一种烷基腺嘌呤DNA糖基化酶突变体、融合蛋白和应用的制作方法

一种烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体、融合蛋白和应用
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体、融合蛋白和应用。


背景技术：

2.目前，主要的碱基编辑技术包括两类，胞嘧啶碱基编辑技术(cbe)和腺嘌呤碱基编辑技术(abe)，分别由胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶与cas9融合而成，可高效的实现基因组特定位点c到t或a到g的碱基转换。60％左右的遗传疾病由单碱基突变引起，其中约47％的致病点突变为g到a突变，这需要有效的abe工具。目前，基于碱基编辑技术的细胞疗法已被fda批准用于临床疾病治疗。
3.abe是碱基编辑器中最重要的基础研究工具之一，目前公认的最高效的腺嘌呤碱基编辑器是abe8e。腺嘌呤碱基颠换编辑器aybe v3(nat biotechnol，2023)是在abe8e基础上融合了烷基腺嘌呤dna糖基化酶(mpg)，可实现在在基因组指定位点实现a到g、c、t的编辑。但是，新型碱基编辑技术aybe存在体积过大的问题，可能会影响其利用腺相关病毒(aav)体内递送(上限4.7kb)用于基因治疗的应用。因此，开发一种较小体积且维持相当靶向活性的aybe工具是本领域的迫切需要。


技术实现要素：

4.本发明申请人根据碱基编辑技术的工作原理，通过对融合蛋白aybe v3的理性设计，截去了aybe v3中mpg核心功能没有影响的相对保守区域，开发出了体积更小的a到y(y＝t或c)碱基编辑器，更适用于aav的递送，在基因治疗方面有广阔的应用前景。
5.一方面，本技术提供了一种烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体由烷基腺嘌呤dna糖基化酶删除部分氨基酸序列获得，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列、第287-298位氨基酸序列、第2-88位氨基酸序列、第111-115位氨基酸序列、第172-177位氨基酸序列、第207-216位氨基酸序列、第226-241位氨基酸序列、第260-268位氨基酸序列和/或第284-298位氨基酸序列，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶氨基酸序列如seq id no.11所示。
6.在一种优选的实施方式中，本技术中所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶(mpg)为mpg(g163r,n169s,s198a,k202a,g203a,s206a and k210a)，具体可见参考文献：programmable a-to-y base editing by fusing an adenine base editor with an n-methylpurine dna glycosylase,https://doi.org/10.1038/s41587-022-01595-6，其氨基酸序列如seq id no.11所示。
7.本领域技术人员可以理解的是，本技术中蛋白质编码规则遵循常用规则，以第2-79位为例，所述第2-79位即指自序列n端开始向c端方向顺序计数第2个氨基酸位点至第79个氨基酸位点。
8.其中，烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体为烷基腺嘌呤dna糖基化酶删除部分氨基酸
序列后的截短序列。
9.进一步的，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列和/或第287-298位氨基酸序列；优选的，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体的氨基酸序列包括seq id no.1、seq id no.2和/或seq id no.3；更优选的，编码所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体的序列包括如seq id no.15所示核苷酸序列或与seq id no.15具有至少98％序列同一性的核苷酸序列、如seq id no.16所示核苷酸序列或与seq id no.16具有至少98％序列同一性的核苷酸序列、和/或如seq id no.17所示核苷酸序列或与seq id no.17具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。
10.优选的，编码所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体的序列包括与seq id no.15具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列，
11.和/或，与seq id no.16具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列，
12.和/或，与seq id no.17具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列。
13.在一种优选的实施方式中，
14.烷基腺嘌呤dna糖基化酶删除第2-79位氨基酸序列后，获得的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.15所示；
15.烷基腺嘌呤dna糖基化酶删除第287-298位氨基酸序列后，获得的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.16所示；
16.烷基腺嘌呤dna糖基化酶删除第2-79位氨基酸序列、第287-298位氨基酸序列后以及2-79aa与287-298aa双截短，获得的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.17所示。
17.另一方面，本技术还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括如上述的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体。
18.进一步的，所述融合蛋白还包括脱氨酶；优选的，所述脱氨酶包括胞嘧啶脱氨酶和/或腺苷脱氨酶；更优选的，所述脱氨酶为腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶为细菌来源的腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶选自大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶、金黄色酿脓葡萄球菌来源的腺苷脱氨酶、猪霍乱沙门菌来源的腺苷脱氨酶、化脓性链球菌来源的腺苷脱氨酶中的一种或多种；更优选的，所述腺苷脱氨酶为大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶tada-8e；更优选的，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列包括seq id no.20所示序列；更优选的，编码所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列包括seq id no.21所示序列。
19.进一步的，所述融合蛋白还包括核酸酶；所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为cas9；更优选的，所述cas9选自来源于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或嗜热链球菌的cas9；更优选的，所述cas9选自cas9突变体ncas9、dcas9、vqr-spcas9、vrer-spcas9、spcas9；更优选的，所述cas9为spcas9；更优选的，所述spcas9的氨基酸序列包括seq id no.22所示序列；更优选的，编码所述spcas9的核苷酸序列包括seq id no.23所示序列。
20.进一步的，所述融合蛋白还包括nls；优选的，所述nls位于所述融合蛋白的至少一端；更优选的，所述nls的氨基酸序列包括seq id no.18所示序列；更优选的，编码所述nls的核苷酸序列包括seq id no.19所示序列。
21.本领域技术人员可以理解的是，所述融合蛋白nls、蛋白表达元件、核苷脱氨酶和核酸酶之间可以增加已知的连接肽(linker)进行连接，并且在不影响融合蛋白本身功能的前提下，所述融合蛋白还可以进行已知的修饰，包括磷酸化、乙酰化、泛素化、糖基化等。
22.在一种优选的实施方式中，所述融合蛋白的连接顺序(n端至c端)为：nls、脱氨酶、核酸酶、烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体。
23.另一方面，本技术中还提供了生物材料，所述生物材料包括下述a)-d)中任一种：
24.a)一种基因，所述基因编码如上述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体，或如上述融合蛋白；
25.b)一种表达盒，所述表达盒含有a)所述基因；
26.c)一种重组载体，所述重组载体含有a)所述基因和/或b)所述表达盒；
27.d)一种重组细胞或重组菌，含有如上述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体、如上述融合蛋白、a)所述基因、b)所述表达盒或c)所述重组载体。
28.另一方面，本技术还提供了一种单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统包括上述的融合蛋白；优选的，所述单碱基基因编辑系统还包括sgrna，所述sgrna引导所述融合蛋白对目的细胞中的目的基因进行单碱基基因编辑；更优选的，所述sgrna的靶序列包括seq id no.12-14中至少一种。
29.具体实施时，所述sgrna的靶序列包括seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14的任一种、任意两种或全部三种。
30.本技术中已证明在多个靶点的情况下，所述融合蛋白均表现出a到c/t的编辑能力，且保持相当的活性。证明了本技术发现的mpg 2-79aa以及287-298aa截去后，对靶向编辑活性影响最小且可大幅减小aybe v3的尺寸，该基因编辑器具有普适性，能够广泛应用于不同靶点情况下的基因编辑过程中。因此，本领域技术人员可根据实际情况重新设计靶点及sgrna，使用所述融合蛋白进行基因编辑。
31.另一方面，本技术还提供了一种降低单碱基基因编辑器体积的方法，所述方法包括删除单碱基基因编辑器中烷基腺嘌呤dna糖基化酶的部分氨基酸序列，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列、第287-298位氨基酸序列、第2-88位氨基酸序列、第111-115位氨基酸序列、第172-177位氨基酸序列、第207-216位氨基酸序列、第226-241位氨基酸序列、第260-268位氨基酸序列和/或第284-298位氨基酸序列，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶氨基酸序列如seq id no.11所示；优选的，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列和/或第287-298位氨基酸序列；优选的，所述单碱基基因编辑器为aybe；更优选的，所述单碱基基因编辑器为aybe v3。
32.另一方面，本技术还提供了如上述的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体、如上述的融合蛋白、或如上述的生物材料、或如上述的单碱基基因编辑系统、或如上述的方法在制备基因编辑产品、制备用于疾病治疗和/或预防的产品、制备动物和/或植物模型中的应用。
33.本发明具有如下有益效果：
34.1、本发明申请人根据mpg蛋白晶体结构与功能关系，理性设计截短位点，通过筛选
截短位点，发现并验证了mpg的2-79aa、287-298aa截去后以及2-79aa与287-298aa双截短，对靶向编辑活性影响最小且可大幅减小aybe v3的尺寸；
35.2、本发明中还提供了一种较小体积的aybe v3及其制备方法，通过截短mpg蛋白，能够在维持相当靶向活性的同时缩小aybe v3的体积，克服了目前aybe v3因体积较大难以通过aav包装进行体内递送的问题，使该aybe更有可能通过aav递送进行在体递送用于基因治疗，具有更佳广阔的应用前景。
附图说明
36.此处所说明的附图用来提供对本技术的进一步理解，构成本技术的一部分，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。在附图中：
37.图1是不同截短组aybe(aybe v3)的设计与构建示意图，其中，bpnls为核定位信号(其氨基酸序列如seq id no.18所示，核苷酸序列如seq id no.19所示)，tada-8e腺苷脱氨酶abe8e(其氨基酸序列如seq id no.20所示，核苷酸序列如seq id no.21所示)，spcas9为核酸酶(其氨基酸序列如seq id no.22所示，核苷酸序列如seq id no.23所示)；
38.图2是不同的截短组aybe(aybe v3)在人的内源靶点t3、t11、t12编辑效率对比图。
具体实施方式
39.技术术语：
40.表达：术语“表达”包括涉及甲基转移酶或其突变体产生的任何步骤。
41.重组：广义上讲，任何造成基因型变化的基因交流过程，都叫做重组。
42.表达盒：表达盒是指由启动子、靶基因和报道基因等组成，能在特定组织中表达并易于检测的一组dna序列。
43.重组载体：重组载体就是在克隆载体基本骨架的基础上转入目的基因，进而使目的基因能够表达的载体。
44.重组菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
45.重组细胞：术语“重组细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
46.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
47.如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
48.实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照sambrook等人，分子克隆，实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)所记载，或按照厂商的建议条件。
49.1.1、质粒设计及构建
50.1.1.1、根据腺嘌呤转位碱基编辑技术aybe v3中mpg(氨基酸序列如seq id no.11所示)的蛋白晶体结构在进化保守区域理性设计10个截短方案，分别构建了这10个截短质粒(图1)：aybe xx1、aybe xx2、aybe xx3、aybe xx4、aybe xx5、aybe xx6、aybe xx7、aybe xx8、aybe xx9、aybe xx10(序列如表1所示)。
51.表1、截短质粒序列(mpg部分)
52.53.[0054][0055]
1.1.2、设计了3个来自于人的内源性靶点t3、t11、t12(序列如表2所示)进行筛选。人工合成表1所示靶点t3、t11、t12的dna，通过金门克隆连接至sgrna表达质粒u6-sgrna-ef1α-gfp的bbsⅰ位点处(用于表达相应靶点的sgrna)，得到重组靶点质粒。
[0056]
表2、所用靶点及序列
[0057]
靶点名称序列(5
’‑3’
)seq id no.t3gtcatccagtgctaccgctgtgg12t11gggaataaatcatagaatcctgg13t12acgtgccaggtggagcacccagg14
[0058]
1.1.3、将1.1.1与1.1.2中构建的质粒经sanger测序，确保完全正确。
[0059]
1.2、细胞转染
[0060]
将hek293t 2
×
105细胞铺24孔板，待细胞长至70％-80％时，按aybe xxx:sgrna＝750ng:250ng进行质粒组合的转染，每种质粒组合转染设3孔重复，每孔2
×
105个细胞。同时设不转染任何质粒的空白对照。分别在转染24h、48h后，弃上清，加入500μl完全培养基(89％dmem(gibco)+10％fbs(biovision technology)+1％ps(gibco))，持续到细胞基因组提取。
[0061]
aybe xxx代表：质粒aybe xx1、aybe xx2、aybe xx3、aybe xx4、aybe xx5、aybe xx6、aybe xx7、aybe xx8、aybe xx9、aybe xx10中任一种，以质粒abe8e、aybe为阳性对照。
[0062]
1.3、基因组提取及扩增子文库的准备
[0063]
转染后72h，用biosearch的quickextract
tm
dna提取试剂盒(qe09050)提取细胞基因组dna。之后用hitom试剂盒的操作流程，设计相对应的鉴定引物(序列如表3所示)，即在正向鉴定引物5’端加上搭桥序列5
’‑
ggagtgagtacggtgtgc-3’，反向鉴定引物5’端加上搭桥序列5
’‑
gagttggatgctggatgg-3’，即得到一轮pcr产物，之后利用一轮pcr产物作为模板，进行二轮pcr后混在一起切胶回收纯化，随后送到测序公司进行ngs测序。
[0064]
通过be-analyzer(http://www.rgenome.net/be-analyzer/#！)统计测序细胞最终基因编辑效率，编辑效率结果如图2所示。
[0065]
表3、所用靶点的鉴定引物
[0066][0067]
结论：由图2结果可见，与原有的aybe v3相比，aybe xx1(2-79aa截短)、aybe xx2(287-298aa截短)、aybe xx3(2-79aa与287-298aa双截短)在多个靶点均展示出了a到c/t的编辑能力，具体是aybe xx1，aybe xx2，aybe xx3的a到c的编辑效率为分别为7.5-10.9％，7.5-12.9％，5.8-8.8％，a到t的编辑效率分别为2.8-4.6％，3.1-4.5％，2.5-3.4％这与aybe v3中的a到c(13.6-18.9％)和a到t(5.4-6％)的编辑效率相当。
[0068]
因此，本技术发现并证明了mpg的2-79aa以及287-298aa截去后，对靶向编辑活性影响最小且可大幅减小aybev3的尺寸，进而获得了三个小体积mpg，mpg1(2-79aa截短)：氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.15所示，mpg2(287-298aa截短)：氨基酸序列如seq id no.2所示，核苷酸序列如seq id no.16所示，mpg3(2-79aa与287-298aa双截短)：氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.17所示。
[0069]
以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。

技术特征：
1.一种烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体，其特征在于，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体由烷基腺嘌呤dna糖基化酶删除部分氨基酸序列获得，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列、第287-298位氨基酸序列、第2-88位氨基酸序列、第111-115位氨基酸序列、第172-177位氨基酸序列、第207-216位氨基酸序列、第226-241位氨基酸序列、第260-268位氨基酸序列和/或第284-298位氨基酸序列，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶氨基酸序列如seq id no.11所示。2.所述根据权利要求1所述的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体，其特征在于，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列和/或第287-298位氨基酸序列；优选的，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体的氨基酸序列包括seq id no.1、seq id no.2和/或seq id no.3；更优选的，编码所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体的序列包括如seq id no.15所示核苷酸序列或与seq id no.15具有至少98％序列同一性的核苷酸序列、如seq id no.16所示核苷酸序列或与seq id no.16具有至少98％序列同一性的核苷酸序列、和/或如seq id no.17所示核苷酸序列或与seq id no.17具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。3.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括如权利要求1或2所述的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括脱氨酶；优选的，所述脱氨酶包括胞嘧啶脱氨酶和/或腺苷脱氨酶；更优选的，所述脱氨酶为腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶为细菌来源的腺苷脱氨酶；所述腺苷脱氨酶选自大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶、金黄色酿脓葡萄球菌来源的腺苷脱氨酶、猪霍乱沙门菌来源的腺苷脱氨酶、化脓性链球菌来源的腺苷脱氨酶中的一种或多种；更优选的，所述腺苷脱氨酶为大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶tada-8e；更优选的，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列包括seq id no.20所示序列；更优选的，编码所述腺苷脱氨酶的核苷酸序列包括seq id no.21所示序列。5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括核酸酶；所述核酸酶选自cas9、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、cpf1中的一种或任意几种；优选的，所述核酸酶为cas9；更优选的，所述cas9选自来源于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或嗜热链球菌的cas9；更优选的，所述cas9选自cas9突变体ncas9、dcas9、vqr-spcas9、vrer-spcas9、spcas9；更优选的，所述cas9为spcas9；更优选的，所述spcas9的氨基酸序列包括seq id no.22所示序列；更优选的，编码所述spcas9的核苷酸序列包括seq id no.23所示序列。6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括nls；优选的，所述nls位于所述融合蛋白的至少一端；更优选的，所述nls的氨基酸序列包括seq id no.18所示序列；更优选的，编码所述nls的核苷酸序列包括seq id no.19所示序列。7.生物材料，其特征在于，所述生物材料包括下述a)-d)中任一种：a)一种基因，所述基因编码如权利要求1或2所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体，或如权利要求3-6中任一所述融合蛋白；b)一种表达盒，所述表达盒含有a)所述基因；c)一种重组载体，所述重组载体含有a)所述基因和/或b)所述表达盒；d)一种重组细胞或重组菌，含有如权利要求1或2所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体、如权利要求3-6中任一所述融合蛋白、a)所述基因、b)所述表达盒或c)所述重组载体。
8.一种单碱基基因编辑系统，其特征在于，所述单碱基基因编辑系统包括权利要求3-6中任一所述的融合蛋白；优选的，所述单碱基基因编辑系统还包括sgrna，所述sgrna引导所述融合蛋白对目的细胞中的目的基因进行单碱基基因编辑；更优选的，所述sgrna的靶序列包括seq id no.12-14中至少一种。9.一种降低单碱基基因编辑器体积的方法，其特征在于，所述方法包括删除单碱基基因编辑器中烷基腺嘌呤dna糖基化酶的部分氨基酸序列，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列、第287-298位氨基酸序列、第2-88位氨基酸序列、第111-115位氨基酸序列、第172-177位氨基酸序列、第207-216位氨基酸序列、第226-241位氨基酸序列、第260-268位氨基酸序列和/或第284-298位氨基酸序列，所述烷基腺嘌呤dna糖基化酶氨基酸序列如seq idno.11所示；优选的，所述部分氨基酸序列包括第2-79位氨基酸序列和/或第287-298位氨基酸序列；优选的，所述单碱基基因编辑器为aybe；更优选的，所述单碱基基因编辑器为aybe v3。10.如权利要求1或2所述的烷基腺嘌呤dna糖基化酶突变体、如权利要求3-6中任一所述的融合蛋白、或如权利要求7所述的生物材料、或如权利要求8所述的单碱基基因编辑系统、或如权利要求9所述的方法在制备基因编辑产品、制备用于疾病治疗和/或预防的产品、制备动物和/或植物模型中的应用。

技术总结
本发明提供了一种烷基腺嘌呤DNA糖基化酶突变体、融合蛋白和应用，涉及生物技术领域。本发明申请人根据碱基编辑技术的工作原理，通过对融合蛋白AYBE的理性设计，截去了AYBE中对烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(MPG)核心功能没有影响的区域第2-79位氨基酸序列、第287-298位氨基酸序列以及2-79aa与287-298aa双截短氨基酸序列，开发出了体积更小的A到Y(Y＝T或C)碱基编辑器，克服了目前AYBE因体积较大难以通过腺相关病毒(AAV)包装进行体内递送的问题，使该碱基编辑器更有可能通过AAV递送进行在体递送用于基因治疗，具有更佳广阔的应用前景。具有更佳广阔的应用前景。具有更佳广阔的应用前景。


技术研发人员：张晓辉 任婧萱 李皓婕
受保护的技术使用者：权利要求书2页说明书8页序列表（电子公布）附图2页
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/9/7