一种黄药子及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法与流程

1.本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种黄药子及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法。


背景技术：

2.黄药子为薯蓣科植物黄独dioscorea bμlbifera l.的干燥块茎。黄药子具有散结消瘿，清热解毒，凉血止血的功效。用于瘿瘤痰核，症瘕痞块，疮疡肿毒，咽喉肿痛，吐血，衄血，咯血，毒蛇咬伤。现代药理学研究表明，黄药子具有抗菌、止痛、抗炎、抗癌、对血液系统、对心脏及平滑肌作用等多种药理作用。黄药子的主要化学成分为二萜内酯类化合物、黄酮类化合物等多种化合物。黄药子暂时未被《中国药典》收载，研究参考较为局限。
3.黄药子制剂常见的类型有汤剂、粉末剂、配方颗粒等，例如标准汤剂冻干粉是由黄药子饮片经过提取、浓缩、干燥等步骤得到。然而由于中药标准汤剂冻干粉已经不具备药材性状鉴别的特征，现有鉴别黄药子的方法不适于标准汤剂冻干粉等由黄药子水提取物制得的制剂的质量检测，特征峰少，分离效果差。采用高效液相色谱法对黄药子标准汤剂冻干粉及其制剂进行特征图谱的定性检测目前还是一个空白，如何提高黄药子水提取及其制剂的检测标准，全面地控制成品质量是本发明需要解决的技术问题。


技术实现要素：

4.因此，本发明的目的在于提供一种黄药子及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法，该方法根据黄药子及其制剂的特点，建立该品种的特征图谱，实现各特征峰的有效分离，为全面建立黄药子及其制剂的质量控制标准提供科学依据。
5.为此，本发明提供了一种黄药子及其制剂特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
6.(1)供试品溶液的制备；
7.(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0
→
50min
→
70min
→
80min，流动相中乙腈的体积百分数为：5％
→
15％
→
30-35％
→
95％。
8.进一步地，步骤(2)中，检测波长为200-220nm；和/或，柱温为20-30℃；和/或，流速为0.8-1.2ml/min；和/或，梯度洗脱程序还包括：80
→
90min，流动相中乙腈的体积百分数为：95％
→
95％。
9.进一步地，梯度洗脱程序还包括：80
→
90min
→
91min
→
100min，流动相中乙腈的体积百分数为：95％
→
95％
→
5％
→
5％。
10.进一步地，步骤(1)包括如下步骤：
11.1)取供试品加入提取溶剂提取，得到提取液；
12.2)将提取液进行固液分离，取液体，干燥；
13.3)采用溶剂溶解干燥后的固体，即得供试品溶液；优选的，步骤(1)满足如下a-e中
的任意一项或者多项：
14.a、步骤1)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.1-0.4:15-60；质量与体积的配比关系为g/ml；
15.b、所述提取溶剂包含水、甲醇、乙醇中的至少一种，优选为甲醇；
16.c、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-60min；
17.d、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤；
18.e、步骤3)中，所述溶剂为甲醇或者乙醇。
19.进一步地，所述黄药子及其制剂选自黄药子药材、黄药子饮片、黄药子水提取物或者黄药子制剂。
20.可选的，所述药物制剂为粉剂(例如标准汤剂冻干粉)、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
21.可选的，所述黄药子的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
22.取黄药子，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；所述辅料为药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：peg6000、peg4000、虫蜡等。
23.可选的，所述黄药子的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
24.取黄药子，加热回流提取1～5次，每次加入8～25重量倍量的水提取10min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至70℃相对密度为1.00～1.10/ml，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；
25.更可选的，取黄药子，加热回流提取2次，第1次加入10重量倍量的水提取30min，第2次加入8重量倍量的水提取20min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.00～1.10g/ml，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
26.进一步地，所述的构建方法还包括采用黄独乙素、儿茶素、表儿茶素中的一种或者多种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；优选的，溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶液；优选的，每1ml对照品溶液中含各对照品40-80μg。
27.进一步地，所述的构建方法还包括采用黄药子对照药材加水提取、滤过、干燥后得到的固体采用提取溶剂提取后固液分离，取液体，即得对照药材参照物溶液，以及按照上述
任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照药材参照图谱的步骤。
28.其中，所述提取溶剂如前述所限定。固液分离为离心或者过滤。
29.进一步地，所述黄药子及其制剂的特征图谱具有8个特征峰，峰8与黄独乙素对照品参照物峰保留时间相对应，与黄独乙素对照品参照物峰相应的峰为s峰，峰1～峰7与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内，峰1～峰7和s峰的规定值依次为：0.21、0.24、0.41、0.58、0.67、0.83、0.89。
30.进一步地，所述黄药子及其制剂的特征图谱具有8个特征峰，峰3为儿茶素，峰4为表儿茶素，峰8为黄独乙素。依次为峰1-8。
31.可选的，所述黄药子的药物制剂的指纹图谱中，以8号峰黄独乙素为内参考峰，计算色谱与对照图谱的相似度不得小于0.90
32.本发明还提供了任一所述的黄药子及其制剂特征图谱的构建方法在黄药子及其制剂产品的质量检测中的应用。
33.本发明还提供了一种黄药子及其制剂产品的质量检测方法，包括将待测产品按照上述任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤；优选的，还包括测定黄药子及其制剂产品中黄独乙素的含量的步骤。
34.进一步地，测定黄药子及其制剂产品中黄独乙素的含量的步骤包括：
35.(1)供试品溶液和对照品溶液的制备；
36.(2)取供试品溶液和对照品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-0.1％磷酸溶液(体积比30:70)为流动相，通过外标法测试供试品溶液中的黄独乙素的含量。
37.进一步地，检测波长为200-220nm；和/或，柱温为20-30℃；和/或，流速为0.8-1.2ml/min。
38.进一步地，供试品溶液的制备方法包括如下步骤：
39.1)取供试品加入提取溶剂提取，得到提取液；
40.2)将提取液进行固液分离，取液体，干燥；
41.3)采用溶剂溶解干燥后的固体，即得供试品溶液；优选的，步骤(1)满足如下a-e中的任意一项或者多项：
42.a、步骤1)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.1-0.4:15-60；质量与体积的配比关系为g/ml；
43.b、所述提取溶剂包含水、甲醇、乙醇中的至少一种，优选为甲醇；
44.c、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-60min；
45.d、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤；
46.e、步骤3)中，所述溶剂为甲醇或者乙醇。
47.进一步地，所述黄药子及其制剂选自黄药子药材、黄药子饮片、黄药子水提取物或者黄药子制剂。
48.可选的，所述药物制剂为粉剂(例如标准汤剂冻干粉)、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
49.进一步地，对照品溶液的溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶
液。
50.进一步地，每1ml对照品溶液中各对照品40-80μg。
51.本发明技术方案，具有如下优点：
52.1.本发明提供的黄药子及其制剂特征图谱的构建方法，取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相，在特定洗脱程序下得到8个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、简便，为黄药子及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对黄药子及其制剂整体成分表征，重现性稳定。更重要的是，通过流动相梯度的筛选实现了二萜内酯类及黄酮类专属性成分的同时指认，特征性显著。
53.2.本发明提供的黄药子及其制剂特征图谱的构建方法，以药材、饮片及其相关制剂为研究对象，确认了8个共有特征峰，指认了黄独乙素、儿茶素、表儿茶素3个关键特征成分，图谱所展示的结果极易判定，为黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱鉴别提供一种快速、可靠的检测方法，能够更加有专属性评价黄药子及其药物制剂之间的质量差异，更能够全面地、快速地检测其质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
54.3.本发明所述建立黄药子的药物制剂的指纹图谱的方法，以黄药子的药物制剂为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰峰3为儿茶素、峰4为表儿茶素、峰8为黄独乙素，选择8号峰黄独乙素作为指纹图谱中的内参考峰，确定了黄药子的药物制剂与对照图谱的相似度不小于0.90，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测黄药子的药物制剂的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
附图说明
55.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
56.图1为实施例1得到的黄独乙素对照品色谱图；
57.图2为实施例1得到的黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱；
58.图3为实施例2第(1)项下黄药子标准汤剂冻干粉以甲醇和纯水为流动相全梯度洗脱下得到的色谱图；
59.图4为实施例2第(1)项下黄药子标准汤剂冻干粉以乙腈和纯水为流动相全梯度洗脱下得到的色谱图；
60.图5为实施例2中梯度1得到的色谱图；
61.图6为实施例2中梯度2得到的色谱图；
62.图7为实施例2中梯度3得到的色谱图；
63.图8为实施例2中梯度4得到的色谱图；
64.图9为实施例2中梯度5得到的色谱图；
65.图10为实施例2中梯度6得到的色谱图；
66.图11为实施例2中以乙腈-水为流动相得到的色谱图；
67.图12为实施例2中以乙腈-0.2％醋酸水为流动相得到的色谱图；
68.图13为实施例2中以乙腈-0.2％甲酸水为流动相得到的色谱图；
69.图14为实施例2中流速为0.8ml/min得到的色谱图；
70.图15为实施例2中流速为1ml/min得到的色谱图；
71.图16为实施例2中流速为1.2ml/min得到的色谱图；
72.图17为实施例2中柱温为20℃得到的色谱图；
73.图18为实施例2中柱温为25℃得到的色谱图；
74.图19为实施例2中柱温为30℃得到的色谱图；
75.图20为实施例2中agilent色谱柱得到的色谱图；
76.图21为实施例2中tnature色谱柱得到的色谱图；
77.图22为实施例2中ymc色谱柱得到的色谱图；
78.图23为实施例2中纯水提取色谱图；
79.图24为实施例2中乙醇提取色谱图；
80.图25为实施例2中甲醇提取色谱图；
81.图26为实施例2中25％甲醇提取色谱图；
82.图27为实施例2中50％甲醇提取色谱图；
83.图28为实施例2中75％甲醇提取色谱图；
84.图29为实施例2中黄药子对照药材特征图谱；
85.图30为实施例3中18批黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱；s1～s15：03001y、03002y、03003y、03004y、03005y、03006y、03009y、03010y、03011y、03012y、03013y、03014y、03015y、03018y、03019y；
86.图31为实施例3中黄药子标准汤剂冻干粉对照特征图谱；
87.图32为实施例3中黄药子药材、饮片、标准汤剂冻干粉、水提取物、颗粒的特征图谱；s1：药材211116016；s2：药材211116017；s3：药材211116018；s4：饮片211101y；s5：饮片211102y；s6：饮片211103y；s7：冻干粉211101y；s8：冻干粉211102y；s9：冻干粉211103y；s10：提取物1；s11：提取物2；s12：提取物3；s13：颗粒1；s14：颗粒2；s15：颗粒3；
88.图33为实施例3中儿茶素、表儿茶素对照品与供试品的对比图，自下而上依次为供试品、儿茶素和表儿茶素；
89.图34为实施例4专属性考察中黄药子标准汤剂冻干粉阴性对照的色谱图；
90.图35为实施例4专属性考察中黄药子标准汤剂冻干粉供试品色谱图；
91.图36为实施例7专属性考察中黄药子标准汤剂冻干粉阴性对照的色谱图；
92.图37为专属性考察中黄药子标准汤剂冻干粉供试品色谱图。
具体实施方式
93.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其
他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
94.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
95.本发明中，黄药子标准汤剂冻干粉是以黄药子饮片为原料按照本领域常规方法制得，例如本发明中，按如下方法进行样品制备：取药材，根据《中国药典》2020年版有关规定，炮制(炮制工艺：除去杂质，切片，干燥)成符合要求的饮片，取饮片约100g，破碎，置砂锅中，加入1000ml纯化水浸泡30分钟，采用砂锅先武火(500w)煮沸，再文火(300w)煎煮30分钟，200目滤布趁热滤过，滤液冷却至室温；药渣再加800ml纯化水，先武火(500w)煮沸，再文火(300w)煎煮20分钟，200目滤布趁热滤过，滤液冷却至室温，合并滤液；滤液减压浓缩(50～65℃)至相对密度为1.08～1.12g/ml的浓浸膏，浓浸膏置于冷冻干燥机中，冷冻干燥至干燥状态，取出，称重，研磨成粉末，分装于西林瓶中，即得黄药子标准汤剂冻干粉。
96.实施例1
97.本实施例提供了一种黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
98.(1)供试品溶液的制备：以黄药子标准汤剂冻干粉为供试品，取供试品适量，研细，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
99.(2)对照品溶液的制备：取黄独乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得；
100.(3)高效液相色谱法检测：各取对照品溶液和供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为30℃，检测波长为210nm。理论板数按黄独乙素峰计算应不低于5000。
[0101][0102]
结果见下表和图1和2所示，色谱方法系统适应性良好，黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、特征峰分布均匀，具有8个特征峰，峰8与黄独乙素对照品参照物峰保留时间相对应，与黄独乙素对照品参照物峰相应的峰为s峰，峰1～峰7与s峰的相对保留时间依次为：0.20、0.22、0.38、0.54、0.65、0.80、0.89。
[0103]
表1黄药子标准汤剂冻干粉的系统适应性参数
[0104][0105]
实施例2
[0106]
1、仪器与试药
[0107]
1.1仪器
[0108]
色谱仪1：岛津高效液相色谱，包括lc-20ad二元泵、sil-20a自动进样器、spd-20a检测器、色谱工作站。电子分析天平：mettler toledo newclassic ms十万分之一天平、jing tian fa2044a万分之一天平。
[0109]
色谱柱：(1)agilent pursuit xrs 5c18(柱长为120mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)；
[0110]
(2)ymc aq c18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)；
[0111]
(3)waters symmetry c18(柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5μm)。
[0112]
1.2试剂
[0113]
甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
[0114]
1.3试药
[0115]
黄独乙素对照品：购于panphy，批号lot no09a-x08-202，纯度：98％。
[0116]
黄药子对照药材：购于上海鸿永生物科技有限公司，批号280033-202111。
[0117]
2、色谱条件和提取溶剂的考察
[0118]
(1)流动相系统的考察
[0119]
供试品溶液的制备：取黄药子标准汤剂冻干粉0.2g，置于具塞锥形瓶，加入20ml体积百分数为80％甲醇，称重，超声提取30min，用80％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，供hplc分析用。色谱条件如下：分别采用甲醇或者乙腈为流动相a，以水为流动相b，色谱柱采用：tnature c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，柱温为30℃，流速为每分钟1ml，进样量10μl，按照下表进行梯度洗脱。
[0120]
表2全梯度洗脱程序
[0121][0122]
结果见图3-4所示，乙腈和甲醇出峰情况大体一致，但乙腈洗脱能力更强，故有机相选用乙腈。
[0123]
(2)流动相系统的考察
[0124]
取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，分别按下述梯度洗脱程序进行检测，其余色谱条件均与第(1)项相同。
[0125]
表3梯度1～3
[0126][0127]
表4洗脱优化条件4～6
[0128][0129]
表5系统适用性参数
[0130]
[0131][0132]
结果见上表和图5-10所示，相比于其他梯度条件，采用乙腈梯度5和6获得的特征图谱基线更加平稳，且分离度明显提高，峰形良好，其中梯度6最佳。
[0133]
(3)水相种类的考察
[0134]
取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，分别以水、0.2％醋酸、0.2％甲酸为流动相b，以乙腈为流动相a，按照梯度6进行梯度分析，其余色谱条件均与第(1)项相同。
[0135]
结果如图11-13所示，相比于乙腈-0.2％醋酸、乙腈-0.2％甲酸，采用乙腈-水为流动相得到的特征图谱对各峰的分离效果明显提高，基线明显更加平稳，且峰形良好。
[0136]
(4)流速的考察
[0137]
考察不同流速0.8、1.0、1.2ml/min对各个特征峰的分离情况的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，分别在流速为0.8、1.0、1.2ml/min下，按照梯度6进行梯度分析，其余色谱条件均与第(1)项相同。
[0138]
表6不同流速考察系统适用性参数
[0139][0140]
结果见上表和图14-16，使用0.8、1.0、1.2ml/min可实现多个特征峰的分离，尤其是1.0ml/min的分离效果最好。
[0141]
(5)柱温的考察
[0142]
考察不同柱温20、25、30℃对各个特征峰的分离情况的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，分别在柱温为20、25、30℃下，按照梯度6进行梯度分析，其余色谱条件均与第(1)项相同。
[0143]
表7不同柱温考察系统适用性参数
[0144][0145]
结果见上表和图17-19，使用20、25、30℃可实现多个特征峰的分离，尤其是30℃的分离效果最好。
[0146]
(6)色谱柱的考察
[0147]
考察色谱柱对色谱峰分离及峰形等的影响。取本实施例第(1)项制得的供试品溶液，按照梯度6进行梯度分析，采用如下三个色谱柱进行检测：ymc aq c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)、tnature色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，agilent pursuit xrs 5c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，其余色谱条件均与第(1)项相同。
[0148]
表8不同色谱柱考察系统适用性参数
[0149]
[0150][0151]
结果见图20-22，使用上述三种c18色谱柱均可实现多个特征峰的分离，尤其是采用ymc色谱柱时，色谱柱对峰1的分离效果更好，故选择ymc色谱柱作为黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱测定的色谱柱。
[0152]
3、供试品溶液的制备
[0153]
(1)提取溶剂的考察
[0154]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇、乙醇、水、25％(体积百分数)甲醇、50％(体积百分数)甲醇、75％(体积百分数)甲醇各25ml，密塞，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，滤过，取续滤液，即得。hplc检测，色谱条件同实施例1，考察结果见下表和图23-28所示。
[0155]
表9提取溶剂的色谱峰系统适应性参数比较
[0156][0157][0158]
结论：通过考察水、甲醇、乙醇、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇对黄药子标准汤剂
冻干粉的提取效果，甲醇峰形最好，其他溶剂峰面积相差不大，因此选择甲醇作为黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱的提取溶剂。
[0159]
(2)提取方式的选择
[0160]
根据上述确定的提取条件，进一步考察不同黄药子标准汤剂冻干粉提取方式对黄药子标准汤剂冻干粉提取效果。以色谱峰的信息量及系统适用性作为主要考察指标。
[0161]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.2g，加甲醇25ml，分别超声处理(功率250w，频率40khz)、加热回流45分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。hplc检测，色谱条件同实施例1。
[0162]
表10黄药子标准汤剂冻干粉提取方式的色谱峰系统适应性参数比较
[0163][0164]
结论：黄药子标准汤剂冻干粉不同提取方式考察时色谱峰的系统适应性参数较优，分离度，对称性较好，不同提取方式对黄药子标准汤剂冻干粉提取无明显差异，考虑操作方式的简便性，选择超声作为黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱的提取方式。
[0165]
(3)提取时间的考察
[0166]
根据上述确定的提取条件，进一步考察不同提取时间对黄药子标准汤剂冻干粉提取效果。以色谱峰的信息量及系统适用性作为主要考察指标。
[0167]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.2g，加甲醇25ml，分别超声处理(功率250w，频率40khz)30、45、60分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。hplc检测，色谱条件同实施例1。
[0168]
表11黄药子标准汤剂冻干粉提取时间的色谱峰系统适应性参数比较
[0169][0170]
试验结果表明，当超声时间为30～60分钟时，黄药子标准汤剂冻干粉的峰面积差异不大，选择45分钟作为黄药子标准汤剂冻干粉的提取时间。
[0171]
(4)溶剂用量的考察
[0172]
根据上述确定的提取条件，进一步考察不同黄药子标准汤剂冻干粉溶剂用量：15ml、25ml、50ml对黄药子标准汤剂冻干粉提取效果。以色谱峰的信息量及分离效果作为主要考察指标。
[0173]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.2g，分别加甲醇15、25、50ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。hplc检测，色谱条件同实施例1。
[0174]
表12溶剂用量的色谱峰系统适应性参数比较
[0175]
[0176][0177]
结论：当溶剂量15～50ml时，峰面积呈比例下降，说明在15～50ml溶剂量时，均可完全提取，综合可考虑峰面积响应，将提取溶剂量确定为25ml。
[0178]
(5)取样量的选择
[0179]
根据上述确定的提取条件，进一步考察不同黄药子标准汤剂冻干粉取样量：0.1g、0.2g、0.4g对黄药子标准汤剂冻干粉提取效果。以色谱峰的信息量及分离效果作为主要考察指标。
[0180]
分别取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1、0.2、0.4g，加甲醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，取出，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。hplc检测，色谱条件同实施例1。
[0181]
表13取样量的色谱峰系统适应性参数比较
[0182][0183][0184]
试验结果表明，当取样量在0.1g～0.4g时，峰面积按比例增加，说明在取样量0.1g～0.4g时，均可完全提取，综合考虑色谱峰的响应，将0.2g作为黄药子标准汤剂冻干粉的取样量。
[0185]
(6)进样量的考察
[0186]
根据上述确定的提取条件，进一步考察供试品溶液的不同进样体积：5μl、10μl、15μl、20μl对色谱峰的分离效果。供试品溶液按照实施例1的方法制得，以色谱峰的信息量及分离效果作为主要考察指标。其余色谱条件同实施例1。
[0187]
表14进样量的考察中色谱峰系统适应性参数比较
[0188][0189]
试验结果表明，当进样量为15～20μl分离度均良好，其中，10μl-15μl的峰型更好，且峰高、峰宽相对适中，因此优选进样体积为10-15μl作为本试验的供试品溶液进样体积。
[0190]
实施例3
[0191]
(1)多批黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱测定
[0192]
取黄药子对照药材2g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇25ml，超声处理(功率250w，频率40khz)45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
[0193]
取18批黄药子标准汤剂冻干粉(批号：03001y、03002y、03003y、03004y、03005y、03006y、03009y、03010y、03011y、03012y、03013y、03014y、03015y、03018y、03019y、211101y、211102y、211103y)按实施例1的方法操作制备得到供试品溶液，取18批供试品溶液和对照药材参照物溶液按照实施例1第(3)项的方法进行测试，得到黄药子对照药材特征图谱和18批黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱。见图29和30所示，将18批黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱检测aia数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算软件，共标
定了8个峰共有峰，形成共有模式图，并建立对照图谱，如图31所示。
[0194]
表15 18批黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱测定相对保留时间结果
[0195][0196]
表16 18批黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱测定相对峰面积结果
[0197]
[0198][0199]
根据研究结果确定：黄药子标准汤剂冻干粉特征图谱供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰的保留时间相对应，其中峰8应与黄独乙素对照品参照物峰保留时间相对应。与黄独乙素对照品参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
10％范围内，规定值为：0.21(峰1)、0.24(峰2)、0.41(峰3)、0.58(峰4)、0.67(峰5)、0.83(峰6)、0.89(峰7)。所得对照特征图谱相对保留时间结果如下述表格。18批黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱，黄药子标准汤剂冻干粉对照特征图谱见下述图表。测定结果表明18批次的黄药子标准汤剂冻干粉各个特征峰规定的相对保留时间均在规定值的
±
10％之内。
[0200]
对照图谱的拟合方式采用mark峰拟合。
[0201]
表17黄药子标准汤剂冻干粉对照图谱相对保留时间
[0202][0203]
表18黄药子标准汤剂冻干粉对照图谱相对峰面积
[0204][0205]
表19黄药子对照药材特征图谱相对保留时间
[0206][0207]
表20黄药子对照药材特征图谱相对峰面积
[0208][0209]
(2)特征图谱传递
[0210]
分别以18批黄药子药材、18批黄药子饮片、3批黄药子标准汤剂冻干粉、3批黄药子水提取物以及3批黄药子配方颗粒为供试品按照实施例1的方法构建特征图谱，并与对照特征图谱比较，测试相似度，结果见下表所示，
[0211]
其中，黄药子水提取物的制备方法如下：取黄药子饮片9000g，加水煎煮2次，第一次加10倍水浸泡30分钟，煎煮30分钟，滤过，第二次加8倍水，煎煮20分钟，滤过，在70℃减压浓缩至相对密度1.00～1.10g/ml(60-70℃)的流膏，干燥，粉碎，混匀，分装，即得黄药子水提取物，其供试品溶液按照实施例1的方法制得。
[0212]
黄药子配方颗粒的制备方法如下：取黄药子饮片9000g，加水煎煮2次，第一次加10倍水浸泡30分钟，煎煮30分钟，滤过，第二次加8倍水，煎煮20分钟，滤过，在70℃减压浓缩至相对密度1.00～1.10g/ml(60-70℃)的流膏，干燥，粉碎，出膏率为6％～11％，加麦芽糊精(0.1％-5.1％)，混匀，干法制粒，制成1000g，分装，即得黄药子配方颗粒，其供试品溶液按照实施例1的方法制得。
[0213]
结果如下表和图32所示，各特征图谱得到的特征峰数量一致，均出现8个特征峰，各特征峰相对保留时间相对应，其中8号峰的保留时间应与相应的对照品参照物峰保留时间相对应，相似度均大于0.95。说明黄药子从药材经净选为黄药子饮片的过程中，主要化学成分未发生变化，物质基础一致，黄药子饮片按传统制备方法制得的标准汤剂冻干粉中，与原料的化学成分一致，说明黄药子饮片经水煮后物质基础未发生改变，量值传递关系良好。
[0214]
表21药材、饮片、提取物以及颗粒的相似度结果
[0215]
药材批号相似度饮片批号相似度提取物批号相似度21020010.99803001y0.998提取物10.99521020020.99703002y0.999提取物20.99521020030.99803003y0.998提取物30.99521020040.98603004y0.985颗粒批号相似度21020050.99903005y0.993黄药子颗粒10.999
21020060.99903006y0.999黄药子颗粒20.99921020090.99803009y0.996黄药子颗粒30.99921020100.99503010y0.997
ꢀꢀ
21020111.00003011y0.995
ꢀꢀ
21020121.00003012y0.994
ꢀꢀ
21020130.99903013y0.999
ꢀꢀ
21020140.99803014y0.999
ꢀꢀ
21020150.99903015y0.998
ꢀꢀ
21020180.99903018y0.992
ꢀꢀ
21020190.99903019y0.997
ꢀꢀ
2111160160.999211101y0.999
ꢀꢀ
2111160170.999211102y0.999
ꢀꢀ
2111160180.969211103y0.999
ꢀꢀ
[0216]
(3)峰指认
[0217]
对照品溶液的制备：取儿茶素、表儿茶素适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml对照品溶液中含40μg儿茶素、40μg表儿茶素的溶液，即得。
[0218]
取上述实施例1制得的黄药子标准汤剂冻干粉的供试品溶液，将各对照品溶液及供试品溶液，按实施例1的方法高效液相色谱法进行检测后比对，结果如图33。
[0219]
小结：黄药子标准汤剂冻干粉供试品色谱图中峰3儿茶素、峰4表儿茶素、峰8为黄独乙素。
[0220]
实施例4方法学验证
[0221]
1、仪器精密度试验
[0222]
以黄药子标准汤剂冻干粉为供试品按照实施例1的方法制备供试品溶液，取同一份黄药子标准汤剂冻干粉的供试品溶液，按实施例1下的色谱条件，重复进样6次，测定8个特征峰的相对保留时间，并进行分析。
[0223]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2％，表明仪器精密度良好。
[0224]
2、方法重复性试验
[0225]
取同一批黄药子标准汤剂冻干粉6份，按实施例1的下方法分别测定8个共有峰的相对保留时间，并进行分析。
[0226]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd小于2.0％，相对峰面积的rsd小于5.09％，表明本方法重复性良好。
[0227]
3、中间精密度(不同操作人员)
[0228]
分别由三名检验员在不同的时间，用同一台设备，按实施例1的下色谱条件测定同一批号的黄药子标准汤剂冻干粉，分别测定8个共有峰的相对保留时间，并进行分析。
[0229]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2.0％，表明方法中间精密度(不同人员)良好。
[0230]
4、稳定性考察
[0231]
取同一黄药子标准汤剂冻干粉为供试品按实施例1供试品溶液的制备和高效液相
色谱法检测，分别在制备后0、4、8、12、16、24小时进样，测定8个共有峰的相对保留时间，并进行分析，确定供试品溶液的稳定性。
[0232]
结果表明，各特征峰与参照物s峰的相对保留时间的rsd均小于2％，表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
[0233]
5、专属性考察
[0234]
精密吸取实施例1制得的供试品溶液、阴性对照溶液(甲醇)各10μl，分别注入液相色谱仪，按实施例1的方法检测，如图34和35所示，结果阴性无干扰。
[0235]
实施例5
[0236]
本实施例提供了一种黄药子标准汤剂冻干粉的质量检测方法，包括实施例1的黄药子标准汤剂冻干粉的特征图谱的构建方法，还包括以下步骤：
[0237]
(1)供试品溶液的制备：取黄药子药材，根据《中国药典》2020年版有关规定，炮制(炮制工艺：除去杂质，切片，干燥)成符合要求的饮片，取饮片约100g，破碎，置砂锅中，加入1000ml纯化水浸泡30分钟，采用砂锅先武火(500w)煮沸，再文火(300w)煎煮30分钟，200目滤布趁热滤过，滤液冷却至室温；药渣再加800ml纯化水，先武火(500w)煮沸，再文火(300w)煎煮20分钟，200目滤布趁热滤过，滤液冷却至室温，合并滤液；滤液减压浓缩(50～65℃)至相对密度为1.08～1.12g/ml的浓浸膏，测定浓浸膏的含固量，计算标准汤剂的出膏率；浓浸膏置于冷冻干燥机中，冷冻干燥至干燥状态，取出，称重，研磨成粉末，分装于西林瓶中，即得黄药子标准汤剂冻干粉。以黄药子标准汤剂冻干粉为供试品按照实施例1的方法制得供试品溶液。
[0238]
(2)对照品溶液的制备：取黄独乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得；
[0239]
(3)高效液相色谱法检测：各取对照品溶液和供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％(体积百分数)磷酸溶液(体积比30:70)为流动相；检测波长为210nm。理论板数按黄独乙素峰计算应不低于3000。结果显示：
[0240]
表1黄药子标准汤剂冻干粉供试品及对照品黄独乙素系统适用性参数
[0241][0242]
实施例6含量测定方法的考察
[0243]
(1)提取方式的选择
[0244]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟或者加热回流45分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，超声法和回流法的平均值为12.15mg/g、12.05mg/g，两组相对平均偏差为0.42％。
[0245]
结果表明超声处理及加热回流测定的含量相同，为了操作的便捷性，选择超声作为黄药子标准汤剂冻干粉含量测定的提取方式。
[0246]
(2)提取溶剂种类的选择
[0247]
考察甲醇、乙醇、乙腈和水4种提取溶剂对黄药子标准汤剂冻干粉含量测定结果的影响。
[0248]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同溶剂各20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，甲醇、水、乙醇和乙腈的平均值依次为13.23mg/g、10.00mg/g、3.08mg/g和0.60mg/g，各组相对平均偏差为72.68％。
[0249]
结果表明了采用不同类型的提取溶剂，不同溶剂对黄药子标准汤剂冻干粉含量测定影响较大，甲醇测得的含量最高，因此后续考察不同浓度溶剂对含量测定的影响。
[0250]
(3)提取溶剂浓度的选择
[0251]
考察25％、50％、75％的甲醇和纯甲醇对黄药子标准汤剂冻干粉含量测定结果的影响。
[0252]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入25％、50％、75％的甲醇和甲醇各20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，25％、50％、75％的甲醇和纯甲醇的平均值依次为11.83mg/g、11.91mg/g、11.22mg/g和13.23mg/g，各组相对平均偏差为4.91％。
[0253]
试验结果表明，甲醇浓度对黄药子标准汤剂冻干粉的含量测定有一定影响。甲醇测得的含量最高，因此优选甲醇作为黄药子标准汤剂冻干粉含量测定的提取溶剂。
[0254]
(4)超声时间的考察
[0255]
考察超声时间对黄药子标准汤剂冻干粉含量测定结果的影响。
[0256]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，分别超声处理(功率300w，频率40khz)15、30、60分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测。每组平行制样2份进行测试，15、30、60分钟的平均值依次为13.80mg/g、13.70mg/g、13.81mg/g，各组相对平均偏差为0.34％。
[0257]
结果表明了当超声时间15-60分钟时，含量结果相当，将黄药子标准汤剂冻干粉含量测定的超声时间优选为30分钟。
[0258]
(5)溶剂用量的选择
[0259]
考察20、40和60ml 3个溶剂体积对黄药子标准汤剂冻干粉含量测定结果的影响。
[0260]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇20、40、60ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，20、40和60ml的平均值依次为13.62mg/g、13.58mg/g、13.17mg/g，各组相对平均偏差为1.42％。
[0261]
结果表明了当溶剂量为20-60ml时，含量结果相当，说明在20-60ml溶剂量时，均可完全提取，综合考虑峰面积将黄药子标准汤剂冻干粉溶剂量优选为20ml。
[0262]
(6)取样量考察
[0263]
考察不同取样量对黄药子标准汤剂冻干粉含量提取效果的影响。
[0264]
分别取本品(黄药子标准汤剂冻干粉)粉末约0.1、0.2、0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，0.1、0.2、0.3g的平均值依次为12.88mg/g、12.87mg/g、12.30mg/g，各组相对平均偏差为2.00％。
[0265]
试验结果表明，取样量为0.1-0.3g时，黄药子标准汤剂冻干粉黄独乙素含量均能完全提取，综合考虑峰面积，优选0.1g作为黄药子标准汤剂冻干粉黄独乙素含量测定的取样量。
[0266]
(7)超声功率的考察
[0267]
考察不同标汤(冻干粉)量对黄药子标准汤剂冻干粉含量提取效果的影响。取本品(黄药子标准汤剂冻干粉)粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，分别在100w、150w和300w的功率下超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按照实施例5的色谱条件检测，每组平行制样2份进行测试，100w、150w和300w的功率的平均值依次为12.74mg/g、12.75mg/g、12.71mg/g，各组相对平均偏差为0.12％。
[0268]
试验结果表明，不同超声功率下，测定的黄药子标准汤剂冻干粉含量结果相同，说明超声功率对含量测定影响不大，因此优选常用的300w作为黄药子标准汤剂冻干粉含量测定的超声功率。
[0269]
实施例7方法学验证
[0270]
对实施例5的方法进行方法学验证。
[0271]
1、专属性考察
[0272]
取空白样品溶液(甲醇)和实施例5制得的供试品溶液，按照实施例5项下的色谱条件进行hplc分析，记录色谱图，结果见图36和37所示，阴性对照试验无干扰。
[0273]
2、检测限与定量限
[0274]
检测限：按照《中国药典》2020年版四部通则质量标准分析方法验证指导原则中检测限进行测定，把已知浓度供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，信噪比为3:1。试验测得黄独乙素检测限为0.00013μg。
[0275]
定量限：按照《中国药典》2020年版四部通则质量标准分析方法验证指导原则中定量限进行测定，信噪比为10:1。试验测得黄独乙素定量限为0.00045μg。
[0276]
3、线性关系考察
[0277]
取黄独乙素适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含12.495μg、24.99μg、49.98μg、99.96μg、199.92μg、399.84μg的溶液，精密吸取以上不同浓度的黄独乙素对照品溶液10μl注入液相色谱仪，按照实施例5项下的色谱条件进行hplc分析，测定峰面积，以黄独乙素的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果见下表，回归方程为：y＝891060.9x+21616.6，r2＝1。实验结果表明黄独乙素进样量在0.1249～3.9984μg范围内线性关系良好。
[0278]
4、精密度试验
[0279]
(1)仪器精密度试验
[0280]
取同一份实施例5制备得到的黄药子标准汤剂冻干粉的供试品溶液，按照实施例5项下的色谱条件进行hplc分析，重复进样6次，测定黄独乙素的峰面积。结果显示黄独乙素连续进样6针峰面积的rsd为0.40％，表明仪器精密度良好。
[0281]
(2)不同人员中间精密度考察
[0282]
同一批黄药子标准汤剂冻干粉，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按实施例5方法处理，测定黄独乙素的含量，结果显示黄独乙素峰含量的rsd为1.3％，结果表明本法在不同操作人员中间精密度良好。
[0283]
(3)重复性考察
[0284]
取同一批黄药子标准汤剂冻干粉6份，按实施例5供试品溶液的制备方法制备，按照实施例5项下的色谱条件进行hplc分析，并计算含量结果rsd％。rsd为1.9％，表明该方法重复性良好。
[0285]
(4)准确度考察
[0286]
即加样回收试验，精密称取同一批号9份黄药子标准汤剂冻干粉约0.05g，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入黄独乙素对照品溶液(0.2524mg/ml)1ml、2ml和3ml，各3份，按实施例5方法处理，使用随行样品含量计算回收率，回收率结果见下表。结果回收率在92％～105％之间，平均回收率为95.35％，rsd值为2.3％，表明方法准确性良好。
[0287]
(5)溶液的稳定性
[0288]
取同一份实施例5制备得到的黄药子标准汤剂冻干粉的供试品溶液，在自动进样盘中放置，按照实施例5项下的色谱条件进行hplc分析，分别于0、4、8、12、16和24h进样分析，记录黄独乙素的色谱峰面积，计算rsd，以考察溶液的稳定性。rsd为0.85％。实验结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定，可以满足测定需要。
[0289]
(6)耐用性考察
[0290]
①
不同流速耐用性考察
[0291]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，按实施例5供试品制备方法处理，分别在不同流速0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min下进行试验，其余色谱条件同实施例5，测定黄独乙素的峰面积，并计算含量。结果表明，不同流速检测黄药子标准汤剂冻干粉的含量差异较小，平均含量为15.71mg/g，相对平均偏差为0.6％，该方法在不同流速下耐用性较好。
[0292]
②
不同柱温的考察
[0293]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，按实施例5供试品制备方法处理，分别在不同柱温28℃、30℃、32℃下进行试验，测定黄独乙素的峰面积，计算含量，结果表明，不同柱温检测黄药子标准汤剂冻干粉的含量差异小，平均含量为15.43mg/g，相对平均偏差为0.8％，该方法对于不同柱温耐用性较好。
[0294]
③
不同磷酸浓度的考察
[0295]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，按实施例5供试品制备方法处理，分别使用0.08％，0.10％和0.12％的磷酸和乙腈为流动相进行试验，其余色谱条件同实施例5，测定黄独乙素的峰面积，计算含量，平均含量为15.36mg/g，相对平均偏差为2.0％，结果表明，当磷酸浓度发生微小变化时，该方法耐用性较好。
[0296]
④
不同色谱柱的考察
[0297]
取黄药子标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，按实施例5供试品制备方法处理，分别用不同品牌色谱柱wondasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)、tinature(250mm
×
4.6mm，5μm)和agilent pursuit xrs c18(250mm
×
4.6mm，5μm)进行试验，其余色谱条件同实施例5，检测黄药子标准汤剂冻干粉中黄独乙素的峰面积并计算含量，结果表明，不同色谱柱检测得到的黄独乙素的含量结果差异较小，平均含量为15.55mg/g，相对平均偏差为0.9％，该方法对不同品牌色谱柱耐用性好。
[0298]
以上方法学研究结果表明该方法符合含量测定的要求，可用于黄药子标准汤剂冻干粉中黄独乙素含量测定。
[0299]
(7)黄药子标准汤剂冻干粉含量测定
[0300]
按实施例5方法测试18个批次标准汤剂中黄独乙素含量及转移率如下表所示。
[0301]
18个批次标准汤剂中黄独乙素含量转移率范围为20.0％～44.5％，均值为35.5％，sd为7.6％，均值
±
30％的波动范围为24.9％～46.2％。规定黄药子标准汤剂冻干粉中转移率范围20.0％～45.0％。符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求。黄药子含量均值0.676％，sd为0.155％，实测最小值0.394％，实测最大值1.411％，均值
±
30％范围为0.473％～0.879％，均值
±
3sd范围为0.211％～1.14％。
[0302]
(8)黄药子标准汤剂冻干粉含量限度制定
[0303]
黄药子标准汤剂冻干粉的质量属性：依据18批样品的实测数据，确定出膏率范围为6％～11％，均值8.8％；确定指标成分黄独乙素含量范围3.94～14.11mg/g，均值6.76mg/g，sd为1.55，均值
±
30％范围为4.73～8.79mg/g，均值
±
3sd范围为2.11～11.41mg/g。黄药子标准汤剂冻干粉以实测值～均值
±
3sd范围确定黄独乙素含量范围为3.9～11.0mg/g。
[0304]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种黄药子及其制剂特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，得到供试品的特征图谱，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈和水为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0
→
50min
→
70min
→
80min，流动相中乙腈的体积百分数为：5％
→
15％
→
30-35％
→
95％。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，检测波长为200-220nm；和/或，柱温为20-32℃；和/或，流速为0.8-1.2ml/min；和/或，梯度洗脱程序还包括：80
→
90min，流动相中乙腈的体积百分数为：95％
→
95％。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：1)取供试品加入提取溶剂提取，得到提取液；2)将提取液进行固液分离，取液体，干燥；3)采用溶剂溶解干燥后的固体，即得供试品溶液；优选的，步骤(1)满足如下a-e中的任意一项或者多项：a、步骤1)中，供试品的质量与提取溶剂的体积比为0.1-0.4:15-60；质量与体积的配比关系为g/ml；b、所述提取溶剂包含水、甲醇、乙醇中的至少一种，优选为甲醇；c、步骤1)中，提取方式为超声提取或者回流提取，提取时间为30min-60min；d、步骤2)中，所述固液分离为离心或者过滤；e、步骤3)中，所述溶剂为甲醇或者乙醇。4.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，所述黄药子及其制剂选自黄药子药材、黄药子饮片、黄药子水提取物或者黄药子制剂。5.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用黄独乙素、儿茶素、表儿茶素中的一种或者多种为对照品加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-3中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品参照图谱的步骤；优选的，溶剂选自甲醇或者体积百分数为70％以上的甲醇水溶液；优选的，每1ml对照品溶液中含各对照品40-80μg。6.根据权利要求1-3中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用黄药子对照药材加水提取、滤过、干燥后得到的固体采用提取溶剂提取后固液分离，取液体，即得对照药材参照物溶液，以及按照权利要求1-3中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照药材参照图谱的步骤。7.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，所述黄药子及其制剂的特征图谱具有8个特征峰，峰8与黄独乙素对照品参照物峰保留时间相对应，与黄独乙素对照品参照物峰相应的峰为s峰，峰1～峰7与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％范围之内，峰1～峰7和s峰的规定值依次为：0.21、0.24、0.41、0.58、0.67、0.83、0.89。8.根据权利要求1-7中任一所述的构建方法，其特征在于，所述黄药子及其制剂的特征图谱具有8个特征峰，峰3为儿茶素，峰4为表儿茶素，峰8为黄独乙素。9.权利要求1-8中任一所述的黄药子及其制剂特征图谱的构建方法在黄药子及其制剂产品的质量检测中的应用。
10.一种黄药子及其制剂产品的质量检测方法，其特征在于，包括将待测产品按照权利要求1-8中任一所述的构建方法得到特征图谱的步骤；优选的，还包括测定黄药子及其制剂产品中黄独乙素的含量的步骤。

技术总结
本发明涉及中药制剂质量检测领域，具体提供了一种黄药子及其制剂特征图谱的构建方法及质量检测方法，其中在特征图谱构建方法中，色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，在特定洗脱程序下得到8个共有特征峰，并实现了这些共有特征峰的很好分离，得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、分离效果好、特征成分专属性强，为黄药子及其制剂的质量检测和控制提供依据，实现对黄药子及其制剂整体成分表征，重现性稳定。性稳定。性稳定。


技术研发人员：郑晓英 仝一丹 邱俊棠 秦宇翔 张辉 谭沛
受保护的技术使用者：华润三九现代中药制药有限公司
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/7