一种长双歧杆菌SX-1326及其应用的制作方法

一种长双歧杆菌sx-1326及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌sx-1326及其应用。


背景技术：

2.癌症，又称恶性肿瘤，是细胞生长失调导致的危及人类健康的疾病。据统计，癌症导致的死亡率呈逐年上升趋势，已成为仅次于心血管疾病的第二大致死因素，严重威胁着我国人民的生命健康，是二十一世纪人类面临的最严峻的公共卫生问题之一。目前，肿瘤的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗及免疫治疗等。尽管随着精准医疗的发展，靶向和免疫治疗得到了长足的发展，但传统治疗手段手术、放疗和化疗仍是当前肿瘤治疗的重要手段。提高肿瘤治疗疗效减少毒副作用，从而延长患者生存期，确保生活质量是肿瘤治疗的目标。肿瘤药物治疗会导致不良反应的发生，其中胃肠道反应，如恶心、呕吐、腹泻、便秘等是常见的不良反应症状。药物引起胃肠道不良反应通常是由于引起肠道菌群紊乱及肠粘膜通透性损伤导致。如化疗药物会引起消化道黏膜严重损伤，使细胞间紧密连接破坏，导致肠黏膜屏障通透性增加，引发黏膜炎。化疗产生的炎性细胞因子引起肠屏障功能减弱及肠上皮细胞凋亡，使有害菌进入肠道，有益菌比例降低，引起肠道菌群失调。
3.益生菌是一类对宿主有益的活性微生物。大量报道证实益生菌具有多种生理功效，可以改善肠道环境、调节肠道菌群平衡、增强机体免疫力、抗肿瘤、预防糖尿病及缓解过敏症状等。长双歧杆菌是益生菌的一种，属于双歧杆菌属，是婴儿和成人肠道中最常见的双歧杆菌物质，也是人应用最广泛的益生菌之一。长双歧杆菌具有安全性，可用于食品及保健食品，在人类健康中发挥重要作用，具有抑制肠道致病菌、调节肠道平衡、促进营养吸收、延缓衰老和增强机体免疫功能等生理功能。长双歧杆菌可通过增加促炎细胞因子，增强体液免疫和细胞免疫，活化巨噬细胞，激活多核白细胞及单核细胞的吞噬活性。促进淋巴细胞转化，bax等抑癌基因的表达上调，从而发挥抗炎及抗肿瘤作用。益生菌可通过对肿瘤相关信号通路的调节来抑制肿瘤的发生，通过对炎症相关通路的调节改善肿瘤及药物的不良反应。tlr4/nf-κb信号通路在炎症信号传递中发挥着重要的作用，是肿瘤药物导致的肠道炎症等不良反应中发挥信号传递作用的重要通路。
4.长双歧杆菌存在多个菌株，市场上应用较为广泛的长双歧杆菌菌株为bb536、ncc2705，尽管不同菌株间一致性很高，但不同菌株间的作用差异相对较大，针对长双歧杆菌抗炎、抗肿瘤作用的报道相对较少，筛选具有优良抗炎、抗衰老及抗肿瘤作用的长双歧杆菌，对开发功能性食品、保健品及药物具有极大价值。
5.百岁老人属于超长寿人群，对于年龄相关的慢性病、慢性炎症和感染疾病的易感性下降，具有独特的肠道菌群，百岁老人肠道菌群与长寿及机体健康相关。研究表明，相比于年轻人和老年人，百岁老人肠道中存在一些特殊的细菌菌株，这些菌群能够产生特殊的物质如次级胆汁酸，抑制病原菌生长，预防疾病发生。对于中国百岁老人的研究数据表明，相比于百岁以下的老年人，百岁老人肠道菌群多样性显著增加（p《0.05），双歧杆菌和乳酸菌群落结构多样性增加。因此，从百岁老人粪便中筛选益生菌，可用于开发抗炎，抗衰老及
抗肿瘤的益生菌产品。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种长双歧杆菌sx-1326及其应用。所述长双歧杆菌筛选自赣南山区百岁老人粪便，通过体外及动物实验对其耐受耐胆盐特性及抗炎抗肿瘤的作用进行验证，显示出了肿瘤预防功能，在抗炎，抗衰老及抗肿瘤方面具备一定的应用价值。
7.为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种长双歧杆菌sx-1326，所述长双歧杆菌sx-1326于2020年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no.19853。
8.在一优选示例中，所述长双歧杆菌sx-1326具有如下特性：ⅰ）菌体特征为革兰氏染色阳性，杆状不运动的细菌；ⅱ）菌落特征为菌落大小直径在0.5mm-2mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明；ⅲ）生长特性为在37℃恒温下厌氧培养生长，在mrs培养基中培养23h-25h后达对数期；ⅳ）具有耐酸特性；
ⅴ
）具有耐胆盐特性。
9.在一优选示例中，所述长双歧杆菌sx-1326在ph为7.0
±
0.2的培养环境中，存活率不小于100%。
10.在一优选示例中，所述长双歧杆菌sx-1326在胆盐的质量占比为0.02%
±
0.02%的培养环境中，存活率不小于100%。
11.动物试验表明，所述长双歧杆菌sx-1326能够显著地改善结直肠癌小鼠的疾病活动指数，显著改善结直肠癌小鼠的肠道炎症；所述长双歧杆菌sx-1326联合化疗药物治疗能够改善化疗药物疗效。
12.基于一个总的发明构思，本发明的另一个目的在于保护上述长双歧杆菌sx-1326在制备具备抗炎、抗衰老、抗肿瘤功能的食品、保健品或膳食补充剂及药物中的应用。
13.在一优选示例中，所述药物中还包括药学上可接受的辅料，所述药物为片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂或溶液剂。
14.基于一个总的发明构思，本发明还一个目的在于保护一种益生菌制剂，所述益生菌制剂包括：上述长双歧杆菌sx-1326经培养获得的菌液，或将所述菌液经冻干或喷雾干燥获得的干粉菌剂。
15.在一优选示例中，所述益生菌制剂中长双歧杆菌sx-1326的活菌量≥1
×
108cfu/g或1
×
108cfu。
16.与现有技术相比，在本发明中，发明人从赣南山区百岁老人粪便中首次分离鉴定出了一株生长特性良好的长双歧杆菌bifidobacterium longum sx-1326。
17.经体外测定其生理特性，具有良好的耐酸、耐胆盐及抗炎、抗肿瘤作用性能，可经受一定的胃酸侵蚀，保持较高活性到达肠道发挥其有益功能，具有较好的抗炎作用，通过抑制有害菌从而维持肠道菌群平衡，通过调节炎症因子和抑癌基因表达，故具有一定的抗肿瘤功效；与化疗药物联用可改善化疗药物抗肿瘤疗效，缓解副作用，后续可用于制备抗衰
老、抗炎、抗肿瘤的食品、保健品及药物等。
附图说明
18.图1为本发明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠体重结果图；图2为本发明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠疾病活动指数结果图；图3为本发明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠结直肠长度结果图；图4为结肠炎症细胞浸润和形态学改变情况（200
×
，he染色）；图5为小鼠肠道中炎性因子tnf-α、il-6和il-1β的表达情况（q-pcr）；图6为肠道中tlr4-myd88-p65信号通路蛋白的表达情况（wb）。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加明白清楚，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，但是本发明并不限于这些实施例。需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为质量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如没有特别说明，均为本领域的常规方法。
20.本文中所用的术语“包含”、“包括”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
21.当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或者优选值与任何范围下限或优选值的任意一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外地说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
22.下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
23.实施例1 长双歧杆菌sx-1326的分离筛选及鉴定
24.采集赣南山区百岁老人的新鲜粪便样本，厌氧低温保存，于4h-6h（具体为5.2h）内运输至实验室进行处理。
25.选取中段粪便1-2g（具体为1.72g），加入无菌生理盐水中进行充分混匀，室温静置10min，取上层悬液，用生理盐水梯度稀释，吸取菌悬液涂布于mrs固体培养基，37℃恒温厌氧培养24h，得到单菌落。
26.观察记录菌落形态，选取菌落数量适中的平板，挑选单菌落划线接种于bbl固体培养基上分离纯化3次，得到单菌落。
27.将上述分离得到的菌株接种于液体培养基进行厌氧培养，并提取基因组dna进行16s rdna测序，根据形态特征、培养性状和生理生化特征以及16s rdna测序结果，与ncbi数据库进行比对，并使用blast在genbank中进行相似性比对，根据理化特征及测序结果，鉴定该菌株为长双歧杆菌，将其进行菌种保藏，编号为sx-1326，保藏号为：cgmcc no.19853，保藏日期为2020年5月20日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
（cgmcc）。
28.实施例2 长双歧杆菌酸耐受能力测定
29.挑取单菌落置于装有培养基的2ml微型离心管中，37℃恒温厌氧培养进行菌种活化，将活化后的菌液转入50ml mrs培养基中，37℃厌氧培养24h。将菌液在4℃低温离心机中4000g离心10min，弃上清，将沉淀用pbs重悬，将菌群悬液分别置于不同培养瓶中，加入pbs稀释，并分别调节ph至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，于37℃培养4h，进行平板活菌计数，计算菌株存活率。存活率是在该浓度培养基中取样时的活菌数与ph 7.0的活菌数之比，以%表示。
30.如表1所示，为长双歧杆菌菌株经酸耐受试验后存活率；由表1结果可见，本发明长双歧杆菌对酸具有良好的耐受性。
31.表1 长双歧杆菌sx-1326在不同ph值中的耐受性ph值2.03.04.05.06.07.0存活率（%）8085929096100。
32.实施例3 长双歧杆菌胆盐耐受能力测定
33.将二次活化后的菌液转入10ml mrs培养基中，37℃厌氧培养24h。将菌液在4℃低温离心机中4000g离心10min，弃上清，将菌体重悬并接种于包含不同浓度胆盐（0.0%-0.5% w/v）的mrs培养基中，37℃培养4h。取菌液检测活菌数，计算菌株存活率。存活率是在此浓度培养基中取样时的活菌数与胆盐浓度0.0%的活菌数之比，以%表示。
34.如表2所示，为长双歧杆菌菌株经胆盐耐受试验后存活率；由表2结果可见，长双歧杆菌对胆盐具有良好的耐受性。
35.表2 长双歧杆菌sx-1326在不同胆盐浓度中的耐受性胆盐浓度0.0%0.1%0.2%0.3%0.4%0.5%存活率（%）1009995908682。
36.实施例4 长双歧杆菌改善结直肠癌小鼠健康状况
37.购买60只c57bl/6雄性小鼠（spf级，18-20g，7周龄），spf级环境下适应性饲喂一周后，留空白对照组小鼠不做任何处理，其余小鼠严格按照aom/dss（氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠）四步诱导法进行结直肠造模。期间解剖小鼠观察肿瘤形成情况，he染色显示结肠组织形态学发生明显改变，出现病理性核分裂象等结果表明造模成功。将结直肠癌小鼠随机分为四组，分别给予生理盐水，长双歧杆菌、伊立替康、以及两者联合用药治疗，正常小鼠作为空白对照组。长双歧杆菌组每天给予1
×
109cfu/ml灌胃，伊立替康组采用伊立替康进行输注治疗，研究期间每隔一周对小鼠进行称重，观察各组小鼠的粪便，并于治疗结束后测量各组小鼠的结直肠长度。根据cooper hs评分标准（cooper hs评分标准=体重下降分数+大便性状分数+便血分数）对各组小鼠进行疾病活动指数评分。
38.如图1所示，为本发明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠体重结果图；如图2所示，为本发明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠疾病活动指数结果图；如图3所示，为本发明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠结直肠长度结果图。
39.长双歧杆菌治疗组可显著减缓小鼠体重下降幅度（p《0.01），长双歧杆菌治疗组及
长双歧杆菌联合伊立替康治疗组可降低小鼠疾病活动指数，恢复结直肠的长度，具有缓解小鼠结直肠癌症状的作用，体现了长双歧杆菌的抗肿瘤作用。
40.实施例5 长双歧杆菌改善结直肠癌小鼠肠道炎症
41.结直肠癌会导致肠道菌群紊乱，引发肠道炎症及肠屏障损伤，而化疗药物如伊立替康等也会导致肠粘膜受损，加重肠道炎症。
42.基于上述实施例4中的各组小鼠，将治疗结束后的各组小鼠解剖取结肠进行he染色，评估肠道炎症情况；提取基因组dna利用q-pcr对相关炎症因子（tnf-α、il-6、il-1β）进行检测；提取蛋白通过western blotting检测炎症相关蛋白的表达情况。
43.如图4、图5和图6所示，为he染色、qpcr和wb实验表明长双歧杆菌菌株改善结直肠癌小鼠肠道炎症。
44.长双歧杆菌能明显减少肠道炎性细胞浸润并恢复正常肠道结构，通过抑制炎症因子的表达，减轻肠道炎症反应；长双歧杆菌通过抑制tlr4，进一步抑制p65蛋白表达，表明长双歧杆菌通过tlr4/myd88/p65信号通路影响炎性蛋白表达，从而减轻肠道炎症反应，协同化疗药物，减少不良反应，缓解肿瘤。
45.上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种长双歧杆菌sx-1326，其特征在于，所述长双歧杆菌sx-1326于2020年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.19853。2.根据权利要求1所述的一种长双歧杆菌sx-1326，其特征在于，所述长双歧杆菌sx-1326具有如下特性：ⅰ）菌体特征为革兰氏染色阳性，杆状不运动的细菌；ⅱ）菌落特征为菌落大小直径在0.5mm-2mm之间，圆形，边缘整齐，乳白色，不透明；ⅲ）生长特性为在37℃恒温下厌氧培养生长，在mrs培养基中培养23h-25h后达对数期；ⅳ）具有耐酸特性；
ⅴ
）具有耐胆盐特性。3.根据权利要求1所述的一种长双歧杆菌sx-1326，其特征在于，所述长双歧杆菌sx-1326在ph为7.0
±
0.2的培养环境中，存活率不小于100%。4.根据权利要求1所述的一种长双歧杆菌sx-1326，其特征在于，所述长双歧杆菌sx-1326在胆盐的质量占比为0.02%
±
0.02%的培养环境中，存活率不小于100%。5.权利要求1所述的一种长双歧杆菌sx-1326在制备具备抗炎、抗衰老、抗肿瘤功能的食品、保健品或膳食补充剂及药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的辅料，所述药物为片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂或溶液剂。7.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂包括：权利要求1中所述长双歧杆菌sx-1326经培养获得的菌液，或将所述菌液经冻干或喷雾干燥获得的干粉菌剂。8.如权利要求7所述的一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂中长双歧杆菌sx-1326的活菌量≥1
×
108cfu/g或1
×
108cfu/ml。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌SX-1326及其应用，所述长双歧杆菌SX-1326于2020年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19853。经体外测定其生理特性，具有良好的耐酸、耐胆盐及抗炎、抗肿瘤作用性能，可经受一定的胃酸侵蚀，保持较高活性到达肠道发挥其有益功能，具有较好的抗炎作用，通过抑制有害菌从而维持肠道菌群平衡，通过调节炎症因子和抑癌基因表达，故具有一定的抗肿瘤功效；与化疗药物联用可改善化疗药物抗肿瘤疗效，缓解副作用，后续可用于制备抗衰老、抗炎、抗肿瘤的食品、保健品及药物等。保健品及药物等。保健品及药物等。


技术研发人员：王盛洲 陈廷涛 王翠敏 王京苏 林勇敢 刘文华
受保护的技术使用者：江西善行生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/9/7