优选的，将步骤（2）得到的黑色粘稠状发酵液于50℃减压浓缩至原体积的1/5~1/4。
20.更优选的，将步骤（3）浓缩发酵液加入3~5倍体积乙醇，静置后离心，弃上清，冻干处理得到phxp3胞外粗多糖cpeps-t。
21.更优选的，将步骤（4）胞外粗多糖cpeps-t依次通过脱蛋白、除盐、deae纤维素柱层析、减压浓缩和冻干处理后，得到胞外多糖cpeps-2。
22.更更优选的，本发明提供了一种更具体的cpeps-2的制备方法：
23.（1）从菌株phxp3菌落边缘挑取菌丝块接种至装有400 ml pdb培养基的1000 ml三角瓶中，28℃，150 rpm，避光发酵12~14 d，得菌液；pdb培养基按重量百分比计为土豆汁20%，葡萄糖2%，余量为水。
24.（2）通过过滤和离心除去菌丝体，得到黑色黏稠状发酵液，并于50℃减压浓缩至原体积的1/5~1/4；
25.（3）加入3~5倍体积乙醇，搅拌混匀，4℃静置沉淀12 h后，离心，弃上清，再进行冻干处理，得到phxp3胞外粗多糖cpeps-t；
26.（4）依次通过脱蛋白、除盐、deae纤维素柱层析对所得粗多糖cpeps-t进行分离纯化，并进行减压浓缩和冻干处理，发现cpeps-t主要由两部分构成，分别命名为cpeps-1和cpeps-2。
27.对上述粗多糖及分离纯后产物的理化性质进行初步鉴定发现，粗多糖cpeps-t为灰色粉末，溶于水后为棕红色，在较高浓度时成粘稠状。纯化产物cpeps-1和cpeps-2为白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇，乙酸乙酯，二氯甲烷和正丁醇，溶于水后为透明溶液。
28.进一步对上述获得的cpeps-t、cpeps-1及cpeps-2进行了生物活性研究，结果如下：
29.将cpeps-t、cpeps-1及cpeps-2分别配制成100 mg/l的溶液，测定上述化合物对于辣椒疫霉病及大豆疫霉病的防治作用。实验结果表明：cpeps-2显著地提高了植物对辣椒疫霉病菌和大豆疫霉病菌的抗性，100 mg/l浓度下防治效果分别达到了75.0%和80.4%；cpeps-t和cpeps-1两个处理组的效果均低于cpeps-2处理组。
30.在具体的实施方案中，所述胞外多糖cpeps-2的重均分子量为20~25kda。
31.在具体的实施方案中，所述胞外多糖cpeps-2由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、
半乳糖醛酸、阿拉伯糖以及葡萄糖醛酸组成。
32.在更具体的实施方案中，所述胞外多糖cpeps-2的单糖组成为：葡萄糖：甘露糖：半乳糖：鼠李糖：半乳糖醛酸：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸=30~35：28~33：18~25：10~15：0.3~0.8：0.1~0.5：0.05~0.3。
33.在更具体的实施方案中，所述胞外多糖cpeps-2的单糖组成为：葡萄糖：甘露糖：半乳糖：鼠李糖：半乳糖醛酸：阿拉伯糖：葡萄糖醛酸=33.98：30.99：20.71：13.34：0.56：0.27：0.15。
34.第五方面，本发明保护了前文所述的胞外多糖cpeps-2在如下（b1）或（b2）中的应用：
35.（b1）在植物免疫诱抗中的应用；
36.（b2）在制备植物免疫诱抗剂中的应用。
37.第六方面，本发明保护了一种植物免疫诱抗剂，所述植物免疫诱抗剂含有前文所述的胞外多糖cpeps-2。
38.第七方面，本发明保护了前文所述的植物免疫诱抗剂在防治农业植物病害中的应用，所述病害为大豆疫霉病、辣椒疫霉病和/或稻瘟病。
39.在具体的实施方案中，所述植物免疫诱抗剂可以根据实际需要制备成不同剂型，如乳油、水乳剂、微乳剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或悬浮剂等等。
40.有益效果：本发明筛选出一株胶孢炭疽菌phxp3，并对其进行了生物保藏，该菌株在发酵过程中产生的胞外多糖cpeps-2，在诱导植物抗病性试验中表现出优异的活性，可作为新型植物免疫诱抗剂在防治农业植物病害中应用。
41.保藏说明
42.菌种名称：胶孢炭疽菌；
43.拉丁名：colletotrichum gloeosporioides；
44.菌株编号：phxp3；
45.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
46.保藏机构简称：cgmcc；
47.保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
48.保藏日期：2021年11月22日；
49.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.23858。
附图说明
50.图1为胶孢炭疽菌phxp3菌落形态图；
51.图2为本发明制得的胞外多糖cpeps-1和cpeps-2的洗脱曲线图；
52.图3为本发明制得的胞外多糖诱导烟草叶片抵御辣椒疫霉病菌侵染实验结果；
53.图4为本发明制得的胞外多糖防治辣椒疫霉病温室盆栽实验结果；
54.图5为本发明制得的胞外多糖诱导大豆叶片抵御大豆疫霉病菌侵染实验结果；
55.图6为本发明制得的胞外多糖防治大豆疫霉病温室盆栽实验结果。
具体实施方式
56.以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
57.实施例1 内生菌phxp3的获取途径和分离方法
58.采集位于江苏省南京市紫金山地区的红茴香植物地上部，将采集的叶片先浸泡于75%酒精中30s，然后用无菌水清洗3次，再用75%酒精消毒30 s，最后用无菌水清洗3次后加适量无菌水研磨，获得样品溶液。接着对处理后的样品溶液进行梯度稀释，分别稀释稀释10、100、1000倍。将原液和稀释液各取150 μl，涂布于用于真菌培养的pda平板（200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1 l水），每份样品三个重复。将涂布好的平板放置于25℃培养2-3周，当平板上长有菌丝出现，挑取单菌落边缘菌丝于新鲜pda平板上培养，经反复挑取纯化3遍后，获得纯菌株phxp3。
59.实施例2 内生菌phxp3的形态学特征和its测序
60.内生真菌phxp3生长较为缓慢，在pda平板上培养4-5d的菌落直径约5 cm；其平板正面呈现灰白色，菌丝绒毛状，边缘菌丝细小；背面起初呈现白色，后以中心向周围扩散的趋势逐渐变为深灰绿色，与胶孢炭疽菌（colletotrichμm gloeosporioides）形态一致。
61.利用its通用引物扩增菌株phxp3的相关基因片段并测序，测序结果经blast比对后与胶孢炭疽菌的同源性达99%。
62.实施例3 胶孢炭疽菌phxp3的液体发酵
63.用5 mm的打孔器从phxp3菌落边缘取直径5 mm的菌落圆片，在超净工作台中接种至pda固体培养基的平板上，25℃恒温培养箱中培养4-5 d；采用相同方法取菌落圆片4-5片接种于装有400 ml pdb培养基（200 g马铃薯，20 g葡萄糖，1 l水）的1000 ml三角瓶中，28℃，150 rpm，避光发酵12~14 d，发酵液形态由淡黄色逐渐变为深灰绿色。
64.实施例4 粗多糖cpeps-t的提取
65.菌液通过过滤和离心除去菌丝体，离心条件为12000 rpm，15 min，得到黑色黏稠状发酵液；发酵液于50℃减压浓缩至原体积的1/5~1/4，加入3~5倍体积乙醇，搅拌混匀，4℃静置沉淀12 h；12000 rpm离心15 min，弃上清，挥干溶剂后加入少量水，于-20℃冰箱冻实，再进行冻干处理，即得到phxp3胞外粗多糖cpeps-t。
66.实施例5 粗多糖cpeps-t的分离纯化
67.a. 脱蛋白。将氯仿和正丁醇按体积比4:1的比例配成混合液，将粗多糖加水溶解，在粗多糖溶液中加入1/5体积的混合液，剧烈震荡后，10000 rpm离心10 min，静置分层，除去中间交界处的蛋白质和有机相。重复上述操作，至水相和有机相之间没有乳白色物质产生，除去有机相，进行冻干处理。
68.b. 除盐。将脱脱蛋白并冻干后的多糖加适量水溶解，装入透析袋，放入烧杯中，于水流中透析3 d，再于超纯水中透析2 d，期间多次换水，将无机盐等小分子杂质滤出膜外。
69.c. deae纤维素柱层析。称取80 mg除蛋白除盐后的胞外多糖cpeps-t溶解于8 ml超纯水中，过0.45 μm滤膜，沿壁加入含酸碱处理处理后deae纤维素de-52填料的层析柱中，分别用超纯水、0.1mol/l、0.3 mol/l、0.5 mol/l nacl溶液依次洗脱，每个梯度洗脱200 min，控制流速1.0 ml/min，每10 min收集1管洗脱液。应用苯酚硫酸法进行检测，绘制洗脱曲线，合并同一吸收峰对应管数的样品，其中用0.1mol/l nacl溶液洗脱液所得多糖即为
cpeps-2。
70.d．冷冻干燥。含cpeps-2洗脱液于50℃减压浓缩，透析处理后，于-20℃冰箱冻实，再进行冻干处理，得到胞外多糖cpeps-2。
71.实施例6胞外多糖cpeps-2的结构表征
72.cpeps-2的分子量测定：将样品溶解在0.1mnano3水溶液终浓度为1mg/ml，进行高效液相分析。利用软件astra6.1处理色谱数据，实验结果如表1所示。
73.表1cpesp-2分子量测定结果
[0074][0075]
cpeps-2的单糖组成测定：称量多糖样品5mg，加入1ml2mtfa溶液，105℃加热6小时。通氮气，吹干，加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。色谱系统采用的是thermoics5000离子色谱系统，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测，实验结果如表2所示。
[0076]
表2cpesp-2单糖组成分析结果
[0077][0078]
注：glu:葡萄糖（glucose）man:甘露糖（mannose）gal:半乳糖（galactose）rha:鼠李糖（rhamnose）gal-ua半乳糖醛酸（galacturonicacid）ara:阿拉伯糖（arabinose）glc-ua:葡萄糖醛酸（glucuronicacid）
[0079]
实施例7多糖诱导植物抗病性测定方法（离体叶片实验）
[0080]
分别配制100μg/mlcpeps-t、cpeps-1、cpeps-2测试溶液，以及100μg/ml氨基寡糖素阳性对照溶液，并对烟草和大豆植株根部浇灌，每株浇灌10ml，空白对照浇灌清水。72h后取下叶片，并分别在烟草叶片背面接种直径为5mm的辣椒疫霉病菌菌饼，在大豆叶片背面接种直径为5mm的大豆疫霉病菌菌饼。接菌时应尽量避开叶脉并保持接种部位对称一致。接种完成后，在黑暗保湿的条件下培养36h后，于紫外灯照射下拍照记录病斑大小。病斑面积用imagej软件测量。
[0081]
测得病斑面积，通过以下公式算出抑制率：
[0082][0083]
表3胞外多糖诱导植物抵御辣椒疫霉病菌和大豆疫霉病菌侵染（离体叶片实验）
[0084][0085]
实验结果表明，cpeps-2处理组的活性优于cpeps-1和cpeps-t处理组，cpeps-2可
以有效地诱导烟草和大豆植株产生抗性，对辣椒疫霉病菌和大豆疫霉病菌抑制率分别达到64.2%和68.8%，与同等浓度阳性对照氨基寡糖素的效果相当。
[0086]
实施例8多糖诱导植物抗病性测定方法（温室盆栽实验）
[0087]
分别配制100μg/mlcpeps-t、cpeps-1、cpeps-2测试溶液，以及100μg/ml氨基寡糖素阳性对照溶液，并对烟草和大豆植株根部浇灌，每株浇灌10ml，空白对照浇灌清水。72h后，分别向烟草植株喷施10ml浓度为1
×
105cfu/ml的辣椒疫霉游动孢子液，向大豆植株喷施10ml浓度为1
×
105cfu/ml的大豆疫霉游动孢子液。喷施完毕后将植株放置于保湿环境下培养4-5d，待植株发病进行拍照记录。
[0088]
表4胞外多糖诱导植物抵御辣椒疫霉病菌和大豆疫霉病菌侵染（温室盆栽实验）
[0089][0090]
实验结果表明，cpeps-2处理组的活性优于cpeps-1和cpeps-t处理组，对辣椒疫霉病和大豆疫霉病防效分别为75.0%和80.4%，与同等浓度阳性对照氨基寡糖素的效果相当。
[0091]
上述温室盆栽实验结果与离体叶片实验结果一致，表明胶孢炭疽菌phxp3胞外多糖cpeps-2可以显著的诱导植物产生抗病性，可作为新型植物免疫诱抗剂应用于农业植物病害防控。
[0092]
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

技术特征：
1.一种胶孢炭疽菌（colletotrichum gloeosporioides）phxp3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23858，保藏日期为2021年11月22日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述的胶孢炭疽菌phxp3或含有权利要求1所述的胶孢炭疽菌phxp3的培养物。3.权利要求1中所述的胶孢炭疽菌phxp3、权利要求2所述的菌剂在如下（a1）-（a3）任一中的应用：（a1）在制备胞外多糖cpeps-2中的应用；（a2）在植物免疫诱抗中的应用；（a3）在制备含有胞外多糖cpeps-2的植物免疫诱抗剂中的应用。4.一种胞外多糖cpeps-2，其特征在于，通过权利要求1所述的胶孢炭疽菌phxp3的发酵液得到，具体包括如下步骤：（1）挑取胶孢炭疽菌phxp3菌落，接种进入液体培养基进行发酵；（2）过滤除去步骤（1）发酵液中菌丝体，得到黑色粘稠状发酵液，减压浓缩；（3）采用醇沉、离心、冻干的手段从步骤（2）浓缩发酵液中获得胞外粗多糖cpeps-t；（4）分离纯化步骤（3）所得胞外粗多糖cpeps-t，获得胞外多糖cpeps-2。5.根据权利要求4所述的胞外多糖cpeps-2，其特征在于，所述胞外多糖cpeps-2的重均分子量为20~25kda。6.根据权利要求5所述的胞外多糖cpeps-2，其特征在于，所述胞外多糖cpeps-2由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖以及葡萄糖醛酸组成。7.权利要求4-6任一所述的胞外多糖cpeps-2在如下（b1）或（b2）中的应用：（b1）在植物免疫诱抗中的应用；（b2）在制备植物免疫诱抗剂中的应用。8.一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述植物免疫诱抗剂含有权利要求4-6任一所述的胞外多糖cpeps-2。9.权利要求8所述的植物免疫诱抗剂在防治农业植物病害中的应用，所述病害为大豆疫霉病、辣椒疫霉病和/或稻瘟病。10.根据权利要求9所述的应用，所述植物免疫诱抗剂剂型为乳油、水乳剂、微乳剂、可湿性粉剂、水分散粒剂、或悬浮剂。

技术总结
本发明公开了一种胶孢炭疽菌及其胞外多糖作为植物免疫诱抗剂的应用，属于微生物技术和植物免疫诱抗剂研发领域。本发明提供一种胶孢炭疽菌PHXP3，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23858。该菌株在发酵过程中产生的胞外多糖CPEPS-2，在诱导植物抗病实验中表现出优异的活性，可作为新型植物免疫诱抗剂进行开发应用。用。用。


技术研发人员：叶永浩 严威 李钰 陈李一凡 李晖 王玉琴
受保护的技术使用者：南京农业大学三亚研究院
技术研发日：2023.08.07
技术公布日：2023/9/7