一种基于LAMP的大白菜黑斑病致病菌检测方法

一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法
技术领域
1.本发明涉及植物病原物检测技术领域，具体涉及一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法。


背景技术：

2.大白菜黑斑病是由半知菌亚门链格孢属(alternaria)真菌侵染所致。白菜感染病菌后在叶片上形成黑色或深褐色的斑点或斑块，这些斑点开始为小型的黄色斑点，逐渐扩大为直径2-6毫米黑色或深褐色斑块，斑块的形状不规则，边缘模糊。后期受感染的叶片逐渐出现凋萎、干燥和枯死的现象。严重感染的情况下，整个叶片可能会枯死。在高湿度条件下，病原菌可能会产生孢子并形成黑色霉层，覆盖在叶片上；黑斑病菌可能侵入植物的根部和茎部，导致根系腐烂和茎部病变。
3.大白菜黑斑病在全国各地都有发生，是大白菜的一种常见叶部病害。大白菜受害后光合作用减弱，植株衰老加速，茎叶味苦，品质低劣，产量明显减少，在部分地区流行年份会减产20-30％，从而造成重大损失。国内外均开展了防治白菜黑斑病的研究工作，主要利用种子处理、生物防治和植物抗菌活性物质和化学药剂进行此病的综合控制(leifert et al.,1992；terras et al.,1993；daya et al.,1997；pedras et al.,1997；shrestha et al.,2000；tylkowska et al.,2001；肖长坤等，2002；崔秀荣等，2005；王刚等，2006)。以上措施的实施需要在致病菌明确的情况下才能“对症下药”，因为针对不同的致病菌需要用不同的防治措施。国外对大白菜黑斑病致病菌鉴定方法有比较系统的研究(king et al.,1994；hansen et al.,1997；doullah et al.,2006)，主要有以下几种类型：植株或离体器官鉴定、毒素活性鉴定法、细胞学鉴定、组织培养技术鉴定法、生化鉴定筛选和分子鉴定方法。而分子鉴定方法是目前比较流行的一种方法。
4.lamp(loop-mediated isothermal amplification)方法是一种新型的核酸扩增技术，它具有快速、简便、高效、灵敏、特异性强等优点，已经成功地应用于多种病原体的检测。针对大白菜黑斑病致病菌的检测，目前已有pcr、nested pcr等方法，但这些方法存在以下不足：
5.1、pcr和nested pcr需要进行多个步骤，如dna提取、pcr反应条件调试等，操作繁琐、耗时长，且易受到环境因素的影响而产生假阳性或假阴性的结果。
6.2、pcr和nested pcr的专一性较低，易受到外源性dna污染的影响。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，在样品制备和反应过程中引入了多种特异性核酸引物和反应控制元素，以提高检测的特异性和灵敏度。另外，lamp方法的反应过程是在等温条件下进行的，无需特殊仪器设备，反应时间短，更适合在田间或野外进行实时检测。
8.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
9.一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，包括以下步骤：
10.样品处理，对需要检测的大白菜叶片、叶柄、根、茎等部位进行取样，用消毒过的剪刀和钳子取出样本，选取所需检测部位切下大约1cm
×
1cm的样品，放入1.5ml去离子水中，用vortex离心混合，离心速度为12000g，离心时间为5min，离心后，将所得到的上清液分别用超滤管过滤，筛选出病菌。需要注意的是，在样品处理过程中，需要保持良好的无菌操作，以避免样品污染。
11.dna提取，将筛选得到的病菌在60℃下培养12小时，收集菌液，提取菌体总dna；dna提取可采用普通的dna提取试剂盒进行提取，如omega dna extraction kit、tianamp bacterial dna kit等，dna提取方法的选择应根据检测的具体要求和实验条件进行选择。
12.lamp反应体系制备，将lamp反应体系组分按照下表配置：
[0013][0014]
其中，内引物和外引物各含两个特异性引物，环状引物由fip和bip组成，加快扩增速率；增强剂适用于改善高gc区域的扩增效率。
[0015]
lamp反应，将提取的dna加入lamp反应体系中，在反应器中进行dna扩增；
[0016]
结果分析，将lamp反应后的产物进行结果分析，肉眼直接观察：使用10μl sybr green i(1:10,000)染色扩增产物。如果颜色由浅绿色转变为荧光绿，可判断为阳性，否则为阴性。
[0017]
热泳电泳法：将反应产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，经紫外线观察，如果出现目标带，说明样品中存在目标序列。需要注意的是，进行lamp反应时需要避免污染，包括反应液、试剂及样品。
[0018]
该方法基于lamp技术，具有灵敏度高、快速、简单等特点，适用于大白菜黑斑病致病菌的快速检测。
[0019]
进一步的，dna提取包括以下步骤：
[0020]
1.预处理样品
[0021]
将pda培养基中的菌液离心，弃去上清液，用pbs洗涤沉淀细胞，再次离心后倒掉pbs，最后用1mlte缓冲液(10mm tris-hcl，1mm edta，ph 8.0)悬浮沉淀细胞。
[0022]
2.细胞破碎和裂解
[0023]
向细胞悬浮液中加入蛋白酶k和lysozyme，使其在60℃下孵育12分钟。
[0024]
3.去除蛋白质和其他杂质
[0025]
加入nuclei lysis solution，使细胞释放出核酸；再加入protein precipitation solution沉淀蛋白质和其他杂质，将反应液进行离心，将离心得到的上清液转移到新的管中。
[0026]
4.洗涤dna
[0027]
将上面得到的上清液转移到dna binding column中，用wash buffer 1和wash buffer 2两次洗涤去除杂质。最后使用wash buffer 3将dnabinding column进行最后一次洗涤。
[0028]
5.提取dna
[0029]
将dnabinding column放在新的离心管中，加入elution buffer，使dna从binding column中洗出，最后用wash buffer 3冲洗binding column以洗出所有dna。可以使用任何方法储存提取出来的dna。
[0030]
整个过程需要注意无菌操作，按照试剂盒说明书进行操作。
[0031]
提取的dna需要经过纯化处理，可以使用酚/氯仿方法或纯化试剂盒将dna纯化；最后使用紫外分光光度计检测dna含量和纯度，确保提取的dna质量。
[0032]
进一步的，lamp反应的步骤具体包括：
[0033]
1.准备所需的试剂及工具，包括bst dna聚合酶、mgso4、dntps、lamp内引物、lamp外引物、lamp环状引物fip、lamp环状引物bip、lamp增强剂和反应缓冲液等。
[0034]
2.根据上述表格中的比例，精确量取每个试剂，配置lamp反应体系；具体操作方法如下：
[0035]
将所需体积的1
×
isothermal amplification buffer加入反应管中。
[0036]
加入相应量的mgso4，并充分混匀。
[0037]
加入dntps，充分混匀。
[0038]
加入lamp内引物和外引物；内引物和外引物各含两个特异性引物，加入后充分混匀。
[0039]
加入lamp环状引物fip和bip，充分混匀。
[0040]
加入lamp增强剂(0.8m betaine)，充分混匀。
[0041]
最后加入bst dna聚合酶。为避免酶的活性丧失，在加入bst dna聚合酶时，需要先加入反应管底部，充分混匀后再加入反应管顶部。
[0042]
3.将配置好的lamp反应体系转移到反应管中，待扩增的dna要根据需要加入合适的量，一般为体积为10-50ng，浓度为10-12
mol/l，充分混匀后关闭反应管盖子。
[0043]
4.将反应管放入反应器中，设置反应器温度为65℃(适宜温度范围62-68℃)，开始反应。
[0044]
5.根据需要设置反应时间，一般建议反应时间为40-60分钟。反应结束后，可以直接进行结果分析。
[0045]
在操作过程中要避免污染，尽量使用无菌技术操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。此外，反应体系的各个组分的最终浓度应当精确配制，以保证反应的准确性和可靠
性。
[0046]
进一步的，lamp内引物：包括f3和b3引物，均为20-24个碱基的基因序列；
[0047]
lamp外引物：包括fip和bip引物，均为30-40个碱基的基因序列；
[0048]
f3：5'-ctgctggagctggatagc-3'；
[0049]
b3：5'-gaacctcggacaggagaa-3'；
[0050]
fip：5'-gggcgcggttctagagtgaaaccgcatggttccatggt-3'；
[0051]
bip：5'-aagtgagcatggcgggttcagcagtagcgcgtcgcgg-3'。
[0052]
这些引物设计的基础是使用了针对致病菌its序列的生物信息学分析工具ncbi primer-blast进行了引物设计和验证。
[0053]
本发明的有益效果：
[0054]
本发明提出来一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，使用该方法可以提高检测的特异性和灵敏度，减少假阳性和假阴性结果的出现。另外，由于该方法在等温条件下进行反应，无需特殊仪器设备，反应时间短，更适合在野外或田间进行实时检测。步骤s1和s2的样品制备和dna提取操作可以确保提取到高质量的dna样品，从而提高反应的准确性和可靠性。s3中lamp反应体系的具体配制可以保证反应的稳定性和一致性，让扩增反应更加可靠。在结果分析方面，使用肉眼直接观察和热泳电泳法两种方法进行结果分析，可以确保结果的准确性和可靠性。
[0055]
本发明引入多种特异性核酸引物和反应控制元素，这些核酸引物的设计是基于大白菜黑斑病致病菌具有的特殊基因组序列。这些引物能够特异性地与目标dna结合，从而提高了检测的特异性和灵敏度。此外，反应控制元素的引入可以有效地减少非特异性反应，可以更准确地检测大白菜黑斑病致病菌。
[0056]
本发明的lamp方法的反应过程是在等温条件下进行的，与pcr方法(聚合酶链式反应)相比，lamp方法的反应过程是基于等温扩增反应，无需复杂的仪器设备，反应时间较短，可以在田间或野外进行实时检测。这种方法可以显著减少样本检测的时间和成本。
[0057]
本发明的结果分析采用肉眼直接观察和热泳电泳法，操作简便、结果直观，能够快速判断样品是否阳性。
[0058]
综上所述，本发明提供了一种高效、准确、便捷的基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，可以提前预警并采取相应的防控策略，从而减少病害造成的损失。
[0059]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
[0060]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0061]
实施例1
[0062]
如本实施例所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，包括以下步骤：
[0063]
s1：将大白菜预处理后得到待检测样本，筛选出病菌；
[0064]
s2：将步骤s1所得的病菌培养后进行dna提取；
[0065]
s3：将步骤s2提取的dna加入lamp反应体系中进行扩增；
[0066]
s4：将步骤s3扩增所得产物进行结果分析。
[0067]
在本实施例中，所述步骤s1具体包括以下子步骤：
[0068]
s1.1：取大白菜叶片、根、茎等不同部位的植株进行采样；
[0069]
s1.2：用经过消毒处理的剪刀和钳子取出样本，选取所需检测部位切下1cm
×
1cm的样品；
[0070]
s1.3：将步骤s1.2所得样本放入1.5ml去离子水中，vortex离心混合，离心速度为12000g，离心时间为5min；
[0071]
s1.4：离心后，将所得到的上清液分别用超滤管过滤，筛选出病菌。
[0072]
在本实施例中，所述步骤s2具体包括以下子步骤：
[0073]
s2.1：样品处理后，将筛选后的病菌菌株在pda培养基中孵育至对数生长期，即菌液浓度达到约为od600＝0.5～0.8；
[0074]
s2.2：将pda培养基中的菌液离心，弃上清液，用pbs洗涤沉淀细胞，再次离心后弃pbs，最后用1mlte缓冲液(10mm tris-hcl，1mm edta，ph 8.0)悬浮沉淀细胞；
[0075]
s2.3：细胞破碎和裂解，向细胞悬浮液中加入蛋白酶k和lysozyme，使其在60℃下孵育12分钟；
[0076]
s2.4：去除蛋白质和其他杂质，加入nuclei lysis solution，使细胞释放出核酸；再加入protein precipitation solution沉淀蛋白质和其他杂质，离心反应液后将上清液转移到新的管中；
[0077]
s2.5：洗涤dna，将上面得到的上清液转移到dna binding column中，用wash buffer 1和washbuffer 2两次洗涤去除杂质；最后使用wash buffer 3将dnabinding column进行最后一次洗涤；
[0078]
s2.6：提取dna，将dnabinding column放在新的离心管中，加入elution buffer，使dna从binding column中洗出，最后用wash buffer 3冲洗binding column以洗出所有dna。
[0079]
在本实施例中，所述步骤s3中lamp反应体系包括bst dna聚合酶、mgso4、dntps、lamp内引物、lamp外引物、lamp环状引物fip、lamp环状引物bip、lamp增强剂与反应缓冲液，其中各组分浓度按照下表配置：
[0080]
[0081][0082]
其中，内引物和外引物各含两个特异性引物；环状引物由fip和bip组成，加快扩增速率；增强剂适用于改善高gc区域的扩增效率。
[0083]
在本实施例中，所述步骤s3具体包括以下子步骤：
[0084]
s3.1：所需体积的1
×
isothermalamplification buffer加入反应管中；加入相应量的mgso4，并充分混匀；
[0085]
s3.2：加入dntps，充分混匀；加入lamp内引物和外引物；
[0086]
s3.3：加入lamp环状引物fip和bip，充分混匀；加入lamp增强剂(0.8mbetaine)，充分混匀；
[0087]
s3.4：加入bst dna聚合酶，为避免酶的活性丧失，在加入bst dna聚合酶时，需要先加入反应管底部，充分混匀后再加入反应管顶部；
[0088]
s3.5：将配置好的lamp反应体系转移到反应管中，加入步骤s2所得dna，充分混匀后关闭反应管盖子准备进行扩增；
[0089]
s3.6：将反应管放入反应器中，设置反应器温度为62-68℃开始反应；反应时间为40-60分钟，反应体系为25μl；
[0090]
s3.7：将lamp反应后的产物进行结果分析。
[0091]
在本实施例中，所述步骤s3中lamp内引物包括f3和b3引物，lamp外引物包括fip和bip引物；各组引物序列为：
[0092]
f3：5'-ctgctggagctggatagc-3'；
[0093]
b3：5'-gaacctcggacaggagaa-3'；
[0094]
fip：5'-gggcgcggttctagagtgaaaccgcatggttccatggt-3'；
[0095]
bip：5'-aagtgagcatggcgggttcagcagtagcgcgtcgcgg-3'。
[0096]
在本实施例中，所述步骤s3.7中结果分析具体包括肉眼直接观察：使用10μl sybr green i(1:10,000)染色扩增产物；如果颜色由浅绿色转变为荧光绿，可判断为阳性，否则为阴性；
[0097]
热泳电泳法：将反应产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，经紫外线观察，如果出现目标带，说明样品中存在目标序列。
[0098]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：将大白菜预处理后得到待检测样本，筛选出病菌；s2：将步骤s1所得的病菌培养后进行dna提取；s3：将步骤s2提取的dna加入lamp反应体系中进行扩增；s4：将步骤s3扩增所得产物进行结果分析。2.如权利要求1所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于：所述步骤s1具体包括以下子步骤：s1.1：取大白菜叶片、叶柄、根、茎等不同部位的植株进行采样；s1.2：用经过消毒处理的剪刀和钳子取出样本，选取所需检测部位切下1cm
×
1cm的样品；s1.3：将步骤s1.2所得样本放入1.5ml去离子水中，vortex离心混合，离心速度为12000g，离心时间为5min；s1.4：离心后，将所得到的上清液分别用超滤管过滤，筛选出病菌。3.如权利要求1所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于：所述步骤s2具体包括以下子步骤：s2.1：样品处理后，将筛选后的病菌菌株在pda培养基中孵育至对数生长期，即菌液浓度达到约为od600＝0.5～0.8；s2.2：将pda培养基中的菌液离心，弃去上清液，用pbs洗涤沉淀细胞，再次离心后弃pbs，最后用1mlte缓冲液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)悬浮沉淀细胞；s2.3：细胞破碎和裂解，向细胞悬浮液中加入蛋白酶k和lysozyme，使其在60℃下孵育12分钟；s2.4：去除蛋白质和其他杂质，加入nucleilysissolution，使细胞释放出核酸；再加入proteinprecipitationsolution沉淀蛋白质和其他杂质，离心反应液后将上清液转移到新的管中；s2.5：洗涤dna，将上面得到的上清液转移到dnabinding column中，用washbuffer1和washbuffer2两次洗涤去除杂质；最后使用washbuffer3将dnabindingcolumn进行最后一次洗涤；s2.6：提取dna，将dnabindingcolumn放在新的离心管中，加入elutionbuffer，使dna从bindingcolumn中洗出，最后用wash buffer3冲洗bindingcolumn以洗出所有dna。4.如权利要求1所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于：所述步骤s3中lamp反应体系包括bstdna聚合酶、mgso4、dntps、lamp内引物、lamp外引物、lamp环状引物fip、lamp环状引物bip、lamp增强剂与反应缓冲液，其中各组分浓度按照下表配置：
其中，内引物和外引物各含两个特异性引物，共同放大反应物；环状引物由fip和bip组成，加快扩增速率；增强剂适用于改善高gc区域的扩增效率。5.如权利要求4所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于：所述步骤s3具体包括以下子步骤：s3.1：所需体积的1
×
isothermalamplificationbuffer加入反应管中；加入相应量的mgso4，并充分混匀；s3.2：加入dntps，充分混匀；加入lamp内引物和外引物；s3.3：加入lamp环状引物fip和bip，充分混匀；加入lamp增强剂(0.8mbetaine)，充分混匀；s3.4：加入bstdna聚合酶，为避免酶的活性丧失，在加入bst dna聚合酶时，需要先加入反应管底部，充分混匀后再加入反应管顶部；s3.5：将配置好的lamp反应体系转移到反应管中，加入步骤s2所得dna，充分混匀后关闭反应管盖子准备进行扩增；s3.6：将反应管放入反应器中，设置反应器温度为62-68℃开始反应；反应时间为40-60分钟，反应体系为25μl；s3.7：将lamp反应后的产物进行结果分析。6.如权利要求5所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于：所述步骤s3中lamp内引物包括f3和b3引物，lamp外引物包括fip和bip引物；各组引物序列为：f3：5'-ctgctggagctggatagc-3'；b3：5'-gaacctcggacaggagaa-3'；fip：5'-gggcgcggttctagagtgaaaccgcatggttccatg gt-3'；bip：5'-aagtgagcatggcgggttcagcagtagcgcgtcgc gg-3'。7.如权利要求5所述的一种基于lamp的大白菜黑斑病致病菌检测方法，其特征在于：所述步骤s3.7中结果分析具体包括肉眼直接观察：使用10μlsybrgreeni(1:10,000)染色扩增产物；如果颜色由浅绿色转变为荧光绿，可判断为阳性，否则为阴性；
热泳电泳法：将反应产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，经紫外线观察，如果出现目标带，说明样品中存在目标序列。

技术总结
本发明涉及植物病原物检测技术领域，具体涉及一种基于LAMP的大白菜黑斑病致病菌检测方法，本发明可以提高检测的特异性和灵敏度，减少假阳性和假阴性结果的出现。另外，由于该方法在等温条件下进行反应，无需特殊仪器设备，反应时间短，更适合在野外或田间进行实时检测；步骤S1和S2的样品制备和DNA提取操作可以确保提取到高质量的DNA样品，从而提高反应的准确性和可靠性。S3中LAMP反应体系的具体配制可以保证反应的稳定性和一致性，让扩增反应更加可靠。在结果分析方面，使用肉眼直接观察和热泳电泳法两种方法进行结果分析，可以确保结果的准确性和可靠性。结果的准确性和可靠性。


技术研发人员：兰梅 和江明 徐学忠 张丽琴 胡靖锋 杨红丽
受保护的技术使用者：云南省农业科学院园艺作物研究所
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/9/7