一种法尼基焦磷酸合酶及其应用

1.本研究属于定点诱变领域，具体涉及一种法尼基焦磷酸合酶(spfpps)及其应用。


背景技术：

2.掷孢酵母(sporobolomycespararoseus)是一类非常规酵母，基于最新分类学，被归为担子菌门(basidiomycota)、柄锈菌亚门(pucciniomycotina)中掷孢酵母属(sporobolomyces)。菌体表面光滑湿润，形成红或粉红色的菌落并产生肾形或豆形掷孢子，也称红酵母，其掷孢能力使其在自然界分布广泛，已在水生环境、土壤、大气、植物叶片中等被分离出。掷孢酵母不仅可以消除废水系统中冗余的氮、产生挥发性有机化合物如高级醇、乙酸酯等气味活性分子，体内还可以合成麦角甾醇、辅酶q10(coenzyme q10)以及多种类胡萝卜素等异戊二烯类物质。其所有类异戊二烯化合物的骨架都是由类异戊二烯合酶(isoprenyl diphosphate synthases,ipps或ids)又称异戊烯基转移酶(pt)催化合成或修饰的。其中法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthases,fpps,ec 2.5.1.10)属于类异戊二烯合酶家族中的e家族，是类异戊二烯合成途径中一种重要的限速酶，负责催化dmapp与多个ipp以头尾偶联的方式连续缩合合成fpp，作为一些代谢物质如甾醇、辅酶q、类胡萝卜素等的前体(图1)，因此fpps作为类异戊二烯合成途径中的节点物质，其通量和酶活性决定了下游物质的代谢水平。fpps是最早被分离并获得蛋白晶体结构的ipps，相对其他ipps的了解较为清晰。目前为止，已在植物、动物、细菌、真菌等生物中克隆出fpps基因，可见fpps在物种中的分布也十分广泛，但在真菌中的研究较少，仅在酿酒酵母、红法夫酵母以及木霉中发现并成功分离，且均以单拷贝形式存在细胞质中。


技术实现要素：

3.本发明目的在于提供一种法尼基焦磷酸合酶(spfpps)及其应用(掷孢酵母spfpps基因生物学功能以及其突变体的生物体功能)。
4.为实现本发明所述目的，所提供以下技术方案予以实现:
5.一种法尼基焦磷酸合酶(spfpps)，法尼基焦磷酸合酶基因(spfpps)如seq id no:1中碱基所示。
6.一种所述的法尼基焦磷酸合酶的应用，所述法尼基焦磷酸合酶(spfpps)在合成异戊烯基焦磷酸中的应用。
7.所述法尼基焦磷酸合酶(spfpps)在以牻牛儿基焦磷酸(gpp)或二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)为底物催化合成异戊烯基焦磷酸(fpp)中的应用。
8.具体为：
9.1.反应底物标品使用甲醇：10mm氨水(v/v)＝7：3的溶液溶解，
10.2.反应体系
[0011][0012]
反应条件：28℃，2h，
[0013]
3.酶活产物去焦磷酸化：反应2h后的样品中加入0.2mol/l tris-hcl200μl(含2usap和2utipp)，30℃反应12h，冰上停止反应，
[0014]
4.加入400μl正己烷萃取3次，收集正己烷层至新管中，
[0015]
5.氮吹浓缩至100μl左右，
[0016]
6.薄层层析(tlc)检测酶活产物
[0017]
一种所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体，所述尼基焦磷酸合酶(spfpps)(seq id no:2)中90位酪氨酸(y)进行突变。
[0018]
所述的掷孢酵母中法尼基焦磷酸合酶(spfpps)(seq id no:2)中90位酪氨酸(y)突变为丙氨酸(a)或赖氨酸(k)。
[0019]
一种所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体的应用，所述突变体在催化合成类异戊二烯化合物。
[0020]
所述突变体spfpps-y90a在以牻牛儿基焦磷酸(gpp)或二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)为底物催化合成类异戊二烯化合物(fpp和ggpp)中的应用。
[0021]
具体为：
[0022]
体外酶活反应：
[0023]
1.反应底物标品使用甲醇：10mm氨水(v/v)＝7：3的溶液溶解，
[0024]
2.反应体系
[0025][0026]
反应条件：28℃，2h，
[0027]
3.酶活产物去焦磷酸化：反应2h后的样品中加入0.2mol/l tris-hcl200μl(含2usap和2utipp)，30℃反应12h，冰上停止反应，
[0028]
4.加入400μl正己烷萃取3次，收集正己烷层至新管中，
[0029]
5.氮吹浓缩至100μl左右，
[0030]
6.薄层层析(tlc)检测酶活产物
[0031]
所述突变体spfpps-y90k水解底物ggpp生成fpp中的应用。
[0032]
体外酶活反应：
[0033]
1.反应底物标品使用甲醇：10mm氨水(v/v)＝7：3的溶液溶解，
[0034]
2.反应体系
[0035][0036]
反应条件：28℃，2h，
[0037]
3.酶活产物去焦磷酸化：反应2h后的样品中加入0.2mol/l tris-hcl
[0038]
200μl(含2usap和2utipp)，30℃反应12h，冰上停止反应，
[0039]
4.加入400μl正己烷萃取3次，收集正己烷层至新管中，
[0040]
5.氮吹浓缩至100μl左右，
[0041]
6.薄层层析(tlc)检测酶活产物
[0042]
一种携带法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的菌株的应用，所述携带法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的菌株掷孢酵母在合成异戊烯基焦磷酸中的应用。
[0043]
本发明的有益效果：
[0044]
本发明中掷孢酵母sporobolomycespararoseusngr分离自草莓果实，能够高产类胡萝卜素，spfpps作为多种代谢途径中的关键酶并且参与ngr中类胡萝卜素的合成。因此，通过定向突变使其酶活性改变，不仅可以探究关键位点对酶活的影响，并且对调节掷孢酵母中类胡萝卜素的合成提供可行性，而本发明所获得的突变能够催化不同烯丙基底物与ipp缩合，产生两种底物或使底物水解实现可逆。
附图说明
[0045]
图1异戊烯基转移酶催化的延伸反应及类异戊二烯合成通路上的主要产物
[0046]
图226s rdnad1/d2区域扩增产物电泳图
[0047]
图3基于d1/d2序列26s rdna采用临接法构建系统发育树
[0048]
图4a：s.pararoseus ngr；b：s.pararoseusnbrc 0376t；c：r.glutiniscbs 1125t；d：β-胡萝卜素标准品高效液相色谱检测图
[0049]
图5二苯胺(dpa)与盐胁迫对掷孢酵母生长的影响
[0050]
图6掷孢酵母ngr中spfpps基因电泳(m：marker；1：基因组dna；2：cdna)
[0051]
图7掷孢酵母ngr spfpps的cdna和基因组dna的序列比对图8来自七个物种的fpps蛋白序列比对
[0052]
图9掷孢酵母ngr spfpps蛋白质三级结构模型
[0053]
图10基于不同物种的fpps氨基酸序列采用邻接法构建系统发育树
[0054]
图11sds-page分析重组蛋白pet32a-spfpps(m：marker；1：携带质粒pet32a的bl21菌株破碎后的上清；2：携带质粒pet32a-spfpps的bl21菌株破碎后的上清；3：携带质粒pet32a的bl21菌株破碎后的沉淀；4：携带质粒pet32a-spfpps的bl21菌株破碎后的沉淀)
[0055]
图12重组蛋白pet32a-spfpps的纯化(m：marker；ft：样品流出液；1-5：washing buffer依次洗脱；6-10：elution buffer依次洗脱)
[0056]
图13spfpps体外酶活产物tlc分析(s：goh和foh标准品混合液；1和3：分别以dmapp和gpp作为烯丙基底物的不含spfpps蛋白的酶活反应体系；2和4：分别以dmapp和gpp作为烯
丙基底物的含spfpps蛋白的酶活反应体系)
[0057]
图14蛋白spfpps-y90a与spfpps的序列比对
[0058]
图15蛋白spfpps-y90k与spfpps的序列比对
[0059]
图16基因spfpps-y90a与spfpps的序列比对
[0060]
图17基因spfpps-y90k与spfpps的序列比对
[0061]
图18sds-page分析蛋白pet32a、pet32a-spfpps、spfpps-y90a、spfpps-y90k(m：marker；1-4：携带质粒pet32a、pet32a-spfpps、spfpps-y90a和spfpps-y90k的bl21菌株破碎后的上清；5-8：携带质粒pet32a、pet32a-spfpps、spfpps-y90a和spfpps-y90k的bl21菌株破碎后的沉淀)
[0062]
图19蛋白spfpps-y90a与spfpps-y90k的纯化(m：marker；1-5：蛋白spfpps-y90a使用elution buffer依次洗脱；6-10：spfpps-y90k使用elution buffer依次洗脱)
[0063]
图20spfpps及突变蛋白体外酶活产物tlc分析(a、b、c和d：烯丙基二磷酸底物为dmapp、gpp、fpp和ggpp，s：goh、foh和ggoh标准品混合液)
[0064]
图21蛋白farm以及上游第4，第5位残基的可视化(a、b和c：蛋白分别为spfpps,spfpps-y90a,spfpps-y90k)
具体实施方式
[0065]
以下结合实施例来进一步解释本研究，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
[0066]
本试验从掷孢酵母转录组测序数据库中，筛选出法尼基焦磷酸合酶候选基因序列，成功克隆鉴定其酶活，并探究了其蛋白序列关键氨基酸位点对酶活功能的影响。因此，对spfpps定向突变使其具有能够满足人类生活或生产需要的蛋白功能，为fpps相关研究提供参考。
[0067]
实施例1
[0068]
掷孢酵母的获得
[0069]
1.菌株的分离：
[0070]
分离于沈阳农业大学草莓园中的草莓果实表皮。将采集的新鲜草莓果实样品放入盛有90ml无菌水并带有少量小玻璃珠的摇瓶中，放置在180r/min的摇床上振荡培养30min，使草莓样品均匀地分散在稀释液中制成10-1
稀释液。吸取1ml 10-1
稀释液于装有9ml无菌水的玻璃试管中，振荡混匀制成10-2
稀释液。依次类推，连续稀释，直至稀释到10-6
。本研究选取10-3
、10-4
、10-5
三个稀释梯度的稀释液，分别吸取0.1ml稀释液在分离用pda培养基上均匀涂布，直至固体培养基表面变干，每个稀释度设置3次重复。将平板置于30℃恒温培养箱中培养5-7d。待平板上微生物菌落长出后，通过观察菌落的形态特征，挑取少许长势良好且表面湿润、边缘整齐的红色真菌的单菌落，划线转接于分离用ypd培养基中，28℃培3-5d。依此方法连续划线纯化培养3次以上，镜检其纯度，直至获得纯培养，划线于试管斜面，并置于4℃冰箱中保藏备用。最终，我们从草莓果实中分离到1株可以弹射掷孢子的红酵母，命名为ngr，具有菌落大而厚、表面湿润、有光泽等特征。初步鉴定为红酵母，于4℃冰箱中保存。
[0071]
2.菌株的鉴定：
[0072]
2.1形态学鉴定：
[0073]
在ypd平板上s.pararoseus ngr形成光滑湿润、边缘整齐的经典酵母菌菌落，菌落颜色偏黄红。在pda培养基上，菌落特征基本同ypd。
[0074]
2.2序列同源性分析：
[0075]
1.总dna的提取
[0076]
挑取实施例1的2.1中单菌落接入50ml液体pda培养基中，28℃，180rpm培养24h至a
560
为1.0作为种子液，将种子液按1：100(v/v)接种100ml液体培养基，28℃，180rpm培养18-24h至a560为2.0，菌体浓度约为107cell/ml。室温4000rpm 5min离心收集菌体，1ml无菌蒸馏水离心洗涤菌体2次，转移到1.5ml已灭菌离心管中，12000rpm离心1min，弃上清。加入100μl裂解液(100mm tris，30mm edta，0.5％sds，ph8.0 121℃灭菌30min备用)。100℃水浴15min，加入100μl 2.5m醋酸钾后，置于冰上30min。加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)剧烈震荡，12000rpm离心10min，吸取上清到新管，重复这一步骤，直到两相之间没有沉淀，将上清液移至另一1.5ml离心管中。加入等体积的预冷的异丙醇，于-20℃静置15min，12000rpm离心10min。加入2倍的体积预冷的乙醇静置20min沉淀dna，70％乙醇过夜脱盐。95％乙醇脱水1-2min，待室温干燥，加入100μl无菌水，-20℃保存备用。
[0077]
2.pcr扩增目的片段
[0078]
以ngr基因组dna为模板，进行pcr扩增。26s rdna d1/d2区引物nl1、nl4序列如下：
[0079]
nl1为gcatatcaataagcggaggaaaag
[0080]
nl4为ggtccgtgtttcaagacgg
[0081]
表1pcr反应体系
[0082][0083]
pcr反应程序：
[0084]
表2pcr反应程序
[0085][0086]
3.pcr电泳检测：
[0087]
称取0.3g琼脂糖粉末，加入30ml 1
×
tae缓冲液中，加热至琼脂糖完全溶解后加入1.5μl dna染色液gelred，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有1
×
tae缓冲液的电泳槽中，
缓冲液应没过胶面，吸取2μl与loading buffer混匀的pcr产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入dna分子量标准(dnamarker)，接通电源在5v/cm条件下电泳30min，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于紫外透射仪上成像，根据dna分子量标准(dna marker)判断扩增条带的浓度及大小。得到约600bp单一条带(如图2)，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0088]
掷孢酵母ngr26s rdna序列(5
’‑3’
)：
[0089]
taagcggaggaaaagaaactaacaaggattcccctagtagcggcgag
[0090]
cgaagcgggaaaagctcaaatttgtaatctggcgtcttcgacgtccg
[0091]
agttgtaatctcgagaagtgttttccgtgatagaccgcatacaagtct
[0092]
cttggaacagagcgtcatagtggtgagaacccagtacacgatgcgga
[0093]
tgcctattactttgtgatacactttcgaagagtcgagttgtttgggaat
[0094]
gcagctcaaattgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcga
[0095]
gagaccgatagcgaacaagtaccgtgagggaaagatgaaaagcact
[0096]
ttggaaagagagttaacagtacgtgaaattgttggaagggaaacaca
[0097]
tgcagtgatacttgctattcggggcaactcgattggcaggcccgcatc
[0098]
agtttttcggggcggaaaatcgtagagagaaggtagcagtttcggct
[0099]
gtgttatagctctttactggattcgccctgggggactgaggaacgcag
[0100]
cgtgcttttagcatgagcttcggcttatccacgcttaggatgcgggtttatggctgtatatgacccgtcttgaaacacg*
[0101]
4.序列比对及系统发育树构建
[0102]
将经电泳检测的26s rdna pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，通过在ncbi比对发现，该序列与掷孢酵母菌属(sporobolomyces sp.)的26s rdna序列的同源性最高，系统发育树结果显示(如图3)，sporidioboluspararoseusstrain在同一分支上，亲缘关系较近，因此可以推断ngr为掷孢酵母，命名为sporobolomycespararoseus ngr。
[0103]
2.3生理生化特征鉴定：
[0104]
1.ngr类胡萝卜素组分含量测定
[0105]
活化的菌株接种到ypd液体培养基中，25℃150rpm培养72h，3000rpm离心5min收集菌体，冷冻干燥，称重。采用改进的二甲基亚砜法
[1]
提取色素，将二甲基亚砜预热50-60℃，全程避光操作。称取0.2g菌粉，在通风橱中加入2ml二甲基亚砜对菌体进行破壁处理，65℃水浴30min，期间多次震荡充分裂解菌体。加入三倍二甲基亚砜体积的丙酮(6ml)，65℃水浴20min，期间适当振荡，12,000rpm离心3min，观察丙酮浸提之后的菌体颜色，若菌体还有颜色，则重复加入丙酮、65℃水浴至菌体变白。将离心后的上清收集到新离心管中，加入等体积正己烷萃取三次，每次室温静置20min左右(萃取时可以在离心管中加入1ml无菌水，使萃取更完全)。收集正己烷层至新离心管。
[0106]
通过高效液相色谱(hplc)法对色素各组分及含量进行分析。色素进样前需用0.22μm的微孔滤膜去除杂质。流动相：a：90％乙腈；b：100％乙酸乙酯，梯度洗脱：0-5min，b浓度从0升至50％；5.01min，b浓度升至53％；5.01-10min，b浓度53％；10-15.01min，b浓度升至54％；15.01-20min，b浓度升至55％；20.01min，b浓度升至56％；20.01-30min，b浓度升至
57％；30-35min，b浓度降为0；流速：1ml/min；进样量20为μl；检测波长为450nm。
[0107]
从hplc色谱图上看，掷孢酵母ngr主要色素(1、2、3)与s.paraposeus nbrc 0376
t
和r.glutinis cbs 1125
t
各组分出峰时的保留时间相近，在27min内主要出现了3个吸收峰(如图4)。可确认掷孢酵母ngr所积累的三种主要色素分别为β-胡萝卜素、圆酵母素和红酵母红素。
[0108]
2.耐盐性测定
[0109]
制备含0m(对照)、0.75m和1.5mnacl的ypd固体平板。将活化好的ngr取单菌落划线法接种在ypd平板，25℃培养7d测定耐盐性范围。二苯胺(dpa)被广泛用于抑制细菌、真菌等的类胡萝卜素的生物合成，浓度适宜时能够使得色素的合成受到抑制，菌体颜色变浅且不影响生物的生长速度。通过二苯胺来阻断野生型ngr菌株类胡萝卜素的生物合成，验证色素的缺失对ngr菌株在nacl胁迫下生长的影响。结果表明(如图5)，非盐胁迫处理条件下，正常培养的与添加了二苯胺的掷孢酵母ngr生长状态基本一致。然而，在nacl胁迫条件下，添加了二苯胺的掷孢酵母ngr生长状态显著低于非添加二苯胺组，并随着盐胁迫浓度增大抑制作用更显著。
[0110]
综上，掷孢酵母sporobolomycespararoseusngr是一株耐盐并能够高产类胡萝卜素的红酵母，详见
[2,3]
，其全基因序列可参见genbank号：gca_010758995.1。
[0111]
实施例2掷孢酵母中法尼基焦磷酸合酶基因(spfpps)的克隆
[0112]
1.掷孢酵母的培养与收集
[0113]
平板划线活化掷孢酵母ngr，挑取单菌落接种至100ml ypd液体培养基，28℃180r/min培养至对数期，以1：100(v/v)接种到新100ml ypd液体培养基中，28℃180r/min培养，收集。
[0114]
2.掷孢酵母基因组dna的提取
[0115]
利用yeast genomic dna extraction kit酵母基因组dna提取试剂盒。
[0116]
3.掷孢酵母总rna的提取及cdna的合成
[0117]
提取掷孢酵母中的总rna，并经过dnase i的处理去除rna中含有的dna，再以去除了rna酶的rna为模板，逆转录合成cdna。
[0118]
4.spfpps的pcr扩增
[0119]
从ngr转录组测序中获得法尼基焦磷酸合酶候选基因序列comp9430，命名为spfpps，设计特异引物，以ngr基因组dna和cdna为模板，
[0120]
spfpps-f、spfpps-r为引物进行pcr扩增。
[0121]
spfpps-f为cgggatccatgtcttcgaacgagaaacgg
[0122]
spfpps-r为cgagctcctacttttgtctcttgtaaactttcg
[0123]
pcr反应体系：
[0124]
表3pcr反应体系
[0125][0126]
pcr反应程序：
[0127]
表4pcr反应程序
[0128][0129]
5.pcr产物的电泳检测
[0130]
称取0.3g琼脂糖粉末，加入30ml 1
×
tae缓冲液中，加热至琼脂糖完全溶解后加入1.5μl dna染色液gelred，混合均匀，趁热倒入制胶槽中，并插上梳板，室温静置20min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，将制备好的琼脂糖凝胶放入盛有1
×
tae缓冲液的电泳槽中，缓冲液应没过胶面，吸取2μl与loading buffer混匀的pcr产物加入琼脂糖凝胶的点样孔，在其中一个点样孔中加入dna分子量标准(dna marker)，接通电源在5v/cm条件下电泳30min，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于紫外透射仪上成像，根据dna分子量标准(dna marker)判断扩增条带的浓度及大小。如图6所示，分别在1000bp处和近2000bp处出现与预期一致的特异性条带，将经电泳检测的pcr产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，结果如图7，说明spfpps基因组dna以及cdna扩增成功。
[0131]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶基因spfpps基因组dna序列(5
’‑3’
)：atgtcttcgaacgagaaacgggagcgattcttgtctgtatggccttcactctccgacgagctagtagattacgcaaagggtgagaagatgcccaaggatgccgtagaatggttcaaacgcgtaagaatcgccctttccctcccttgaccaggttgatcgctcctcgttcaactcgactttgttgatctggctgacaacctctcccgctggcacagaacctggaccacaacactcctggaggtacaccagactcgtccgtatcaattgagagaacttatatgctcatcttttcgtgtgttctcacaggaaaactcaaccggggaatttcggttgtcgataccgtagagatcatcaagggttccaagctgactgaagaagagtacagaaaagctgctatccttggatggtgcatcgagcttgtgagtaccagacctgcgctgtacaaaatttcaaaaatctgggagaatttattgttgaccatgatcgtcttccttagctacaagcttacttcctcgtagctgacgacatgatggatcaaagtgttacccgacgtggacaaccttgttggtaccgagtagtgagttccacctatcgtaaaatcccgatttaaagggcggagctgactgccgactctgttcgttcacgtcttcaggagagtgtcggtaacatcgctatcaacgactctttcatgcttgaagctgccatctactacctcctcaagaagcacttccgtcaagagaaatactacgtcgatttgatggaactcttccacgaagtaagctgcgctcttgcttctgtaggtggaaaagcaccaagctgcccgatcttactctctgtagactaccttccaaaccgaactcggtcaactcatcgatctcatcaccgctccagaagattccgtcgatctcagcaaattctctctcgaaaagtaacacctctcccaagtcgcctcgttttcaaatcgcttactaatgttggtcgtctttctctagacacca
cctcattgt cgtctacaagactgcttactactctttctacctccccgtcgctctcgcactccacatgtcgggagtcacttccccttctgccttccaaaagtctctcgacattctgattcccatgggagagtacttccaagtacaagacgactacctcgattgctatggaactcctgaacaaattggaaagattggtaccgatattttggacaacaagtgcagttggttgatcaacgttgcactacaaaaagcttcgactgatcaacgtaaagttctagatgtgagctacatccgcaatctaccttcttcccaaagttttgcagcaccgaactcattgtattggaaacgacaggaaaactatggagtgaaaaactctgaatcggaagctaaaatcaaggcagtttacaaagaactcgaactagctcgtcaattcgaagagtacgaagcatcgtcttacgaacaattgaacaagcttatcaacgagattcccgaaggaggttcagaagatggtttgaagagggagattttccaaagctttttagcgaaagtttacaagagacaaaagtag*
[0132]
seq id no:1
[0133]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶spfpps cdna序列(5
’‑3’
)：atgtcttcgaacgagaaacgggagcgattcttgtctgtatggccttcactctccgacgagctagtagattacgcaaagggtgagaagatgcccaaggatgccgtagaatggttcaaacgcaacctggaccacaacactcctggaggaaaactcaaccggggaatttcggttgtcgataccgtagagatcatcaagggttccaagctgactgaagaagagtacagaaaagctgctatccttggatggtgcatcgagcttctacaagcttacttcctcgtagctgacgacatgatggatcaaagtgttacccgacgtggacaaccttgttggtaccgagtagagagtgtcggtaacatcgctatcaacgactctttcatgcttgaagctgccatctactacctcctcaagaagcacttccgtcaagagaaatactacgtcgatttgatggaactcttccacgaaactaccttccaaaccgaactcggtcaactcatcgatctcatcaccgctccagaagattccgtcgatctcagcaaattctctctcgaaaaacaccacctcattgtcgtctacaagactgcttactactctttctacctccccgtcgctctcgcactccacatgtcgggagtcacttccccttctgccttccaaaagtctctcgacattctgattcccatgggagagtacttccaagtacaagacgactacctcgattgctatggaactcctgaacaaattggaaagattggtaccgatattttggacaacaagtgcagttggttgatcaacgttgcactacaaaaagcttcgactgatcaacgtaaagttctagatgaaaactatggagtgaaaaactctgaatcggaagctaaaatcaaggcagtttacaaagaactcgaactagctcgtcaattcgaagagtacgaagcatcgtcttacgaacaattgaacaagcttatcaacgagattcccgaaggaggttcagaagatggtttgaagagggagattttccaaagctttttagcgaaagtttacaagagacaaaagtag*
[0134]
6.序列比对以及构建系统发育树
[0135]
将spfpps蛋白序列与其他7个物种中fpps进行比对，显示出五个高度保守的区域，其中共两个区域是富含天冬氨酸的基序farm和sarm(如图8中红框标记)同时也是发生酶活反应的场所。spfpps蛋白的链长决定区(chain length determination，cld)结构是yflvaddmmd(图8中黄框标记)，farm上游第4和第5位在蛋白序列中位于第91和第90位，分别是芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸。对spfpps蛋白三级结构进行可视化(图9)，获知其中第90位氨基酸可能作为改变酶活性的关键位点。
[0136]
采用邻接法构建系统发育树，分析spfpps和其他物种fpps之间的进化关系。我们从图10中可以看出，spfpps与圆红酵母(rhodotorula toruloides)中fpps均属于i型fpps，同源性最高，为84.86％。
[0137]
seq id no:2
[0138]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶spfpps氨基酸序列：
[0139]
mssnekrerflsvwpslsdelvdyakgekmpkdavewfkrnldhntpggklnrgisvvdtveiikgsklteeeyrkaailgwciellqayflvaddmmdqsvtrrgqpcwyrvesvgniaindsfmleaaiyyllkkhfrqekyyvdlmelfhettfqtelgqlidlitapedsvdlskfslekhhlivvyktayysfylpvalalhmsgvtspsafqks
ldilipmgeyfqvqddyldcygtpeqigkigtdildnkcswlinvalqkastdqrkvldenygvknseseakikavykelelarqfeeyeassyeqlnklineipeggsedglkreifqsflakvykrqk*
[0140]
实施例3spfpps的功能验证
[0141]
1.构建原核表达体系
[0142]
将克隆得到的目的基因spfpps与表达载体pet32a(+)进行酶切，选择的酶切位点为bamhi与saci，连接，构建重组质粒pet32a-spfpps。
[0143]
2.重组蛋白的表达与纯化
[0144]
将重组质粒pet32a-spfpps转化大肠杆菌bl21(de3)中，加入1mm iptg，28℃条件下诱导，蛋白电泳观察表达情况，蛋白在上清中大量表达，大小约为60kda(如图11)。对成功表达的重组蛋白pet32a-spfpps进行纯化及蛋白电泳分析(图12)，对纯化后蛋白进行浓缩。
[0145]
3.体外酶活验证
[0146]
反应底物标品使用甲醇：10mm氨水(v/v)＝7：3的溶液溶解，
[0147]
配置酶活反应体系
[0148]
表5酶活反应体系
[0149][0150]
反应条件：28℃反应2h。
[0151]
s:foh和goh标准品混合液
[0152]
1：dmapp+ipp
→
无烯丙基产物斑点出现
[0153]
2：
[0154]
3：gpp+ipp
→
gpp
[0155]
4：
[0156]
对酶活产物进行去焦磷酸化处理后萃取，随后进行薄层层析，检测酶活反应产物。将浓缩后的spfpps蛋白加入底物中进行体外酶活反应，待反应结束后进行去焦磷酸化生成对应的醇，通过薄层层析(tlc)观察并分析产物分布及性质(图13)。
[0157]
4.酶活产物去焦磷酸化：反应2h后的样品中加入0.2mol/l tris-hcl 200μl(含2usap和2utipp)，30℃反应12h，冰上停止反应。
[0158]
5.加入400μl正己烷萃取3次，收集正己烷层至新管中。
[0159]
6.氮吹浓缩至100μl左右。
[0160]
7.薄层层析(tlc)检测酶活产物
[0161]
spfpps能够利用dmapp、gpp为底物合成唯一产物c15的fpp，不合成其他链长的产物。
[0162]
实施例4编码突变蛋白基因的克隆
[0163]
1.对上述掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶spfpps蛋白质fpps三维结构进行分析，选择蛋白序列中第90氨基酸苯丙氨酸(y)作为突变位点，通过重叠延伸pcr
[4,5]
的方式，将其分别替换为丙氨酸a、赖氨酸k(如图14、15)。
[0164]
2.对替换后的序列进行克隆，测序。
[0165]
seq id no:3
[0166]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶定点突变spfpps-y90a氨基酸序列：
[0167]
mssnekrerflsvwpslsdelvdyakgekmpkdavewfkrnldhntpggklnrgisvvdtveiikgsklteeeyrkaailgwciellqaaflvaddmmdqsvtrrgqpcwyrvesvgniaindsfmleaaiyyllkkhfrqekyyvdlmelfhettfqtelgqlidlitapedsvdlskfslekhhlivvyktayysfylpvalalhmsgvtspsafqksldilipmgeyfqvqddyldcygtpeqigkigtdildnkcswlinvalqkastdqrkvldenygvknseseakikavykelelarqfeeyeassyeqlnklineipeggsedglkreifqsflakvykrqk*
[0168]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶定点突变spfpps-y90k氨基酸序列：
[0169]
seq id no:4
[0170]
mssnekrerflsvwpslsdelvdyakgekmpkdavewfkrnldhntpggklnrgisvvdtveiikgsklteeeyrkaailgwciellqakflvaddmmdqsvtrrgqpcwyrvesvgniaindsfmleaaiyyllkkhfrqekyyvdlmelfhettfqtelgqlidlitapedsvdlskfslekhhlivvyktayysfylpvalalhmsgvtspsafqksldilipmgeyfqvqddyldcygtpeqigkigtdildnkcswlinvalqkastdqrkvldenygvknseseakikavykelelarqfeeyeassyeqlnklineipeggsedglkreifqsflakvykrqk*
[0171]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶定点突变spfpps-y90a cdna序列(5
’‑3’
)：
[0172]
atgtcttcgaacgagaaacgggagcgattcttgtctgtatggccttca
[0173]
ctctccgacgagctagtagattacgcaaagggtgagaagatgcccaa
[0174]
ggatgccgtagaatggttcaaacgcaacctggaccacaacactcctg
[0175]
gaggaaaactcaaccggggaatttcggttgtcgataccgtagagatc
[0176]
atcaagggttccaagctgactgaagaagagtacagaaaagctgctat
[0177]
ccttggatggtgcatcgagcttctacaagctgccttcctcgtagctga
[0178]
cgacatgatggatcaaagtgttacccgacgtggacaaccttgttggta
[0179]
ccgagtagagagtgtcggtaacatcgctatcaacgactctttcatgct
[0180]
tgaagctgccatctactacctcctcaagaagcacttccgtcaagaga
[0181]
aatactacgtcgatttgatggaactcttccacgaaactaccttccaaa
[0182]
ccgaactcggtcaactcatcgatctcatcaccgctccagaagattccg
[0183]
tcgatctcagcaaattctctctcgaaaaacaccacctcattgtcgtct
[0184]
acaagactgcttactactctttctacctccccgtcgctctcgcactcc
[0185]
acatgtcgggagtcacttccccttctgccttccaaaagtctctcgaca
[0186]
ttctgattcccatgggagagtacttccaagtacaagacgactacctcg
[0187]
attgctatggaactcctgaacaaattggaaagattggtaccgatatttt
[0188]
ggacaacaagtgcagttggttgatcaacgttgcactacaaaaagctt
[0189]
cgactgatcaacgtaaagttctagatgaaaactatggagtgaaaaac
[0190]
tctgaatcggaagctaaaatcaaggcagtttacaaagaactcgaact
[0191]
agctcgtcaattcgaagagtacgaagcatcgtcttacgaacaattgaa
[0192]
caagcttatcaacgagattcccgaaggaggttcagaagatggtttga
[0193]
agagggagattttccaaagctttttagcgaaagtttacaagagacaaaagtag*
[0194]
掷孢酵母ngr法尼基焦磷酸合酶定点突变spfpps-y90k cdna序列(5
’‑3’
)：
[0195]
atgtcttcgaacgagaaacgggagcgattcttgtctgtatggccttca
[0196]
ctctccgacgagctagtagattacgcaaagggtgagaagatgcccaa
[0197]
ggatgccgtagaatggttcaaacgcaacctggaccacaacactcctg
[0198]
gaggaaaactcaaccggggaatttcggttgtcgataccgtagagatc
[0199]
atcaagggttccaagctgactgaagaagagtacagaaaagctgctat
[0200]
ccttggatggtgcatcgagcttctacaagctaaattcctcgtagctga
[0201]
cgacatgatggatcaaagtgttacccgacgtggacaaccttgttggta
[0202]
ccgagtagagagtgtcggtaacatcgctatcaacgactctttcatgct
[0203]
tgaagctgccatctactacctcctcaagaagcacttccgtcaagaga
[0204]
aatactacgtcgatttgatggaactcttccacgaaactaccttccaaa
[0205]
ccgaactcggtcaactcatcgatctcatcaccgctccagaagattccg
[0206]
tcgatctcagcaaattctctctcgaaaaacaccacctcattgtcgtct
[0207]
acaagactgcttactactctttctacctccccgtcgctctcgcactcc
[0208]
acatgtcgggagtcacttccccttctgccttccaaaagtctctcgaca
[0209]
ttctgattcccatgggagagtacttccaagtacaagacgactacctcg
[0210]
attgctatggaactcctgaacaaattggaaagattggtaccgatatttt
[0211]
ggacaacaagtgcagttggttgatcaacgttgcactacaaaaagctt
[0212]
cgactgatcaacgtaaagttctagatgaaaactatggagtgaaaaac
[0213]
tctgaatcggaagctaaaatcaaggcagtttacaaagaactcgaactagctcgtcaattcgaagagtacgaagcatcgtcttacgaacaattgaacaagcttatcaacgagattcccgaaggaggttcagaagatggtttgaagagggagattttccaaagctttttagcgaaagtttacaagagacaaaagtag*
[0214]
实施例5突变蛋白功能验证
[0215]
1.构建原核表达载体
[0216]
按照上述实施例3中记载构建重组质粒pet32a-spfpps-y90a，pet32a-spfpps-y90k，分别转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆进行扩大培养，保藏菌种，提取质粒，送公司测序验证目的序列无突变，测序结果如图16、17。
[0217]
2.定点突变重组蛋白的表达与纯化
[0218]
将重组质粒pet32a-spfpps-y90a，pet32a-spfpps-y90k分别转化大肠杆菌bl21(de3)中，28℃低温培养诱导，蛋白电泳观察表达情况(图18)，对表达的重组蛋白进行纯化及蛋白电泳分析(图19)，对纯化的蛋白进行浓缩。
[0219]
4.spfpps-y90a与spfpps-y90k体外酶活验证
[0220]
反应底物标品使用甲醇：10mm氨水＝7：3(v/v)的溶液溶解，
[0221]
配置酶活反应体系
[0222]
表6酶活反应体系
[0223]
[0224]
反应条件：28℃反应2h。
[0225]
s：goh、foh和ggoh作为标准品混合液
[0226]
以dmapp为底物
[0227]
含spfpps蛋白的酶活反应：dmapp+ipp
→
fpp
[0228]
含spfpps-y90a蛋白的酶活反应：dmapp+ipp
→
fpp+ggpp
[0229]
含spfpps-y90k蛋白的酶活反应：dmapp+ipp
→
fpp
[0230]
以gpp为底物
[0231]
含spfpps蛋白的酶活反应：gpp+ipp
→
fpp
[0232]
含spfpps-y90a蛋白的酶活反应：gpp+ipp
→
fpp+ggpp
[0233]
含spfpps-y90k蛋白的酶活反应：gpp+ipp
→
fpp
[0234]
以fpp为底物
[0235]
含spfpps蛋白的酶活反应：fpp+ipp
→
fpp
[0236]
含spfpps-y90a蛋白的酶活反应：fpp+ipp
→
ggpp
[0237]
含spfpps-y90k蛋白的酶活反应：fpp+ipp
→
fpp
[0238]
以ggpp为底物
[0239]
含spfpps蛋白的酶活反应：ggpp+ipp
→
ggpp
[0240]
含spfpps-y90a蛋白的酶活反应：ggpp+ipp
→
ggpp
[0241]
含spfpps-y90k蛋白的酶活反应：ggpp+ipp
→
fpp
[0242]
对酶活产物进行去焦磷酸化处理后萃取，随后进行薄层层析，检测酶活反应产物。
[0243]
得到的spfpps与突变蛋白体外酶活结果如图20所示，产物分布主要是c15的fpp和c20的ggpp。对于spfpps，以dmapp、gpp、fpp为底物，产物分布均表现为c15的fpp，以c20的ggpp为底物未反应，说明spfpps具有法尼基焦磷酸合酶的催化活性，且具有产物特异性，不生成其他链长的产物；spfpps-y90a的酶活结果表现为，当以c5的dmapp和c10的gpp为底物时，产物为c15的fpp，以c15的fpp和c20的ggpp为底物时，产物为c20的ggpp，说明spfpps-y90a具有合成c15的fpp和c20的ggpp的功能；spfpps-y90k的体外酶活结果表明，分别以c5的dmapp、c10的gpp、c15的fpp、c20的ggpp任一为底物，产物均表现为c15的fpp，这一现象可能表明spfpps-y90k蛋白可以对底物c20的ggpp进行水解。
[0244]
以上结果说明spfpps蛋白farm上游第5位氨基酸的替换会使酶活发生改变，从薄层层析(tlc)上产物分布来看，spfpps-y90a具有同时合成fpp和ggpp的fpps/ggpps双功能活性，spfpps-y90k具有可以水解ggpp，以dmapp或gpp为底物与ipp缩合生成fpp的功能。
[0245]
综上所述，i型fpps可以利用dmapp或gpp作为底物与ipp缩合生成fpp，在spfpps的蛋白质三级结构预测中显示，第90位(farm上游第5位)的氨基酸为具有大体积侧链的酪氨酸，位于fpp尾部，猜测该位置的氨基酸残基为阻碍产物链延伸的关键位点，于是将spfpps蛋白序列中的第90位y替换为小体积的a和较小体积的k(如图21)。我们的结果进一步验证了farm区域上游第5位为改变酶活性的关键位点这一假设，并且不同氨基酸残基在改变酶催化活性以及酶与底物结合情况中具有重要作用，为探索蛋白序列中影响催化活性的残基以及蛋白产物链长延伸的关键位点提供参考。
[0246]
[1]李春季.掷孢酵母类胡萝卜素合成关键酶基因的克隆表达与功能分析[d].沈阳农业大学,2016.
[0247]
[2]li c,zhang n,li b,et al.increased torulene accumulation in red yeast sporidioboluspararoseus ngr as stress response to high salt conditions[j].food chemistry.2017,237:1041-1047.
[0248]
[3]li c,li b,zhang n,et al.salt stress increases carotenoid production of sporidioboluspararoseus ngr via torulene biosynthetic pathway[j].the journal of general and applied microbiology.2019,65(3):111-120。

技术特征：
1.一种法尼基焦磷酸合酶(spfpps)，其特征在于：法尼基焦磷酸合酶基因(spfpps)如seq id no:1中碱基所示。2.一种权利要求1所述的法尼基焦磷酸合酶的应用，其特征在于：所述法尼基焦磷酸合酶(spfpps)在合成异戊烯基焦磷酸中的应用。3.按权利要求2中法尼基焦磷酸合酶的应用，其特征在于：所述法尼基焦磷酸合酶(spfpps)在以牻牛儿基焦磷酸(gpp)或二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)为底物催化合成异戊烯基焦磷酸(fpp)中的应用。4.一种权利要求1所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体，其特征在于：所述法尼基焦磷酸合酶(spfpps)(seq id no:2)中90位酪氨酸(y)进行突变。5.按权利要求4所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体，其特征在于：所述法尼基焦磷酸合酶(spfpps)(seq id no:2)中90位酪氨酸(y)突变为丙氨酸(a)或赖氨酸(k)。6.一种权利要求5所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体的应用，其特征在于：所述突变体在催化合成类异戊二烯化合物。7.按权利要求6所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体的应用，其特征在于：所述突变体spfpps-y90a在以牻牛儿基焦磷酸(gpp)或二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)为底物催化合成类异戊二烯化合物(fpp和ggpp)中的应用。8.按权利要求6所述的法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的突变体的应用，其特征在于：所述突变体spfpps-y90k水解底物ggpp生成fpp中的应用。9.一种携带法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的菌株的应用，其特征在于：所述携带法尼基焦磷酸合酶(spfpps)的菌株掷孢酵母在合成异戊烯基焦磷酸中的应用。

技术总结
本研究属于定点诱变领域，具体涉及一种法尼基焦磷酸合酶(SpFPPS)及其应用。法尼基焦磷酸合酶基因(SpFPPS)如SEQ ID NO:1中碱基所示。SpFPPS作为多种代谢途径中的关键酶并且参与NGR中类胡萝卜素的合成。因此，通过定向突变使其酶活性改变，不仅可以探究酶活反应机理，并且对调节掷孢酵母中类胡萝卜素的合成提供可行性。可行性。


技术研发人员：李炳学 王云娇 张宁 曾楠 王丹丹 陈斌
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：2023.06.29
技术公布日：2023/9/7