一种PD-L1适体修饰的金纳米棒材料及其应用

一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料及其应用
技术领域
1.本发明属于纳米技术和生物医药技术领域，具体涉及一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料。


背景技术：

2.过去二十年，纳米技术的进步创造了癌症治疗的新方法。与传统的癌症免疫疗法不同，合理设计的纳米材料可以触发特定的杀瘤效应，并优化抗原呈递，诱导持久的免疫反应。此外，与低分子量免疫调节剂相比，纳米级免疫调节剂具有可控的药代动力学行为，因此纳米技术在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用潜力。
3.在过去的几十年里，基于免疫检查点封锁(icb)对抗程序性细胞死亡1(pd-1)和程序性死亡配体1(pd-l1)的肿瘤免疫治疗已经显示出了对特定癌症的良好治疗效果。然而，它仍面临着免疫反应受限和抗肿瘤疗效等挑战，因为大量患者存在“冷”肿瘤，炎症信号和t细胞浸润不足。为了提高icb治疗的有效性，对抑制性肿瘤微环境的重编程和刺激免疫反应的策略已被广泛探索。一种很有前途的方法是用光热疗法(ptt)启动肿瘤，它可以重塑肿瘤环境，诱导非侵入性和空间特异性免疫原性。不同类型的在近红外(nir)窗口具有强吸光度的纳米材料被提出与icb结合，突出具有潜在的抗肿瘤作用。
4.到目前为止，pd-1/pd-l1最常用的策略是使用单克隆抗体。然而，与抗体相关的一些缺点仍未解决，如成本高，免疫相关不良事件。小分子抑制剂或其他抗体替代品的开发为解决这些问题提供了替代方法。
5.适配体是一种dna/rna寡核苷酸链，可以与相应的靶点结合，并具有高亲和力和特异性。适配体具有其免疫原性低、易于化学合成和修饰等优点，已被广泛用作治疗药物和靶向配体。在最近的研究中，pd-l1靶向适配体可以中断pd-1/pd-l1的相互作用，提高免疫应答强度。然而，利用pd-l1适配体构建多功能抗肿瘤平台的努力仍然有限。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料，通过au-s配位将pd-l1适配体(apdl1)偶联到金纳米棒(gnr)上制备得到pd-l1适体金纳米棒apdl1@gnr；并能在蛋白和细胞水平上与pd-l1敏感而特异性地结合。通过靶向肿瘤细胞上的pd-l1，apdl1@gnr在肿瘤部位积累，apdl1通过取代肿瘤中过表达的谷胱甘肽(gsh)从gnr中释放出来，并发挥pd-l1阻断作用。与gnr介导的光热合作，增强了强大的抗肿瘤免疫，包括增强成熟树突状细胞(dcs)的过滤，抑制调节性t细胞的减少，细胞毒性t细胞的激活，和抑制t细胞衰竭。在光热效应与免疫检查点抑制协同作用下，小鼠肿瘤被有效抑制，具有良好的生物相容性，为肿瘤治疗提供了潜在的治疗平台。
7.为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，包括以下步骤：
9.s1：金纳米种子制备：边搅拌边向ctab溶液中加入haucl4，然后加入新鲜制备的硼
氢化钠，制备得到金纳米种子；
10.s2：金纳米棒制备：向ctab溶液中依次加入haucl4、硝酸银、盐酸、抗坏血酸，最后加入金纳米种子，过夜孵育，得到长轴吸收峰在800nm左右的金纳米棒；
11.s3：pd-l1适体金纳米棒制备：将巯基修饰的pd-l1适配体(apdl1-sh)与金纳米棒水溶液混合均匀，过夜搅拌后离心得到apdl1@gnr；
12.优选的，所述s1中的ctab溶液浓度为0.2m，体积为5ml；haucl4溶液的浓度为0.5mm，体积为5ml；硼氢化钠溶液的浓度为10mm,体积为600ul；
13.优选的，所述s2中ctab溶液浓度为0.2m，体积为30ml；haucl4溶液的浓度为0.5mm，体积为6ml；硝酸银溶液的浓度为0.1m，体积为75ul；盐酸溶液的浓度为1.2m，体积为75ul；抗坏血酸溶液的浓度为10mm，体积为3.7ml；
14.优选的，所述s2中加入的金纳米种子的体积为50ul；
15.优选的，所述s2中巯基修饰的pd-l1适配体(apdl1-sh)溶液的浓度为100um，体积为50ul；
16.优选的，所述s2中的金纳米棒溶液的浓度为1nm，体积为1ml。
17.本发明的另一目的在于提供一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料，将其应用于肺癌的光热-免疫联合靶向治疗中；
18.优选的，所述靶向治疗的靶向策略为偶联靶向pd-l1适配体apdl1的主动靶向策略。
19.本发明的有益效果是：
20.1)本发明的靶向pd-l1的金纳米棒apdl1@gnr，相比于裸露的pd-l1核酸适配体，结合金纳米颗粒的pd-l1核酸适配体在体内的血液循环时间有较大的提高，并且pd-l1核酸适配体的结合并不影响金纳米棒的光热性能，为金纳米棒纳米材料在体内运用提供更大的可能；
21.2)运用了主动靶向策略，偶联pd-l1适配体，主动靶向癌细胞表面过表达的pd-l1，实现材料的特异性高效递送；
22.3)运用新的治疗策略，首次将pd-l1适配体与金纳米棒结合，阻断pd-1/pd-l1结合，同时结合光热治疗，既能直接杀伤肿瘤，又能逆转免疫抑制性肿瘤微环境激活机体免疫反应；
23.4)本发明设计方法简单，反应条件温和，为肺癌的精准治疗提供了一种新的策略。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1是apdl1@gnr表征数据示意图；
26.图2是apdl1@gnr的体外光热能力；
27.图3是apdl1@gnr对不同肺癌细胞的光热杀伤效果；
28.图4是各组小鼠体内抗肿瘤免疫效应；
29.图5是各组抗肿瘤效果图和肿瘤生长曲线示意图。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1
32.制备apdl1@gnr纳米材料：
33.s1：在搅拌条件下向ctab溶液中加入haucl4，然后加入新鲜制备的硼氢化钠，以制备金纳米种子；
34.s2：在ctab溶液中逐次加入haucl4、硝酸银、盐酸、抗坏血酸，最后加入金纳米种子，过夜孵育，得到长轴吸收峰在800nm左右的金纳米棒；
35.s3：将巯基修饰的pd-l1适配体(apdl1-sh)与金纳米棒水溶液混合均匀，过夜搅拌后离心得到apdl1@gnr；
36.图1为制备纳米粒子的透射电子显微镜图，紫外可见光吸收光谱图和电位图，由图可知，制备得到了良好分散，直径约为100nm的高质量的apdl1@gnr，uv-vis-nir显示出apdl1特异吸收峰，经修饰后，表面电位也发生相应变化，表明apdl1的成功修饰。
37.实施例2
38.测定apdl1@gnr的体外光热能力：
39.图2为不同浓度apdl1@gnr和gnr，使用波长为808的近红外激光照射后的光热曲线。由图可见，相比gnr，apdl1的修饰，对apdl1@gnr光热能力几乎没有影响。
40.实施例3
41.apdl1@gnr的体外肿瘤杀伤效果：
42.图3为不同浓度的apdl1@gnr与a549和llc两种肺癌细胞孵育后使用波长为808的近红外激光照射一段时间后的光热杀伤效果。由图可见，apdl1@gnr对肺癌细胞具有良好的光热杀伤作用，且的杀伤效果与apdl1@gnr的浓度成正比例关系。
43.实施例4
44.apdl1@gnr的体内抗肿瘤免疫效应：
45.c57小鼠皮下注射1
×
106个llc细胞，当肿瘤体积达到100mm3左右时，小鼠被随机分配为6个治疗组(n＝5)：dpbs,apdl1,gnr,gnr+nir laser,apdl1@gnr,apdl1@gnr+nir laser。药物通过腹腔注射，隔天注射一次，共给药3次。使用公式计算肿瘤体积(mm3)：肿瘤体积＝(最短直径)2×
(最长直径)
×
0.5，探究纳米药物对体内免疫效应的影响。
46.图4为治疗后肿瘤组织各种免疫细胞成分和比例的改变，由图可见，apdl1@gnr+nir laser的治疗组与对照组及其他实验组相比能有效抑制调节t细胞的分化，增强细胞毒性t细胞的活力。
47.实施例5
48.apdl1@gnr的抗肿瘤效果：
49.图5为6个治疗组(n＝5)：dpbs,apdl1,gnr,gnr+nir laser,apdl1@gnr,apdl1@gnr
+nir laser抗肿瘤效果图。由图可见，apdl1@gnr+nir laser的治疗组与对照组及其他实验组相比能显著抑制异植肿瘤的生长。
50.综上，本发明开发了一种靶向pd-l1的金纳米棒，通过特异性靶向pd-l1过表达的肿瘤细胞，实现纳米药物的高效递送，结合光热效应，有效抑制肺癌的生长，逆转免疫抑制性的肿瘤微环境，激发机体免疫反应，为肺癌的精准治疗提供了一种新的策略，并为其他实体瘤的治疗提供新思路。

技术特征：
1.一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，包括制备金纳米种子、制备金纳米棒和pd-l1适体金纳米棒apdl1@gnr的制备；其特征在于：所述pd-l1适体金纳米棒apdl1@gnr的制备，将巯基修饰的pd-l1适配体apdl1-sh与金纳米棒水溶液混合均匀，过夜搅拌后离心得到apdl1@gnr。根据权利要求1所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于：制备金纳米种子为：边搅拌边向ctab溶液中加入haucl4，然后加入新鲜制备的硼氢化钠，制备得到金纳米种子；其中，ctab溶液浓度为0.2m，体积为5ml；haucl4溶液的浓度为0.5mm，体积为5ml；硼氢化钠溶液的浓度为10mm,体积为600ul。2.根据权利要求1所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于：制备金纳米棒：向ctab溶液中依次加入haucl4、硝酸银、盐酸、抗坏血酸，最后加入金纳米种子，过夜孵育，得到长轴吸收峰在800nm左右的金纳米棒；其中，ctab溶液浓度为0.2m，体积为30ml；haucl4溶液的浓度为0.5mm，体积为6ml；硝酸银溶液的浓度为0.1m，体积为75ul；盐酸溶液的浓度为1.2m，体积为75ul；抗坏血酸溶液的浓度为10mm，体积为3.7ml。3.根据权利要求2所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于，加入的金纳米种子的体积为50ul。4.根据权利要求2所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于，所述巯基修饰的pd-l1适配体apdl1-sh溶液的浓度为100um，体积为50ul。5.根据权利要求2所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于，所述金纳米棒溶液的浓度为1nm，体积为1ml。6.根据权利要求1-5任一项所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于，将制备得到的apdl1@gnr应用于肺癌的光热-免疫联合靶向治疗中。7.根据权利要求6所述一种pd-l1适体修饰的金纳米棒材料apdl1@gnr的制备方法，其特征在于，所述靶向治疗的靶向策略为偶联靶向pd-l1适配体apdl1的主动靶向策略。

技术总结
本发明公开了一种PD-L1适体修饰的金纳米棒材料及其应用，制备的金纳米棒纳米材料APDL1@GNR，通过设计PD-L1适配体主动靶向策略，结合光热效应，实现肺癌靶向光热免疫复合疗法。该策略为本发明首次提出，有效抑制肺癌的生长，并激发机体免疫反应，为肺癌的精准治疗提供了一种新的策略，并为其他实体瘤的治疗提供新思路。提供新思路。提供新思路。


技术研发人员：赵岳涛 刘洪 常睿敏 李坦
受保护的技术使用者：中南大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/7